Method Article

Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bevat een stapsgewijze handleiding voor de Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopische techniek, inclusief details over het genereren van de laserlichtbron, het voorbereiden van een weefselmonster, het uitvoeren van beeldvorming en het analyseren van de gegevens. SLAM bevordert niet-lineaire microscopie door vier complementaire labelvrije contrasten te meten om de micro-omgeving van het weefsel te onderzoeken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet-lineaire optische microscopie brengt biologische monsters in beeld door signalen te detecteren van de niet-lineaire interactie van ultrakorte laserpulsen met endogene moleculen. Deze methode maakt snelle chemische en structurele identificatie mogelijk met subcellulaire resolutie op een label- of tag-vrije en niet-destructieve manier, waardoor een krachtige benadering mogelijk wordt om cellen en weefsels te onderzoeken. Deze kenmerkende niet-lineaire contrasten omvatten multifoton-geëxciteerde autofluorescentie en harmonische generatie. Omdat elk van deze contrasten unieke voordelen en beperkingen biedt, bieden hun combinatie en hun spatiotemporele co-registratie een complementair contrastpalet dat de analytische mogelijkheden van niet-lineaire optische microscopie verbetert. Daarom ontwikkelde onze groep Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopie, een beeldvormingstechniek die vier of meer gelijktijdig gegenereerde niet-lineaire optische signalen meet, met als doel verschillende morfologische, metabole en functionele kenmerken in biologische monsters te identificeren. Hier presenteren we een protocol voor SLAM-beeldvorming van weefsels, met de nadruk op essentiële componenten van de techniek, waaronder de laserbron, pulscompressie en microscoop. Daarnaast bespreken we de monstervoorbereiding en schetsen we de gegevensverwerkingspijplijn voor SLAM-gegevens. De gepresenteerde workflow is geschikt voor het onderzoeken van de metabole toestand, rangschikking, cellulaire responsen en samenstelling van zowel menselijke als dierlijke weefsels zonder te vertrouwen op exogene labels.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niet-lineaire optische microscopie maakt gebruik van de respons van een preparaat op intense optische straling (licht met elektrische velden groter dan 3 × 103 V/cm) om beeldcontrast af te leiden, waarbij de geïnduceerde polarisatie (en dus het gegenereerde signaal) niet-lineair afhangt van de invallende intensiteit 1,2,3. Omdat deze meervoudige contrasten elk worden gemedieerd door verschillende licht-materie-interacties, biedt niet-lineaire microscopie gelijktijdige toegang tot unieke informatie over zowel de morfologie als het chemische landschap van een exemplaar 1,2,3. Terwijl traditionele microscopietechnieken met een lineaire interactie met het verlichtingslicht ook kwantitatieve beeldvorming mogelijk maken, maakt niet-lineaire microscopie een meer multimodale benadering mogelijk, vaak met een verbeterde beelddiepte en optische doorsnede, terwijl het ook minder fotoschade aan het monster veroorzaakt4. In de context van biomedische toepassingen, zoals intraoperatieve histologie-achtige evaluatie van weefsel 5,6, maakt deze techniek het mogelijk om natuurlijke biomoleculen direct te onderzoeken, waardoor naadloos onderzoek van levende cellen mogelijk wordt zonder dat er externe markers of modificaties nodig zijn. Deze benadering vermijdt het gebruik van tags, labels7, exogene moleculen, genetisch tot expressie gebrachte fluorescerende eiwitten of nanodeeltjes, die niet alleen uitgebreide arbeid vergen, maar ook het potentieel hebben om de inheemse biochemie van het monster te verstoren en een negatieve invloed te hebben op doelcellen of weefsels 8,9,10. De niet-lineaire microscoop dient dus als een krachtig en echt analytisch hulpmiddel dat continue beeldvorming van microscopisch kleine structuren biedt zonder de chemische en structurele integriteit van het monster te veranderen. Deze mogelijkheid opent een breed scala aan toepassingen, variërend van diagnose en ontdekking van geneesmiddelen tot celsignalering en systeembiologie.

Multifotoncontrasten zoals autofluorescentie met twee fotonen (2PAF), autofluorescentie met drie fotonen (3PAF), tweede harmonische generatie (SHG) en derde harmonische generatie (THG) bieden elk analytische voordelen bij het karakteriseren van monsters. 2PAF wordt gegenereerd door endogene flavines, waarbij flavine adenosinedinucleotide (FAD) het meest voorkomt in biologische systemen11. 3PAF maakt gebruik van nabij-infrarode excitatie om intrinsieke chromoforen zoals NAD(P)H te visualiseren en maakt metabole beeldvorming mogelijk terwijl UV-gerelateerde fototoxiciteit en verzwakkingsproblemen worden omzeild12. SHG onthult specifiek niet-centrosymmetrische moleculaire structuren zoals fibrillair collageen (type I, II en III) en eiwitarrays 13,14,15,16,17, wat structurele inzichten oplevert 1. Ten slotte blinkt THG, gevoelig voor interfaces en kleine structurele kenmerken, uit in het in beeld brengen van lipideverdelingen en extracellulaire blaasjes 18,19,20,21,22.

Elk van deze contrastsignalen is onafhankelijk onderzocht door onderzoeksgroepen, waardoor de niche voor multifoton niet-lineaire microscopie is gevestigd als een betrouwbaar en veelzijdig hulpmiddel voor biologische toepassingen 23,24,25,26. Deze inspanningen werden aangevoerd door de uitvinders van de 2PAF-microscoop, die hun innovatieve technologie gebruikten om nieuwe inzichten te krijgen in weefselmorfologie, celmetabolisme en zelfs de morfofunctionele kenmerken van pathologieën zoals de ziekte van Alzheimer en kanker23. Hun werk heeft uiteindelijk geleid tot baanbrekende toepassingen in de neurowetenschappen 27,28. In de daaropvolgende jaren benadrukten verschillende onderzoekers de gevoeligheid van de SHG voor veranderingen in de extracellulaire matrix, de steiger die structurele ondersteuning biedt aan cellen en die substantiële veranderingen ondergaat tijdens de pathogenese van kanker29. Met name Campagnola et al.14,24,30,31 toonden aan dat SHG-microscopie de visualisatie van macromoleculaire en supramoleculaire assemblages mogelijk maakt, waarbij details zoals de rangschikking, concentratie en het type collageen worden onthuld die niet detecteerbaar zijn met conventionele op fluorescentie gebaseerde technieken. Deze resultaten onderstreepten het potentieel van SHG-microscopie als een levensvatbaar diagnostisch hulpmiddel in klinische omgevingen. Ten slotte werd THG-microscopie met succes toegepast om retinale lagen bij knaagdieren te visualiseren met subcellulaire resolutie25, hersenstructuren in kaart te brengen32 en de multi-grensvlaktopografie van melanoomcelinvasie vast te leggen33.

Deze historische implementaties van niet-lineaire microscopie betroffen over het algemeen een mode-locked femtosecond (fs) laser gekoppeld aan een doel met een hoge numerieke apertuur (NA) om de niet-lineaire signalen te genereren en te verzamelen, die vervolgens met een dichroïsche spiegel naar een banddoorlaatfilter werden geleid en werden verzameld met een fotomultiplicatorbuis (PMT)34. Ondanks vergelijkbare implementaties waren de meeste applicaties gericht op het verwerven van slechts één of hooguit twee contrasten, terwijl ze de andere over het hoofd zagen. Om het potentieel van de multifotonmicroscoop volledig te benutten, implementeerden Boppart et al. eerst de sequentiële verwerving van meerdere niet-lineaire contrasten 21,35,36,37, gevolgd door hun gelijktijdige detectie 4,22,38,39,40,41. De resulterende techniek, bekend als Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopie, co-registreert ruimtelijk en tijdelijk de niet-lineaire 2PAF-, 3PAF-, SHG- en THG-signalen door middel van single-shot excitatie en multiplexdetectie, waardoor een superieur analytisch vermogen wordt bereikt. De spatiotemporele colokalisatie van deze vier kanalen levert hoog gerangschikte en feature-rijke gegevensop 42 die voordelen bieden ten opzichte van sequentieel verkregen gegevens door bewegingsartefacten te elimineren en te zorgen voor een betere beeldregistratie. Bijgevolg maakt SLAM het mogelijk om samengestelde kenmerken te genereren, zoals optische reductie-oxidatieverhoudingen, die metabolische eigenschappen effectief karakteriseren 43,44,45. Bovendien vergemakkelijkt de gecombineerde analyse van signalen over modaliteiten heen de engineering van extra functies op basis van de correlatie en colokalisatie van kanalen. Shi et al. toonden bijvoorbeeld het belang aan van de colokalisatiekenmerken van SLAM-microscopie bij het nauwkeurig classificeren van cellen van de Chinese hamster (CHO) die worden gebruikt in de farmaceutische productie42. Op deze manier legt SLAM de basis voor wat nu wordt beschouwd als de state-of-the-art op het gebied van multifotonmicroscopie, en maakt het de weg vrij voor toekomstige vooruitgang in het veld46.

In dit protocol schetsen we de belangrijkste componenten van een SLAM-microscoop (Figuur 1) en beschrijven we een stapsgewijze methodologie voor de implementatie ervan. Dit omvat het genereren en vormgeven van de excitatiepulsen, de voorbereiding van representatieve weefselmonsters, beeldvormingsprocedures en de verwerking, evenals de weergave van de resulterende gegevens. Door gebruik te maken van kant-en-klare technologie en gevestigde technieken, is dit protocol universeel, overdraagbaar en kan het gemakkelijk worden gereproduceerd met behulp van vergelijkbare optische systemen in verschillende laboratoria.

figure-introduction-1
Afbeelding 1: Het optische ontwerp van een gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multiharmonische (SLAM) microscoop. De femtosecondelaser geeft 1040 nm licht af in pulsen van 370 fs met een herhalingssnelheid van 10 MHz. De intensiteit en polarisatie van de laser worden zorgvuldig gecontroleerd voordat een fotonisch kristal wordt gepompt om een supercontinuüm te genereren. De pulsen worden vervolgens gecomprimeerd door een pulsvormer en naar een op maat gemaakte laserscanmicroscoop (gestippeld vakje) geleid. Dichroïsche spiegels en banddoorlaatfilters isoleren de niet-lineaire signalen die door het monster worden gegenereerd voordat ze worden gedetecteerd door hooggevoelige fotondetectoren zoals fotomultiplicatorbuizen (PMT's) of hybride fotodetectoren (HPD's). Optisch ontwerp is gebaseerd op een eerder beschreven systeem41. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierstudies werden uitgevoerd volgens het protocol UIUC#23031 dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Illinois en volgden strikt alle relevante richtlijnen en voorschriften.

1. Fotonische kristalvezel (PCF) splitsen en uitlijnen

  1. Snijd met behulp van vezelsnijders of draadknippers een stuk fotonische kristalvezel (PCF, Table of Materials) tot een lengte van iets meer dan 15 cm.
    NOTITIE: Aan elk uiteinde van de PCF worden lengtes van minimaal 1.5 cm gespleten, aangezien deze lengte nodig is om de PCF tijdens het splitsen stevig vast te klemmen. De uiteindelijke lengte van de PCF (12 cm) die in deze studie werd gebruikt, werd bepaald op basis van een eerdere simulatie met behulp van de gegeneraliseerde niet-lineaire Schrödingervergelijking47 en empirische tests. Over het algemeen kan de beste PCF-lengte variëren, afhankelijk van het PCF-type, de laserinvoer van de pomp en het gewenste supercontinuüm.
    LET OP: Draag tijdens het snijden van PCF persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) om de ogen en huid van de onderzoeker te beschermen. Gooi de vezelresten onmiddellijk weg in de afvalcontainer voor scherpe voorwerpen.
  2. Verwijder ongeveer 3 cm van de plastic coating van elk uiteinde van de PCF met behulp van een vezelstripper (Table of Materials) of scheermesje en reinig eventueel achtergebleven plastic met tissuepapier (Table of Materials) en 100% methanol.
  3. Plaats het ene uiteinde van de PCF in de houder op een precisiehakmes van optische vezels (Materiaaltabel) en lijn het mes uit op 1.5 cm van het uiteinde van de PCF. Sluit de klemmen voorzichtig en druk op de splijtknop .
    NOTITIE: Volg zorgvuldig de gebruikershandleiding van het vezelhakmes, inclusief specifieke richtlijnen voor het splijten van PCF's. De instellingen, zoals de vezelspanning, moeten mogelijk worden afgesteld voor consistente en hoogwaardige spleten voor elk type PCF.
  4. Inspecteer het gespleten vlak en de zijkant van de PCF met behulp van de geïntegreerde microscoop (vergroting 10×) op een werkstation voor het verwerken van glasvezels (materiaaltabel) en zorg ervoor dat de klif van goede kwaliteit is (Figuren 2A,C). Splits opnieuw als er vuil is (Figuur 2D), krassen (Figuur 2E), of als het gespleten oppervlak niet vlak is en loodrecht staat op de lengte van de PCF (Figuur 2B).
    NOTITIE: Bij deze stap en de volgende stappen moet uiterste voorzichtigheid worden betracht om te voorkomen dat de gespleten uiteinden van de PCF op een oppervlak worden aangeraakt om schade te voorkomen.
  5. Splits het tweede uiteinde van de PCF en zorg voor de gewenste uiteindelijke lengte.
    OPMERKING: De PCF die in dit protocol wordt gebruikt, wordt gesneden tot 12 cm.
  6. Inspecteer, net als bij de vorige stappen, het pas gespleten uiteinde van de PCF (zie stap 1.4). Als de spleet defect of inconsistent lijkt, gooi dan de huidige PCF weg en herhaal het proces met een nieuwe.
  7. Klem het invoeruiteinde van de PCF op een 3-assige tafel (materiaaltabel) bij ongeveer de brandpuntsafstand van de vezelkoppelingslens zoals gemeten met een liniaal. Ondersteun het andere uiteinde van de PCF stevig met een tijdelijke paal of houder.
    NOTITIE: Klem de uitgang nog niet vast om te voorkomen dat de PCF breekt tijdens de bruto-afstelling.
    LET OP: Het ondersteunen van het uitvoeruiteinde en het omringen met voldoende straalblokken is noodzakelijk om het risico op blootstelling aan laser te verminderen.
  8. Plaats een optische vermogensmeter (Table of Materials) in het straalpad net voor de PCF om het ingangsvermogen te meten. Zorg ervoor dat de femtosecondelaser (Materiaaltabel) wordt geblokkeerd door sluiter 1 voordat u de laser inschakelt.
    NOTITIE: Voltooi altijd alle vereiste trainingsprogramma's voor laserveiligheid om de risico's van lasergebruik te begrijpen.
    LET OP: Draag bij het gebruik van de laser een geschikte laserveiligheidsbril die speciaal is afgestemd op de golflengte en het vermogen van de gebruikte laser. Voordat u de laser gebruikt, verwijdert u alle sieraden, horloges en andere reflecterende voorwerpen die gevaarlijke verdwaalde reflecties kunnen veroorzaken.
  9. Zet de laser aan en laat hem opwarmen gedurende de door de laser gespecificeerde "koude opwarmtijd". Open sluiter 1 en pas het vermogen aan met behulp van de halve golfplaat (HWP1) net voor de polarisatiestraalsplitser totdat de vermogensmeter 260 mW of minder aangeeft.
    OPMERKING: Het gebruik van 260 mW voor uitlijning werd empirisch vastgesteld als laag genoeg om beschadiging van de PCF te voorkomen (zelfs als deze niet goed uitgelijnd was), terwijl het nog steeds een heldere straal biedt voor visualisatie op een IR-viewer of fluorescerend doel.
  10. Blokkeer de laser met sluiter 1 en verplaats de vermogensmeter naar het uitgangsuiteinde van de PCF.
  11. Deblokkeer de laser en pas de optische as van het PCF-invoervlak aan met behulp van de 3-assige fase totdat het signaal op de vermogensmeter verschijnt, wat aangeeft dat er wat licht is gekoppeld aan de kern, bekleding of plastic coating van de PCF. Als het positioneren van de PCF-ingang in het brandpunt van de straal buiten het bereik van de 3-assige trap ligt, blokkeert u de laser, past u de PC aan en klemt u deze opnieuw.
    OPMERKING: Een infrarood (IR) kijker of fluorescerend doel kan worden gebruikt om te visualiseren waar de straal is gefocusseerd.
  12. Pas met behulp van de 3-assige tafel één dimensie van de optische as van de PCF aan om het bereik te vinden waarover licht is gekoppeld, bereken het midden van dat bereik en verplaats de tafel daarheen. Herhaal dit voor de tweede dimensie om de straal ongeveer te centreren op de kern van de PCF.
    OPMERKING: De μm-vinkjes op de 3-assige tafel kunnen helpen bij het meten van afstanden en het vinden van het midden van de PCF.
  13. Pas de drie dimensies van de 3-assige trap iteratief aan in een herhalende volgorde, terwijl de koppelingsefficiëntie wordt geoptimaliseerd om de straal nauwkeurig te centreren en te focussen in de kern van de PCF.
    NOTITIE: Als de maximale koppelingsefficiëntie, zoals gemeten door de vermogensmeter, merkbaar lager is dan 80% van het ingangsvermogen, sluit sluiter 1, maak dan de PCF los en inspecteer deze op schade. Als de schade beschadigd is, start u opnieuw vanaf stap 1.1, anders blokkeert u de laser, klemt u de PCF opnieuw vast en start u de uitlijning opnieuw vanaf stap 1.11.
  14. Blokkeer de straal met sluiter 1 en verhoog het laservermogen tot 1,6 W.
    OPMERKING: Het gebruik van 1,6 W werd bepaald door middel van simulatie en empirische tests om een voldoende breed supercontinuüm te genereren, terwijl het onder de schadedrempel van de PCF bleef.
  15. Open sluiter 1 en pas opnieuw iteratief de 3-assige trap aan om de PCF-ingangslocatie aan te passen om de koppelingsefficiëntie te optimaliseren.
    OPMERKING: Empirisch gezien is de maximale efficiëntie doorgaans ongeveer 80%.
  16. Sluit sluiter 1 en klem de uitgang van de PCF vast op ongeveer de brandpuntsafstand van de parabolische spiegel. Plaats een balkblok aan de uitgang van de parabolische spiegel.
  17. Verlaag het laservermogen weer naar 260 mW of minder.
  18. Open sluiter 1 en gebruik de 3-assige tafel van de parabolische spiegel om de optische as van de parabolische spiegel uit te lijnen om vervorming van de straal te minimaliseren. Pas vervolgens de focus aan en collimeer de straal in het verre veld.
    OPMERKING: Gebruik een IR-viewer of fluorescerend doel om de uitgangsstraal te bekijken.
  19. Pas de spiegels na de parabolische spiegel aan om ervoor te zorgen dat de straal is uitgelijnd met de rest van het optische systeem.
    OPMERKING: Installeer permanente flip-uitlijndoelen of irissen om deze stap reproduceerbaar te maken.
  20. Sluit sluiter 1 en verhoog het laservermogen tot 1.6 W. Open sluiter 1 en controleer of het straalpad ongewijzigd is.
  21. Meet het uitgangsvermogen van de pulsvormer (materiaaltabel) met behulp van een vermogensmeter. Draai de halfgolfplaat voor de pulsvormer (HWP3) om de transmissie-efficiëntie van de pulsvormer te optimaliseren.

figure-protocol-1
Figuur 2: Gekloofde uiteinden van de fotonische kristalvezel (PCF). (EEN, TER) Afbeeldingen van de zijkant van de kloof. (C-F) Afbeeldingen van het gezicht van de klieven. (A) Een goed gespleten PCF heeft een plat en loodrecht vlak. (B) Een slecht gespleten PCF met een schuin en afgebroken vlak. (C) Een goed gespleten PCF met een schoon gezicht. (D) Een verkeerd behandelde PCF met vuil op het oppervlak. (E) Een slecht gespleten PCF met krassen op het oppervlak. (F) Een oude PCF die is vervangen. Er is zichtbare schade aan de kern van de PCF, zoals te zien is aan de donkere vlek in het midden van de PCF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Pulskarakterisering en -optimalisatie

  1. Meet met behulp van een spectrometer of optische spectrumanalysator (OSA, Table of Materials) de laser na de parabolische spiegel om de supercontinuümgeneratie van de PCF te verifiëren.
  2. Draai de halve golfplaat na de polariserende straalsplitser (HWP2) om de breedte van het supercontinuüm te optimaliseren.
  3. Schakel de microscopie-autocorrelator in (Materiaaltabel). Stel met behulp van de software de detector in op de interne detector en stel het scanbereik in op 5 ps om ervoor te zorgen dat de volledige breedte van de pulsautocorrelatie wordt vastgelegd.
    OPMERKING: Voor opstellingen met langere pulsbreedtes (bijvoorbeeld als gevolg van dispersie in een lange PCF), moet het scanbereik op de juiste manier worden vergroot. Houd er rekening mee dat de pulsbreedte gemeten door een intensiteitsautocorrelator niet de werkelijke pulsduur is, maar het kan nog steeds dienen als een nuttige referentie voor pulscompressie. Voor een nauwkeurige en volledige karakterisering van zowel de pulsamplitude als de fase moeten spectraal opgeloste technieken zoals Frequency-Resolved Optical Gating (FROG)48 worden gebruikt.
  4. Deblokkeer de laser en lijn de autocorrelator uit met de straal die de pulsvormer verlaat totdat er een signaal verschijnt.
    OPMERKING: Het plaatsen van tijdelijke spiegels (twee aan de ingang en twee aan de uitgang van de autocorrelator) maakt het mogelijk om de straal uit te lijnen met de autocorrelator zonder de rest van het optische systeem te beïnvloeden.
  5. Zorg ervoor dat sluiter 2 gesloten is en breng het juiste dompelmedium (zoals water of olie) aan op de objectieflens (materiaaltabel). Plaats de externe detector van de autocorrelator op de microscooptafel (materiaaltabel) en pas de tafel aan om de detector direct boven het objectief te plaatsen.
    OPMERKING: In tegenstelling tot typische microscoopobjectieven, zijn de aanbevolen objectieven die worden gebruikt voor SLAM-microscopie ultraviolet doorlatend om de detectie van THG38 te verbeteren.
  6. Zet de spiegels van de scangalvanometer (Materiaaltabel) aan om hun voltage op nul te zetten. Open de sluiter en gebruik een IR-viewer of fluorescerend doel om te controleren of de straal de externe detector bereikt.
  7. Stel de autocorrelatordetector in op de externe detector. Pas de positie van de stage aan totdat het signaal verschijnt.
    NOTITIE: Als de detector verzadigd is, verlaagt u het vermogen met behulp van het neutrale-dichtheidsfilter.
  8. Pas de polynomiale coëfficiënten (dispersievolgordes) van de pulsvormer aan om de pulsbreedte die door de autocorrelator wordt gemeten iteratief te minimaliseren. Verklein het scanbereik van de autocorrelator op de juiste manier naarmate de pulsbreedte afneemt om de nauwkeurigheid en visualisatie van de autocorrelatiefunctie te verbeteren.
    OPMERKING: De optimale pulsbreedte zoals gemeten met een Gaussiaanse pasvorm moet enkele tientallen femtoseconden (fs) zijn.

3. Voorbereiding van het monster

OPMERKING: Voor de eenvoud beschrijft dit protocol ex vivo weefselbeeldvorming. Vanwege het labelvrije karakter van SLAM kunnen in vivo beeldvormingsprocedures echter gemakkelijk worden aangepast38.

  1. Euthanasie van het dier via CO2 -verstikking of een andere door de IACUC goedgekeurde euthanasiemethode.
  2. Oogst het (de) betreffende orgaan(en) met behulp van standaard necropsieprocedure49 binnen 10 minuten na de autopsie en spoel af met voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed te verwijderen.
    OPMERKING: In deze studie werden de lever en longen geoogst.
  3. Ontleed het orgaan verticaal of horizontaal met behulp van een mes, afhankelijk van de vereiste oriëntatie voor analyse. Zorg ervoor dat de dissectie met precisie wordt uitgevoerd om de integriteit van de weefselstructuur te behouden.
  4. Plaats het stukje weefsel in een steriel weefselkweekschaaltje gevuld met fenol roodvrije complete celkweekmedia. Koel het weefsel in de koelkast bij 4 °C als u niet onmiddellijk afbeeldingen verzamelt.
    OPMERKING: De celkweekmedia die in deze studie werden gebruikt, waren HEPES gebufferd-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 4 mM glutamine en supplementen met endotheelcelgroeimedium (Materiaaltabel). Dit medium werd zorgvuldig gekozen om de fysiologische levensvatbaarheid van de epitheel- en endotheelcellen die zich in het nierweefselmonster bevinden tijdens de beeldvormingsduur50 te behouden.
  5. Om fluorescentiekalibratiestandaarden op te stellen, zet u een precisieweegschaal op nul op het gewicht van een antistatische weegboot en meet u ongeveer 5 mg flavinadenine-dinucleotidedinatriumzout (FAD, Table of Materials) of 5 mg gereduceerd nicotinamide-adenine-dinucleotidedinatriumzout (NADH, Table of Materials).
  6. Gebruik een enkelkanaals pipet om een geschikt volume van 1 M HEPES-buffer te doseren in de weegschalen met voorgewogen FAD- of NADH-poeders om 5 mM stockoplossingen te bereiden. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om het poeder op te lossen.
  7. Bereid 1 mM werkoplossing uit de voorraadoplossingen door 1:5 verdunning in de HEPES-buffer.
    OPMERKING: De werkconcentratie van 1 mM die in dit onderzoek werd gebruikt, werd empirisch bepaald om een hoog signaal te produceren en tegelijkertijd detectorverzadiging te vermijden.
  8. Bewaar de voorraad FAD- en NADH-oplossingen in microcentrifugebuisjes bij 4 °C.
    OPMERKING: Oplossingsstandaarden kunnen enkele dagen gekoeld worden bewaard, maar het wordt aanbevolen om voor elk experiment verse oplossingen te bereiden.
  9. Vlak voor het verzamelen van SLAM-microscopiebeelden, plaatst u de weefselmonsters in beeldvormingsschalen met glazen bodem van 35 mm (Materiaaltabel). U kunt ook een glazen dekglaasje gebruiken. Verdeel de FAD- en NADH-oplossingen in identieke schalen of dekglaasjes.
    OPMERKING: Ongecoat glas of poly-D-lysine gecoat glas wordt sterk aanbevolen vanwege het verminderde achtergrondsignaal. Zorg ervoor dat de glasdikte geschikt is voor het microscoopobjectief dat wordt gebruikt (in dit onderzoek werd #0 gebruikt).

4. SLAM-installatie en -bediening

  1. Controleer of de laserinvoer naar de PCF wordt geblokkeerd door sluiter 1 en schakel de laser in. Laat de laser opwarmen gedurende de opgegeven "koude opwarmtijd" van de laser.
    OPMERKING: In dit onderzoek wordt 30 minuten koude opwarmtijd gebruikt voor de laser.
  2. Controleer of het straalpad vrij is van obstakels en plaats een optische vermogensmeter in het straalpad net voor de PCF. Open sluiter 1 en meet het ingangsvermogen.
  3. Sluit sluiter 1 en verplaats de vermogensmeter naar de uitgang van de PCF na de parabolische spiegel. Open sluiter 1 en maximaliseer de PCF-output met behulp van de ingang 3-assige trap.
  4. Laat de PCF 10 minuten opwarmen en maximaliseer dan het uitgangsvermogen opnieuw. Registreer de overdracht van de PCF. Als de transmissie onder de 50% komt, vervang dan de PCF.
    NOTITIE: Tijdens het gebruik van de SLAM-microscoop (in de volgende stappen) wordt aanbevolen om elk uur het uitgangsvermogen van de PCF te meten om consistente gegevens te garanderen.
  5. Verplaats de vermogensmeter achter het ND-filter (Neutral Density) en draai het filter om het laservermogen te regelen dat het monster bereikt.
    OPMERKING: Vermenigvuldig het gemeten vermogen met de doorlaatbaarheid van de overige optische componenten. De doorlaatbaarheid wordt gemeten door de vermogensmeter achter de objectieflens te plaatsen. Voor dit onderzoek werd een gemiddeld laservermogen van 20 mW bij het monster gebruikt. Het laservermogen werd empirisch bepaald voor het gegeven monster, de beelddiepte en het microscoopsysteem om beelden van hoge kwaliteit te genereren en tegelijkertijd schade aan het monster of niet-lineariteit van de detector te voorkomen. Hoewel er geen definitieve standaard is, is typische labelvrije multifotonbeeldvorming beperkt tot enkele tientallen tot honderden milliwatts 7,32,33,51,52.
  6. Zet de galvanometers en het podium aan. Open de acquisitiesoftware en voer de gewenste parameters voor beeldvorming in.
    OPMERKING: In dit onderzoek werden 512 × 512 pixels en een pixelverblijftijd van 13,65 μs gebruikt om een gezichtsveld van 360 × 360μm2 in beeld te brengen. Vijf frames die met 0,333 Hz zijn gemaakt, werden gemiddeld tot één frame van hoge kwaliteit.
  7. Plaats het monster op de objecttafel met behulp van de geschikte dompelmedia voor het objectief, zoals eerder in stap 2.5 is gebruikt.
  8. Doe de kamerverlichting uit en sluit de gordijnen.
    NOTITIE: Om beschadiging van detectoren te voorkomen, mag u nooit kamerverlichting inschakelen terwijl de detectoren aan zijn of de luiken van de detector open staan.
  9. Schakel de voedingen en versterkers van de detector in.
  10. Sluit de lichtbak rond het podium.
  11. Gebruik de elektronische bedieningsschakelaars om de luiken van de detector handmatig te openen (S3, S4, S5, S6).
  12. Klik in de microscoopacquisitiesoftware op Klik om acquisitie te starten om te beginnen met het verzamelen van SLAM-beelden. Pas de scherpstelling van de microscoop aan door aan de knop op de microscoopstagecontroller (Materiaaltabel) te draaien totdat het monster scherp wordt.
    OPMERKING: Het glazen dekglaasje genereert een sterk THG-signaal, dat kan worden gebruikt om de beelddiepte nauwkeurig te bepalen met behulp van de stagepositie die wordt weergegeven op de microscoopstagecontroller. Alle foto's van oplossingsstandaarden die in dit onderzoek zijn gemaakt, zijn bijvoorbeeld genomen op een brandvlak 20 μm boven het dekglaasje.
  13. Gebruik de joystick op de microscooptafelcontroller om het gewenste gezichtsveld in het monster te zoeken en klik vervolgens op Stoppen en resetten.
    OPMERKING: Als het beeld verzadigd is, keert u terug naar stap 4.5 en verlaagt u het stroomverbruik. Als het beeld een signaal-ruisverhouding van minder dan 10 heeft, kan het vermogen in plaats daarvan voorzichtig worden verhoogd.
  14. Klik op het tabblad Opslaan op Gegevens opslaan om deze in te stellen op Ja en klik vervolgens op Klik om acquisitie te starten. Wacht tot de overname is afgerond voordat u verder gaat.
  15. Om het monster tijdens de beeldvorming te veranderen of te manipuleren, sluit u de detectorluiken en gebruikt u een zaklamp of hoofdlamp voor licht. Zodra het monster is gewijzigd, keert u terug naar stap 4.10.
    OPMERKING: Om herhaalbaarheid en kwantitatieve analyse mogelijk te maken, verzamelt u SLAM-afbeeldingen van FAD- en NADH-oplossingsstandaarden. Zorg ervoor dat het gezichtsveld, de beeldgrootte en het excitatievermogen overeenkomen met wat is gebruikt voor de biologische monsters.
  16. Om de SLAM-beeldacquisitie te beëindigen, sluit u de luiken van de detector en schakelt u de detectoren uit voordat u de kamerverlichting inschakelt.
  17. Blokkeer de laser met sluiter 1 en schakel vervolgens de laser uit.
  18. Zet de galvanometers en de trap uit. Sluit de microscoopacquisitiesoftware.
  19. Gooi het zakdoekje op de juiste manier weg en maak de werkplek schoon.

5. Visualisatie van gegevens

OPMERKING: De volgende beeldanalyse kan plaatsvinden in een beeldanalysesoftware zoals ImageJ53 (Table of Materials) of een programmeertaal met mogelijkheden voor beeldanalyse, zoals Python of MATLAB. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u gegevensvisualisatie uitvoert met behulp van ImageJ.

  1. Zorg ervoor dat de afbeeldingen van elk kanaal een verliesvrije afbeeldingsindeling hebben (bijv. TIFF of PNG).
    OPMERKING: De aangepaste microscoopbesturingssoftware die in dit onderzoek is gebruikt, slaat afbeeldingen automatisch op als TIFF's. Als u een afbeelding wilt opslaan als een TIFF, opent u deze in ImageJ en selecteert u Bestand > Opslaan als > Tiff.
  2. Om verlichtingsstandaardafbeeldingen te genereren, opent u de FAD- en NAD(P)H-kanaalafbeeldingen van respectievelijk FAD- en NADH-oplossingen in ImageJ. Selecteer voor elke afbeelding Proces > filters > Gaussiaans vervagen..., stel Sigma (straal) in op 41 en klik vervolgens op OK.
    OPMERKING: Pas de Sigma (Straal) van het Gaussiaanse filter naar behoefte aan om het beeld voldoende vloeiend te maken.
  3. Om tegelijkertijd ongelijkmatige verlichting te corrigeren en de fluorescentie-intensiteit te normaliseren, opent u de FAD- en NAD(P)H-kanaalafbeeldingen van het monster. Selecteer voor elke afbeelding Proces > Image Calculator..., selecteer voor Afbeelding1 de voorbeeldafbeelding, selecteer voor Bediening de optie Delen en selecteer voor Afbeelding2 de standaardafbeelding voor verlichting die overeenkomt met het kanaal van de voorbeeldafbeelding en klik vervolgens op OK.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor het corrigeren van systeemvariabiliteit en het behouden van consistentie in kwantitatieve evaluaties van autofluorescentie, zoals de optische redoxratio (ORR).
  4. Als er meerdere foto's worden gemaakt om een groter gezichtsveld of z-stack te vormen, voegt u de afbeeldingen samen tot één afbeelding of stapel afbeeldingen.
  5. Om een ORR-afbeelding te genereren, telt u eerst de FAD- en NAD(P)H-afbeeldingen op. Selecteer Proces > Image Calculator..., selecteer voor Image1 en Image2 respectievelijk de FAD- en NAD(P)H-kanaalafbeeldingen, selecteer voor Bewerking de optie Toevoegen en klik vervolgens op OK. Als u de ORR-afbeelding wilt berekenen, selecteert u Process > Image Calculator..., selecteert u voor Image1 de FAD-kanaalafbeelding, selecteert u Operation de optie Divide, en selecteert u voor Image2 het resultaat van de som van FAD en NAD(P)H en klikt u vervolgens op OK.
  6. Als u een kleurenmap op de ORR-afbeelding wilt toepassen, selecteert u Afbeelding > Kleur > LUT bewerken, klikt u op Openen, selecteert u het gewenste bestand in de opzoektabel (.lut) en klikt u op OK. Selecteer Afbeelding > Pas > Helderheid/contrast aan en pas het contrast naar wens aan.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een isoluminante kleurenkaart te gebruiken, zoals de (omgekeerde) CET-I254,55 kleurenkaart die in dit onderzoek is gebruikt. Als u een kleurenmap in ImageJ wilt omkeren nadat u deze op een afbeelding hebt toegepast, selecteert u Afbeelding > Kleur > LUT's omkeren.
  7. Om de helderheid van de kenmerken in het ORR-beeld te verbeteren, schaalt u de helderheid op basis van de intensiteit van de fluorescentiekanalen. Selecteer eerst het resultaat van de som van FAD en NAD(P)H en selecteer Proces > Contrast verbeteren..., zorg ervoor dat Normaliseren is aangevinkt en klik vervolgens op OK. Selecteer Bewerken > Kopiëren om dit resultaat naar het klembord te kopiëren. Selecteer vervolgens de ORR-afbeelding en selecteer Afbeelding > Type > RGB-kleur" en selecteer vervolgens Afbeelding > Type > HSB (32-bits). Verplaats de schuifregelaar onder aan de afbeelding helemaal naar rechts om het helderheidskanaal weer te geven, selecteer Bewerken > plakken en selecteer vervolgens Afbeelding > Type > RGB-kleur.
  8. Als u de SLAM-afbeelding als een composiet wilt visualiseren, opent u de vier SLAM-kanalen in ImageJ en selecteert: Afbeelding > kleur > Kanalen samenvoegen... Selecteer voor C2 (groen) de SHG-kanaalafbeelding, voor C5 (cyaan) selecteert u de NAD(P)H-kanaalafbeelding, voor C6 (magenta) selecteert u de THG-kanaalafbeelding en voor C7 (geel) selecteert u de FAD-kanaalafbeelding. Zorg ervoor dat Samenstelling maken is aangevinkt en klik op OK.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De complexe multichannel, multimodale benadering van de SLAM-microscoop (Figuur 1) kan het voor nieuwe gebruikers moeilijk maken om problemen op te lossen en de resultaten te begrijpen. Ten eerste heeft een goed gespleten PCF een schoon oppervlak (Figuur 2C) met een plat oppervlak dat loodrecht staat op de lengte van de PCF (Figuur 2A). Een schuin, afgebroken splijtvlak (Figuur ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genereren van een geschikt supercontinuüm is cruciaal voor succesvolle SLAM-beeldvorming, maar het kan een uitdaging zijn vanwege de complexiteit van het instellen van de PCF. Zorgen voor nauwkeurig splijten en zorgvuldig omgaan met de PCF is essentieel om schone oppervlakken vrij te houden van puin, vuil of krassen, die allemaal een effectieve koppeling, supercontinuümgeneratie kunnen verstoren en zelfs de levensduur van de PCF kunnen verkorten. Aangezien de PCF regelmatig moet word...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor de apparatuur die in deze studie werd gebruikt, werd gedeeltelijk verstrekt door GSK via het Center for Optical Molecular Imaging van het Beckman Institute for Advanced Science and Technology. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door het NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) en het NSF Science and Technology Center for Quantitative Cell Biology. K.K.D.T werd ondersteund door het NIEHS Research Training Program in Toxicology and Environmental Health (5T32ES007326-25), ADC werd ondersteund door het Beckman Institute for Advanced Science and Technology Postdoctoral Fellows-programma en AH werd ondersteund door het NIBIB Tissue Microenvironment Training Program (T32EB019944). De auteurs danken Darold Spillman voor zijn beheer van laboratoriumruimtes, apparatuur en technologie en danken Drs. Janet E. Sorrells en Rishyashring R. Iyer voor hun eerdere bijdragen aan het SLAM-microscoopsysteem dat in deze studie is gebruikt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-axis stageThorLabsMAX316Discontinued.
35 mm glass bottom imaging dishMatTekP35G-0-14-CUncoated #0 coverglass.
DMEMGibco21063029High glucose, HEPES, no phenol red.
Endothelial cell growth medium supplementsPromoCellC-39210Omit Fetal Calf Serum.
FemtoTrain femtosecond laserSpectra-Physics1040-5Average Power: >5.0 W, Pulse Energy: >500 nJ, Wavelength: 1040 nm ±8 nm, Repetition Rate: 10 MHz, Pulse Width (FWHM): <220 fs.
Fetal Bovine SerumCytivaSH30071.03HyClone Characterized.
Fiber stripperThorLabsT10S13
Flavin adenine dinucleotide disodium salt hydrateSigma-AldrichF6625
Galvanometer mirrorsCambridge Technology6215HDiscontinued.
Glass processing workstationVytranGPX3800
ImageJEliceiri lab at the University of Wisconsin MadisonVersion 2.16.0FIJI Distribution.
Kimwipe tissue paperKimberly-Clark Professional34120
L-GlutamineCytivaSH30034.01
Microscope stageApplied Scientific InstrumentationFTP-2050
Microscope stage controllerApplied Scientific InstrumentationMS-2000-500-UDSW
Microscopy autocorrelatorAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Objective lensOlympusXLPLN25XWMP2Water immersion, 25X magnification, 1.05 NA.
Optical power meterNewport919P-003-10600 - 1700 nm.
Optical spectrum analyzerThorLabsOSA202C
Photonic crystal fiberNKT PhotonicsLMA-PM-15 NKTLarge mode area, polarization maintaining. Core Diameter: 15 µm.
Precision optical fiber cleaverFujikuraCT-101
Pulse shaperBiophotonics Solutions Inc.FemtoJock-DDiscontinued.
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrateSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles