Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

22 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van maternale mutant dat een stabiele zpc:cas9 knock-in-lijn koppelt aan Tol2-gemedieerde afgifte van sgRNA-expressiecassettes.

Samenvatting

Oögenese en vroege embryonale ontwikkeling zijn kritisch afhankelijk van maternale afgeleide mRNA's en eiwitten. Het elimineren van deze maternale factoren vereist homozygote mutaties in vrouwelijke zebravissen, wat vaak resulteert in dodelijke of onvruchtbare fenotypes, die de verwerving van maternale mutante embryo's voorkomen. Ons eerdere werk introduceerde een snelle aanpak om zygote letaliteit te omzeilen door middel van eicelspecifieke genoombewerking. Het eerder gerapporteerde cas9-transgen vertoont echter instabiliteit en ondergaat geleidelijke uitschakeling over opeenvolgende generaties. Bovendien belemmert de aanwezigheid van Tol2-transponeerbare elementen die de zpc:cas9-cassette in deze lijn flankeren het potentieel voor verdere sgRNA-transgenese met behulp van het Tol2-systeem, dat momenteel het meest efficiënte transgene systeem in zebravissen is. Daarom is er een kritieke behoefte aan een Tol2-vrije zebravislijn die zorgt voor een stabiele en robuuste eicelspecifieke Cas9-expressie. Hier presenteren we een regel met zpccas9 knock-in op de rbm24a-locus die aan deze vereiste voldoet. Met behulp van deze verbeterde tool bieden we een pijplijn voor de snelle generatie van maternale mutanten van genen met zygotisch letale mutante fenotypes binnen het zebravismodel.

Inleiding

De vroege embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren is sterk afhankelijk van het RNA en de eiwitten die in het ei zijn opgeslagen, gezamenlijk aangeduid als maternale factoren. Deze maternale producten worden voornamelijk gesynthetiseerd tijdens het diploteenstadium van meiose I 1,2,3. Om hun functionele rol te onderzoeken, is het essentieel om homozygote mutante vrouwelijke individuen te genereren, aangezien alleen homozygote mutaties in de eicellen deze maternale factoren volledig kunnen uitputten. Het verkrijgen van dergelijke homozygote mutante vrouwtjes wordt echter een uitdaging wanneer zygote homozygote mutaties resulteren in letaliteit of steriliteit 4,5. Dit vormt een belangrijke barrière voor het ophelderen van de functies van maternale producten die worden gecodeerd door zygote, letale of steriele genen. Om deze technische beperking te overwinnen, zijn verschillende innovatieve benaderingen ontwikkeld 6,7,8. Toch hebben deze technieken vaak te kampen met langere experimentele tijdlijnen of substantiële technische uitdagingen.

In ons eerdere werk hebben we ook een voorwaardelijke knock-outstrategie ontwikkeld die het mogelijk maakt om maternale mutanten binnen een enkele generatiete genereren 9,10. Het systeem bestaat uit twee belangrijke componenten: Tg(zpczcas9) transgene zebravis en een I-SceI transgeen plasmidesysteem dat 3-4 sgRNA-expressiecassettes herbergt. Door gebruik te maken van dit systeem hebben we met succes voorwaardelijke knock-out van maternale factoren in eicellen 9,10 bereikt, maar er is nog ruimte voor verbetering. Ten eerste was de genoombewerkingsefficiëntie van de eerder gerapporteerde Tg(zpczcas9) transgene lijn niet stabiel in het handhaven van de transgene expressie van Cas9. Bovendien, aangezien deze transgene lijn is gegenereerd met behulp van het Tol2-transposonsysteem, kan Tol2-transpositie niet verder worden gebruikt voor de integratie van de sgRNA-expressiecassette; in plaats daarvan is een I-SceI-gemedieerde transgenese vereist. Deze aanpak is echter minder efficiënt dan Tol2 en is ook gevoeliger voor transgenerationele silencing.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we geprobeerd een knock-in-lijn op te zetten die robuuste en stabiele eicelspecifieke Cas9-expressie mogelijk maakt. Deze lijn maakt het gebruik van het Tol2-transposonsysteem mogelijk voor de zeer efficiënte afgifte van sgRNA-expressieplasmiden in zebravissen. Door gebruik te maken van een op intron gebaseerde genoombewerkingsstrategie11, hebben we met succes een zpccas9-knock-in-lijn gegenereerd met de geïntegreerde site in het laatste intron van het rbm24a-gen (Figuur 1A,B). We kozen deze locus als een kandidaat-genomische veilige haven voor maternale transgenexpressie op basis van twee onafhankelijke waarnemingen. 1) Onschadelijke integratie: in onze recente studie12 bleven homozygote knock-in vissen die exogeen DNA op deze plaats droegen volledig levensvatbaar en vruchtbaar. 2) Robuuste expressie: wanneer een zpccas9-cassette op dezelfde locus werd ingebracht, werd Cas9 op hoge niveaus tot expressie gebracht, wat een consistent sterke genoombewerkingsefficiëntie opleverde over generaties heen (Figuur 1C). Als kerncomponent van kiemplasma werkt het RNA-bindende eiwit Rbm24a samen met Buc om kiemplasma-RNA's op te nemen in kiemkorrels. Bijgevolg leidt maternale Rbm24a-deficiëntie tot een volledige afwezigheid van primordiale kiemcellen (PGC's)12. Hier, door rbm24a als voorbeeld te nemen in ons recente werk, bieden we een verbeterd videoprotocol voor het genereren en karakteriseren van maternale mutanten voor zygote letale genen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen en werden ethisch goedgekeurd door het Institutional Animal Care Committee van de Universiteit van Shandong (goedkeuring nr. SYDWLL-2021-15). Het overzicht van dit protocol is weergegeven in Figuur 2.

1. Genereren van de rbm24a-RFP zpc:cas9 knock-in lijn

  1. Scherm van sgRNA voor knock-in
    1. Selecteer en synthetiseer knock-in sgRNA-kandidaten
      1. Dien de sequentie van het laatste intron van rbm24a in bij CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) om optimale sgRNA-kandidaten te identificeren die zowel hoge CRISPRscan-scores vertonen (indicatief voor on-target efficiëntie) als lage CFD-scores (als gevolg van off-target effecten). Synthese van de lange oligo voor elk sgRNA (sgRNA oligo).
        OPMERKING: CRISPRscan genereert sgRNA-oligo's die essentiële functionele elementen bevatten, waaronder de T7-promotorsequentie, de 20-nucleotide sgRNA-doelsequentie en een 16-nucleotide sgRNA-scaffold-sequentie. Hier hebben we een sgRNA geselecteerd met de volgende sequentie: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3" (T7 promotor kleine letters, 20-nt guide hoofdletters, gedeeltelijke steiger kleine letters).
      2. Om de DNA-sjabloon voor sgRNA-synthese te verkrijgen, bereidt u 50 μL Fill-in PCR-reactie voor: 2x Taq Master-mix 25 μL; sgRNA-primer (10 μM) 2 μL; Universele primer (10 μM) 2 μL; Gedeïoniseerd H2Ø 21 μL.
        OPMERKING: De sequenties van alle primers worden weergegeven in de materiaaltabel.
      3. Meng grondig en breng het reactiemengsel over naar een voorgeprogrammeerde thermische cycler en start het versterkingsprotocol met behulp van de cyclusparameters als volgt: 1 cyclus bij 94 °C gedurende 3 min, 35 cycli (94 °C gedurende 15 s, 50 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 30 s) en 1 cyclus bij 72 °C gedurende 5 min.
      4. Bereid het reactiemengsel voor sgRNA-synthese voor in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml; combineer alle componenten bij kamertemperatuur in de volgende volgorde: 11 μL gedestilleerd water, 2 μL ATP/GTP/CTP/UTP (elk 10 mM), 10 μL PCR-product, 4 μL 10x RNA-polymerasereactiebuffer, 2 μL T7 RNA-polymerase en 1 μL RNase-remmer. Het totale reactievolume is 40 μL. Meng grondig door te tikken en voer een korte centrifugatie uit.
      5. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C. Voeg 1 μL DNase I toe, meng door te flikkeren en centrifugeer kort. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om ervoor te zorgen dat het DNA-sjabloon volledig wordt verwijderd.
      6. Voeg 5 μL silica magnetische kralen toe, gevolgd door 120 μL (4x volume) RNA-bindingsbuffer (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05%, ethanol 100 ml). Meng grondig door te pipetteren. Incubeer op een thermomixer bij 1.500 tpm gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Plaats de buis op een magnetische standaard en verwijder het bovenstaande voorzichtig met behulp van een pipet of vacuümsysteem.
      8. Voeg 400 μL 90% ethanol en vortex toe om de kralen opnieuw te suspenderen. Plaats de buis op de magnetische standaard en gooi de supernatant weg.
      9. Herhaal de stappen voor het wassen van ethanol om in totaal twee wasbeurten te voltooien.
      10. Verwijder achtergebleven supernatant en laat de geopende buis gedurende 10 minuten aan de lucht drogen op een verwarmingsblok van 50 °C.
      11. Voeg 15 μL nucleasevrij water toe en incubeer op een thermomixer bij 1.500 tpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      12. Plaats de buis op de magnetische standaard en breng het eluaat over in een nieuwe microcentrifugebuis.
      13. Bevestig de 98 bp sgRNA-band door middel van agarose-elektroforese. Kwantificeer de RNA-concentratie met behulp van een microspectrofotometer en agarose-elektroforese, label duidelijk en bewaar bij -20 °C.
    2. Test de efficiëntie van sgRNA
      1. Om de werkelijke efficiëntie van sgRNA's te bepalen, bereidt u het ribonucleoproteïne (RNP)-complex voor op micro-injectie. Meng 1 μL van elk sgRNA (50 ng/μL eindconcentratie) met 1 μL Cas9-eiwit (100 ng/μL eindconcentratie) op ijs door te pipetteren. Lever 2 nL van het RNP-complex toe aan elk embryo in het stadium van één cel door middel van micro-injectie.
      2. Verzamel 24 uur na de bevruchting (hpf) 10 embryo's voor elke geïnjecteerde Cas9 RNP in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en verwijder voorzichtig overtollig medium. Voeg 100 μL 50 mM NaOH (10 μL per embryo) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 95 °C met behulp van een verwarmingsblok of thermocycler. Neutraliseer het lysaat door 10 μL 1 M Tris-HCl (pH 7,0) toe te voegen.
      3. Gebruik het geneutraliseerde embryolysaat direct als sjabloon voor PCR-amplificatie. Ontwerp primers om een fragment te amplificeren dat de doellocatie bevat met flankerende sequenties van ≥100 bp aan beide zijden. Verifieer PCR-producten door middel van agarosegelelektroforese en zuiveren met gelextractie indien nodig. Uitvoeren van Sanger-sequencing van de versterkte producten.
      4. Kwantificering van de efficiëntie van CRISPR-bewerking: analyseer sequentiechromatogrammen met behulp van de ICE-analysetool (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normaliseer de bewerkingsefficiëntie ten opzichte van niet-geïnjecteerde controlemonsters volgens de protocollen die door de website worden aanbevolen.
  2. Constructie van een donorplasmide voor knock-in
    1. Gebruik de gevestigde TEDA-methodologie (T5 exonuclease DNA-assemblage) om de ligatiereactie uit te voeren13.
    2. Gebruik een Gibson-assemblagestrategie met drie fragmenten voor de constructie van het rbm24a-RFP KIzpc:cas9 knock-in donorplasmide. Het eerste fragment omvat een 1.704 bp 5' homologie-arm die het genomische gebied direct stroomopwaarts van het rbm24a-stopcodon omvat. De tweede is de GFP-coderingssequentie. De derde bevat een 2.274 bp 3' homologiearm stroomafwaarts van het rbm24a stopcodon, gevolgd door de zpccas9-expressiecassette die in de 3'-richting distaal van de rbm24a 3'-UTR is geplaatst.
    3. Monteer de drie fragmenten in de ApaI-site van pBluescript SK-vector met behulp van Gibson-assemblage.
    4. Controleer het uiteindelijke plasmide door middel van restrictiedigestie en Sanger-sequencing.
  3. Micro-injectie en selectie van embryo's met vroege integratie
    1. Bereid het injectiemengsel voor dat 12 pg rbm24a-RFP KIzpc:cas9 knock-in donorplasmide, 200 pg sgRNA en 600 ng recombinant Cas9-eiwit in nucleasevrij water bevat. Breng 1-2 nL van het mengsel toe aan de blastoschijf van embryo's in het eencellige stadium met behulp van standaard micro-injectietechnieken. Screen embryo's bij 30 hpf op RFP-expressiepatronen die de endogene expressie van rbm24a nabootsen, wat wijst op integratie van het donorplasmide al in het splitsingsstadium. Selecteer deze embryo's met vroege integratie voor de fokkerij, die een RFP-signaal vertoonden in de lens, het hart, de skeletspier en de haarcellen van het binnenoor (Figuur 3A,B).
      OPMERKING: Zuiver het plasmide door fenol-chloroform-extractie vóór injectie om eventuele resterende RNases die tijdens de plasmidebereiding zijn geïntroduceerd, te verwijderen.
    2. Analyseer de expressiepatronen van maternale Rbm24a-RFP in embryo's van de F1-generatie afgeleid van rbm24a-RFP KIzpc:cas9 inkruisingen (Figuur 4A,B).
  4. Beoordeling van de expressie en bewerkingsefficiëntie van Cas9-eiwitten
    1. Om de efficiëntie van Cas9-bewerking te beoordelen, injecteert u 200 pg bmp2b sgRNA in 1-cel rbm24a-RFP KIzpc:cas9-embryo's (Figuur 1C,D).
    2. Om de stabiliteit van Cas9-bewerking te evalueren, kwantificeert u het aantal embryo's dat dorsalisatiefenotypes vertoont en voert u Sanger-sequencinganalyse uit om de bewerkingsefficiëntie te beoordelen (Figuur 5A-D).
      OPMERKING: Hoewel we geen vermindering van Cas9-expressie over drie generaties hebben gedetecteerd, raden we toch aan om de bewerkingsefficiëntie in elke generatie van deze knock-in-regel te verifiëren.

2. sgRNA-transgenese in rbm24a-RFP KI zpc cas9-lijn

  1. Selecteer en synthetiseer sgRNA's voor rbm24a-knock-out .
    1. Selecteer en synthetiseer sgRNA-kandidaten zoals beschreven in stap 1.1.1.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om sgRNA's te selecteren die zich richten op de voorste helft van het coderende gebied om een zeer efficiënt functieverlies te garanderen. Bovendien, als kritieke eiwitdomeinen worden geïdentificeerd in het C-terminale gebied, zijn sgRNA's die gericht zijn op het 3'-uiteinde van de coderende sequentie ook acceptabel. CRISPRscan genereert sgRNA-oligo's die essentiële functionele elementen bevatten, waaronder de T7-promotorsequentie, de 20-nucleotide sgRNA-doelsequentie en een 16-nucleotide sgRNA-scaffold-sequentie. Om een effectieve knock-out van het maternale gen te bereiken, is het raadzaam om 6-8 kandidaten te ontwerpen om 3-4 zeer efficiënte sgRNA's betrouwbaar te identificeren. Een gedetailleerd protocol is te vinden in een eerder artikel9.
    2. Test de sgRNA-efficiëntie in het vroege zebravisembryo zoals beschreven in stap 1.1.2.
      OPMERKING: sgRNA's met een bewerkingsefficiëntie van meer dan 50% hebben de voorkeur.
  2. Constructie van transgeen plasmide dat sgRNA tot expressie brengt
    OPMERKING: Om de bewerkingsefficiëntie te maximaliseren, raden we aan om vier afzonderlijke, niet-overlappende sgRNA's te gebruiken, elk gescheiden door ten minste 36 bp. Deze sgRNA's worden individueel geligeerd in pU6x:sgRNA-vectoren (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), die elk een unieke U6-promotor herbergen samen met de 3'-steiger14. Vervolgens worden deze vier U6-vectoren, die elk een sgRNA-expressiecassette bevatten, via Golden Gate-ligatie geassembleerd tot de pGGDestISceIEB-4sgRNA-bestemmingsvector.
    De pU6x:sgRNA-vectoren moeten opeenvolgend worden geselecteerd. Als u bijvoorbeeld drie sgRNA's kloont, gebruik dan de vectoren #1 tot #3; als je vier sgRNA's kloont, gebruik dan vectoren #1 tot #4.
    1. Subklonering van sgRNA-doelsequentie in pU6x:sgRNA-vectoren
      1. Volgens de volgorde van geselecteerd sgRNA, synthetiseer de gloeiprimers: Voorwaartse primer: TTCGN(19); Omgekeerde primer: AAAC[N(19)]*. Waarbij GN(19) de 20 nt doelsequentie van sgRNA is. [N(19)]* vertegenwoordigt de omgekeerde complementsequentie van de 19 nt van het sgRNA-doelwit in de 3'-richting.
      2. Om de primers te gloeien, bereidt u het mengsel als volgt voor: 1 μL voorwaartse primer (100 μM), 1 μL omgekeerde primer (100 μM), 2 μL 10x buffer en 16 μL gedeïoniseerde H2O om een totaal volume van 20 μL te bereiken. Meng grondig.
        OPMERKING: Sequenties van alle primers werden weergegeven in de Materiaaltabel.
      3. Plaats het mengsel in een thermocycler en voer het programma als volgt uit: 1 cyclus op 95 °C gedurende 15 min, vervolgens geleidelijk afkoelen tot 50 °C met een gecontroleerde hellingssnelheid van 0.1 °C/s, en houd deze temperatuur gedurende 10 minuten aan; 10 minuten op 4 °C houden.
      4. Bereid het reactiemengsel voor op het klonen van de gegloeide sgRNA-doelsequentie in pU6x-sgRNA-vectoren zoals beschreven: 1 μL 10x restrictie-enzymbuffer, 1 μL 10x T4-ligasebuffer, 0,3 μL T4-ligase, 0,3 μL BsmBI, 0,2 μL PstI, 0,2 μL Sal I, 1 μL gegloeide sgRNA-primer, 5 μL pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) en 1 μL gedeïoniseerde H2O, waarbij het uiteindelijke reactievolume wordt aangepast aan 10 μL.
      5. Meng de reactiecomponenten grondig en voer het volgende thermocyclerprogramma uit: 6 cycli (37 °C gedurende 20 min, 16 °C gedurende 15 min), 1 cyclus bij 37 °C gedurende 10 min, 1 cyclus bij 55 °C gedurende 15 min, 1 cyclus bij 80 °C gedurende 15 min.
      6. Voor transformatie, ontdooi DH5α competente cellen op ijs, meng voorzichtig 50 μL van de cellen met het ligatiemengsel door de buis te tikken en incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 minuten. Voer een hitteschok uit bij 42 °C gedurende 60 s en breng de buis vervolgens onmiddellijk terug naar ijs gedurende 2 minuten. Spreid de getransformeerde cellen uit op een LB-plaat met 100 μg/ml spectinomycine en incubeer de plaat ondersteboven bij 37 °C gedurende ten minste 16 uur om kolonievorming mogelijk te maken.
      7. Voor kolonie-PCR kiest u elke bacteriekolonie met een pipetpunt en brengt u deze over in 10 μl gedeïoniseerde H2O. Resuspendeer de kolonie grondig door op en neer te pipetteren om volledige dispersie te garanderen voor stroomafwaartse PCR-analyse. Bereid het PCR-reactiemengsel voor door 5 μL 2x Taq Mix, 2 μL kolonievloeistof, 0,4 μL elk M13 forward primer (10 μM) en reverse primer (10 μM) en 2,2 μL gedeïoniseerde H2O te combineren, wat een totaal reactievolume van 10 μL oplevert.
      8. Voer het programma uit zoals hieronder weergegeven: 1 cyclus bij 94 °C gedurende 3 min, 23 cycli (94 °C gedurende 15 s, 55 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 30 s) en 1 cyclus bij 72 °C gedurende 5 min.
      9. Onderwerp de PCR-producten aan elektroforese. Selecteer de positieve kolonie met de verwachte grootte van 482 bp (Figuur 6).
      10. Inoculeer de resterende kolonievloeistof in 3 ml LB-medium aangevuld met 100 μg/ml spectinomycine. Incubeer bij 37 °C en schud gedurende 14 uur bij 200 tpm.
      11. Extraheer plasmiden uit de bacteriecultuur met behulp van de Plasmid Miniprep Kit volgens de instructies van de fabrikant. Meet de plasmideconcentratie met behulp van een microspectrofotometer.
      12. Onderwerp de geëxtraheerde plasmiden aan Sanger-sequencing met behulp van de M13 forward primer. Lijn de sequentieresultaten uit met de verwachte U6-vectorkaart om de juiste invoeging van het sgRNA-doelwit te verifiëren.
    2. Assemblage van pGGDestEB-4sgRNA-vector
      OPMERKING: Zoals geïllustreerd in figuur 7, kunnen vier U6-gestuurde sgRNA-expressiecassettes efficiënt worden geligeerd in de pGGDestEB-4sgRNA-backbone-vector met behulp van Golden Gate-assemblage. Het aantal af te binden sgRNA's bepaalt het gebruik van vectoren. Gebruik bijvoorbeeld bij het samenstellen van vier sgRNA-cassettes pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 en pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Bereid het 20 μL Golden Gate-reactiemengsel voor met: 2 μL 10× restrictie-enzymbuffer, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 100 ng van elk pU6x:sgRNA#x-construct, 50 ng pGGDestIEB-4sgRNA-bestemmingsvector, 1 μL BsaI, 1 μL T4 DNA-ligase en gedeïoniseerd water om het uiteindelijke volume aan te passen aan 20 μL.
      2. Voer de Golden Gate-assemblagereactie uit in 3 cycli van 20 minuten bij 37 °C, gevolgd door 15 minuten bij 16 °C, en eindig vervolgens met een laatste incubatie van 15 minuten bij 80 °C voor enzyminactivering.
      3. Om te transformeren, brengt u 5 μL van het reactiemengsel over in competente cellen en plaat op ampicilline-aangevuld LB-medium.
      4. Voer kolonie-PCR uit door kolonies te screenen met behulp van Dest voorwaartse en achterwaartse primers (zie materiaaltabel) om de aanwezigheid van een insert te bevestigen (Figuur 8).
        OPMERKING: De hoofdband van 2.415 bp en een ladderpatroon moeten aanwezig zijn voor een positieve kloon.
      5. Extraheer plasmiden uit positieve kolonies en sequentie met behulp van Dest forward en Reverse primers voor elk sgRNA-doelwit.
      6. Lijn de resultaten van de Sanger-sequentie uit met de voorspelde vectorsequentie ter verificatie.
  3. Micro-injectie en prescreening van transgene oprichters
    1. Verzamel embryo's die zijn voortgebracht door homozygote rbm24a-RFP KIzpc:cas9 vissen.
    2. Bereid het injectiemengsel voor door 1 μl pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μl) te combineren met 1 μl Tol2-transposase-mRNA (50 ng/μl).
      OPMERKING: Zuiver het plasmide met behulp van fenol-chloroform-extractie vóór injectie om eventuele resterende RNase te verwijderen die mogelijk is geïntroduceerd tijdens het plasmide-extractieproces. Het plasmide en Tol2-mRNA werden direct verdund in zuiver water.
    3. Plaats een glazen dekglaasje in een schaal van 15 cm. Lijn de embryo's uit langs de rand van het dekglaasje en verwijder voorzichtig overtollig water met een pipet. Injecteer 2 ml van het mengsel in de blastoschijf van elk embryo in het 1-celstadium. Spoel de embryo's na de injectie voorzichtig af met blauw water en breng ze over naar een verse schaal. Plaats de schaal ten slotte in een broedmachine van 28 °C voor de teelt.
      OPMERKING: Bereid methyleenblauwe werkoplossing (blauw water) als volgt: Los 180 g zeezout op in 2,7 L gedestilleerd water en steriliseer tot 100x zeewaterbouillon. Verdun deze bouillon 200-voudig met steriel gedestilleerd water om 1/100x zeewater te verkrijgen. Voeg 10 μL 5% (m/v) methyleenblauwe stockoplossing toe aan 1 L van deze 1/100x zeewater om de uiteindelijke werkoplossing te bereiden.
    4. Selecteer bij 24 hpf embryo's die robuuste en alomtegenwoordige BFP-expressie vertonen. Verhoog bij 4 dpf alleen de signalen die sterke transgene fluorescerende signalen behouden (Figuur 9).

3. Karakterisering van dubbele transgene embryo's

  1. Fenotypering van dubbele transgene embryo's
    1. Verzamel embryo's van mozaïek transgene stichtervrouwtjes die paren met wildtype mannetjes.
    2. Pak de BFP-positieve (BFP+) embryo's op in het eencellige stadium onder een fluorescentiesteromicroscoop.
    3. Identificeer ontwikkelingsstoornissen die optreden in BFP+ -embryo's, maar niet in BFP-embryo's .
    4. Fixeer embryo's 's nachts in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C. Voer indien nodig in situ hybridisatie, immunofluorescentiekleuring of andere histologische analyses uit.
      OPMERKING: Alleen defecte fenotypes die uitsluitend voorkomen in GFP- of BFP-positieve embryo's die sgRNA tot expressie brengen, zijn betrouwbaar. Conclusies dienen met de nodige voorzichtigheid getrokken te worden, en maternale mutante fenotypes dienen onderbouwd te worden door meer dan 10 gevallen.
  2. Genotypering van maternale mutante embryo's
    OPMERKING: Voor identificatie van Mrbm24a embryo's, ze kunnen gemakkelijk worden opgepikt door de afwezigheid van Rbm24a-RFP onder een fluorescentiemicroscoop. Daarentegen berust het identificeren van maternale mutanten van andere genen voornamelijk op een celaspiratiestrategie voorafgaand aan zygote genoomactivering, gevolgd door de RT-PCR-analyse van maternale mRNA's in de verzamelde cellen (Figuur 10).
    1. Cel aspiratie
      1. Bereid een 1,5% agarose-oplossing voor door deze op te lossen in 1/3x Ringer's buffer en te koken tot het gesmolten is. Giet de oplossing in een petrischaal van 90 mm en plaats een vorm (WPI, z-mallen) in de gesmolten agarose. Eenmaal gestold, verwijdert u de vorm voorzichtig, wat resulteert in een kant-en-klare plaat.
      2. Gebruik glazen haarvaten en een trekker om smeltverzegelde naalden te maken. Voor een optimale celaspiratienaald stelt u twee lichte gewichten en het verwarmingsvermogen in op Lv1: 60 en Lv2: 90 en selecteert u de stap 2-procedure. Snijd de capillaire punten af met een puntig pincet (zie materiaaltabel) om een openingsdiameter van 30-40 μm te verkrijgen. Maak vervolgens een spike aan de naaldpunt met behulp van een microsmid, die helpt bij penetratie en schade aan het embryo minimaliseert.
      3. Combineer vermeende vrouwelijke oprichters met wildtype zebravissen en verzamel de embryo's. Isoleer BFP-positieve embryo's in het eencellige stadium.
      4. Bij 3 hpf dechorioneer de embryo's door incubatie in 1 mg/ml Pronase in 1/3x Ringer's buffer gedurende 10 minuten en voorzichtig pipetteren, en plaats de embryo's voorzichtig op de agaroseplaat overspoeld met 1/3x Ringer's buffer aangevuld met 1x penicilline-streptomycine. Heroriënteer de embryo's zodat het blastomeer naar de capillaire punt is gericht.
        OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de embryo's met zorg terug te plaatsen, omdat ze extreem kwetsbaar zijn zonder de bescherming van het chorion. Laat ze het oppervlak van het medium niet raken!
      5. Gebruik een micro-injector om 20-40 cellen van elk embryo op te zuigen door voorzichtig de evenwichtsdruk te verminderen die de aspiratiekracht van de capillaire werking compenseert15. Laat deze cellen vrij in 2 μL gedeïoniseerd H2O aan de openingsrand van PCR-buisjes door de evenwichtsdruk te verhogen.
        OPMERKING: Om kruisbesmetting te voorkomen, moet de glazen naald vóór elke aspiratie worden gereinigd door het afzuigen en uitwerpen van gedeïoniseerde H2Ø 3x.
      6. Voeg 200 μL RNA-extractiereagens toe om de cellen weg te spoelen en bewaar de buisjes tijdelijk op ijs. Analyseer vervolgens de genotypen van cellen van embryo's met of zonder ontwikkelingsafwijkingen.
        OPMERKING: Cellen die in het extractiereagens zijn geconserveerd, kunnen bij -20 °C worden bewaard totdat de overeenkomstige embryo's afwijkende fenotypes vertonen.
      7. Laat de embryo's na celaspiratie in de agaroseplaat zitten of plaats ze afzonderlijk in platen met 24 putjes die zijn overspoeld met 1/3x Ringer's oplossing die 1x penicilline-streptomycine bevat.
        OPMERKING: Er moet zorg worden besteed aan het terugplaatsen van de gedechorioneerde embryo's! Meestal onderzoeken we 20-40 embryo's in één experiment, dat ongeveer 1 uur duurt.
    2. Analyse van maternaal mRNA van belang in geambieerde cellen
      1. Voeg 40 μL chloroform toe aan de cellen in het extractiereagens en meng voorzichtig. Centrifugeer het mengsel 1 minuut bij 12.000 g × g bij 4 °C.
      2. Verzamel voorzichtig de bovengrondse. Voeg 1 μl glycogeenoplossing (20 mg/ml) en een gelijk volume isopropanol toe (als het volume van het bovenstaande 100 μl is, voeg dan 100 μl isopropanol toe) en meng goed. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij -20 °C om het neerslaan te vergemakkelijken.
        OPMERKING: Vanwege de kleine hoeveelheid totaal RNA in de opgezogen cellen, moet glycogeen worden toegevoegd om de neerslagefficiëntie te verbeteren en de visualisatie van het neerslag te vergemakkelijken.
      3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C en gooi het bovenstaande weg.
      4. Was de pellet 2x door toevoeging van 500 ml 70% ethanol en centrifugeer gedurende 1 minuut op 12.000 × g .
      5. Gooi de vloeistof weg en open het deksel om de pellet 5 minuten bij kamertemperatuur te laten drogen.
      6. Voeg 7 μL water toe om de pellet op te lossen. Voer reverse transcriptie uit met behulp van de First-streng cDNA-synthesekit, volgens het gedetailleerde protocol in de gebruiksaanwijzing.
      7. Amplificeer het gehele coderende gebied met geschikte primers (zie Materiaaltabel) en voer agarose-elektroforese uit.
      8. Kloon de PCR-producten en sequentie ten minste 30 klonen voor elk embryo om de mutatie te analyseren die in mRNA's is ontstaan.
        OPMERKING: Om te bevestigen dat de aanwezigheid van een defect fenotype wordt veroorzaakt door gerichte mutatie van de geïnteresseerde maternale factor, moeten alle embryo's (n > 5) met defecte fenotypes de afwezigheid van wildtype maternale transcripten vertonen. Omgekeerd zouden wild-type maternale mRNA's aanwezig moeten zijn in alle normaal ontwikkelende embryo's die sgRNA tot expressie brengen (n > 5). Tegelijkertijd zijn in sgRNA-negatieve embryo's alleen wildtype mRNA's detecteerbaar (n > 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Snelle generatie van rbm24a maternale mutanten
We hebben een transgene vector geconstrueerd die expressie mogelijk maakt van een maternale BFP-marker en vier zeer efficiënte sgRNA's die gericht zijn op de rbm24a-coderende sequentie. Na de introductie van deze vector in homozygote rbm24a-RFP KIzpc:cas9-embryo's via Tol2-transpositie, werd Mrbm24a gemakkelijk en snel geïdentificeer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dodelijke zygote mutaties belemmeren de analyse van de maternale bijdrage van een gen. Alternatieve strategieën, met name kiembaanvervanging en micro-injectie van eicellen in situ (OMIS), zijn technisch veeleisend 6,8. Bij celtransplantatie van kiembaanvervanging krijgt het ontvangende embryo zeer weinig PGC's, waardoor de normale vrouwelijke ontwikkeling vaak wordt verhinderd 16,17,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dit protocol is als patent verleend door de China National Intellectual Property Administration, die het beperkte gebruik van de methode zal verlichten na toestemming van de auteurs. De auteurs verklaren dat zij geen andere concurrerende of financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

We danken Jianlin Shen, Yiteng Xu en Qingqing Wei van het Core Facility and Service Platform, School of Lifesciences. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidies 32170816, 32370860, 32450630 en 31871451), Program of Outstanding Middle-aged and Young Scholars van Shandong University, de Taishan Scholars of Shandong Province.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2x M5 HiPer Taq PCR mixMei5bioCat#MF001-BD-100
AgaroseMDbioCat#A006L
AxyPrep Plasmid Miniprep KitAxygenCat#AP-MN-P-4
Capillary electrophoresis instrument (Qsep400)BiOpticN/A
DIG-labeling mixRocheCat#11277073910
DNase IRocheCat#4716728001
DTTThermo Fisher ScientificCat#R0861
First-strand cDNA synthesis kitTransGen BiotechCat#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS NucleaseGenScriptCat#Z03389
Glass capillaries (1.0 x 100 mm)Rantai Educational Equipment FactoryCat#OS-2B
GlycogenBBI Life ScienceCat#28985
GraphPad Prism 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
ImageJOpen sourcehttps://imagej.net/software/fiji/
Low-melting agaroseBiotechCat#CA1351
Microforge (MF2)NARISHIGEN/A
Micro-spectrophotometer (Nano-300)ALLSHENGN/A
OlyVIAOLYMPUSN/A
Penicillin-streptomycinGibcoCat#15140122
Pico-Liter Injector (PLI-100A) Harvard ApparatusN/A
Pointed tweezersWPICat#500341
Pointed tweezers WPI 500341
Puller (PC-100)NARISHIGEN/A
RiboLock RNase InhibitorThermo Fisher ScientificCat#EO0381
rNTPThermo Fisher ScientificCat#R0481
Silicon hydroxyl magnetic beadsSangon BiotechCat#B518720-0001
T7 RNA polymeraseNEBCat#M0251L
ZoldWPICat# z-molds

Referenties

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Genoomredigering bij zebravissenoocytspecifieke knockoutTol2-vrije zebravissendeletie van maternale factorenmicro-injectie van embryo'scelaspiratiefluorescent eiwitmarkerreverse transcriptie-PCR
Generatie van maternale mutanten met behulp van zpc:cas9 knock-in zebravissen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.