Methodenartikel

Afschalen voor grote impact: gestroomlijnde productie van recombinante adeno-geassocieerde virussen met hoge doorvoer

DOI:

10.3791/68646

⸱

12 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks dat ze veel worden gebruikt bij de afgifte van genen, staan recombinante adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren voor opmerkelijke productie-uitdagingen. Dit protocol schetst productiemethoden op microschaal en minischaal met behulp van zowel adherente als suspensiecellen. De methoden stroomlijnen het genereren, zuiveren en optimaliseren van vectoren, waardoor preklinisch onderzoek wordt versneld en de vooruitgang binnen de gentherapiepijplijn wordt vergemakkelijkt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn recombinante adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren naar voren gekomen als een toonaangevend platform voor gentherapietoepassingen. De omslachtige productie- en zuiveringsprocessen blijven echter belangrijke knelpunten in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Grootschalige rAAV-productie met hoge doorvoer zonder arbeidsintensieve en tijdrovende zuiveringsprocedures biedt een waardevolle alternatieve strategie om preklinisch onderzoek en therapeutische screening in een vroeg stadium te versnellen. Deze aanpak maakt het mogelijk om snel diverse rAAV-varianten of therapeutische constructen te genereren met voldoende kwaliteit voor initiële in vitro en in vivo evaluatie. Dit protocol introduceert twee methoden die worden onderscheiden door celtype en productieschaal: rAAV-productie op microschaal en op minischaal. De productie op microschaal wordt uitgevoerd in een formaat met 6 putjes met behulp van aanhangende menselijke embryonale nier (HEK) 293T-cellen (micro-6-well), terwijl bij de productie op minischaal gebruik wordt gemaakt van suspensiecellen in platen met 24 putjes (mini-HT24). Vectoren die via deze methoden worden gegenereerd, ondergaan stroomafwaartse analyses om de celkweekomstandigheden te optimaliseren en/of worden gebruikt om de biologische activiteit van transgenen te beoordelen. Belangrijke analytische uitlezingen zijn onder meer vectorgenoomtitratie (vg/ml), bepaling van capsidetiter (vp/ml), western blot-analyse en celtransductietests. Bovendien worden vectoren die op minischaal worden geproduceerd en semi-gezuiverd met behulp van affiniteitsharsen worden vergeleken met midischaalpreparaten die zijn gezuiverd via cesiumchloride-dichtheidsgradiënten. De gestroomlijnde methoden die hier worden beschreven, tonen een aanzienlijk potentieel aan voor het verfijnen van celkweekparameters, het identificeren van hoofdkandidaten tijdens screenings (d.w.z. geoptimaliseerde transgencassettes of superieure AAV-capsiden) en het verbeteren van transgenexpressie. Gezamenlijk ondersteunen de gepresenteerde workflows de oprichting van een robuust en efficiënt platform voor iteratieve ontwikkeling in de gentherapiepijplijn dat gemakkelijk in elk onderzoekslaboratorium kan worden geïmplementeerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van geneesmiddelen is een complex en arbeidsintensief proces dat de integratie van hoogwaardige gegevens uit verschillende stadia vereist, waaronder doelidentificatie, preklinische validatie en klinische proeven1. Als reactie op de groeiende vraag naar snellere tijdlijnen en lagere kosten2, heeft de farmaceutische industrie in toenemende mate high-throughput (HT) kleinschalige assays in combinatie met geavanceerde kunstmatige intelligentie (AI) ingevoerd als hoeksteen van moderne ontwikkelingsstrategieën 3,4,5. HT-assays maken het mogelijk om snel grote aantallen kandidaat-geneesmiddelen of testvariabelen te screenen en te evalueren tegen een fractie van de tijd en kosten in vergelijking met traditionele methoden 5,6.

Bij gentherapietoepassingen, met name die waarbij gebruik wordt gemaakt van adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren, vormen de hoge kosten van goederen en lange productietijdlijnen aanzienlijke uitdagingen7. Het ontwikkelingsproces begint met het produceren van het plasmidemateriaal dat nodig is voor transfectie, gevolgd door celgroei tot hoge dichtheden die voldoende zijn voor de productie van virale vectoren. Na transfectie is een incubatietijd van twee tot vijf dagen nodig voordat wordt geoogst, en het proces wordt afgesloten met zuivering en batchkarakterisering 8,9. Gezamenlijk kan deze workflow tot een maand duren en is doorgaans beperkt tot een beperkt aantal preparaten die parallel kunnen worden uitgevoerd bij gebruik van affiniteitskolommen of gradiënt-ultracentrifugatie 9,10,11,12.

Het veld erkent de behoefte aan AAV-productieprotocollen op kleine, mini- of microschaal en heeft verschillende benaderingen aangepast om recombinante AAV (rAAV) te produceren in kleine opstellingen op laboratoriumschaal. Deze benaderingen omvatten meestal het gebruik van meerdere schalen van 15 cm voor aanhangende cellen13,14 of 50-2000 ml15 schudkolven voor suspensieculturen. In het verleden werden AAV-zuiveringsmethoden gebruikt, zoals gradiënt-ultracentrifugatie (bijv. jodixanol16, cesiumchloride (CsCl)17 of sucrosegradiënten18). Deze goedkope en serotype-onafhankelijke methode was zeer geschikt voor het produceren van rAAV op laboratoriumschaal, maar het arbeidsintensieve karakter en de beperkte ultracentrifugecapaciteit maken het minder bevorderlijk voor toepassingen met een hoge doorvoer19,20.

De aanhoudende vraag naar een hogere doorvoer leidde tot de verkenning van alternatieve benaderingen om de rAAV-productie te verkleinen. Met behulp van aanhangende cellen zijn formaten zoals 6-well 13,21,22, 96-well23 en zelfs 384-well platen24 onderzocht. Meer recentelijk zijn suspensiecellen ingevoerd, gezien hun verbeterde schaalbaarheid en de vergelijkbare, of zelfs superieure potentie van vectorpreparaten8.

De productie van rAAV met hoge doorvoer in suspensiecellen met een kweekvolume van minder dan 15 ml blijft echter een gespecialiseerd gebied, met beperkte gepubliceerde protocollen 7,25,26. De meeste onderzoeken richten zich op grotere volumes om voldoende opbrengsten te behalen voor downstream-toepassingen 8,9,27, maar net als bij hechtende cellen bieden minischaalformaten een aanzienlijke vermindering van het verbruik van hulpbronnen en de verwerkingstijd, waardoor wordt voldaan aan een kritieke behoefte in het veld. Belangrijk is dat protocollen op mini- en microschaal vaak gebruik maken van "ruwe lysaten", of ongezuiverde celkweekoogsten die vectordeeltjes bevatten, voor stroomafwaartse karakterisering en analyses.

Deze studie schetst twee protocollen die gebruik maken van zowel adherente als suspensieproducerende cellen (Figuur 1). Ruwe rAAV-lysaten geproduceerd uit aanhangende HEK293T cellen worden direct gebruikt voor latere toepassingen, zoals transductie van doelcellen. Daarentegen ondergaan rAAV's die in suspensiecellen worden gegenereerd verdere verwerking via harszuivering met affiniteit met hoge doorvoer. Deze methoden zijn speciaal ontwikkeld om de opbrengst te verbeteren, de vectorkwaliteit te beoordelen en de transgenexpressie te monitoren, terwijl het verbruik van dure reagentia en materialen tot een minimum wordt beperkt. De hier gepresenteerde resultaten laten zien dat zowel ruwe lysaten (van aanhangende cellen) als affiniteit-gezuiverd materiaal (van suspensiecellen) geschikt zijn, afhankelijk van de reikwijdte van de toepassing. Bovendien werd rAAV verkregen met behulp van affiniteitsharsen direct vergeleken met tegenhangers die werden gezuiverd met behulp van traditionele cesiumchloride-ultracentrifugatie in termen van opbrengst, zuiverheid en transductie-efficiëntie in van de mens afgeleide neuronale coculturen.

De toepassing van high-throughput, kleinschalige assays in de ontwikkeling van gentherapiegeneesmiddelen is een onmisbare vooruitgang, die innovatie versnelt en de kloof tussen wetenschappelijke ontdekkingen en therapeutische realiteit overbrugt. Deze methoden verminderen niet alleen de kosten en tijdlijnen, maar maken ook het parallel testen van tal van aandoeningen mogelijk, wat uiteindelijk bijdraagt aan de efficiënte ontwikkeling van transformatieve therapieën.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Micro-6-well productie van rAAV-vectoren in aanhangende cellen

OPMERKING: De micro-6-well productie van rAAV is een aangepaste versie van een eerder gepubliceerd protocol van Fakhiri et al.21.

  1. Zaaien en transfectie van HEK293T cellen
    1. Ontdooi een injectieflacon met HEK293T cellen28 in een waterbad bij 37 °C.
    2. Breng de cellen over naar 30 ml aanhangende celkweekmedia in T175-kolven en bewaar ze in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal kalfsserum (FCS) bij 37 °C en 5% CO2.
    3. Splits HEK293T elke 2-3 dagen: Zuig het celkweekmedium op en voeg voorzichtig 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om de cellen te wassen.
      OPMERKING: Alleen celpassages onder doorgang nummer 15 werden in dit protocol gebruikt om de integriteit en gezondheid van de cellen te waarborgen, wat rechtstreeks van invloed is op de rAAV-productie.
    4. Voeg 2 ml 0,025% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe aan de cellen en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C (of totdat de cellen loskomen).
    5. Stop de reactie door 20 ml vers medium toe te voegen en de cellen in het medium te suspenderen met behulp van een pipet van 25 ml. Afhankelijk van de confluentie kunnen cellen 1:10 of 1:20 worden verdund in 24 ml DMEM-medium met een hoog glucosegehalte. Om een voldoende celdichtheid voor transfectie te verkrijgen, zaad 7 × 106 HEK293T cellen in een T175-kolf.
    6. Na 72 uur bij 37 °C worden de cellen geoogst door trypsinisatie (zoals beschreven in stap 1.1.3-1.1.5), suspendeer ze opnieuw in 20 ml medium en tel je de cellen.
      OPMERKING: Cellen kunnen op verschillende manieren worden geteld, afhankelijk van de gewenste nauwkeurigheid, doorvoer en beschikbare apparatuur. Er worden voornamelijk twee benaderingen gebruikt: handmatig tellen (Neubauer-kamer) en geautomatiseerde celtellers. Dit protocol maakt gebruik van een volledig geautomatiseerde, op afbeeldingen gebaseerde celanalysator om kritieke celparameters zoals levensvatbaarheid, celdichtheid en aggregatiesnelheid te meten.
    7. Zaadcellen met een dichtheid van 0,5 × 106 cellen/putje in een plaat met 6 putjes. Om de cellen gelijkmatig te verdelen, schudt u de plaat voorzichtig en plaatst u deze in de CO2 -incubator.
    8. Na 24 uur bereiken de cellen een samenvloeiing van 60-70% en kunnen ze drievoudig worden getransfecteerd.
    9. Meng voor elk putje 90 μL serumvrij medium met in totaal 2,6 μg plasmide-DNA, inclusief pTransgene, pRep/Cap en pHelper in een molaire verhouding van 1:1:1.
    10. Voeg in een tweede tube 5 μL polyethylenimine (PEI) toe aan 90 μL serumvrij medium vlak voor transfectie.
    11. Na het combineren van de twee oplossingen, vortex het mengsel en incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten.
    12. Voeg de transfectiemengeling druppelsgewijs aan elke put toe. Schud de platen voorzichtig voordat u ze terugplaatst in de broedmachine.
      OPMERKING: Een middelgrote verandering na transfectie kan worden uitgevoerd, maar het werd niet toegepast als standaardpraktijk, aangezien de cellen goede levensvatbaarheid gedurende het experiment behielden.
  2. Oogst en lysis van cellen
    1. Zuig 72 uur na de transfectie het celmedium voorzichtig op van de plaat(en).
    2. Maak cellen los door 500 μL PBS in elk putje toe te voegen en pipetteer voorzichtig op en neer.
    3. Breng de celsuspensie over in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml.
    4. Meet de levensvatbaarheid en dichtheid van cellen handmatig of automatisch door de instructies van de fabrikant te volgen.
    5. Breng 50 μL over van de suspensie in een 96 U-bodemplaat om de transfectie-efficiëntie te bepalen door reporter-positieve populaties te kwantificeren via flowcytometrie.
      OPMERKING: Het wordt altijd aanbevolen om een transfectiecontrole parallel uit te voeren, d.w.z. een transfectie van 1-2 putten met een transgen dat een fluorescerend eiwit draagt (bijv. groen fluorescerend eiwit (GFP), mCherry, enz.) om de transfectieefficiency op de plaat te controleren. Putjes met niet-getransduceerde cellen dienen als negatieve controle.
    6. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 800 × g gedurende 10 minuten bij RT tot pelletcellen, die het grootste deel van de geproduceerde vectoren bevatten.
    7. Gooi het supernatans weg en resusinfecteer de cellen in 100 μl PBS. De celsuspensie kan worden bewaard bij -80 °C.
      OPMERKING: Om een ruw lysaat uit de geoogste cellen te verkrijgen, gebruikt u een van de twee hieronder beschreven benaderingen.
    8. Bij de eerste benadering kunnen cellen worden onderworpen aan vijf vries-dooicycli, elk 5 min, met behulp van een voorverwarmd waterbad van 37 °C en vloeibare stikstof. Draai de monsters kort tussen de cycli gedurende 2-3 s.
    9. De tweede en meest gebruikte optie in dit protocol is sonicatie. Breng hier de celsuspensie over op dunwandige polymerasekettingreactie (PCR)-platen of -buisjes en plaats deze bij 4 °C in een waterbadsonicator.
      1. Sonificeer samples gedurende in totaal 3 minuten met 30 s aan-uit-stappen bij een amplitude van 25% (intensiteit).
    10. Na sonicatie pellet je de cellen met behulp van een tafelcentrifuge (16.100 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C) om celresten te verwijderen en een celvrije vectorsuspensie te verkrijgen.
    11. Breng supernatanten over in buisjes van 1,5 ml en pipetteer 10 μl van elk monster in een laagbindende plaat met 96 putjes voor digitale druppel (dd)PCR of digitale (d)PCR-analyse.
    12. Bewaar de buizen en 96-well platen bij -80 °C tot verder gebruik.
  3. Transductie van HEK293A cellen met behulp van ruwe lysaten
    OPMERKING: HEK293A cellen zijn mogelijk niet geschikt voor alle AAV-serotypen. Om een geschikte cellijn te identificeren, raadpleegt u databases zoals SPIRIT29 (zie Materiaaltabel voor een link naar de SPIRIT-database) of relevante originele onderzoeksartikelen30,31.
    1. Zaad HEK293A cellen in drie platen met 96 putjes een dag voor de transductie met dichtheden van 1,5 × 106 cellen per plaat.
    2. Meng de volgende dag 10 μL van de geproduceerde vectoren met verschillende volumes PBS om verdunningen van 1:2, 1:10 en 1:100 te genereren.
    3. Transduceer met behulp van een meerkanaalspipet de cellen in platen met 96 putjes in technische drievouden.
    4. Incubeer cellen met de rAAV's zonder mediumuitwisseling gedurende 72 uur. Voer daarna de stroomafwaartse experimenten uit, afhankelijk van het transgen dat tot expressie komt, zoals eiwitniveaumetingen, flowcytometrie-analyse voor fluorescerende eiwitexpressie, knockdown-/knock-outanalyses, enz.
    5. Voor standaard flowcytometrie zoals uitgevoerd in dit protocol, aspireert u het medium en maakt u de cellen los door 25 μl 0,025% trypsine/EDTA toe te voegen.
    6. Incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C.
    7. Stop de reactie door 175 μL 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS aan elk putje toe te voegen.
    8. Gebruik 100 μL van de celsuspensie voor flowcytometrie-analyse.

2. Mini-HT24 productie van rAAV-vectoren in suspensiecellen

OPMERKING: In de mini-HT24-opstelling worden, in tegenstelling tot de eerder beschreven productie van micro-6-putjes, gezuiverde preparaten van rAAV-vectoren gegenereerd met behulp van suspensiecellen. Suspensieculturen leveren grotere hoeveelheden rAAV op vanwege de verhoogde celdichtheden die binnen hetzelfde kweekvolume kunnen worden bereikt. In dit protocol werd een formaat van 24 diepe putten gebruikt. Ruwe cellysaten worden gezuiverd in high-throughput met behulp van AAVX-affiniteitsharsen met als doel schonere producten te genereren die nodig zijn voor bepaalde toepassingen waar ruwe lysaten niet geschikt zijn (zie het gedeelte Discussie).

  1. Teelt en drievoudige transfectie van suspensiecellen in platen met 24 diepe putten
    1. Ontdooi een injectieflacon met suspensiecellen voor virale productiecellen (VPC) in een waterbad bij 37 °C. Passage cellen minder dan 30 keer om de constante kwaliteit van de geproduceerde vectoren te garanderen.
    2. Breng de cellen over naar 30 ml suspensiecultuurmedia in een schudkolf en kweek ze gedurende 2-3 dagen onder onderhoudscultuuromstandigheden: 37 °C, 8% CO2, 95% vochtigheid en 140 tpm (straal van het schudplatform 25 mm).
    3. Bepaal de levensvatbare celdichtheid na 2-3 dagen (zie OPMERKING bij stap 1.1.6). Ga door met subkweken en uitbreiden totdat het gewenste aantal levensvatbare cellen dat nodig is voor de productie van AAV is bereikt.
      NOTITIE Subcultuurcellen met een levensvatbare dichtheid van > 4 × 106 cellen/ml en < 6 × 106 cellen/ml of volgens de instructies van de fabrikant op basis van de gebruikte individuele cellijn. Zaad met een levensvatbare dichtheid van 6 × 105 cellen/ml gedurende 3 dagen, gesplitst of 3 × 105 cellen/ml gedurende 4 dagen. Splitsen volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Zaai 3 × 106 cellen/ml in 2,5 ml van elk putje van de plaat met 24 diepe putjes en dek de plaat af met een steriel membraandeksel.
    5. Bereid de drievoudige-transfectiemengeling voor elke rAAV-constructie als volgt voor:
      1. Bereid DNA-Mix van de productieplasmiden (pHelper, pRep/Capside, pTransgene) in een molaire verhouding van 1:1:1 bij een uiteindelijke massa van 600 ng DNA per 1 × 106 levensvatbare cellen.
      2. Bereid het mengsel in Suspension Culture Medium op een eindvolume van 2,5% van het te transfecteren cultuurvolume.
      3. Bereid de PEI-Mix in Suspension Culture Medium voor op een eindvolume van 2,5% van het te transfecteren kweekvolume. Gebruik een eindmassa van 1 ng PEI per 1 ng DNA.
      4. Combineer zowel DNA-Mix als PEI-Mix door het volledige volume van de individuele PEI-Mix over te brengen naar de corresponderende DNA-Mix, wat resulteert in een transfectiemixvolume van 5% van het kweekvolume.
      5. Meng door 10 keer op en neer te pipetteren.
        OPMERKING: Draai de transfectiemix niet na de incubatietijd om verstoring van PEI-DNA-complexen te voorkomen die tijdens incubatie zijn gevormd32.
      6. Incubeer 10 minuten bij RT.
    6. Voeg de transfectiemengsels druppelsgewijs toe aan de overeenkomstige putjes terwijl je de plaat met diepe putten zorgvuldig schudt.
    7. Sluit de plaat af met een steriele ademende rayonfilm en bedek deze extra met het bijbehorende membraandeksel om verdamping te minimaliseren.
    8. Zorg ervoor dat de plaat op een geschikte schudbak voor diepe put wordt geplaatst en zet deze stevig vast.
    9. Incubeer de cellen bij 37 °C, 8% CO2, 95% vochtigheid en 225 tpm gedurende 72 uur.
      OPMERKING: Verschillende formaten van platen met diepe putjes vereisen een individuele beoordeling van de schudsnelheid om een efficiënte gasuitwisseling en het kweken van cellen in een homogene suspensie mogelijk te maken zonder dat cellen na verloop van tijd naar de bodem bezinken. Dit vereist initiële tests, afhankelijk van de individuele laboratoriumapparatuur en -opstelling, evenals de cellijnen die voor de productie worden gebruikt. Overweeg vooral de schudradius, het plaatformaat en de vorm van de putbodem om de celsuspensie homogeen te houden en om te voorkomen dat cellen naar de bodem zakken.
  2. Oogst en lysis
    1. Oogst de cellen door het volledige kweekvolume van elk putje over te brengen naar individueel geëtiketteerde buisjes van 5 ml en centrifugeer ze gedurende 20 minuten bij 800 × g bij 4 °C.
    2. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet opnieuw in 550 μl Dulbecco's (D)PBS en breng de suspensie over naar een schroefdopbuis van 1,8-2,0 ml om aërosolen en druppels bij het openen van de buisjes te voorkomen.
      OPMERKING: Pellets kunnen op dit punt ook worden opgeslagen om later door te gaan met het zuiveringsproces. Bewaar de met fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) geresuspendeerde pellets van Dulbecco bij -80 °C en houd hier rekening mee tijdens de vries-dooicyclus.
    3. Bereid lysaten voor door de buisjes ongeveer 2 minuten in vloeibare stikstof te plaatsen en ze vervolgens te ontdooien in een waterbad van 37 °C. Herhaal deze cyclus 3-5x.
    4. Centrifugeer lyseren gedurende 5 minuten bij 1000 × g bij 4 °C. Dek de centrifuge-emmers af met spuitbusdichte deksels.
    5. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge.
      OPMERKING: Lysaten moeten helder zijn en vrij van zichtbaar vuil of troebelheid om verstopping van de hars die in het zuiveringsproces wordt gebruikt, te voorkomen. Vermijd het schudden of verstoren van de pellets. Herhaal de centrifugatiestap voor het geval de bovenstaande stoffen niet helder zijn. Houd rekening met een hogere centrifugatiesnelheid of een langere duur in het geval van sterk geconcentreerde monsters of monsters met grote hoeveelheden vuil.
  3. Affiniteitshars gebaseerde high-throughput rAAV-zuivering
    1. Bereid in een bekerglas de elutiebuffer voor door 720 mg citroenzuur toe te voegen aan 50 ml ultrapuur water om een eindconcentratie van 75 mM citroenzuur te bereiken.
    2. Roer de buffer totdat het poeder volledig is opgelost.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het putvolume voldoende is om de buffervolumes en pipetpunten op te vangen zonder te morsen of kruisbesmetting van aangrenzende putten te riskeren.
    3. Stel de pH in op 3,0 door druppelsgewijs 1 M zoutzuur (HCl) toe te voegen terwijl u de buffer continu roert en meet met een pH-elektrode.
    4. Voer steriele filtratie uit op de buffer met een poriegrootte van 0,22 μm.
    5. Bereid kolommen van een 96 deep-well plaat met een putvolume van 2-2,2 ml voor op zuivering volgens het schema beschreven in tabel 1.
      OPMERKING: De monsters hier zijn gezuiverd met behulp van een elektronische meerkanaals pipetopstelling. Het proces is compatibel met geautomatiseerde vloeistofverwerkingssystemen en kan worden opgeschaald voor een hogere monsterdoorvoer.
    6. Voer de zuivering uit in een bioveiligheidskast op RT met behulp van parameters die worden weergegeven in het zuiveringsschema (zie tabel 1) of optimaliseer parameters volgens individuele vereisten, afhankelijk van hars- of monstervolume, verwachte titer, enz.
    7. Voeg na de elutie 1/4 elutievolume neutralisatiebuffer toe aan elk monster.
    8. Meng door 80% van het volume 10x op en neer te pipetteren.
    9. Bereid de dialyseplaten voor door de membraancassettes te verwijderen en aan elk putje 1600 μL dialysebuffer toe te voegen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de membranen niet in contact komen met vloeistof voordat u de dialyse uitvoert, aangezien opnieuw drogen de integriteit en functie van het membraan kan aantasten.
    10. Breng het volledige monstervolume (maximaal 300 μl) over naar een dialysecassette met een geschikt volumeformaat en membraanporiegrootte (≥ grenswaarde van 20.000 moleculair gewicht (MWCO)). Zorg ervoor dat de membranen homogeen belast zijn en er geen luchtbellen aanwezig zijn.
    11. Plaats de cassettes in de geladen putjes van de dialyseplaat en sluit de plaat af met een afdichtingsfolie.
    12. Breng de dialyseplaat over naar een schudplatform en incubeer gedurende 30 minuten bij 300 tpm 4 °C
    13. Vervang de dialysebuffer en herhaal de incubatie bij 300 tpm, 4 °C gedurende 30 min.
    14. Herhaal de bufferuitwisseling en incubatie in totaal 3x.
    15. Breng het volledige volume van de gedialyseerde monsters over in geëtiketteerde bewaarbuisjes en bewaar ze bij 4 °C als ze vervolgens worden gebruikt voor karakterisering of andere experimenten.
    16. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag. Vermijd vries-dooicycli, omdat dit de potentie van de AAV's kan beïnvloeden, en bereid indien nodig kleine hoeveelheden aliquots voor.
  4. Titratie van rAAV genomische titer uit ruwe lysaten en zuivering op basis van hars met behulp van digitale PCR (dPCR)
    1. Om de genomische titer van de ruwe lysaten te bepalen, d.w.z. virale genomen per ml (vg/ml), ontdooit u de geoogste vectormonsters bij RT en pipetteert u vervolgens 10 μl in een buisje.
      OPMERKING: Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de virale genoom (vg/ml) titer van een vectorpreparaat te bepalen, waarbij absolute kwantificering doorgaans berust op twee hoofdbenaderingen: de op druppels of emulsie gebaseerde methode (ddPCR) en de op microplaten gebaseerde methode, weergegeven door digitale PCR (dPCR)33,34. Naast deze digitale methoden kan absolute kwantificering ook worden bereikt met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR). Hoewel qPCR van oudsher een relatieve kwantificeringsmethode is, kan deze worden aangepast voor absolute kwantificering door gebruik te maken van een plasmidestandaardcurve. Dit omvat een plasmide dat de doelsequentie in een bekende concentratie bevat, die als referentie dient om de virale genoomtiter te extrapoleren21,33. Hoewel qPCR sneller en goedkoper is dan ddPCR of dPCR, is het minder nauwkeurig en leunt het sterk op de nauwkeurigheid van de plasmidestandaard16. Ongeacht de kwantificeringsmethode moeten monsters worden voorbehandeld om de virale genomen uit de deeltjes vrij te maken. Dit protocol volgt een eerder beschreven methode van Dobnik, D. et al35.
    2. Behandel rAAV-monsters met een nuclease bij 37 °C gedurende 30 minuten om vrij plasmide-DNA uit het transfectieproces af te breken.
      OPMERKING: Optioneel, afhankelijk van het gebruikte enzym: verwarm de monsters gedurende 15 minuten tot 95 °C om het enzym te inactiveren en de capside van de vector te lyseren.
    3. Voeg na afkoeling tot RT gedurende 15 minuten proteïnase K toe om capsidefragmenten te verteren.
    4. Voor inactivatie van proteïnase K worden de monsters opnieuw gedurende 15 minuten verhit tot 95 °C.
    5. Bereid de ddPCR- of dPCR-mastermixen voor volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Gebruik gelabelde DNA-sondes omdat deze een specifieker signaal geven dan intercalerende kleurstoffen. Ontwerp sondes om "centraal" te binden in het virale genoom, d.w.z. in het transgen (zie OPMERKING), in plaats van de promotor of polyA-staart, en selecteer een fluorofoor zoals hexachloor-6-carboxyfluoresceïne (HEX) of 6-carboxyfluoresceïne (FAM) die compatibel is met het respectieve PCR-systeem.
      OPMERKING: Onlangs is multiplex ddPCR of dPCR, waarbij gebruik wordt gemaakt van primer-/sondesets die gericht zijn op verschillende regio's van het virale genoom, gebruikt om de nauwkeurigheid van de titerbepaling te verbeteren36,37. Deze aanpak maakt het mogelijk om intacte genomen te kwantificeren door formules toe te passen die zijn uiteengezet in de gerefereerde studies of door gebruik te maken van geïntegreerde softwareoplossingen.
    7. Voer een 10-voudige seriële verdunning uit van de nabewerkte monsters in ddH2O met behulp van platen met 96 putjes met een lage DNA-binding. Breng ten slotte 5,5 μL (voor ddPCR) of 2 μL (voor dPCR) van de sjabloon (verdunningen 104- en 105) over naar de ddPCR 96-wells plaat, die al de ddPCR/dPCR Master Mix inclusief primer/sondes bevat. Pas het verdunningsbereik aan op basis van de productie-efficiëntie van individuele constructies om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire detectiebereik vallen.
      OPMERKING: Aangezien dPCR/ddPCR-kwantificering een zeer gevoelige methode is, zijn 104- en 10 5-verdunningen van de monsters nodig.
    8. Volg de onderstaande stappen voor ddPCR.
      1. Volg voor PCR-amplificatie de instructies van de fabrikant voor het optimaliseren van de testomstandigheden, inclusief aanpassingen aan de gloei- en amplificatietijden op basis van de gebruikte primer-/sondeset(s). Het standaard cyclusprotocol dat in dit onderzoek werd gebruikt, was als volgt: initiële denaturatie bij 9 °C gedurende 10 minuten (oplopend °C/s); 35 cycli van denaturatie bij 9 °C gedurende 30 s en amplificatie bij 6 °C gedurende 60 s; gevolgd door een laatste rekstap bij 9 °C gedurende 10 minuten (helling °C/s).
      2. Na PCR-amplificatie van de rAAV-virale genoomdoelen, brengt u de plaat over naar de druppellezer en volgt u de instructies van de fabrikant om de fluorescentie-intensiteit in elk putje te meten. De druppellezer maakt absolute kwantificering mogelijk van het aantal virale genoomkopieën pe μL-reactie.
    9. Volg de onderstaande stappen voor dPCR.
      1. Zoals beschreven voor de op ddPCR gebaseerde kwantificering, volgt u de instructies van de fabrikant voor het optimaliseren van de testomstandigheden.
      2. Volg om te beginnen het vooraf ingestelde thermische profiel op het dPCR-apparaat, dat een eerste denaturatiestap bij 9 °C gedurende 2 minuten omvat, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 9 °C gedurende 15 s en gloeien/verlengen bij 5 °C gedurende 30 s.
        OPMERKING: Dit protocol is uitgevoerd met behulp van de aanbevolen rampsnelheden en reactievolumes die door de fabrikant zijn gespecificeerd.
    10. Analyseer ddPCR- en dPCR-gegevens met behulp van verschillende softwareoplossingen, meestal geleverd door de fabrikant van het instrument (bijv. QX manager en QIAcuity Software Suite 1.2). Selecteer voor beide methoden alleen monsterverdunningen met een toereikende verhouding tussen positieve en negatieve partities/druppels voor kwantificering.
      OPMERKING: Voor de bepaling van rAAV-deeltjestiters (vp/ml; vp = virale deeltjes) van ruwe lysaten en AAVX-harsgezuiverd materiaal, kan een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) worden gebruikt., Er zijn verschillende in de handel verkrijgbare standaard sandwich-ELISA-kits voor AAV-kwantificering beschikbaar (de kits die in dit werk worden gebruikt, worden vermeld in de materiaaltabel). Voer de test uit volgens de handleiding(en) van de fabrikant. Zorg ervoor dat de gebruikte ELISA-kit compatibel is met het AAV-serotype dat wordt geproduceerd.
  5. Analyse van de VP-ratio van gezuiverde rAAV's
    OPMERKING: Om de verhouding van het virale capside-eiwit (VP) van elk monster uit de individuele putjes van de 24 deep-well-opstelling te bepalen, kunnen standaard western blot of geautomatiseerde capillaire protocollen worden uitgevoerd.
    1. Om AAV2-capside-eiwitten VP1, VP2 en VP3 te detecteren, gebruikt u een primair anti-AAV VP1/VP2/VP3 monoklonaal antilichaam. Zorg ervoor dat het primaire antilichaam werkt met het respectieve serotype of de capsidevariant.
    2. Gebruik geschikte positieve controles, zoals recombinant VP1, VP2 en VP3 of een AAV-referentiestandaard.
    3. Bereid de positieve controle voor bij een moleculaire verhouding van 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) om de verwachte VP-verhouding na te bootsen. Dit dient ook als referentie voor de kwantificering van de VP-ratio met behulp van signaalgebiedintegratie.
    4. Selecteer een capillaire kit met een geschikt bereik dat de te detecteren capside-eiwitten omvat, inclusief de kleinste (VP3 met ~ 60 kDa) en de grootste (VP1 met ~ 82 kDa). Dit kan variëren afhankelijk van het serotype en de gebruikte capsidevariant.
    5. Bereid de reagentia en de gebiotinyleerde ladder die in de set zitten voor volgens de instructies van de fabrikant.
    6. Bereid een verdunningsreeks van de monsters (op basis van de genomische titer vanaf 1 × 1012 vg/ml tot 1 × 1010 vg/ml of 1:2 verdunningen vanaf het onverdunde monster tot 1:64) in de meegeleverde verdunningsbuffer van de kit om een goed detectiebereik voor elk monster te garanderen.
    7. Verdun het primaire antilichaam in de meegeleverde antilichaamverdunningsbuffer volgens de instructies van de fabrikant of afhankelijk van eerdere tests. Begin met 1:100.
    8. Gebruik een bijbehorende detectiekit, afhankelijk van de bron van het primaire antilichaam.
    9. Laad de plaat volgens het schema dat bij de kit is geleverd.
    10. Zorg ervoor dat u lege kolommen vult met water of ook met een verdunningsbuffer van het monster om de haarvaten van het instrument niet te beschadigen door droog te lopen.
    11. Dek de plaat af met een afdichtfolie en centrifugeer bij 1200 × g, 5 min, bij 4 °C.
    12. Breng de plaat en haarvaten over naar het instrument en gebruik vooraf ingestelde standaardvoorwaarden voor de run.
    13. Analyseer de run met behulp van een data-analysesoftware, zoals Compass (versie 6.3.0)38.
      OPMERKING: Om de integriteit van deeltjes, monodispersiteit en zuiverheid te analyseren negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie (ns-TEM) wordt aanbevolen. TEM-analyse kan worden uitgevoerd zoals beschreven door Steininger et. al25. Andere methoden, zoals massafotometrie39, SEC-MALS40 en zilverkleuring41 , kunnen echter ook aanvullende uitlezingen opleveren om de kwaliteit van rAAV-preparaten te beoordelen.
  6. Transductie met gezuiverde virusdeeltjes
    OPMERKING: Om cellen met gezuiverde virale vectoren te transduceren, moet een multipliciteit van infectie (MOI) worden bepaald. MOI wordt gedefinieerd als het aantal deeltjesbevattende genomen dat per cel wordt toegevoegd. Het is belangrijk op te merken dat dit een theoretische waarde is; het werkelijke aantal rAAV-genomen dat per cel wordt afgeleverd, hangt af van het vermogen van de capside om de doelcellen met succes te transduceren. Daarom moet het optimale MOI altijd experimenteel worden bepaald. In dit deel was het doel om twee virale vectorvoorraden te vergelijken, die werden geproduceerd met behulp van verschillende zuiveringsmethoden (cesiumchloride-ultracentrifugatie en AAVX-affiniteitshars). Daartoe werden van mensen afgeleide neuronale co-culturen getransduceerd met de twee preparaten en werd de transductie-efficiëntie beoordeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.
    1. Smeer een zwarte optische bodemplaat met 96 putjes 's nachts in met 0,1% (Poly-L-Ornithine) PLO bij 4 °C of incubeer ≥ 1 uur bij 37 °C.
    2. Zuig op de dag van het zaaien het PLO-coatingreagens op en bedek het met de Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix en incubeer gedurende ≥1 uur bij 37 °C.
    3. Kweek motorneuronen met astrocyten in een verhouding van 1:6 of op aanbeveling van de leverancier.
    4. Na 2 dagen in vitro (DIV) transduceer je de co-cultuur bij een MOI van 50.000.
    5. Ontdooi virale aliquots bij 4 °C.
    6. Bereid transductiemedia voor (virale vectoren met het gewenste MOI op basis van virale genomen per cel + celkweekmedia in de juiste hoeveelheden om 50% van de kweekmedia per put te vervangen).
    7. Voer 50% media-uitwisseling uit met transductiemedia.
    8. Voer bij 5 DIV volledige media-uitwisseling uit met reguliere cultuurmedia.
    9. Onderhoud cellen met regelmatige uitwisseling van kweekmedia om de 2-3 dagen of volgens de aanbeveling van de leverancier.
    10. Bewaak de expressieniveaus met een live beeldmicroscoop die is uitgerust met de juiste excitatie voor het transgen van de reporter. Voor van mensen afgeleide neuronen wordt plateauexpressie waargenomen tussen 10-14 dagen na transductie (zie figuur 4A).
StapBuffer/MateriaalPutvolume [μL]Werkvolume [μL]CycliDebiet
[μL/min]
1. EvenwichtEvenwicht/
Wassen I Buffer		11009502500
2. Bezig met laden/
Vastleggen		Voorbeeld Supernatant5505004
3. Was IEvenwicht/
Wassen I Buffer		11009502
4. Wassen IIWash II Buffer11009502
5. ElutieElutie buffer70 μL (20 μL Resin tips)
250 μL (80 μL Harstips)		60 μL (20 μL Resin tips)
240 μL (80 μL Harstips)		4
6. NeutralisatieNeutralisatie bufferVoeg 1/4 van het elutievolume rechtstreeks toe aan elk monster
70 μL geëlueerd monster → Voeg 17,5 μL toe
250 μL geëlueerd monster → 62,5 μL toevoegen		--

Tabel 1: Plaatlay-out en zuiveringsparameters voor de zuivering van affiniteitshars van rAAV's.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren is de vraag naar de productie van AAV-vectoren op laboratoriumschaal aanzienlijk toegenomen, wat heeft geleid tot de oprichting van tal van contractonderzoeksorganisaties die dit als een dienst aanbieden42. Gezien de hoge kosten en vertraagde tijdlijnen die vaak gepaard gaan met outsourcing, blijft interne rAAV-productie een aantrekkelijke optie. Met name protocollen met een hoge doorvoer die het materiaalverbruik en de werkuren minimaliseren en tegelijkertijd zuiveringsstappen integreren, zijn zeer nuttig in de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Dit protocol schetst twee high-throughput opstellingen voor rAAV-productie: een micro-6-well-benadering met behulp van adherente cellen en een mini-HT24-protocol voor suspensiecellen (zie overzicht in figuur 1). De opstelling met micro-6 putjes maakt gebruik van aanhangende HEK293T cellen om rAAV te produceren in een formaat met 6 putjes. Dit materiaal werd gebruikt om de effecten van twee in de handel verkrijgbare PEI-transfectiereagentia en natriumchloride (NaCl) op de productie van rAAV2 te evalueren (Figuur 2A). Hier werden verschillende parameters tegelijkertijd gemonitord: (i) levensvatbaarheid van de producerende cel en transfectie-efficiëntie met behulp van een GFP-transgen (Figuur 2B en aanvullende figuur 1), en (iii) percentage GFP-positieve (GFP+) cellen na transductie met ruwe lysaten (Figuur 2C). Het transductie-experiment diende als een goedkope en snelle indirecte uitlezing van vectortiters en functionaliteiten. Interessant is dat de lagere verhoudingen van transfectiereagens aan DNA voldoende waren om efficiënte vectorproductie te bevorderen (Figuur 2B) terwijl de goede levensvatbaarheid van de cel behouden blijft. Bovendien leek de toevoeging van 150 mM NaCl gunstig, vooral bij het gebruik van het PEIpro-reagens. Het uitvoeren van dit experiment op microschaal bood verschillende voordelen: (i) een snelle workflow, waarbij het zaaien, transfecteren en oogsten van cellen binnen een week voltooid is; ii) verenigbaarheid met standaard downstream analytische analyses; en (iii) brede toepasbaarheid op alle AAV-serotypen.

Voor toepassingen die grotere hoeveelheden rAAV-vectoren vereisen, zoals in vivo experimenten of in vitro kinetische studies (waarbij een hoger of breder scala aan MOI's wordt toegepast), is opschaling noodzakelijk. Om een mini-HT24-protocol op te stellen dat voldoende materiaal levert voor zuivering met hoge doorvoer, werden suspensiecellen gebruikt. In vergelijking met hechtende cellen bieden suspensieculturen een betere schaalbaarheid en zijn ze ruimtebesparender, omdat ze niet worden beperkt door het oppervlak. Omdat suspensiecellen vrij groeien in het medium, kunnen ze het hele kweekvolume beslaan, waardoor opschaling in drie dimensies eenvoudiger wordt. Dit maakt het mogelijk om hogere celdichtheden te bereiken in vergelijking met laagculturen. Bovendien zijn ophangsystemen gemakkelijker te onderhouden en te verwerken omdat er geen loslatingsstappen nodig zijn tijdens het passeren of oogsten. De uniformiteit van de rAAV-productie in het formaat met 24 putjes werd beoordeeld door drie belangrijke parameters over de plaat te analyseren (Figuur 3): (A) Deeltjestiter (vp/ml); (B) VP-ratio in de capside; (C) Genomische titer (vg/ml) en (D) Leeg-tot-vol-verhouding.

Hoewel er enige variabiliteit werd waargenomen tussen deze parameters, bleef deze grotendeels binnen een tweevoudig bereik, wat binnen de meetfoutmarge ligt. De expressie van VP-eiwitten werd ook geëvalueerd met behulp van geautomatiseerde western blot-analyse (Figuur 3E). Ten slotte wordt een vergelijking gepresenteerd van de totale opbrengsten verkregen uit de productie van micro-6-wells, mini-HT24 en middelgrote schaal (schudkolven) om de selectie van de juiste schaal te begeleiden op basis van experimentele vereisten en stroomafwaartse analytische behoeften (Figuur 3F).

Een cruciaal aspect van elk AAV-zuiveringsprotocol is de evaluatie van de zuiverheid en potentie van vectoren. Hier werden met hars gezuiverde vectoren zij aan zij vergeleken met die welke waren gezuiverd met behulp van een op cesiumchloride (CsCl) gebaseerde ultracentrifugatiemethode (UC) in twee stappen (Figuur 4). Een vergelijkbare potentie tussen de twee preparaten werd waargenomen door fluorescentiemicroscopie, zoals aangetoond door de succesvolle transductie van motorneuronen en astrocyten (Figuur 4A). Elektronenmicroscopie-analyse onthulde geen significante verschillen in deeltjesvorm of aggregatietoestand. Er was echter een lichte trend die erop wees dat CsCl-zuivering consistenter schonere preparaten opleverde (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de productie- en bereidingsmethoden van rAAV. Deze figuur illustreert de productiemethoden van rAAV, variërend van midi-schaal schudkolven tot mini-HT24-suspensieculturen en micro-6-goed hechtende culturen. Deze benaderingen maken het mogelijk om rAAV op verschillende schalen te genereren, waarbij gebruik wordt gemaakt van verschillende strategieën voor cellyse en vectorzuivering. De uiteindelijke karakterisering van rAAV's omvat doorgaans qPCR/dPCR voor kwantificering van het virale genoom (vg/ml), ELISA voor bepaling van de capsidetiter (vp/ml) en celtransductietesten om biologische activiteit te beoordelen. Gemaakt in BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Optimalisatie van het transfectieprotocol voor de productie van rAAV met micro-6 putjes. (A) Schematisch overzicht van het experiment met geteste parameters en analytische uitlezingen. (B) HEK293T cellen werden gezaaid in platen met 6 putjes met een dichtheid van 0,5 × 106 cellen/put 24 uur voorafgaand aan transfectie. Verschillende DNA-hoeveelheden, PEI-typen (Pro of Max), verhoudingen en NaCl-concentraties werden getest. (C) Percentage GFP-positieve (GFP+) HEK293A cellen 72 uur na transductie met gelijke volumes lysaten van paneel A (elk 10 μl). Voor de eenvoud wordt alleen de DNA-conditie weergegeven die resulteerde in de hoogste vectoropbrengsten (2650 ng). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Analytische karakterisering van rAAV geproduceerd in een mini-HT24-opstelling en titervergelijking op verschillende schalen. (A) ELISA-analyse van gezuiverde rAAV-capsidetiters in elke put. Waarden worden weergegeven als variaties boven de gemiddelde deeltjestiter van de plaat na zuivering. Verwachte titers zijn afhankelijk van de gebruikte AAV-capside en het verpakte transgen. Deeltjestiters voor verschillende AAV-vectoren varieerden van laag 1011 tot hoog 1012 VP/ml. (B) VP-ratio-analyse door WES van gezuiverde rAAV uit de aangegeven putten. Recombinante AAV2 VP1, VP2 en VP3 werden gebruikt als positieve controles met een molaire verhouding van 1:1:10. (C) dPCR-analyse van gezuiverd rAAV uit elke put. Waarden worden weergegeven als variaties boven de gemiddelde genomische titer van de plaat na zuivering. Verwachte titers zijn afhankelijk van de gebruikte AAV-capside en het verpakte transgen. De genomische titers voor verschillende AAV-vectoren varieerden van laag 1010 (rAAV2) tot hoog 1011 vg/ml (rAAV9, hier niet weergegeven). (D) Leeg-tot-vol-verhouding (E/F) van de aangegeven putjes, gebaseerd op genomische en deeltjestiterresultaten van panelen A en C. Waarden worden genormaliseerd naar het plaatgemiddelde. De gemiddelde E/F in mini-HT24-formaat voor rAAV2 is 10,6% ± 3,0% na harszuivering met AAVX-affiniteit. (E) Capillaire western blot-analyse van VP-eiwitten in gezuiverde rAAV2-monsters uit elk putje. (F) Vergelijking van de totale virale genoomopbrengsten, rekening houdend met de uiteindelijke monstervolumes en de concentratie van elke methode. Gegevens worden weergegeven als gemiddeld vouwverschil over het kleinste formaat (micro-6-well), met foutbalken die de standaarddeviatie (SD) van biologische replicaten aangeven. Voor productie met 24 deep-wells met hoge doorvoer en harszuivering met AAVX-affiniteit, SD = ±0,176 (n = 24); voor sonicatie met micro-6 putjes; SD = ±0,349 (n = 6); en voor standaard productie op middelgrote schaal met CsCl-gradiëntzuivering, SD = ±134,70 (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vergelijking van potentie en zuiverheid tussen high-throughput (HT) hars-gezuiverde rAAV en standaard CsCl-gezuiverde monsters. (A) Van mensen afgeleide motorneuronen en astrocyten werden getransduceerd met hetzelfde rAAV-construct dat fluorescentiereporter mRuby3 tot expressie brengt onder de humane synapsinepromotor als een reporter bij een MOI van 50.000. Fluorescentiemicroscopiebeelden werden zeven dagen na de transductie (DPT) vastgelegd op een live beeldmicroscoop. rAAV's werden gezuiverd met behulp van de standaard CsCl-gradiëntmethode (boven) of de HT AAVX-affiniteitsharstip-gebaseerde benadering (onder). CsCl-gezuiverde monsters werden blootgesteld aan een extra vries-dooicyclus voordat transductie werd uitgevoerd en vergeleken met met hars gezuiverde rAAV's. (B) Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse van rAAV2-serotype-gebaseerde varianten gezuiverd via CsCl-gradiënt (boven) en HT-harstipmethoden (onder). Twee batches HT-harsgezuiverde monsters van rAAV2 kunnen worden vergeleken zonder dialyse (linksonder) en met dialyse (rechtsonder). Leeg-tot-vol-verhoudingen (E/F) werden bepaald met behulp van TEM om >90% vol te zijn voor CsCl-gradiënt ultracentrifugatie-gezuiverde monsters en < 40% vol voor met AAX-affiniteit gezuiverde harsmonsters. Schaal balk = 100 nm. Paneel B toont representatieve foto's van gezuiverde batches met behulp van de aangegeven methoden. Houd er rekening mee dat deze afbeeldingen niet behoren tot dezelfde preparaten die zijn gebruikt voor transductie-experimenten die worden getoond in paneel A. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Transfectie van HEK293T cellen voor rAAV2-GFP-productie met behulp van de micro-6-well-opstelling. Verschillende DNA-hoeveelheden, NaCl-concentraties (in mM), PEI-producten en PEI-tot-DNA-verhoudingen werden gebruikt voor transfectie (zoals beschreven in figuur 2). De beelden werden genomen 72 uren na transfectie gebruikend zelfde belichtingstijd (320 ms). Representatieve helderveld- en fluorescentiemicroscopiebeelden worden in deze figuur getoond. Vergroting: 10X. Schaalbalk niet weergegeven; Afbeelding is alleen voor illustratieve doeleinden en kwalitatieve beoordeling. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocoldocument schetst efficiënte methoden voor het produceren van rAAV in kleinschalige omgevingen met een hoge doorvoer waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel hechtende als suspensiecellen. Deze methodologieën komen tegemoet aan de toenemende vraag naar schaalbare en flexibele rAAV-productieprocessen die preklinisch onderzoek ondersteunen en tegelijkertijd tijd, kosten en resourceverbruik minimaliseren.

Zowel hechtende als ophangcelsystemen bieden duidelijke voordelen en uitdagingen voor de kleinschalige productie van rAAV's. Adherente celsystemen, zoals HEK293T cellen28 gekweekt in plaatformaten met meerdere putjes, zijn bijzonder geschikt voor vectorontwerp in een vroeg stadium en vergelijkende studies. Hun compatibiliteit met gevestigde kweek- en transfectieprotocollen maakt een eenvoudige implementatie in de meeste laboratoria mogelijk. Bijvoorbeeld, Grosse et al. gebruikte kleinschalige productie in platen met 6 putjes om de AAP-functionaliteit te onderzoeken, een eiwit dat cruciaal is voor de assemblage van de virale capside22. Drittanti et al. produceerde rAAV-vectoren in platen met 96 putjes om de kinetiek van rAAV-replicatie te beoordelen en de effecten van verschillende Adenovirus-helpers op rAAV-productie te testen23. Met name in de laatste studie werd een replicatietest beschreven met behulp van gespecialiseerde HeLa-cellen die AAV Rep en Cap tot expressie brengen om het signaal verder te versterken. Meer recentelijk, Quan et al. paste een productieprotocol met 384 putjes met hoge doorvoer toe in de context van een siRNA-screening, waarbij relatieve titers24 werden gerapporteerd. Gezien de beperkte hoeveelheid materiaal blijft het echter nog steeds onzeker hoeveel tests en uitlezingen kunnen worden uitgevoerd, of dat er voldoende MOI's kunnen worden bereikt in celtransductie-experimenten die verder gaan dan het meten van fluorescerende eiwitten, wat mogelijk van invloed is op de reproduceerbaarheid.

In dit werk werd micro-6-well-gebaseerde productie in aanhangende HEK293T cellen gebruikt om de kweekomstandigheden voor rAAV2 te optimaliseren (Figuur 1 en Figuur 2). In lijn met eerdere studies en technische rapporten 43,44, hadden lagere PEI-tot-DNA-ratio's en de toevoeging van NaCl tijdens transfectie een positieve invloed op de rAAV-productie. Dit werd indirect weerspiegeld in de transductie-efficiëntie van de geproduceerde vectoren in HEK293A cellen. De opvallende verschillen die werden waargenomen met de lagere PEI:DNA-ratio's werden voornamelijk toegeschreven aan cellulaire stress, zoals aangegeven door de lage cellevensvatbaarheid, vooral met PEIpro. Hoewel de effecten minder duidelijk waren onder PEImax-omstandigheden, toonden microscopiebeelden celvrije gebieden in de cellulaire laag, wat wijst op stress of celloslating (aanvullende figuur 1).

Belangrijk is dat deze bevindingen niet direct toepasbaar waren op vectorproductie in suspensieculturen, wat benadrukt dat experimentele omstandigheden die de rAAV-productie in aanhangende HEK293T cellen verbeteren, zich niet altijd vertalen naar suspensiecellen, zelfs als het onderliggende celtype hetzelfde blijft. Deze discrepantie kan worden toegeschreven aan verschillen op transcriptomisch en proteomisch niveau tussen deze twee systemen45. Bijgevolg kan een nauwere afstemming op klinische productieprocessen het gebruik van suspensieculturen in de vroege ontwikkelingsfasen noodzakelijk maken. Voortbouwend op deze waarnemingen en het voordeel van het bereiken van hogere celdichtheden in suspensie, werd een systeem met 24 diepe putten toegepast om rAAV te produceren in suspensieculturen op minischaal (mini-HT24). Dit systeem onderging een uitgebreide validatie en toonde consistente vg/ml- en vp/ml-titers over de plaat aan, samen met uniforme VP-eiwitexpressie en -verhoudingen (Figuur 3A-E). De hogere celdichtheden die werden bereikt in de mini-HT24-opstelling (3 × 106 cellen/ml) in vergelijking met het micro-6-well-formaat (5 × 105 cellen per putje) resulteerden inderdaad in hogere rAAV-titers, zoals weergegeven in figuur 3F. Dit benadrukt een belangrijk voordeel van op suspensie gebaseerde systemen, die niet worden beperkt door het oppervlak van het kweekvat. Het implementeren van dergelijke systemen vereist echter gespecialiseerde apparatuur die mogelijk niet in alle laboratoria beschikbaar is. Ten slotte wordt aanbevolen om geïdentificeerde loodmoleculen of superieure kweekomstandigheden van het mini-HT24-systeem verder te valideren met behulp van minibioreactorsystemen zoals AMBR15 of AMBR250, aangezien is aangetoond dat deze systemen de productieomstandigheden in grote bioreactoren beter nabootsen46,47.

De keuze van het zuiveringsniveau speelt een cruciale rol bij het bepalen van de geschiktheid van rAAV-preparaten voor specifieke downstream-toepassingen. Ruwe lysaten, afgeleid van zowel adherente (micro-6-well) als suspensieculturen (mini-HT24), bieden een snelle en hulpbronnenefficiënte optie voor voorlopige screeningstests. Deze lysaten bevatten een mengsel van virale deeltjes, cellulair puin en mediacomponenten, wat acceptabel is voor toepassingen zoals vectorgenomische/deeltjestiter, screening op transductie-efficiëntie en western blot-analyse. Vooral toepasbaar in studies die zich richten op fundamentele biologische vragen (zoals hierboven geïllustreerd in het onderzoek naar AAP-functionaliteit), optimalisatie van de celkweekconditie en preklinische screening en selectie van kandidaten. De aanwezigheid van onzuiverheden kan echter hogere verdunningen noodzakelijk maken, wat resulteert in lagere assaygevoeligheden. Bovendien kunnen onzuiverheden de levensvatbaarheid van gevoelige celtypen, zoals primaire cellen, negatief beïnvloeden.

In tegenstelling tot ruwe lysaten bereiken met AAVX-affiniteitshars gezuiverde preparaten, die uitsluitend worden gebruikt in het op suspensie gebaseerde protocol, een hoger zuiverheidsniveau door intacte capsiden selectief te isoleren. Dit overwint de beperkingen van ruwe cellysaten, waardoor deze preparaten geschikter zijn voor toepassingen zoals in vivo-onderzoeken , maar ook voor gedetailleerde in vitro-analyses van de kinetiek van transgenexpressie en nauwkeurige functionele uitlezingen, waarvoor vaak grotere hoeveelheden materiaal nodig zijn (zie opbrengstvergelijking in figuur 3F). Voor in vitro toepassingen waren de opbrengsten van rAAV-vectoren geproduceerd in de mini-HT24-setting meestal voldoende voor de meeste uitlezingen, afhankelijk van het aantal cellen en de vereiste MOI's. In vivo toepassingen daarentegen vereisen doorgaans productie op een midi-shake-kolfschaal of groter, afhankelijk van de dosis, de toedieningsroute en het diermodel. Ondanks de hogere kosten en tijd die nodig zijn voor zuivering, rechtvaardigen de consistentie en betrouwbaarheid van het resulterende materiaal vaak de investering voor kritieke gebruiksscenario's. Met name de resultaten in figuur 4 tonen aan dat rAAV-vectoren die zijn gezuiverd met behulp van affiniteitsharsmethoden vergelijkbaar zijn met die welke zijn gezuiverd via traditionele cesiumchloride (CsCl) ultracentrifugatie. Dit is in lijn met eerdere waarnemingen dat lege capsiden geen effect hebben op de transductie of deze zelfs kunnen versterken, afhankelijk van de aanwezige AAV-soorten48. Het is echter belangrijk op te merken dat in dit experiment slechts één MOI en één tijdstip werden gebruikt en dat de optimale omstandigheden voor elk celtype afzonderlijk moeten worden bepaald. Terwijl CsCl-zuivering over het algemeen een schonere achtergrond oplevert, vertonen HT-harspunt gezuiverde AAV's een grotere variabiliteit in zuiverheid (zie TEM-afbeeldingen in figuur 4). Samen ondersteunen deze bevindingen de acceptatie van grootschalige workflows met een hoge doorvoer.

Het gebruik van kleinschalige met affiniteitshars gevulde tips bij zuivering met hoge doorvoer biedt een praktische oplossing voor snelle rAAV-screening, maar verschillende technische aspecten vereisen aandacht om betrouwbare resultaten te garanderen. Vanwege het beperkte volume van het harsbed zijn deze tips bijzonder gevoelig voor verstopping, vooral bij het verwerken van ruwe lysaten. Daarom is het klaren van lysaten door centrifugeren met hoge snelheid essentieel om cellulair afval te verwijderen voordat het wordt geladen, aangezien onvoldoende klaring de stroomsnelheden kan verminderen en de opbrengst in gevaar kan brengen. Voor de mini-HT24-opstelling wordt het optimaliseren van transfectieprotocollen en het handhaven van een maximaal werkvolume van 2,5-3 ml per put aanbevolen. Bij het werken met verschillende serotypen of capsidebibliotheken is het raadzaam om verschillende soorten affiniteitshars te testen, aangezien de bindingsefficiëntie en het herstel kunnen variëren afhankelijk van de capsidestructuur49. Het draagbare elektronische meerkanaals pipetteersysteem maakt eenvoudige integratie van deze workflow in kleine laboratoria mogelijk en biedt flexibiliteit zonder dat automatisering nodig is. Handmatige hantering kan echter variabiliteit en verschillen van partij tot partij met zich meebrengen. Voor meer consistentie kunnen geautomatiseerde vloeistofverwerkingsplatforms nuttig zijn. Er moet zorgvuldig op worden gelet dat kruisbesmetting tijdens de toevoeging van monsters en buffers wordt voorkomen, en het gebruik van geschikte plaatformaten met voldoende putvolume is essentieel om overloop te voorkomen. Door rekening te houden met deze overwegingen, waaronder monsterverduidelijking, protocoloptimalisatie, harsselectie en zorgvuldig pipetteren, kunnen onderzoekers technische problemen minimaliseren en de robuustheid en reproduceerbaarheid van kleinschalige affiniteitszuiveringsworkflows met een hoge doorvoer verbeteren.

Kortom, de combinatie van high-throughput, kleinschalige rAAV-productiemethoden met toepassingsspecifieke zuiveringsstrategieën biedt een veelzijdig platform voor het bevorderen van gentherapieonderzoek. Deze protocollen komen tegemoet aan de groeiende vraag naar kosteneffectieve en efficiënte workflows, terwijl ze de flexibiliteit behouden om aan uiteenlopende experimentele vereisten te voldoen. Door de afwegingen tussen zuiverheid, schaalbaarheid en hulpbronnenverbruik in evenwicht te brengen, kunnen onderzoekers de preklinische ontwikkeling versnellen en de overgang naar klinische toepassingen vergemakkelijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Julia Fakhiri erkent dankbaar de steun via een Roche Postdoctoral Fellowship. Elektronenmicroscopiegegevens werden verkregen in de Roche cryo-EM-faciliteit Nautilus. We danken Moritz Classen en Lubomir Kovacik voor hun bijdragen aan de werking en ondersteuning van de faciliteit.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.9% Non-buffered SalineB. Braun, Melsungen, Germany7647-14-5Wash II buffer
1 M Hydrochlocirc acidMerck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA1099700050pH adjustment of buffers
10x DNase I BufferThermo Fisher Scientific, Waltham, USAAM8170GddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9.0Thermo Fisher Scientific, Waltham, USAJ60707.APNeutralization buffer
24-deep well microplatesEnzyscreen, Heemstede, NetherlandsCR1424clSuspension culture equipment
250 mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent CapCorning, New York, NY, USA431144Suspension culture equipment
66 - 440 kDa separation 8x25 capillary cartridgesBioTechne, Minneapolis, MN, USASM-W008Automated Western blot kit
96 Well 2.2 mL Polypropylene DeepWell Thermo Fisher Scientific, Waltham, USAAB0661Sample processing and storage plate
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC SurfaceThermo Fisher Scientific, Waltham, USA165305Transduction assays
AAV2 VP1, recombinant proteinPROGEN, Heidelberg Germany640823Wes reagent
AAV2 VP2, recombinant proteinPROGEN, Heidelberg Germany640824Wes reagent
AAV2 VP3, recombinant proteinPROGEN, Heidelberg Germany640825Wes reagent
AAV2 Xpress ELISAPROGEN, Heidelberg GermanyPRAAV2XPUsed for HT-resin purified samples.
Anti-Mouse Detection Module for WesBioTechne, Minneapolis, MN, USADM-002Automated Western blot kit
Assay/Template specific forward primerCustomCustomddPCR/dPCR
Assay/Template specific probeCustomCustomddPCR/dPCR
Assay/Template specific reverse primerCustomCustomddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - LiquidFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, United StatesNC1192689Medium for suspension cell culture
Bovine Serum Albumin SERVA Electrophoresis, Heidelberg, GermanycBovine Serum AlbuminSupplement for adherent cell medium
Breathable rayon film, sterile VWR International LLC, Radnor, PA, USA391-1262Suspension culture equipment
C1000 ThermocyclerBio-Rad Laboratories, Hercules, USA1851096ddPCR
CaptureSelec AAVX Ligand Leakage ELISA KitThermo Fisher Scientific, Waltham, USA8113522000ELISA
Cedex HiRes Analyzer Roche Holding AG, Basel, Switzerland5650216001Cell counter
CELL culture microplate, 96 wellGreiner Bio-One, Kremsmünster, Austria655162Adeherent cell culture equipment
Citric AcidSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States5949-29-1Purification reagent; CAUTION
CMOS based TEM camera TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, GermanyXF416 Video and Image Processing System
Compass software (version 6.3.0)BioTechne, Minneapolis, MN, USAWES Software
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning, New York, NY, USA  3516Adeherent cell culture equipment
ddPCR Droplet Generator Oil Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA#1864110ddPCR reagent
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA#1863004ddPCR reagent
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA#1863023ddPCR reagent
DMEM, high glucoseThermo Fisher Scientific, Waltham, USA11960044Medium for adherent cell culture
DMEM, low glucoseThermo Fisher Scientific, Waltham, USA11885084Medium for adherent cell culture
DNA low bind 96 well platesEppendorf, Hamburg, Germany30129504ddPCR/dPCR
DNA low bind tubesEppendorf, Hamburg, Germany30108051ddPCR/dPCR
DPBSThermo Fisher Scientific, Waltham, USA14190094Wash buffer
EM grids (T600H-Cu 698 l/inch Hex. mesh Thin Bar; EMS)Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USAFFTH600-Cu-ULElectron microscopy analysis
EVO M5000 Imaging SystemThermo Fisher Scientific, Waltham, USAAMF5000Live imaging microscope for transduction assays
EZ Standard Pack 3BioTechne, Minneapolis, MN, USAPS-ST03EZ-8Automated Western blot kit
Falcon 15mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific, Schwerte, Germany11507411Sample processing
Falcon 50mL Conical Centrifuge TubesFisher Scientific, Schwerte, Germany10203001Sample processing
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher Scientific, Waltham, USA A1413201Culture plate coating
GlutaMAX Supplement (L-Alanyl-L-Glutamine)Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA35050061Supplement for adherent cell medium
HEK293AThermo Fisher Scientific, Waltham, USAR70507Transduction assays (research use only)
HEK293TATCC, Manassas, Virginia, USACRL-3216Adeherent cell culture, used for production of rAAV (research use only)
HEPES solution, 1MMerck, Darmstadt, Germany#H0887Supplement for adherent cell medium
HL-Salt Active Nuclease, SAN (25 U/µL)ArcticZymes Technologies, Tromsø, Norway70910-202ddPCR/dPCR
HydroSpeed Microplate WasherTecan, Männedorf, Switzerland30190101ELISA
iCell Astrocytes Kit, 01434FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, USAR1092Transduction assays
iCell Motor Neuron Kit, 01279FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, USAR1051Transduction assays
Infinite 200 PROTecan, Männedorf, Switzerland30213617

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
  2. Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
  3. Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
  4. Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
  5. Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
  6. Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
  7. Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
  8. Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
  9. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  10. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  11. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  12. Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
  13. Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
  14. Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
  15. Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
  16. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  17. Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
  18. Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
  19. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  20. Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
  21. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  22. Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
  23. Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
  24. Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
  25. Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
  26. Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
  27. Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
  28. DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
  29. Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  30. Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
  31. Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
  32. Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
  33. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
  34. Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
  35. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
  36. Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
  37. Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
  38. Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  39. Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
  40. McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
  41. Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
  42. Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
  43. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  44. Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
  45. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
  46. Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
  47. Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
  48. Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
  49. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Recombinant AAVHigh Throughput ProductionGene TherapyAAV Vector ProductionMicroscale AAVMiniscale AAVHEK 293T CellsCell Transduction AssayVector Genome TitrationWestern Blot

Gerelateerde artikelen