Methodenartikel

Aandacht voor de overgang van mitochondriaal cytochroom C door immunotransmissie-elektronenmicroscopie

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft methoden om micromorfologische veranderingen in neuronen en de overgang van mitochondriaal cytochroom c te bestuderen door middel van immunotransmissie-elektronenmicroscopie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veranderingen in de eiwitlocatie in de microstructuur vormen vaak een nauwkeurig regulatiemechanisme op het niveau van pathologische organellen. Het nauwkeurig vastleggen van de locatie van deze organel-eiwitoverdracht heeft een positieve betekenis en waarde voor de diagnose en behandeling van ziekten. Mitochondriën spelen een centrale rol bij necrose en de intrinsieke route van apoptose. Onder normale omstandigheden bestaat cytochroom c (Cyt c) alleen tussen de binnenste en buitenste membranen van mitochondriën en in de kern. Wanneer cellen apoptose ondergaan, wordt de permeabiliteit van het mitochondriale binnenmembraan gewijzigd en wordt Cyt c vrijgegeven uit de mitochondriën in het cytoplasma. In deze studie werd een rattenmodel van cerebrale ischemie-reperfusieschade opgesteld en werden de micromorfologische veranderingen van neuronen die apoptose ondergaan aangetoond door immunotransmissie-elektronenmicroscopie. Bovendien toont het de visie van immunogold-labeling Cyt c-overdracht van de mitochondriale matrix naar het cytoplasma na cerebrale ischemie-reperfusieschade nauwkeuriger. De immunotransmissie-elektronenmicroscopietechniek die in dit protocol wordt gepresenteerd, is geschikt voor het aantonen van alle eiwitpositieovergangen op microscopisch niveau.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens de Global Burden of Disease-studie van 2021 was een beroerte de3e belangrijkste doodsoorzaak en de 4ebelangrijkste oorzaak van voor invaliditeit gecorrigeerde levensjaren. Er waren 11,9 miljoen nieuwe beroertes, waarbij ischemische beroerte 65,3% (7,8 miljoen) uitmaakte1. Neuronale dood treedt op na cerebrale ischemie, waaronder necrose en apoptose. Het ernstigst aangetaste hersenweefsel ondergaat vervolgens necrotische celdood. Neuronen in de ischemische penumbra of periinfarctzone kunnen na enkele uren of dagen apoptose ondergaan2. Naast bio-energetische en metabolische functies spelen mitochondriën ook een centrale rol in de intrinsieke route van apoptose 3,4,5,6.

Cyt C is een eiwit dat wordt gecodeerd door nucleaire genen. Onder normale omstandigheden bestaat Cyt C alleen tussen de binnenste en buitenste membranen van mitochondriën en in de kern. De apoptotische route die wordt gemedieerd door de afgifte ervan is geassocieerd met de regulerende controle van Bcl-2-familieleden. Na te zijn gestimuleerd door apoptose, worden Bax/Bak-oligomeren gevormd en ingebracht in de mitochondriale buitenmembraanporie, wat resulteert in veranderingen in de mitochondriale osmotische druk en verlies van transmembraanpotentiaal. Cyt C wordt vrijgegeven uit mitochondriën naar het cytoplasma, waar het zich bindt aan de activator van apoptose 1 om het apoptotische complex te vormen en pro-caspase-9 te activeren. Caspase-3 en caspase-7 worden op hun beurt geactiveerd, waardoor de Caspase-cascade wordt geïnitieerd en celapoptose7 wordt geïnduceerd.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) kan de veranderingen in de celstructuur in verschillende stadia van apoptose duidelijk waarnemen. Morfologische waarneming met elektronenmicroscopie is een betrouwbare methode voor het bepalen van apoptose8. Het kan echter geen veranderingen in Cyt C in de ultrastructuur waarnemen. Er zijn verschillende technieken voor het detecteren van specifieke eiwitten in ultrastructuur: flowcytometrie, enzymgekoppelde immunosorbenttest, enzymgekoppelde immunosorbenttest, spectrofotometrie en westernblotting. Ze kunnen de locatieveranderingen van eiwitten in de microstructuur echter niet nauwkeurig vastleggen. Colloïdaal goud heeft deeltjes van verschillende groottes en de elektronendichtheid van colloïdaal goud is hoog. De Immunogold-technologie is bijzonder geschikt voor enkelvoudige of multi-label lokalisatiestudies van immuno-elektronenmicroscopie. Vanwege de inherente licht- tot donkerrode kleur is colloïdaal goud ook vatbaar voor observatie onder lichtmicroscopie. Wanneer specifieke eiwitten Immunogold gelabeld zijn, kunnen de locatieveranderingen worden gevisualiseerd door middel van een TEM met een subcellulaire resolutie9.

Dit protocol beschrijft het benadrukken van de overgang van mitochondriale Cyt C door immunotransmissie-elektronenmicroscopie (IEM). Het algemene doel van deze methode is het visualiseren van de subcellulaire translocatie van Cyt C tijdens door ischemie geïnduceerde apoptose met behulp van IEM. De grondgedachte voor IEM is om Cyt C te labelen met colloïdaal goud en de lokalisatieveranderingen te visualiseren met subcellulaire resolutie met behulp van TEM9. IEM kan de dynamische veranderingen van eiwitten op ruimtelijk niveau observeren en biedt een krachtig middel om fysiologische en pathologische activiteiten te verklaren10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het dierenprogramma is goedgekeurd door het Ethisch Comité van SLAS (IACUC Issue No: SYST-2024-018). Hier werden 6 pathogeenvrije mannelijke SD-ratten (200-220 g) grootgebracht in onafhankelijke ventilatiekooien, waarbij de laboratoriumomgeving op 22-25 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 45%-65% werd gehouden. Alle ratten ondergingen gedurende 1 week adaptieve voeding met gratis water en dieet gedurende de periode.

1. Vaststelling van het model voor occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO)

  1. Verdeel de ratten willekeurig in de MCAO-groep en de schijnoperatiegroep, met drie ratten in elke groep. Zie figuur 1 voor het experimentele stroomschema.
  2. Controleer de apparatuur die bij dit protocol betrokken is volgens de lijst in afbeelding 2.
  3. Gebruik de intraluminale hechtprocedure om een model van MCAO van ischemie-reperfusieschade bij ratten vast te stellen.
  4. Vast de ratten gedurende 12 uur voor de operatie met water toegankelijk.
  5. Verdoof SD-ratten met 2% isofluraan (zie materiaaltabel) in een lucht-zuurstofmengsel met 0,6 l/min. Bevestig de juiste verdoving door de huid van de ledematen met een tang af te knippen; Ratten mogen geen retractie of beenreflex hebben. Zet de volledig bewusteloze ratten vast op de operatietafel en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met behulp van een temperatuurmeter voor dieren. Plak hun ogen dicht tijdens de operatie om uitdroging te voorkomen.
  6. Verwijder de vacht rond de nek met een elektrisch scheerapparaat en desinfecteer de huid met betadine. Maak een incisie in de nek van 1,5 cm met een chirurgische schaar (zie materiaaltabel), voer een stompe dissectie uit op de spier en de perivasculaire fascia en leg de luchtpijp bloot om de juiste gemeenschappelijke halsslagader (CCA), de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA) te lokaliseren. Chirurgisch gereedschap moet worden gesteriliseerd om infectie te voorkomen.
  7. Ligate het distale uiteinde van de ECA met een 6-0surgicalsuture en plaats een andere chirurgische hechting losjes rond het proximale uiteinde van de ECA tot aan het bifurcatiepunt. Zorg ervoor dat u de nervus vagus niet beschadigt.
  8. Klem de CCA en ICA vast met vasculaire clips en maak een kleine incisie in de ECA tussen twee chirurgische hechtingen.
  9. Breng de monofilamenthechting in het ECU-lumen naar beneden in de richting van de CCA, span de chirurgische hechtdraad rond de ECU-stomp aan om de intraluminale hechting vast te zetten en bloedingen te voorkomen. Zorg ervoor dat de monofilamenthechting overeenkomt met het gewicht van het dier om schade te minimaliseren en een doelinfarctvolume van 40% op het ipsilaterale halfrond te bereiken.
  10. Snijd het resterende deel van de ECA af om de stronk vrij te maken en plaats de EVA-stomp onder het bifurcatiepunt zodat deze ongeveer in lijn is met de ICA.
  11. Verwijder de microvasculaire clip van de ICA, ga door met het verschuiven van de hechtdraad totdat een milde weerstand wordt gevoeld, wat de occlusie van de middelste hersenslagader aangeeft; Deze lengte is meestal ongeveer 2 cm. Bind de hechtdraad stevig om het monofilament heen. Verwijder de andere microvasculaire clip van de CCA.
  12. Sluit de incisie met een chirurgische hechting en plaats de rat in een herstelkooi, verzorg het dier tot 2 uur na de ischemie.

2. Herstel van de doorbloeding van de middelste hersenslagader

  1. Controleer vóór heranesthesie de neuroscore met de Longa-scoreschaal om het succes van de operatie te evalueren zoals beschreven in stap 3.
  2. Verdoof de rat zoals hierboven en open de incisie opnieuw. Plaats een microvasculaire clip op de CCA, trek de afsluitende hechtdraad gedeeltelijk terug van de ICA totdat het uiteinde van de hechtdraad zichtbaar is door de ICA.
  3. Plaats nog een microclip op de ICA boven de locatie van de intraluminale hechting, verwijder de afsluitende hechtdraad volledig en bind de ECA stomp af. Reperfusie gedurende 24 uur.
  4. Verwijder de clips van de CCA en ICA. Sluit de incisie met een chirurgische hechting. Buprenorfine (0,05 mg/kg; zie tabel met materialen) subcutaan toedienen.
  5. Zet de rat terug in de kooi, geef water en gepureerd voedsel en zorg ervoor totdat hij weer bij bewustzijn komt. Houd de lichaamstemperatuur van de ratten gedurende de gehele experimentele procedure op 37± 0,5 °C.

3. Beoordeling van de neuroscore

  1. Scoor neurologische defecten na de operatie en 24 uur na reperfusie met behulp van de Longa Score Scale11: (0) geen tekort; (1) het niet volledig uitstrekken van de linker (verlamde zijde) voorpoot; (2) naar links cirkelen (verlamde kant); (3) naar links vallen (verlamde kant); (4) geen spontaan lopen en verminderd bewustzijn; (5) dood.
    OPMERKING: Drie operators werden beoordeeld volgens de bovenstaande normen.

4. Verzameling van hersenweefsel

  1. Verzamel hersenweefsel 24 uur na reperfusie nadat neurologische defecten zijn gescoord en beoordeeld.
  2. Verdoof de rat zoals hierboven beschreven. Snijd de huid om het hoofd en de nek bloot te leggen en knip het cervicale koord van de cervicale wervelkolom af met een chirurgische schaar (zie materiaaltabel).
  3. Scheid en verwijder de achterste nekspieren. Verwijder de schedel voorzichtig met een gebogen tang (zie Tabel met materialen). Let op de dura bij het scheiden van de schedel om krassen op het hersenweefsel te voorkomen. Verwijder het hersenweefsel volledig.
  4. Plaats het hersenweefsel in TEM en IEM fixatief voorgekoeld bij 4 °C en bewaar het in de koelkast bij 4 °C.

5. Schijnvertoning

  1. Voer voor schijnoperaties alle procedures uit zoals hierboven, behalve dat de occlusie niet wordt uitgevoerd.

6. Voorbereiding en beeldvorming van ultradunne secties

  1. TEM voorbereiding van ultradunne secties
    1. Fixatie: Bepaal de bemonsteringsplaats van vers weefsel om mechanische schade zoals tractie, kneuzing en extrusie te minimaliseren en zorg ervoor dat de weefseldikte niet groter is dan 2 mm. Zorg ervoor dat het weefselvolume niet groter is dan 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Fixeer met TEM-fixatief bij 4 °C gedurende 24 uur. Was 3x gedurende 15 minuten in 0,1 M fosfaatbuffer PB (pH 7,4; zie materiaaltabel).
    3. Na fixatie: 1% osminezuur ·0,1 M PB (zie materiaaltabel) toevoegen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (25 °C).
    4. Uitdroging: Dehydrateer het weefsel achtereenvolgens in 30% ethanol gedurende 10 minuten, 50% ethanol gedurende 10 minuten, 70% ethanol gedurende 15 minuten, 90% ethanol gedurende 15 minuten, absolute ethanol gedurende 15 minuten en 100% aceton gedurende 15 minuten.
    5. Dompelen in gom: Dompel de tissues achtereenvolgens onder in de opgeloste epoxyhars SPI-Pon 812: aceton=1:3 gedurende 30 min, oplossing SPI-Pon 812: aceton = 1:1 gedurende 30 min, en oplossing SPI-Pon 812: aceton = 3:1 gedurende 1 uur (zie materiaaltabel).
    6. Polymerisatie en inbedding: Dompel het monster een nacht onder in zuiver SPI-Pon 812 bij 37 °C, wissel het gedurende 8 uur over op vers SPI-Pon 812 en polymeriseer gedurende 48 uur bij 60°C (zie materiaaltabel).
    7. Secties: Snijd het ingebedde blok halfdun op een dikte van 0,8 μm met een diamantmes, kleur met aminotolueen blauw bij 25 °C gedurende 5 min. Lokaliseer en selecteer gebieden met dicht opeengepakte neuronen met een lichtmicroscoop voor sterk vergrote waarneming. Maak ultradunne secties met een microtoom van 90 nm dikte. Leg de monsters op 200 mazen van gegoten koperen roosters (zie materiaaltabel).
    8. Nakleuring: Kleurrooster in uranylacetaat bij 25 °C gedurende 15 minuten en vervolgens kleurrooster in loodcitraat bij 25 °C gedurende 5 min.
  2. IEM voorbereiding van ultradunne secties
    1. Voer stap 6.1.1-6.1.4 uit.
    2. Dompelen in gom: Dompel de weefsels achtereenvolgens onder in de oplossing L. R. Witte hars: Ethanol = 1: 3 gedurende 2 uur, oplossing L. R. Witte hars: Ethanol = 1: 1 gedurende 2 uur, en oplossing L. R. Witte hars: Ethanol = 3: 1 gedurende 2 uur.
    3. Polymerisatie en inbedding: Dompel het monster een nacht onder in zuivere L. R. White Resin bij 4 °C, wissel over op verse L. R. White Resin gedurende 4 uur bij 25 °C en polymeriseer bij 55 °C gedurende 78 uur.
    4. Secties (zoals gedaan in stap 6.1.7): Snijd de ingebedde blokken halfdun af bij een dikte van 0,8 μm, kleur ze gedurende 5 minuten met aminotolueenblauw bij 25 °C. lokaliseer en selecteer gebieden met dicht opeengepakte neuronen met een lichtmicroscoop. Maak ultradunne secties met een dikte van 90 nm. Leg de monsters op koperen roosters.

7. Immunogold-etikettering

  1. Spoel 2x met PBS en 1x met glycinebuffer bij 25 °C gedurende elk 5 minuten, voeg vervolgens 2% fosfaatbuffer runderserumalbumine (PBS-BSA) toe en incubeer gedurende 30 minuten.
  2. Incubeer in de oplossing van het primaire antilichaam (polyklonaal antilichaam van konijnen tegen cytochroom C) bij 37 °C gedurende 2 uur. Het primaire antilichaam wordt verdund met PBS-BSA in een verhouding van 1:50.
  3. Spoel 5x 5x gedurende 5 minuten met PBS op 25 °C. Incubeer in de colloïdale, met goud gelabelde secundaire antilichaam (goudgeconjugeerde geit anti-konijn IgG) oplossing bij 25 °C gedurende 1 uur. Het secundaire antilichaam wordt verdund met PBS-BSA in een verhouding van 1:20 (zie materiaaltabel).
  4. Spoel 5x 5x gedurende 5 minuten met PBS op 25 °C. Spoel 5x 5x gedurende 5 minuten af met gedestilleerd water van 25 °C (zie materiaaltabel).
  5. Na het kleuren: Kleurroosters in uranylacetaat bij 25 °C gedurende 10 minuten en vervolgens kleurroosters in loodcitraat bij 25 °C gedurende 2 minuten (zie materiaaltabel).
  6. Maak foto's van het ultradunne gedeelte en maak foto's met een transmissie-elektronenmicroscoop bij 80 kV.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De neuroscore-evaluatie bevestigt het succes van MCAO, volgens de Longa Score Scale, ratten in de MCAO-groep presenteerden zich ten minste cirkelend naar links (neuroscore 2). Ratten van de schijnoperatiegroep vertoonden geen duidelijke neurologische disfunctie (neuroscore 0). Tijdens de operatiedag werd geen mortaliteit waargenomen. De neuroscore van de dieren staat vermeld in Tabel 1.

IEM-analyse van de MCAO-groep onthulde neuronen met gekro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het primaire doel van reperfusietherapie bij acute ischemische beroerte is het herstellen van de bloedperfusie naar het ischemische gebied. Nu kunnen we dit doel bereiken door middel van intraveneuze trombolyse, endovasculaire behandeling en antitrombotische therapie. Herstel van de bloedperfusie leidt echter tot ischemie-reperfusieschade, verergert neuronale necrose en apoptose, wat leidt tot neurologische stoornissen. Tijdens ischemie-reperfusie leidt abnormale lekkage van elektronen u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Special Scientific Research Project on Traditional Chinese Medicine van Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021MS414).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% normal salineSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.H20083400
200 Mesh formvar coated copper gridsZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g MCAO MonofilamentsBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Absolute ethanolChengdu Kelong Chemical Co.,Ltd.2023101201
acetoneChengdu Kelong Chemical Co.,Ltd.2023120501
Animal anesthesia systemRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Animal temperature maintainerRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Baking tableShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Bone shearFine Science Tools16102-11
capsular embedding moldsZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
CentrifugeSCILOGEXD3024R
Conventional bright-field optical microscopyZeiss (Germany)Primo Star
Curved ophthalmic forceps (10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.211001
Diamond knifeDiatome (Switzerland)DU4530
Dissecting forcepsRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Dissecting forcepsRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Electric blast drying ovenShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Electric shaverYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Fixation fluidSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
glass slideNantong Mevid Life Science Co., Ltd.220518001
Gold-conjugated Goat anti-rabbit lgGSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.D111094
Hemostatic forceps (12.5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Hemostatic forceps (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluraneRayward Life Technology Co., Ltd.2024071201
L. R. White ResinTianjin Tainuo Science and Technology Co., Ltd.AGR1281A
Lead citrateSPI (US)GA10701
Needle holder Jiachi Medical Technology Co., Ltd.10044036898028
Osmium tetroxideTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Rabbit polyclonal antibody to cytochrome c  Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
RatsBeijing Huafukang Biotechnology Co., Ltd.110322241102187881
SPI-Pon 812 embedding resin kitSPI(US)GS02660
StereomicroscopeSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Straight headed scissors (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Straight ophthalmic forceps (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.211001
Surgical scissorsRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Transmission electron microscopyHitachi (Japan), Ltd.HT7800
ultramicrotomeLeica(Germany)UC7
Uranium acetateSPI (US)GS02624

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cytochroom C vrijgaveeiwitlocatiecerebrale ischemieapoptose routeimmunogoudlabelingneuronale apoptosemitochondriale permeabiliteitratmodel
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen