Methodenartikel

Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

DOI:

10.3791/68631

⸱

25 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subretinale injecties zijn een onmisbare techniek voor de preklinische ontwikkeling van therapieën voor fotoreceptor- en RPE-ziekten. We beschrijven een geoptimaliseerde transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen die de intraoperatieve slagingspercentages verbetert en schade aan het netvlies minimaliseert.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De conventionele methode van materiaalafgifte aan de subretinale ruimte in de muis omvat dubbele perforatie van het neurale netvlies, wat uitgebreide chirurgische schade veroorzaakt. Dit leidt tot variabiliteit in de daaropvolgende uitkomstmaten van de visuele functie, zoals elektroretinogram (ERG)-opnames of gedragsvisietests, die werkzaamheidsbeoordelingen van experimentele therapieën verwarren. Om deze barrières te overwinnen, hebben we een transsclerale minimaal invasieve subretinale injectietechniek bij muizen geoptimaliseerd. Bij deze techniek wordt de superieure fornix benaderd met behulp van een op maat gemaakt ooglidspeculum van wolfraamdraad om conjunctivale peritomie en tenotomie uit te voeren. Een pinpoint sclerotomie wordt gemaakt met behulp van een diamantmes zonder het netvlies binnen te dringen, waardoor een fijne glazen naald voorzichtig in een ondiepe hoek wordt ingebracht. De lading wordt met behulp van een micro-injectiepomp in de subretinale ruimte afgeleverd. Optische coherentietomografie (OCT) wordt gebruikt om de grootte en positie van de subretinale bleb onmiddellijk na injectie te beoordelen. We vergeleken de resultaten van deze techniek met de conventionele transretinale methode die wordt uitgevoerd met behulp van een veerbelaste spuit met een 33G-naaldsclerotomie. ERG-opnames wezen op een uitstekend behoud van de retinale functie bij transscleraal geïnjecteerde muizen, vergelijkbaar met die van niet-geïnjecteerde controlemuizen. Daarentegen werd een merkbare vermindering van het ERG-signaal waargenomen in de conventioneel geïnjecteerde cohorten. Samenvattend hebben we een minimaal invasieve techniek geoptimaliseerd voor subretinale injectie bij muizen. We tonen aan dat deze techniek een robuuste en efficiënte methode is voor toediening van gentherapie die anatomische schade aan het netvlies minimaliseert en een minimale impact heeft op de netvliesfunctie. Deze methode verlaagt de drempel voor de ontwikkeling van therapieën die gericht zijn op zowel het retinale gepigmenteerde epitheel als fotoreceptoren voor de behandeling van een breed scala aan netvlies- en maculaire aandoeningen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Subretinale injectie is een oculaire chirurgische ingreep waarbij materiaal wordt afgeleverd in de potentiële ruimte tussen het netvlies en het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Vergeleken met andere methoden voor toediening van geneesmiddelen aan het posterieure segment, zoals intravitreale of suprachoroïdale injecties, bereiken subretinale injecties de meest directe toegang tot zowel de fotoreceptoren als de RPE. Voor de afgifte van virale gentherapiedeeltjes bereikt subretinale injectie veel hogere percentages fotoreceptor- en RPE-transductie, wat zorgt voor lagere virale titers en een verminderd risico op virale toxiciteit1. Bovendien is de subretinale ruimte anatomisch beperkt, waardoor de systemische verspreiding van virale deeltjes wordt beperkt en het risico op immuunresponsen wordt verlaagd2. Bij mensen is het veiligheidsprofiel van subretinale injecties zeer gunstig, waarbij de structuur en functie van het netvlies zich binnen 1 maand na injectie herstellen tot het basisniveau 3,4. Subretinale injecties worden gebruikt in een aantal toepassingen, zoals stamceltransplantatie en toediening van geneesmiddelen met kleine moleculen2, waarbij het meest voorkomende gebruik de toediening van virale vectoren is voor gentherapiebehandelingen van netvliesaandoeningen. De relatief lage virale titers, minimale systemische blootstelling en hoge snelheid en specificiteit van transductie geassocieerd met subretinale injecties hebben ze tot een onmisbare techniek op het gebied van het netvlies gemaakt. Subretinale injecties worden met succes gebruikt bij patiënten voor de behandeling van erfelijke netvliesaandoeningen, waaronder retinitis pigmentosa en Leber congenitale amaurosis 5,6.

Gezien het belang ervan voor het veld, is het vermogen om subretinale injecties bij muizen uit te voeren cruciaal voor preklinische studies naar therapieën voor erfelijke netvliesaandoeningen. De huidige methoden voor subretinale injecties bij muizen hebben echter hoge faalpercentages en veroorzaken vaak chirurgische schade aan het netvlies, wat de betrouwbaarheid en consistentie van functionele uitkomstmaten kan beperken. Conventioneel worden subretinale injecties bij knaagdieren transretinaal uitgevoerd, zodat de naald het voorste netvlies binnendringt, langs de lens gaat en de subretinale ruimte binnendringt als gevolg van een tweede penetratie van het netvlies 7,8 (Figuur 1A). Hoewel deze procedure relatief eenvoudig uit te voeren is, introduceert deze procedure een duidelijke inconsistentie in experimentele resultaten vanwege de variabele mate van chirurgische schade. Dit is met name beperkend voor onderzoeken die gebruik maken van gedrags- en functionele visie-uitkomstmaten. Bovendien is de kristallijne lens bij muizen onevenredig groot in vergelijking met mensen; Dit verhoogt het risico op schade aan de lens tijdens transretinale injectie aanzienlijk, waardoor het dier onbruikbaar wordt voor functionele zichtbeoordelingen4.

Een alternatieve optie is de transsclerale injectieroute, die deze problemen vermijdt door toegang te krijgen tot de subretinale ruimte met behulp van een posterieure benadering, waarbij de naald de sclera, het vaatvlies, het membraan van Bruch en de RPE 4,9 binnendringt (Figuur 1B). Deze aanpak minimaliseert schade aan het netvlies door penetratie van het netvlies volledig te vermijden. Het wordt ook geassocieerd met verminderde reflux van geïnjecteerd materiaal uit de subretinale ruimte10, wat zorgt voor consistentere resultaten en kleinere experimentele cohorten. Hoewel de techniek voor transsclerale subretinale injectie bij muizen al eerder in de literatuur is beschreven, blijft de wijdverbreide acceptatie ervan beperkt door de technische moeilijkheid, die het slagingspercentage kan belemmeren4. Hier beschrijven we verschillende verbeteringen aan de transsclerale injectieprocedure, die het gemakkelijker en sneller maken om uit te voeren, de experimentele variabiliteit verminderen en de slagingspercentages van injecties verbeteren. Deze verbeteringen omvatten de ontwikkeling van een ooglidspeculum van de muis, preoperatieve toediening van atropine, het creëren van een nauwkeurige sclerotomie met behulp van een diamantmes en optimalisatie van de naaldgrootte en injectiebenadering. Deze techniek zorgt voor een uitstekende virale transductiedekking van fotoreceptoren en de RPE, zonder enige chirurgische impact te veroorzaken die door ERG kan worden gedetecteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duke University Institutional Animal Care and Use Committee en de Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Dien een intraperitoneale injectie van 1 mg/kg atropine toe (in een totaal volume van 50 μl) 30 minuten voorafgaand aan het uitvoeren van de subretinale injectie. Deze stap verhoogt de slagingspercentages aanzienlijk door potentieel dodelijke oculocardiale en oculorespiratoire reflexen te voorkomen die worden veroorzaakt door voorbijgaande intraoculaire drukverhoging tijdens de injectie11,12.
    OPMERKING: Onze atropinedosering is geoptimaliseerd voor C57BL/6-muizen en moet mogelijk worden aangepast voor andere muizenstammen. We hebben geen noemenswaardige sekse- of leeftijdsverschillen waargenomen in de dosering van atropine.
  2. Houd de muis tijdens de hele procedure op een warm oppervlak om het diercomfort te maximaliseren en de ontwikkeling van koude staar te verminderen.
  3. Verdoof de muis met 2% ingeademd isofluraan in zuurstof (2 l/min) totdat liggend gedrag wordt waargenomen en het dier niet langer reageert op het beknellen van de teen. Breng een druppel 0,5% proparacaïne aan op het oog voor plaatselijke anesthesie.
  4. Breng een druppel van het mengsel van 0,2% cyclopentolaat en 1% fenylefrine aan op het oog om de pupil te verwijden voor postoperatieve beeldvorming van de subretinale bleb door OCT. Fenylefrine dient ook om intraoperatieve bloedingen te verminderen door oppervlakkige bloedvaten te vernauwen13.

2. Sclerotomie

  1. Voordat u met de procedure begint, laadt u een glazen micronaald met de gewenste hoeveelheid te injecteren oplossing. Bevestig de naald aan de micro-injector, met een compensatiedruk ingesteld op 5 hectopascal (hPa) om de capillaire werking tegen te gaan. We gebruiken meestal volumes van 1 μl voor subretinale injecties.
  2. Plaats de muis onder een ontledende stereomicroscoop. Gebruik een vergroting van 20x voor de stappen 2.3-2.6 en een vergroting van 50x voor de stappen 2.7-3.5.
  3. Voer voor jonge muizen voorafgaand aan de procedure een laterale canhotomie uit om voldoende toegang tot en visualisatie van de operatieplaats te bieden.
  4. Belicht de superieure fornix met behulp van een op maat gemaakt miniatuur draadspeculum (Figuur 1C). Immobiliseer het speculum om handsfree terugtrekking van het bovenste ooglid mogelijk te maken.
  5. Gebruik een schuine Vannas-schaar om een paralimbale incisie uit te voeren (~1 mm achter de limbus) in het superieure bindvlies en het kapsel van Tenon om de superieure 3-4 klokuren van de sclera bloot te leggen. Zorg ervoor dat u de retro-orbitale veneuze sinus niet doorboort. Verwijder alle restanten van de capsule van Tenon die over de beoogde injectieplaats liggen, zorgvuldig maar grondig.
  6. Pak de voorste rand van de conjunctivale peritomie en tenotomie vast met een vergrendelende tang en inferoduct de bol voorzichtig om de superieure sclera bloot te leggen. Immobiliseer de vergrendelde tang om handsfree inferoductie mogelijk te maken.
  7. Breng onmiddellijk een druppel gebalanceerde gebufferde zoutoplossing (BSS) aan op het oog om te voorkomen dat de blote sclera uitdroogt. We vinden ook de optische vergroting die door de BSS-druppel wordt geproduceerd nuttig.
  8. Maak met een diamantmes een nauwkeurige sclerotomie op ~12 uur en ~1-2 mm van de limbus. Plaats het mes in een tangentieel vlak ten opzichte van de sclera om ervoor te zorgen dat de sclerotomie zo klein en ondiep mogelijk is.
    OPMERKING: Dit wordt om twee redenen gedaan: (1) een kleine sclerotomie zorgt voor een strakke pasvorm van de glazen naald, waardoor reflux tijdens de injectiestap wordt verminderd, en (2) een ondiepe sclerotomie is van cruciaal belang om te voorkomen dat het netvlies binnendringt. Merk op dat er een kleine hoeveelheid choroïdaal bloed kan verschijnen op de plaats van de sclerodomie, wat geen negatieve implicaties voor de uitkomst van de procedure impliceert.

3. Transsclerale subretinale injectie

  1. Gebruik ter voorbereiding op de injectie een chirurgische spons om voorzichtig alle BSS van het oogoppervlak te verwijderen.
  2. Houd de naald schuin naar beneden in een ondiepe hoek ten opzichte van de sclera en breng de punt langzaam en voorzichtig in de sclerotomie om toegang te krijgen tot de subretinale ruimte. Om te voorkomen dat het netvlies binnendringt, doet u dit onder een relatief ondiepe hoek en net diep genoeg om de sclerotomieopening met 0,5-1 mm vrij te maken.
    OPMERKING: De afschuining van de naald is naar beneden geplaatst om de kans op choroïdale afgifte te minimaliseren en om de kans te verkleinen dat het netvlies wordt doorboord met de vooruitspringende naaldpunt.
  3. Terwijl u de naald in een stabiele positie houdt, start u de injectie bij 500 hPa met behulp van een voetpedaal en houdt u gedurende 15 s ononderbroken druk.
  4. Om de injectie te beëindigen, houdt u de injectiedruk aan totdat de naald volledig uit de sclerotomie is verwijderd. Als de druk voortijdig wordt onderbroken terwijl de naald zich nog in de subretinale ruimte bevindt, kan een groot deel van de geïnjecteerde lading snel het oog verlaten en weer in de naald terechtkomen door capillaire werking.
  5. Zodra de naald is teruggetrokken, merkt u een gedeeltelijke reflux van de geïnjecteerde oplossing op via de sclerotomieplaats. Dit is te verwachten, aangezien het volume van 1 μL de capaciteit van de subretinale ruimte overschrijdt, zelfs bij volwassen muizen. Afwezigheid van reflux kan duiden op een mislukte injectie als gevolg van onbedoelde choroïdale of intravitreale toediening.
  6. Verwijder de vergrendelingstang en het ooglidspeculum uit het oog. Zorg ervoor dat u geen druk uitoefent op de bol, omdat dit verdere terugvloeiing van de geïnjecteerde oplossing kan veroorzaken.
  7. Breng onmiddellijk na de injectie voldoende glijmiddel oogzalf aan op het oog om visualisatie van de subretinale bleb mogelijk te maken tegen14 oktober.
  8. Breng topische erytromycinezalf aan op het oog en geef algemene postoperatieve zorg aan het dier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een succesvolle injectie met behulp van deze transsclerale techniek genereert een subretinale bleb die onmiddellijk na de injectieprocedure waarneembaar is op OCT (Figuur 2A). Gezien de technische uitdaging van deze techniek is de beeldvormingsstap onmisbaar voor het identificeren van succesvol geïnjecteerde dieren. Voor onderzoekers die van plan zijn deze techniek te gebruiken voor gentherapie-experimenten, raden we aan om oefeninjecties uit te voeren met a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven techniek introduceert verschillende verbeteringen ten opzichte van de eerder beschreven transsclerale injectiebenadering4, die de betrouwbaarheid van de procedure verbeteren en chirurgische schade aan het oog verder verminderen. Een van die verbeteringen is het gebruik van een speculum om het bovenste ooglid terug te trekken, waardoor een stabiele, onbelaste en handsfree toegang tot het oog mogelijk is. Commerciële specula zijn vaak slecht geopt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken John Flannery (University of California, Berkeley) voor het verstrekken van het AAV1-Best1-GFP-virus. Ontvangen financiering: NIH R01 EY031748 (CBR), NIH P30 EY005722 (aan Duke University); FFB Free Family AMD Award (CBR); onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center); FFB Translationeel Onderzoek Versnellingsprogramma TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA), NIH K08 EY033857 (OA); Duke University arts-wetenschapper Strong Start Award (OA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Sodium Chloride Injection, USPHospiraPAA130066
1% Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USPAkornNDC 17478-215-05
30° diamond knifeKatenaK2-6560
AmScope 6W LED dual gooseneck illuminatorAmScopeLED-11CR
Angled Vannas scissorsRobozRS-5618
BSS Sterile Irrigating SolutionAlcon289010-0902
Cyclomydril dilating eyedropsAlcon0065-0359-020.2% cyclopentolate, 1% phenylephrine
epT.I.P.S. MicroloaderTM pipette tipsEppendorf5242 956.003
FemtoJet 4i MicroinjectorEppendorfE5252000021Discontinued product
GenTeal Tears lubricant eye ointmentAlcon16027802
Glass microinjection needlesClunbury ScientificB100-58-5030° bevel. Diameter: 50 µm outer, 29 µm inner
Isoflurane solutionCovetrus29405
MICRON IV retinal imaging microscope with image-guided OCTPhoenixN/A
Stereomicroscope SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Stern-Castroviejo locking toothed forcepsKatenaK5-2552
Toothed forcepsRobozRS-5172
Tungsten cleaning wires for 23s gauge needlesHamilton18306
Ultracell PVA Eye SpearsBVI Medical40400-8
Ultra-Fine2015 insulin syringes BD3284383/10 mL, 8 mm (5/16”), 31G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transsclerale injectieminimaal invasieve techniekmuisretinaretinale gentherapietargeting van fotoreceptorenretinaal pigmentepitheeloptische coherentietomografieelektroretinogrammetrieAAV transductie

Gerelateerde artikelen