Methodenartikel

Leucine Zipper-gebaseerde celsortering voor zuivering van dual-vector-getransduceerde cellen

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor het selectief zuiveren van dubbel getransduceerde T-cellen uit een mengsel van co-getransduceerde T-cellen. Deze benadering combineert twee retrovirale vectoren die elk coderen voor één component van een gepaarde leucine-rits-gebaseerde celsorteermethodologie die selectieve immunomagnetische zuivering van dual-vector-getransduceerde cellen mogelijk maakt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adoptieve T-celtherapieën, waaronder chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen, hebben een indrukwekkende klinische activiteit aangetoond tegen hematologische maligniteiten en zijn veelbelovend bij de behandeling van solide tumormaligniteiten. Ondanks deze successen zijn er meerdere mechanismen van resistentie tegen T-celimmunotherapie geïdentificeerd die het therapeutisch succes beperken, waaronder verlies van of zwakke expressie van doelwitantigenen, ontwikkeling van T-celuitputting en de aanwezigheid van een immunosuppressieve tumormicro-omgeving. Er zijn meerdere celengineeringstrategieën ontwikkeld om deze mechanismen van resistentie te overwinnen. Er kunnen echter meerdere resistentiemechanismen tegelijkertijd optreden, waardoor een combinatie van meerdere technische strategieën nodig is om de antitumoractiviteit te optimaliseren. Beperkingen van vectorverpakkingen beperken de levering van grote hoeveelheden genetische informatie aan T-cellen en vormen een uitdaging bij het tot expressie brengen van meerdere gemanipuleerde constructies. Hier beschrijven we een protocol voor het co-transduceren van T-cellen met twee vectoren om te coderen voor meerdere transgenen, waardoor het aantal gemanipuleerde functies toeneemt. Door een op leucine rits gebaseerde celsorteermethodologie tot expressie te brengen, genaamd Zip-sort, sturen we selectieve immunomagnetische zuivering van dubbel getransduceerde cellen die twee verschillende vectoren hebben opgenomen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T-celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling van B-celleukemie, lymfoom en multipel myeloom 1,2. CAR T-cellen worden ook onderzocht op solide tumormaligniteiten3. Er zijn echter terugkerende mechanismen voor het falen van CAR T-celtherapie geïdentificeerd, waaronder slechte expressie of verlies van het CAR-doelantigeenmolecuul, ontwikkeling van T-celdisfunctie (uitputting), actieve immuunsuppressie door de tumormicro-omgeving en beperkt T-celtransport naar en persistentie in de micro-omgeving van de tumor 3,4,5,6 . Hoewel er individuele technische oplossingen zijn bedacht om te proberen elk van deze CAR T-celresistentiemechanismente overwinnen 3, is het introduceren van meerdere gemanipuleerde functies in een celtherapieproduct om tegelijkertijd meerdere resistentiemechanismen te overwinnen een uitdaging vanwege de beperkte genetische verpakkingscapaciteit van retrovirale en lentivirale vectorsystemen7.

Om de beperkingen in de capaciteit van vectorverpakkingen te overwinnen, wordt steeds meer gebruik gemaakt van co-transductie van T-cellen met meerdere vectoren. Vectorco-transductie is gebruikt om logisch-afhankelijke en geneesmiddelgereguleerde T-celengineeringstrategieën te bestuderen in preklinische studies 8,9,10 en in een recente klinische studie waarin CD19/CD22 dual-CAR T-cellen werden geëvalueerd om de beperkingen van vectorverpakkingen te overwinnen11. Co-transductie genereert echter gemengde celproducten die combinaties van enkelvoudig en dubbel getransduceerde T-cellen bevatten, wat de functionaliteit van het product kan aantasten als het afhankelijk is van componenten die door beide vectoren worden gecodeerd en ook kan leiden tot concurrentie tussen enkelvoudig getransduceerde T-cellen12.

Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een methodologie ontwikkeld met de naam Zip-sort, die gebruik maakt van heterodimeriserende leucine-ritsen - elk tot expressie gebracht uit een van de twee co-getransduceerde vectoren - om eenstaps immunomagnetische zuivering van dubbel getransduceerde cellente sturen 13. In dit protocol beschrijven we methoden voor het construeren van retrovirale vectoren met behulp van onze Zip-sort-methodologie, retrovirale productie en concentratie van supernatans, T-celactivering en co-transductie, en immunomagnetische zuivering van dubbel getransduceerde cellen (Zip-sort).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierstudies werden uitgevoerd in het Parvin Animal Research Laboratory van de City of Hope (COH) onder protocol #23145, goedgekeurd door het COH Institutional Animal Care and Use Committee, en in het vivarium van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) onder protocol #99-07-025, zoals goedgekeurd door het MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee. Menselijke T-cellen werden geïsoleerd uit geanonimiseerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) die Ficoll-Paque waren gezuiverd uit leukocytenreductiefilters verkregen van het City of Hope Blood Donor Center en gebruikt onder protocol #24427 zoals goedgekeurd door de City of Hope Institutional Review Board. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsnormen.

1. Zip-sorteer vectorontwerp

  1. Selecteer de expressievector bij uitstek voor het genetisch modificeren van cellen van belang.
    OPMERKING: De zip-sort-methodologie omvat uitgescheiden ritsen en vangritsen, die beide tot expressie worden gebracht door verschillende vectoren, en die intracellulair paren en naar het celoppervlak sturen om selectieve zuivering van cellen waarin beide vectoren zijn opgenomen mogelijk te maken (Figuur 1A-D)13. Afgescheiden ritsen worden uitgedrukt door Vector 1 en bevatten een affiniteitslabel. Capture-ritsen worden uitgedrukt door Vector 2 en behouden de afgescheiden ritssluiting op het oppervlak van de cel. De blokkerende ritsaanpassing bestaat uit een covalent gekoppelde tweede rits, die niet-specifieke extracellulaire ritskoppeling van de afgescheidene rits blokkeert. De blokkerende ritsmodificatie is nodig om extracellulaire paring te voorkomen bij het toevoegen van een capture-rits aan eiwitten met langwerpige extracellulaire domeinen (meestal extracellulaire domeinen groter dan een kort scharnierdomein).
  2. Selecteer een set afgescheiden en vastgelegde ritsen uit aanvullende tabel 1 en aanvullend bestand 1 om vectoren te testen en te bouwen.
  3. Kloon ritssequenties in gepaarde expressievectoren met behulp van standaard moleculair-biologische technieken13- elk van de twee vectoren codeert ofwel de affiniteitstag uitgescheiden rits of de vangrits (Figuur 1D).
    1. Zie Aanvullende Tabel 1 en Aanvullend Bestand 1 voor ritsconstructiesequenties. De ritssequenties zijn geplaatst op de 5' (N-terminus) van een polycistronisch bericht om hun expressie te verbeteren en daardoor de sorteeropbrengst te verhogen. Plaats de volgende transgenen stroomafwaarts, gescheiden door zelfsplitsende 2A-peptiden (Figuur 1D). Eerdere experimenten hebben echter succes gehad met het plaatsen van de ritsen in een 3'-configuratie als een hoge expressie wordt gehandhaafd.

2. Productie van retrovirussen

  1. Bereid Phoenix-Eco-cellen (ATCC CRL-3214, muis-tropisch virus) of Phoenix-Eco ɑ-V β-3 cellen13 voor (toevoeging van ɑ-V β-3 ontworpen om de hechting van Phoenix-Eco te verbeteren) of 293Vec-RD11414 (humaan-tropisch virus) of 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 cellen (toevoeging van ɑ-V β-3 ontworpen om de hechting van 293Vec-RD114 te verbeteren) 1 dag voorafgaand aan transfectie.
    OPMERKING: Dit protocol vereist geen aanpassing van verpakkingslijnen met ɑ-V β-3-integrinen, maar deze wijziging verbetert de hechting van deze cellijn aan weefselkweekkolven en vergemakkelijkt het verzamelen van retrovirale supernatans.
    1. Trypsiniseer cellen in een T175-kolf met Phoenix- of 293Vec-RD114-cellen bij ~80% samenvloeiing met 0,25% trypsine-EDTA.
      1. Verwijder media, was aanhangende cellen met 10 ml PBS, houd de cellen ongestoord om serumcomponenten te verwijderen die trypsine remmen, voeg 5 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer cellen bij 37 °C gedurende 5 minuten.
      2. Dissocieer en verzamel de cellen in 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en 1% glutaMAX (ook wel complete DMEM genoemd).
      3. Pellet de cellen in een conische buis van 15 ml door ze gedurende 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 340 x g . Decanteren media.
    2. Resuspendeer centrifuge-gepelleteerde cellen in 10 ml volledige DMEM en plaat op een weefselkweekschaaltje van 10 cm ongeveer 1,5 x 106 Phoenix-Eco-cellen, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114-cellen of 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 cellen geteld met een hemacytometer.
    3. Schud of draai de plaat voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen en incubeer een nacht bij 37 °C zodat de cellen zich aan de plaat kunnen hechten.
  2. Controleer ongeveer 18-24 uur later of de cellen voor 60%-70% samenvloeien, waarbij gezonde, aanhangende cellen dendritische projecties vertonen.
  3. Transfect stabiel Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3 cellen, 293Vec-RD114, of 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 cellen met retrovirale LZRS-vector constructen (Addgene Plasmid #31601, EBNA-gebaseerde episomale stabiele transfectie) of PB-vector constructen13 (piggyBac transposon-gebaseerde genomische stabiele integratie, Aanvullend Bestand 1) met behulp van de transfectiekit (Tabel van Materialen) zoals hieronder beschreven.
    1. Combineer 2 μg LZRS-vector DNA of PB-vector DNA en 16 μL enhancer reagens in 300 μL EC-buffer in een microcentrifugebuis voor elke transfectiereactie.
    2. Voor een stabiele integratie van PB-vectorconstructen voegt u ook 1 μg van de hyperactieve piggyBac-transposasevector pCMV-hyPBase15 toe (Sanger Institute).
    3. Draai zachtjes gedurende 5 s en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 20 μL transfectiereagens toe, vortex gedurende 10 s, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om DNA-micelcomplexen te genereren.
    4. Voeg 300 μL volledige DMEM toe aan de buis, pipetteer meerdere keren om grondig te mengen en voeg de miceluspensie druppelsgewijs toe aan de cellen van de geplateerde verpakkingslijn met behulp van een pipet van 1 ml.
    5. Draai voorzichtig om een gelijkmatige afzetting van de micellen te garanderen. Na 24 uur trypsiniseren getransfecteerde cellen en beoordelen van de initiële retrovirale gecodeerde constructexpressie door middel van flowcytometrie.
    6. Breng getrypsiniseerde cellen over naar een T75-kolf met 20 ml volledig DMEM en voeg 2 μg/ml puromycine of 10 μg/ml blasticidine toe, afhankelijk van de antibioticaresistentiegenen, om de getransfecteerde cellen te selecteren. Zodra cellen 70%-75% samenvloeiing bereiken, trypsiniseren en overbrengen naar een T175-kolf met 40 ml volledige DMEM. Behoud de selectie van antibiotica in de media tijdens de uitbreiding van de verpakkingslijn.
    7. Wanneer de cellen voor 80%-85% samenvloeien, trypsiniseren ze opnieuw en bevestigen ze de constructexpressie door middel van flowcytometrie. Vries een hoeveelheid cellen in met behulp van vriesmedia (50% complete DMEM, 40% FBS, 10% DMSO) en passage cellen in twee T175-kolven (1:10-1:12 gesplitste verhouding) met 40 ml volledige DMEM.
  4. Verzamel en concentreer retroviraal supernatans uit volledig geselecteerde stabiele verpakkingslijnen die in T175-kolven worden gekweekt wanneer cellen 80%-85% samenvloeiing bereiken.
    1. Verwijder antibiotica uit de media vóór de eerste oogst door de media in T175 te vervangen door 40 ml verse, volledige DMEM 24 uur voor de eerste beoogde verzameling.
    2. Verzamel en filtreer supernatanten 24 uur na vervanging van de media door het verzamelde supernatans door spuiten van 50 ml te leiden die zijn uitgerust met spuitfilters (0,45 μm, polyvinylideenfluoride). Verzamel in een conische buis van 50 ml.
    3. Voeg 5x polyethyleenglycol (PEG) oplossingsconcentraat (40% (wt/vol) PEG 8.000 MW met 2,4% (wt/vol) NaCl) gefilterd supernatans toe en keer de buis meerdere keren om om grondig te mengen (PEG-precipitatiestap).
    4. Voeg 40 ml volledige DMEM toe aan de oorspronkelijke geoogste T175-kolf, incubeer nog eens 24 uur en verzamel in totaal nog eens 2 opeenvolgende dagen dagelijks viraal supernalant.
    5. Laat het virus 1-2 dagen neerslaan bij 4 °C. Het neergeslagen virus zal verschijnen als vlokkig, drijvend of gesedimenteerd materiaal.
    6. Centrifugeer de PEG-precipiteerde virussuspensie bij 2.100 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi niet-geprecipiteerd supernatant weg.
    7. Resuspendeer elke PEG-geprecipiteerde virale pellet in 500 μL RPMI aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1% glutaMAX, 1% natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren en 0,1% β-mercaptoethanol (aangeduid als volledig RPMI).
    8. Gebruik het geresuspendeerde virus onmiddellijk voor transductie of overdracht naar een microcentrifugebuis en bewaar bij -80 °C.

3. Dag 0: Verrijking en activering van T-cellen bij muizen

  1. Smeer een met weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes in met 1,5 ml PBS per putje met 2 μg/ml anti-CD3 (kloon 145-2C11) en 2 μg/ml anti-CD28 (kloon 37.51). Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
  2. Oogst milt van donormuis, dissocieer cellen door een filter van 40 μm en verzamel splenocyten in volledige RPMI. Pelletsplenocyten door centrifugeren bij 340 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Vrouwelijke BALB/cJ-muizen in de leeftijd van 6-8 weken werden in dit onderzoek gebruikt als donormuizen.
  3. Gooi supernatant weg, draai voorzichtig de vortexpellet weg, voeg 1 ml RBC-lysisbuffer toe, pipetteer 3x-5x om te mengen, incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur, blus af met 10 ml volledig RPMI en draai de cellen af door 5 minuten te centrifugeren bij 340 x g bij 4 °C.
  4. Gooi supernatant weg, voeg 800 μL PBS toe met 0,5% BSA en 2 mM EDTA (ook wel MACS-buffer genoemd) en voeg 200 μL muis-CD19-microbeads toe. Pipette, meng en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  5. Bereid 1 LD-kolom per muizenmilt voor. Bevestig de LD-kolom aan een MACS-scheidingsteken. Plaats er een conische buis van 15 ml onder om CD19-verarmde splenocyten te verzamelen. Maak de kolom nat met 2 ml MACS-buffer.
  6. Was de cellen na incubatie met CD19-microbeads met 5 ml koude MACS-buffer, pelletcellen door ze 5 minuten lang bij 340 x g bij 4 °C te centrifugeren en gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer in 1 ml MACS-buffer en voeg cellen toe aan de LD-kolom. Wacht tot de suspensie is doorgepasseerd voordat u deze wast met 1 ml en vervolgens 2 ml MACS-buffer.
  7. Verzamel de doorstroming van de CD19-verarmde splenocyten om stroomafwaarts te gebruiken. Gooi de LD-kolom weg, draai de CD19-verarmde splenocyten naar beneden door 5 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 340 x g . Gooi het bovenstaande weg en suspendeer opnieuw in 18 ml volledig RPMI. Voeg recombinant humaan IL-2 (rhIL-2) toe aan een uiteindelijke concentratie van 50 IE/ml.
  8. Gooi de antilichaamoplossing weg van de met antilichamen beklede plaat met 6 putjes. Voeg 3 ml geresuspendeerde B-celverarmde splenocyten toe aan elk putje van de met antilichamen beklede plaat met 6 putjes.

4. Dag 1: Retrovirale transductie van T-cellen van muizen

  1. Smeer een niet-weefselkweekbehandelde plaat met 6 putjes in met 1,5 ml PBS per putje dat 2 μg/ml anti-CD3 (kloon 145-2C11), 2 μg/ml anti-CD28 (kloon 37.51) en 20 μg/ml RetroNectine bevat.
    OPMERKING: Niet-weefselkweekplaten worden gebruikt tijdens het coaten van RetroNectin volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  2. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C. Gooi de coatingoplossing weg of bewaar voor hergebruik (mag één keer opnieuw worden gebruikt). Blokkeer de plaat met 1 ml PBS met 2% BSA per putje, incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C en gooi de blokkeeroplossing weg.
  3. Ontdooi in de tussentijd het PEG-neergeslagen virale supernatant in een waterbad van 37 °C.
    OPMERKING: 500 μL van elk geco-getransduceerd PEG-geconcentreerd retrovirus gegenereerd uit een T175-kolf zou voldoende moeten zijn om tot 2 x 106 geactiveerde T-cellen per putje dubbel te transduceren met > 20% dubbele transductie-efficiëntie.
  4. Voeg co-transductie virale supernatanten toe aan de plaat met 6 putjes volgens de gewenste omstandigheden, breng het uiteindelijke volume op ten minste 2 ml met volledige RPMI en 50 IE/ml rhIL-2, en draai gedurende 1 uur bij 2.100 x g en 32 °C.
  5. Voeg 0,5-2 x 106 geactiveerde T-cellen per putje toe en draai de plaat 10 minuten op 340 x g bij 32 °C. Als de cellen niet hechten, herhaal dan de centrifuge bij 340 x g gedurende nog eens 10-20 minuten bij 32 °C. Incubeer een nacht bij 37 °C.

5. Dag 2: Beoordeling van vectorexpressie en optionele hertransductie

  1. Verstoor 100-200 μL aanhangende cellen per toestand van de transductieplaat voor flowcytometrie. De gebruiker moet een door flowcytometrie detecteerbare marker identificeren voor elke individuele vector en affiniteitstag en deze gebruiken om de efficiëntie van vectortransductie met één vector, de efficiëntie van dubbele-vectortransductie en de presentatie van affiniteitstags te beoordelen met behulp van flowcytometrie.
  2. Voer flowcytometrie uit op co-getransduceerde cellen zoals hieronder beschreven.
    1. Stel acquisitieparameterassen in om vectorreporters weer te geven voor vector 1 en vector 2 (afbeelding 1C).
    2. Plot histogrammen voor kleuring van de rits van de affiniteitstag (bijv. FLAG of CD34) voor elk van de vier Vector 1- en Vector 2-expressiekwadranten om ervoor te zorgen dat de kleuring van de affiniteitstag beperkt blijft tot cellen die Vector 1- en Vector 2-transductiereporters tot co-expressie brengen.
  3. Als cellen voldoende dubbele transducatie hebben om voldoende cellen te garanderen voor stroomafwaartse experimenten (over het algemeen 20% of meer dubbele transductie), voer dan de volgende stappen uit.
    1. Smeer het dubbele aantal van de initiële putjes die worden gebruikt om elke T-cellijn te transduceren in met PBS dat 2 μg/ml anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen bevat om T-celstimulatie te behouden. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C.
    2. Breng cellen over naar nieuwe putjes met volledige RPMI met 50 IE/ml rhIL-2 (handhaaft T-celstimulatie).
  4. Als cellen onvoldoende dubbel getransduceerd zijn om voldoende cellen te garanderen voor stroomafwaartse experimenten (meestal < 20% dubbele transductie), voer dan de volgende stappen uit.
    1. Transduceer opnieuw volgens hetzelfde protocol als op dag 1, maar verhoog tot het dubbele van het aantal putjes dat aanvankelijk werd gebruikt om rekening te houden met de expansie van T-cellen.
    2. Incubeer een nacht bij 37 °C. Herhaal flowcytometrie 24 uur later.
      OPMERKING: Vectorgecodeerde constructies, inclusief de ritssluiting van de affiniteitstag, vertonen maximale expressie 2 dagen na de eerste transductie.

6. Dag 3: Immunomagnetische selectie van T-cellen (Zip-sort)

  1. Poolputjes van de cellen die onder dezelfde co-transductieomstandigheden zijn gegenereerd in een conische buis van 15 ml.
  2. Centrifugeer de cellen bij 340 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi de supernatans weg en incubeer de cellen in 500 μl MACS-buffer met 30 μl microbeads (DYKDDDK (FLAG) of humaan CD34) per 1 x 107 cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  3. Was de cellen na de incubatie met 5 ml koude MACS-buffer. Centrifugeer de cellen bij 340 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet in 1 ml MACS-buffer.
  4. Selecteer positief getransduceerde T-cellen met behulp van een LS-kolom zoals hieronder beschreven.
    1. Maak de kolom nat met 2 ml MACS-buffer. Breng de celophanging aan op de LS-kolom in de magnetische standaard.
    2. Achtereenvolgens wassen met MACS-buffer (1 ml, 2 ml, 3 ml). Elute vastgehouden cellen uit de kolom door de kolom uit de magnetische standaard te verwijderen, 5 ml volledige RPMI aan de kolom toe te voegen en de celplunjer in te brengen.
    3. Vang cellen op in een conische buis van 15 ml of rechtstreeks in een T25-kolf. Breng cellen in evenwicht bij 0,5 x 106 cellen/ml in volledige RPMI met 50 IE/ml rhIL-2.
    4. Als u uitgaat van < 20% dubbele transductie, kunt u de cellen eventueel op een tweede LS-kolom elueren voor sequentiële positieve selectie om de zuiverheid na het sorteren te vergroten.
  5. Kweek CAR T-cellen in T25- of T75-kolven bij ongeveer 0,5 x 106 cellen/ml volledig RPMI en 50 IE/ml rhIL-2.
  6. Optioneel: Als T-cellen worden gebruikt voor in vivo experimenten, overweeg dan om te kweken in 1 μM dasatinib om door CAR T-cel tonische signalering geïnduceerde disfunctie te verzwakken die tijdens de initiële kweekperiode wordt aangetroffen13,16.
  7. Voer flowcytometrie uit volgens stap 2.1 en 2.2 hierboven voor voorgesorteerde en nagesorteerde T-cellen om de opbrengst en zuiverheid na het sorteren na het sorteren te beoordelen (% dubbel getransduceerd).
    Opbrengst = 100 x totaal aantal teruggevonden dubbel getransduceerde cellen / totaal aantal dubbel getransduceerde cellen aanwezig in de pre-sorteerpopulatie)

7. Dag 4: Vervolg T-celcultuur

  1. Voeg vers volledig RPMI en 50 IE/ml rhIL-2 toe voor het gehele kweekvolume om de T-celconcentratie op 0,5-1 x 106 cellen/ml te houden.
  2. Optioneel: Als T-cellen worden gebruikt voor in vivo experimenten, voeg dan vers 1 μM dasatinib toe.

8. Dag 5: Karakterisering van Zip-gesorteerde T-cellen

  1. Optioneel: Bereid 100-200 μL T-celsuspensie per toestand gekleurd met antilichamen om CAR's of andere eiwitproducten te detecteren die worden gecodeerd door de Zip-sort-vectoren met behulp van flowcytometrie.
  2. Voer in vitro of in vivo experimenten uit met CAR T-cellen.
  3. Optioneel: Als T-cellen worden gebruikt voor in vivo experimenten, was de cellen dan om dasatinib te verwijderen. Resuspendeer cellen in de concentratie die nodig is voor retro-orbitale of tail-vein-injectie volgens de richtlijnen van de instelling.

9. Dag 0: Zuivering en stimulatie van menselijke T-cellen

  1. Ontdooi snel een flesje gecryopreserveerde menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) in een waterbad (of gebruik vers geïsoleerde PBMC's). Voeg de ontdooide PBMC's toe aan een conische buis van 15 ml met 5 ml MACS-buffer, bereid een aliquot voor om te tellen en pelletcellen door ze gedurende 5 minuten bij 340 x g bij 4 °C te centrifugeren.
  2. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in de MACS-buffer (gebruik 40 μL buffer per 1 x 107 cellen in totaal). Ga verder met T-celisolatie met behulp van de Pan T-celisolatiekit, menselijk, volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Voeg kort 10 μL Pan T-cel biotine-antilichaamcocktail toe per 1 x 107 cellen in totaal. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Voeg 30 μL MACS-buffer toe per 1 x 107 cellen in totaal. Voeg 20 μL Pan T Cell MicroBead Cocktail toe per 1 x 107 cellen in totaal.
    3. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Vul het volume van de celsuspensie met behulp van de MACS-buffer bij tot ten minste 500 μl.
    4. Ga verder met magnetische celscheiding met behulp van een LS-kolom en verzamel de stroom door met verrijkte (onaangeroerde) T-cellen.
  3. Tel de T-celopbrengst en de pelletcellen door 5 minuten te centrifugeren bij 340 x g bij 4 °C. Gooi supernatant weg. Resuspendeer menselijke T-cellen in volledige RPMI bij 1 x 106 cellen/ml met rhIL-2 bij 50 IE/ml.
  4. Voeg aan een conische buis van 15 ml met 2 ml PBS het vereiste volume Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 toe voor T-celexpansie en -activering (25 μL kralen per 1 x 106 cellen, met een verhouding van 1:1 kraal tot T-cel) en draai gedurende 5 minuten bij 4 °C op 340 x g om de kralen te wassen. Gooi supernatant weg.
  5. Meng geresuspendeerde T-cellen met gewassen kralen en breng over naar een T25-kolf voor kweek.

10. Dag 3: Retrovirale transductie van menselijke T-cellen

  1. Smeer een niet-weefselkweekplaat met 6 putjes in met 1,5 ml PBS per putje dat 20 μg/ml RetroNectine bevat.
  2. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C. Gooi de coatingoplossing weg of bewaar voor hergebruik (mag één keer opnieuw worden gebruikt).
  3. Ontdooi in de tussentijd PEG-geprecipiteerde virale supernatanten voor co-transductie in een waterbad van 37 °C.
  4. Voeg co-transductie viraal supernatans toe aan putjes met RetroNectin-gecoate plaat met 6 putjes volgens de gewenste transductieomstandigheden, tel en voeg het gewenste aantal T-cellen toe (meestal 0,5 - 2 x 106 T-cellen/putje), breng het volume op 3 ml met een volledig RPMI dat rhIL-2 bevat en draai gedurende 45 minuten bij 340 x g bij 32 °C.
  5. Houd de T-cellen na 24 uur op 1 x 106 cellen/ml in volledige RPMI met 50 IE/ml rhIL-2.
  6. Breng de cellen over van de plaat met 6 putjes naar de T25-kolf als het volume dat nodig is om de gewenste concentratie van T-cellen te behouden, groter is dan de volumecapaciteit van de plaat met 6 putjes.

11. Dag 6: Zip-sorteren van menselijke CAR T cellen

  1. Verwijder dynabeads uit T-cellen voorafgaand aan op affiniteitstag gebaseerde immunomagnetische zuivering (Zip-sort) om mogelijke dynabead-geassocieerde retentie in de magnetische kolom te voorkomen en voorafgaand aan flowcytometrie om mogelijke interferentie met flowcytometrische analyse te voorkomen.
  2. Draai kort om Dynabeads te dissociëren en breng T-cellen over naar een conische buis van 15 ml en plaats deze in de Dynabead-magneet. Keer de tube een paar keer om en wacht 5 minuten tot de Dynabeads aan de magneet zijn gebonden.
  3. Breng de celsuspensie zonder dynabeads voorzichtig over in een nieuwe conische buis van 15 ml door te zuigen met een pipet. Tel de herstelde celconcentratie en gebruik het volume om de totale celopbrengst te berekenen.
  4. Evalueer CAR-expressie met behulp van flowcytometrie volgens het bovenstaande muistransductieprotocol.
  5. Centrifugeer de cellen door ze gedurende 5 minuten bij 340 x g bij 4 °C te centrifugeren en incubeer in een MACS-buffer van 500 μl met 30 μl microbeads (DYKDDDK (FLAG) of humaan CD34) per 1 x 107 cellen.
  6. Volg de stappen 6.3-6.5 om Zip-gesorteerde menselijke CAR T-cellen te verkrijgen.
  7. Evalueer de levensvatbaarheid na het sorteren door middel van een levensvatbaarheidscontrole van de hemacytometer met behulp van trypanblauwe uitsluiting. De levensvatbaarheid vóór het sorteren zal naar verwachting > 80% bedragen. Dit kan onder de 80% dalen na Zip-sortering, maar herstelt zich na 4-5 dagen.
  8. Verleng menselijke T-cellen in volledige RPMI met 50 IE/ml rhIL-2 en houd de T-celconcentratie op ongeveer 1 x 106 cellen/ml. Uitbreiding en onderhoud van T-cellen na het sorteren kunnen worden aangepast aan de standaard uitbreidings- en gebruiksprotocollen van de gebruiker.
  9. Voer stroomafwaartse experimentele tests uit, zoals dodingstests, cytokineproductie, in vivo analyse met behulp van T-cellen, meestal na dag 8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol demonstreren we co-transductie en eenstaps immunomagnetische selectie van T-cellen die dubbel getransduceerd zijn met twee verschillende retrovirale vectoren (Zip-sort genoemd, Figuur 1)13. Elke vector codeert voor een deel van een heterodimeriserend leucine-ritspaar dat selectief wordt weergegeven op het oppervlak van dubbel getransduceerde T-cellen (Figuur 1A). Een affiniteitstag uitgesc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier hebben we een protocol beschreven voor het genereren van Zip-sort vectorsets, het produceren van retrovirus, het co-transduceren van muis- en menselijke T-cellen en het immunomagnetisch zuiveren van dual-transduced cellen (Zip-sort). Het bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor retrovirale vectoren en voor muis- en menselijke T-cellen. Hoewel de Zip-sort-methodologie niet werd geëvalueerd met andere vectorsystemen, zijn in principe waarschijnlijk andere vectorsystemen compatibe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. en M.V.D.B. zijn mede-uitvinders van octrooiaanvragen met betrekking tot Zip-sort-technologie. A.P.B. verzorgt consultancy voor Abbvie en Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. heeft onderzoeksondersteuning ontvangen van Seres Therapeutics en aandelenopties van Seres Therapeutics en ThymoFox; hij heeft royalty's ontvangen van Wolters Kluwer; hij heeft Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (partner), Synthekine (partner), Beigene (partner), Kite (partner), MustangBio (partner) en Cellectar (partner) geraadpleegd, honorarium ontvangen van of deelgenomen aan adviesraden voor Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (partner), Synthekine (partner), Beigene (partner), Kite (partner), MustangBio (partner) en Cellectar (partner); hij heeft IP-licenties bij Seres Therapeutics en Juno Therapeutics; hij heeft een fiduciaire rol in het stichtingsbestuur van DKMS (een non-profitorganisatie); en hij is de voorzitter van de wetenschappelijke adviesraad voor Smart Immune.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. ontving steun van de Duitse Onderzoeksstichting (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. wordt ondersteund door een loopbaanontwikkelingsprijs van het NCI (prijsnummer K08-CA252157). S.E.J. ontving ook steun van de American Society for Clinical Oncology (Young Investigator award), het National Marrow Donor Program (Amy Program award) en het Parker Institute for Cancer Immunotherapy (Bridge Scholar award). Het onderzoek in het lab van den Brink wordt ondersteund door de prijzen van het Nationaal Kanker Instituut P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; National Heart, Lung and Blood Institute award R01-HL164902 en National Institute of Aging award P01-AG052359. Dit onderzoek wordt gedeeltelijk ondersteund door de schenking van de Deana en Steve Campbell, Chief Physician Executive Distinguished Chair.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tumor cell line related
C1498ATCCTIB-49
BM185-CD19Ref. 13
BM185-CD20Ref. 13
4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D-Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
Lonza SF buffer kit
Virus Productie
10 cm Tissue culture (TC)-treated Cell Culture DishCorning353003
50 mL conical tubeThermo Scientific339652
EffecteneQiagen301425
pENTR1a plasmidAddgene17398
LZRS-RfaAddgene31601
PB MMLV puro (viral vector for mouse T cells)Ref. 13
PB SFG blastR (viral vector for human T cells)Ref. 13
pCMV-hyPBaseSanger Institute
Phoenix-EcoATCCCRL-3214
Phoenix-Eco alpha V beta 3Ref. 13Phoenix-Eco modified to adhere to culture flasks with higher avidity
PB-EF1a intron WPRE mCD4 P2A MCS integrin beta 3Ref. 13optional to enhance adhesion of packaging line cells to culture flasks
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A integrin alpha VRef. 13optional to enhance adhesion of packaging line cells to culture flasks
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alpha V beta 3Biovec PharmaThis study, transfected with alpha V beta 3 vectors
Millex-HV syringe filters (0.45 μm)MilliporeSLHVR33RRS
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Fisher ScientificBP233-1
Sodium ChlorideFisher ScientificS271-500
PuromycinSanta Cruz Biotechsc-108071B
BlasticidinSanta Cruz Biotechsc-204655
T175 TC-treated flasks Corning353112
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200056
Cell media
2-mercaptoethanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaF2442
GlutamaxGibco35050061
MEM non-essential amino acidsGibco11140050
Penicillin-streptomycinGibco15140-163
Sodium pyruvateGibco11360070
T cell stimulatie/transductie
15 mL conical tubeThermo Scientific339650
6-well non-TC plateGibco351146
6-well TC plateGibco353046
anti-CD19 microbeads Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-mouse CD28 (Clone 37.51)BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anti-mouse CD3ε (Clone 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA4737-1G
DasatinibCayman Chemical11498
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Gibco11131D
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-freeInvitrogenAM9260G
HybriMax RBC lysis bufferSigmaR7757-100ML
LD columnMiltenyi Biotec130-042-901
Pan T Cell Isolation Kit, humanMiltenyi Biotec130-096-535
Dynamag-15 MagnetInvitrogen12301D
Phosphate Buffered Saline (1X)Corning21040CV
RetronectinTakaraT100B
rhIL-2Proleukin (aldesleukin)
T25 cell culture flaskCorning353109
Zip-sort
µMACS DYKDDDDK Isolation KitMiltenyi Biotec130-101-591
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
Flow Cytometry en cel monitoring
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Clone OX-7)BD BiosciencesCat# 561409; RRID:AB_10683163
Anti-V5 tag Antibody, (Clone 4C12E11) iFluor 488GenScriptCat# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PECell Signaling TechnologyCat# 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Cell Signaling TechnologyCat# 2233; RRID:AB_823474
APC anti-DYKDDDK Tag (Clone L5)BioLegendCat# 637307; RRID:AB_2561496
Mouse Anti CD34 Antibody, Alexa Fluor

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

Gerelateerde artikelen