Microbioreactor-gebaseerde productie van ankerafhankelijke mesenchymale stromale cellen die voorbereid zijn op acuut respiratoire distress syndroom

Samenvatting

Er wordt een protocol beschreven voor de productie van ankerafhankelijke cellen door microcarrier-microbioreactoren als potentiële cellengebaseerde therapieën. Met een doel van acuut respiratoire noodsyndroom worden vergelijkbare celopbrengst en gunstige genexpressie ten opzichte van fles-gebaseerde procesomstandigheden geïllustreerd. Dit protocol is uitbreidbaar naar andere ankerafhankelijke cellen en doelindicaties.

Samenvatting

Celgebaseerde therapie is een opkomende therapeutische benadering voor een reeks gezondheidsproblemen. Het produceren van voldoende kwaliteitscellen blijft echter een actieve wetenschappelijke en technische uitdaging. Het uiteindelijke celproduct kan niet worden gesteriliseerd; Daarom zijn overwegingen over steriliteit en kwaliteit door ontwerp van groot belang. Voor cellen die afhankelijk zijn van ankerplaats, wordt expansie op basis van een fles nog steeds gebruikt op ontwikkelings- en industriële schaal, wat grote fysieke voetafdrukken vereist, de controle over de biochemische omgeving beperkt (pH, CO₂ en_O2, diffusiegradiënten van voedingsstoffen en metabolieten), en fysieke signalen biedt die de uiteindelijke celkwaliteit kunnen beïnvloeden. Deze uitdagingen hebben gemotiveerd tot de adoptie van bioreactor-gebaseerde productiemethoden, maar dergelijke benaderingen werken doorgaans op volumetrische schaal die uitdagingen met zich meebrengt en te duur kan zijn voor verkennend laboratoriumonderzoek of procesontwikkeling. Er is gerapporteerd dat de productie van microbioreactor-microcarrier celtherapie biochemische controle biedt tijdens kweek voor een testgeval van celbrontype - mesenchymale stromale cellen. Voor de eerste beoordeling van celkwaliteit in vitro werd acuut respiratoir noodsyndroom overwogen als een mogelijk gebruiksscenario. De hier geïllustreerde aanpak maakt snelle procesontwikkeling op werkbankschaal mogelijk dankzij het kleine (2 mL) volume en de strakke biochemische controle in de microbioreactor. Om dit te bereiken voor een ankerafhankelijke celtype zoals mesenchymale stromale cellen, was een aanzienlijke aanpassing van het microbioreactorproces nodig en werd een gelatine-microcarrier platform gebruikt dat intern werd geproduceerd via een microfluïdeproces. Hier wordt extra detail geïllustreerd over de methode en procesparameters die worden gebruikt om dergelijke ankerafhankelijke cellen in de microbioreactor te kweken, met de bedoeling andere onderzoekers in staat te stellen deze praktijken aan te passen aan hun eigen gebruikssituaties en celbrontypes.

Inleiding

Het gebruik van levende cellen als therapeutisch product is recentelijk uitgegroeid tot een veelbelovende nieuwe behandelingsoptie voor verschillende gezondheidsuitdagingen. Zo hebben chimerische antigeenreceptor (CAR) T-cellen duurzame remissie gebracht bij mensen met zogenaamde vloeibare kankers — leukemie, lymfoom en multipel myeloom — die refractair waren op alle eerder beschikbare behandelingen¹. Meer recent is een mesenchymale stam-/stromale cel (MSC) product (Ryoncil) goedgekeurd om kinderen te behandelen die lijden aan steroïde-refractaire acute graft-versus-host ziekte (SR-aGvHD), een aandoening met > sterfte^{van 50% 2}. Maar uitbreiding naar andere onvervulde klinische behoeften vereist intensieve ontwikkeling van zowel de therapie als de middelen om dat product te ontwikkelen en te produceren.

Een van deze onvervulde klinische behoeften is te vinden bij mensen die lijden aan acuut respiratoire noodsyndroom (ARDS). ARDS wordt hier besproken om een specifiek gebruiksscenario te bieden dat de methode, resultaten en mogelijke uitbreidingen naar andere ziektedoelen illustreert. ARDS was een kritieke (progressie van uren tot dagen), veelvoorkomend (> 200.000 jaarlijkse gevallen in de VS) en dodelijke indicatie (27%-46% sterfte, afhankelijk van de ernst van het optreden), en kreeg tijdens de COVID-19-pandemie hernieuwde en brede aandacht als het typische sterftemechanisme voor patiënten die geïnfecteerd zijn met SARS-CoV-2 ^3,4. ARDS wordt gekenmerkt door een verhoogde pulmonale vasculaire permeabiliteit, wat leidt tot interstitiële oedeem, alveolaire overstroming en infiltratie van cellulaire componenten, waaronder neutrofielen en rode bloedcellen, in het alveolaire compartiment⁵. In de initiële exsudatatieve fase van ARDS veroorzaakt aangeboren immuuncel-gemedieerde ontsteking deze pathogene resultaten door de integriteit van de endotheel- en epitheelbarrière te beschadigen en de werving en activatie van immuuncellen te bevorderen via secretie van pro-inflammatoire cytokines; Succesvolle oplossing van de ontstekingsrespons, herstel van de integriteit van barrières en het voorkomen van overmatige fibrose zijn cruciaal voor overleving^. Hoewel antivirale therapieën zoals Remdesivir veelbelovend zijn in de strijd tegen SARS-CoV-2-gemedieerde ARDS, zijn er voor andere oorzaken momenteel geen goedgekeurde farmacologische interventies beschikbaar die de mortaliteit^{verminderen 5}.

MSC's kunnen een veelbelovende benadering bieden voor de behandeling van ARDS, gezien hun longspecifieke tropisme bij systemische injectie en hun vermogen om immunomodulerende paracriene signalen af te scheiden in hun omliggende micro-omgeving ^6,7. Mechanistische studies hebben de expressie van paracriene factoren zoals interleukine-10 (IL-10)⁸, indolamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1)⁹, prostaglandine E2 (PGE2)¹⁰ en andere betrokken bij het stimuleren van de veronderstelde MSC-therapeutische potentie voor meerdere indicaties, waaronder acute longschade (ALI)/ARDS¹¹; daarom vertegenwoordigen expressieniveaus van deze genproducten potentiële kritieke kwaliteitskenmerken (pCQA's) die mogelijk voorspellend zijn voor klinische effectiviteit, en bieden ze hanteerbare afgiftecriteria voor het eindproduct tijdens de productie. Het produceren van voldoende hoeveelheden cellen om een effectieve therapeutische dosis te bereiken is echter een uitdaging; Ryoncil bijvoorbeeld is geïndiceerd voor dosering van 2 x 10^{6 cellen}/kg patiëntmassa, toegediend twee keer per week gedurende 4 weken¹². Voor een patiënt van 80 kg komt dit neer op > 1,2 miljard MSC's voor één behandeling, wat een grote fysieke voetafdruk vereist om voldoende oppervlakte te huisvesten voor deze 2D-groeiconditie. Aangezien dit levende celproduct niet kan worden gesteriliseerd vóór toediening door de patiënt zonder het therapeutisch potentieel van de cellen te schaden, is het gebruik van de huidige richtlijnen voor goede productiepraktijken voor steriele productie van het grootste belang, wat bijdraagt aan de logistieke complexiteit van celproductie en daarmee de kosten van goederen¹³.

Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat typische MSC-productie in weefselkweekpolystyreen (TCPS) kolven bijdraagt aan het ontstaan van intrapopulatie-fenotypische heterogeniteit. Voor sommige eindtoepassingen maakt dit kwaliteitscontrole-inspanningen tussen batches uitdagend in onderzoek en klinische vertaling 14,15,16,17. Er wordt gespeculeerd dat de beperkte biochemische controle die beschikbaar is in TCPS-kolven, waaronder diffusiegradiënten van gassen, voedingsstoffen en metabole afvalstoffen, slechte pH-regulatie, enzovoort, bijdraagt aan deze uitdagingen.

Deze kwesties motiveren de adoptie van bioreactor-gebaseerde cultuur om optimaal gebruik te maken van de superieure biochemische regulatie en celdichtheid die beschikbaar zijn in een gecontroleerd driedimensionaal groeiformaat met dynamische menging¹⁸. Bioreactor-gebaseerde verwerking of productie brengt echter zijn eigen uitdagingen met zich mee: als een ankerafhankelijke celtype hebben MSC's een vorm van substraat nodig om op te groeien in een bioreactor, wat de toevoeging van microcarriers noodzakelijk maakt. Daarnaast werken veel commercieel beschikbare bioreactoren op volumeschalen die onbetaalbaar veel middelen kosten (> 3 L groeimedia) voor het soort verkennend laboratoriumonderzoek dat nodig is om onbekende procesparameters te identificeren en te verfijnen die de expressie van meetbare indicatoren van celkwaliteit beïnvloeden. Deze kenmerken worden beschreven als potentiële kritieke kwaliteitsattributen of pCQAs¹⁹.

Krupczak et al. rapporteerden eerder een microcarrier-microbioreactorbenadering die MSC's produceerde met verbeterde pCQA-expressie voor ARDS, beperkt tot in vitro beoordelingen²⁰. Deze aanpak combineerde het gebruik van een oplosbaar gelatine-microcarrier platform dat intern werd geproduceerd met een commercieel beschikbaar microbioreactorplatform, de Mobius Breez microbioreactor²¹. Deze microbioreactor maakt gebruik van 2 mL wegwerpreactorkamers en bevat veel wenselijke kenmerken voor verbeterde biochemische controle, waaronder regulering van temperatuur, pH, CO₂ en_O2 in een dynamisch gemengd, gesloten-loop perfusie-gevoed systeem, maar is niet ontworpen met ankerafhankelijke cellen zoals MSC's in gedachten. Inderdaad, de standaard microfluïdische kanalen die worden gebruikt om reactorinhoud te injecteren zijn te klein om microcarriers te laten passeren, wat aanzienlijke aanpassingen vereist om succesvolle productie van MSC's op dit platform mogelijk te maken.

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven en geïllustreerd met het doel deze microbioreactor aan te passen aan de ankerafhankelijke cultuur van MSC's. De hier gerapporteerde procesparameters zijn geïdentificeerd met de bedoeling om de procesontwikkeling en productie van MSC's te ondersteunen voor preklinische, in vitro beoordeling van de therapeutische werkzaamheid van ARDS. In principe kan dit protocol echter worden aangepast voor andere eindgebruikerstoepassingen, andere ontstekings- of immunomodulatorische aandoeningen, en andere ankerafhankelijke celtypen die kunnen profiteren van verbeterde biochemische controle in een benchtop-omgeving. Figuur 1 geeft het protocol beschreven in de bijbehorende video weer in schema, en Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4 illustreren de belangrijkste resultaten.

Protocol

1. Microbioreactor-opstelling en -voorbereiding

1. Bereiding van het vereiste aantal microbioreactor-verbruiksmaterialen
   1. Zorg ervoor dat de bioveiligheidskast (BSC) erop staat en steriel is. Verwijder het foliezakje dat het nieuwe verbruiksartikel bedekt door de bovenkant van de zak te doorboren en de foliezak te bewaren tot het einde van dit experiment (om details van lot# te registreren in geval van defect). Open de buitenste blisterverpakking en gooi het hydratatiepakket erin weg. Gooi de buitenste blaarverpakking weg.
   2. Spuit de binnenste blisterverpakking met 70% ethanol en breng het naar de BSC. Open de binnenste blisterverpakking en gooi weg.
   3. Met een steriele spuit verwijder je de zuiger en sluit je de nozzle aan op een 0,22 μm steriel filter. Giet 50 ml ongesteriliseerd ultrazuiver water in de loop van de spuit. Terwijl je de spuit boven een wachtende, steriele 50 mL buis houdt, steek je de zuiger weer in de spuit en injecteer je het steriele gefilterde water in de wachtende verzamelbuis.
   4. Verwijder de doorzichtige plastic dop die aan fles LL in het flessenrek zit. Verwijder met een nieuwe steriele 50 mL spuit de zuiger en sluit de nozzle aan op fles LL. Giet het steriele gefilterde water in het spuitvat en injecteer het in fles LL.
      OPMERKING: De naaldloze aansluitingen kunnen vast komen te zitten tijdens de sterilisatieprocedure van de fabrikant, dus je moet de spuit mogelijk meerdere keren aansluiten en loskoppelen om de afdichting van de fles te breken en de inhoud succesvol te injecteren. Je kunt ook een buislader gebruiken om een bronfles op een steriele manier aan de lasbuis te verbinden voor de juiste fles.
   5. Met dezelfde procedure vul je fles L met 25 mL niet-FBS-aangevuld low glucose DMEM, fles R met 25 mL steriel PBS en fles RR met 8 mL anti-adherentie spoeloplossing. Gebruik voor elke vloeistof een nieuwe steriele spuit.
   6. Herhaal deze procedure voor zoveel verbruiksartikelen als nodig zijn in het experiment.
2. Voer een POD-zelftest uit in elke POD die voor dit experiment wordt gebruikt.
   OPMERKING: De zelftest zou zonder problemen moeten worden afgerond; Als een onderdeel van de zelftest faalt, pak dan het falen aan voordat je verder gaat.
3. Haal de zelftestcassettes uit hun lichtbeschermde opbergtassen.
4. Bevestig het verbruiksproduct aan de bioreactor zoals hieronder beschreven.
   1. Verwijder het groene tape van de kleppen van het verbruiksmateriaal en monteer het in de POD. Plaats de klemmen opnieuw en zorg dat er geen gesis van gas of lucht te horen is terwijl het ontsnapt.
   2. Verbind de witte druksensor van het flesrek, de rode luchtdrukleiding en de blauwe vacuümleiding tussen de verbruiksartikelen en het basisstation/POD. Zorg ervoor dat de zijinjectiepoort is vastgeklemd met een witte druppelvormige klem.
   3. Volg de stappen van de software om een nieuw experiment te starten. Deze culmineren in de autoprime- en calibrate-functie, die ~4-5 uur duurt en 's nachts kan draaien.
5. Label elk flesrek met de POD-locatie zodat het gemakkelijk is te onderscheiden naar welke POD het verbruiksproduct moet worden teruggebracht nadat het uit de bioreactor is verwijderd. Gebruik gekleurde tape om de positie aan te geven: Pod0 = rood, Pod1 = oranje, Pod2 = geel, Pod3 = groen. Schrijf de naam van het experiment en de datum op de band.
6. Laat de verbruiksartikelen 's nachts kalibreren. Zorg ervoor dat het medium de reactor kan binnenkomen en in de afvalleiding kan uitstromen.
7. Als je van plan bent cellen te gebruiken die in vloeibare stikstof zijn opgeslagen, ontdooi en plat ze dan zodat ze > 24 uur hebben om te herstellen van cryo-opslag vóór injectie.

2. Herkalibratie en voorbereiding van microdragers

1. Zorg ervoor dat de autopriming- en kalibratiestappen succesvol zijn afgerond.
   1. Als de kalibratie niet succesvol is voltooid, identificeer en los dan eventuele oorzaakproblemen op en probeer vervolgens een herkalibratie. Veelvoorkomende problemen zijn het nalaten van de witte flessenrekklem te verwijderen, het vergeten van het verwijderen van de groene tape van het verbruiksmateriaal voordat het in de POD wordt geplaatst, en onvoldoende mediavolume in de mediafles.
2. Zorg dat de sensoren voor opgeloste zuurstof stabiel zijn.
   1. Bijna 10% van de verbruiksartikelen vertoont sensordrift in de DO-sensor na kalibratie. Voer de gewenste corrigerende actie uit, namelijk het opnieuw uitvoeren van de volledige kalibratie. Indien nodig, voer een van de volgende dingen uit.
      1. Zorg dat er geen lucht in de cassette zit, vink dan het vakje Display plots uit om de bediening te tonen, klik vervolgens op Autocalibrate DO en pH.
         1. Als er lucht aanwezig was in de reactor wanneer een herkalibratie nodig is, keer dan terug naar de eerste pagina van het MBS-dashboard door op de blauwe linker pijltje linksboven in het venster te klikken voor de specifieke POD in kwestie. Klik op de knop om handmatige operaties te activeren. Vink het vakje 'Waste tube ready' aan en voer W in het tekstinvoervak om de afvalfles te selecteren. Klik op de knop Uitwerpen-was, en klik vervolgens op Ja in het pop-upvenster. Dit zal de reactorkamers leegmaken en opnieuw vullen met media uit de mediabronfles.
3. Bereid het juiste aantal microcarriers voor in 15 mL conische buizen, één voor elke conie.
   OPMERKING: Het aantal microcarriers, het totale oppervlak en de zaaddichtheid van cellen hangen af van je toepassing. Voor dit protocol wordt aanbevolen een absoluut aantal microdragers te injecteren, wat resulteert in 75 cm² beschikbaar microdragergroeioppervlak ter vergelijking met een T75-fles.
4. Laat microcarriers zich in de buis vestigen; Aspireer zoveel mogelijk supernatant zonder microdragers te verwijderen om ruimte te maken voor cellen en verse media.

3. Cel- en microdragerinjectie

1. Zorg ervoor dat de autoprime- en calibrate-functies succesvol zijn voltooid.
2. Klik door het softwarevenster alsof de reactor wordt ingeënt volgens de standaard workflow van de suspensiecel.
3. Voer een notitie in het pop-upvenster in om aan te geven dat er op dit moment geen injectie van cellen heeft plaatsgevonden.
4. Activeer handmatige operaties om het mengen van de reactor te pauzeren en voeg een witte C-klem toe aan de flesrekkleidingen.
5. Verwijder elk verbruiksitem en breng het over naar de BSC. Verwijder het gebruikte medium uit afval- en perfusieflessen en gooi het weg.
   1. Zorg ervoor dat je al het afval uit de grote perfusiefles verwijdert, evenals uit de kleinere 1,5 mL buis die zich in de perfusiefles bevindt, als je van plan bent geconditioneerd medium te oogsten op enig moment in het onderzoek.
6. Verwijder het niet-serum-aangevuld groeimedium uit fles L en gooi weg. Spoel fles L uit met ~20 ml steriele PBS en gooi weg. Voeg 25 ml serum-aangevuld groeimedium toe aan fles L.
7. Breng de verbruiksartikelen terug naar hun respectievelijke POD's. Zet de media source flessen op ijs voor de resterende duur van het experiment. Vernieuw het ijs dagelijks.
   OPMERKING: Nat ijs kan worden aangevuld met vriespakketten om de duur van temperatuurregeling te verlengen.
8. Spoel de reactoren uit met PBS en spoel de leidingen door.
   1. Klik op de knop Flessen doorspoelen , activeer de Radio-knop voor fles L, selecteer Uitvoeren naar afval en klik vervolgens op Start Spoelen MSCserum.
      OPMERKING: Dit zal het nieuw toegevoegde hMSC-medium door de leiding spoelen om te voorkomen dat er geen niet-FBS-aangevuld medium meer de reactor binnenkomt.
   2. Klik opnieuw op de knop Flessen doorspoelen , selecteer de Radio-knop voor Fles RR en begin met doorspoelen. Dit spoelt de anti-adherentie spoeloplossing door de leiding en zorgt ervoor dat deze klaar is voor de invoer in de reactor.
   3. In het venster Flesinhoud geef je in de software aan dat MSCserum zich in Fles R bevindt, die eigenlijk PBS bevat.
   4. Ga naar handmatige operaties en voer drie uitwerp-wascycli uit op de afvalfles.
9. Voeg een anti-adhesientheidsspoeloplossing toe aan de reactor.
   1. Ga terug naar het venster Flesinhoud en geef aan dat MSCserum zich bevindt in Fles RR, dat daadwerkelijk een anti-adherentie spoeloplossing bevat.
   2. Ga naar handmatige operaties en voer één uitwerp-wascyclus uit op de afvalfles.
      OPMERKING: De voormalige PBS-wash was bedoeld om te voorkomen dat componenten in de DMEM de anti-adherence wash zouden verstoren; Nu moet de reactor gevuld zijn met anti-hechtingsspoeloplossing met sporen van PBS.
10. Na 30 minuten met anti-hechtingsoplossing aanwezig, spoel je de consumptiestof uit met PBS.
    1. In het venster Flesinhoud geef je in de software aan dat MSCserum zich in Fles R bevindt, die eigenlijk PBS bevat.
    2. Ga naar handmatige operaties en voer drie uitwerp-wascycli uit op de afvalfles.
    3. Ga terug naar het venster Inhoud van de fles en geef in de software aan dat MSCserum zich in Fles L bevindt, die hMSC-media bevat.
11. Leeg de reactor om te wachten op cel- en microcarrierinjectie. In het handmatige bedieningspaneel klik je op Reinoculeren en laat je het systeem op het punt waar het dashboard aangeeft de reactor te inoculeren.
    OPMERKING: Hier betekent de term inoculeren simpelweg injectie van de cellen die bedoeld zijn voor expansie in de microbioreactor.
12. Voeg de extra weerstanden toe om de mengsnelheid te moduleren in lijn met de standaard R0-weerstand.
13. Haal cellen uit hun kolf en tel ze op een hemocytometer. Voer alle open bewerkingen uit in een BSC om steriliteit te waarborgen.
    1. Aspireer het medium en was daarna met 5-10 mL voorverwarmde PBS. Aspireer de PBS en voeg 5 ml trypsine + EDTA toe aan de colbeurt.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten of totdat alle cellen zichtbaar van het oppervlak van de kolf zijn getild.
    3. Voeg 10 ml voorverwarmde hMSC-media toe om de trypsinactiviteit te neutraliseren. Haal de vloeistofinhoud eruit en doe deze in een 15 mL centrifugebuis.
    4. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in een passend volume hMSC-medium voor tellen. Voor een volledig confluente T75-kolf is een geschikt volume doorgaans 2-4 mL, wat een celconcentratie van ~1-2E6-cellen per mL oplevert.
    5. Meng een monster van de resuspendeerde cellen met een gelijke hoeveelheid Trypan Blue levensvatbaarheidskleurstof en laad het mengsel in een hemocytometer om te tellen. Tel de cellen volgens de instructies van de fabrikant.
14. Bereken het volume celoplossing dat nodig is om 150.000 cellen te bereiken en pipetteer die hoeveelheid in de wachtende 15 mL conische buis met microdragers voor elke coniteit. Vul het volume in de buis bij tot tussen de 2,2 en 2,5 mL met verse, warme hMSC-media.
    OPMERKING: Het volume in elke 15 mL conische buis moet iets groter zijn dan 2 mL, zodat de injectie resulteert in een iets overvolle reactorconditie om belletjes te voorkomen, die in een latere stap worden gelijkgetrokken.
15. Voeg het juiste volume cellen toe aan de T75-thermosregeling.
16. Met één tot twee verbruiksartikelen tegelijk verwijder je de verbruiksartikelen uit de POD en breng ze naar de BSC.
17. Haal cellen en microdragers uit een 5 mL spuit met groene 4 inch stompe naalden. Injecteer de cellen en microcarriers in de reactor.
18. Breng de verbruiksartikelen terug naar het basisstation en herhaal dit totdat alle verbruiksartikelen zijn geïnjecteerd.
19. Klik door het softwarevenster om aan te geven dat de inoculatie heeft plaatsgevonden. Wanneer de software terugkeert naar de normale startpagina, verwijder dan de witte klem van de verbruiksuitvoerlijnen.
20. Voer handmatige operaties in en voer een Eject Excess functie uit met de outputpoort ingesteld op P voor perfusie. Schakel de statische mengmodus in, gebruik 1680 s aan en 120s uit. Houd de mengfrequentie op 5 Hz voor statisch mengen.
21. Schakel de referentiemeting van de optische dichtheid uit.
    1. Open de MBS-client en klik op Verbinden. Voer het volgende commando in de aanhalingstekens in: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Klik op Verzenden, wacht op bevestiging dat het commando succesvol is verzonden, en sluit de MBS-client.
22. Na 24 uur schakel je de statische mixmodus uit en schakel je het normale mixen weer in. Verlaag de mengfrequentie tot 1,5 Hz.

4. Werking van de microbioreactor

1. Controleer de microbioreactor dagelijks om te zorgen dat er geen problemen het experiment verstoren. Zorg ervoor dat de flessen van de mediabron >5 mL medium behouden om de reactor zonder problemen succesvol te laten perfuseren.
2. Vervang de ijsemmers indien nodig om de temperatuur van de mediabron te behouden. Houd de lichtbeschermende gordyn over de voorkant van de microbioreactor om lichtgebaseerde degradatie van vluchtige mediacomponenten te voorkomen.
3. Zorg ervoor dat er geen belletjes in de reactor worden gebracht. Vergeet niet om periodiek het medium in de TCPS-flask control te vervangen.

5. Microbioreactor oogst

1. Zorg dat de BSC steriel is en klaar voor gebruik.
   1. Verwarm de volgende benodigde reagentia in een kraal- of waterbad tot 37 °C: ~25 mL warme hMSC-media, 10 mL warme PBS en 1,5 mL 10 mg/mL Pronase die nodig is voor oogst.
2. Maak het flesrek klaar voor de oogst.
   1. Schakel de handmatige operationele modus in voor elke POD in de software.
   2. Klem de verbruikbare invoerlijnen met een witte C-klem langs het doorzichtige deel van de leiding.
   3. Verwijder de verbruiksartikelen naar de BSC. Haal de inhoud van de afvalfles weg en gooi weg.
   4. Spoel de afvalfles door met ~20 ml PBS en gooi weg. Beoordeel het resterende volume in de mediafles en vul indien nodig bij met verse (koude) hMSC-media.
      OPMERKING: Hier is > 4 mL medium nodig om de drie noodzakelijke uitwerp-wascycli voor oogst te voltooien.
   5. Bekleed de afvalfles met ~5 ml koud hMSC-medium om de geoogste vloeistof te dempen.
3. Haal de cellen uit de microbioreactor.
   1. Met een 1 mL spuit zuig je 200 μL 10 mg/mL Pronase in de spuit en ~300-400 μL lucht.
   2. Schroef de inspuitbuisdop aan de zijpoort los en spuit de naaldloze klepconnector met 70% ethanol. Verwijder de tape die de geknoopte zijpoort injectielijn vasthoudt en maak de knoop los. Maak de witte druppelvormige klem los.
   3. Sluit de 1 mL spuit aan en injecteer de Pronase voorzichtig in de reactor. Volg de vloeistof met lucht door de injectieleiding om te garanderen dat alle vloeistofinhoud naar de reactor wordt gebracht.
   4. Sluit de druppelvormige klem weer in en sluit de injectieleiding aan de zijpoort weer af. Zet het verbruiksmateriaal terug in de POD, sluit alle leidingen weer aan, verwijder de witte C-klem en hervat het mengen.
   5. Zorg ervoor dat de afvalfles en de media source-fles op ijs worden gehouden. Start een timer van 5 minuten en laat de Pronase de microcarriers in de reactor verteren.
   6. Controleer na 5 minuten of de microcarriers zijn afgebroken door te controleren of ze niet meer zichtbaar in de reactor aanwezig zijn. Als microdragers nog zichtbaar zijn, geef dan nog één minuut extra tijd voor de spijsvertering. Als er geen microdragers zichtbaar zijn, ga dan door.
   7. Oogst de cellen. Schakel de handmatige modus in, zet de # van de cycli op 3, en de outputpoort op W voor afval, en klik op Eject Wash.
   8. Nadat de uitwerpwascycli zijn voltooid, haal je het verbruiksmateriaal terug naar de BSC en haal je de inhoud van de afvalfles weg met een spuit van 10 of 20 mL.
   9. Doeer de inhoud van de afvalfles in een 15 mL conische centrifugebuis. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten, aspireer het supernatant en beoordeel de grootte van de celpellet.
   10. Sussief de celpellet opnieuw in 1-5 ml groeimedium of PBS en tel de cellen op een hemocytometer. Herhaal deze stap voor alle verbruiksartikelen.
4. Oogst de conditie van de kolf(s) met je normale celkweekprotocollen. Een typisch protocol voor MSC's wordt beschreven in 3.13.

6. Analyser de cellen uit de microbioreactorcondities en kolfcondities voor downstream toepassing

OPMERKING: De analytische methoden die zijn gebruikt om de getoonde resultaten te produceren, worden hieronder kort weergegeven en in nader detail beschreven in Krupczak, Farruggio en Van Vliet (2024)²⁰.

1. Milieucontrole: Gebruik de grafische gebruikersinterface van de microbioreactor om gegevens te benaderen en weer te geven van elk van de geïntegreerde sensoren van een verbruiksproduct gedurende de duur van een kweekperiode. Deze gegevens worden geleverd in de Breez Explorer-software die wordt geleverd in de laptop die bij de microbioreactor wordt geleverd.
2. Celopbrengst: Oogst MSC's zoals hierboven beschreven en pellet de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de celpellet grondig opnieuw in een geschikte hoeveelheid PBS- of hMSC-medium (1-2 mL). Neem een monster van het opnieuw gesuspendeerde celmengsel en meng met een gelijke hoeveelheid Trypan Blue-kleurstof. Micropipette het gekleurde monstermengsel in een hemocytometerchip en meet het aantal en levensvatbaarheid van cellen op een geautomatiseerde of handmatige hemocytometer.
3. Controleer genexpressie met tweestaps omgekeerde transcriptie van de kwantitatieve polymerasekettingreactie zoals hieronder beschreven.
   1. RNA-zuivering: Gebruik een RNeasy Mini-kit om RNA van elk monster te isoleren en te zuiveren volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd: lys de cellen, breng de cellulaire inhoud over in een zuiveringsspinbuis en spoel de monsters met elke buffer om onnodige cellulaire componenten, nucleïnezuren en eiwitten te verwijderen die de daaropvolgende PCR kunnen verstoren.
   2. cDNA-conversie: Gebruik een High-Capacity Reverse Transcription kit en thermische cycler om het gezuiverde RNA om te zetten naar complementair DNA (cDNA) volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd: ontdooi de kitcomponenten en creëer een mastermix door componenten te combineren in de juiste volumes voor je aantal samples. Laad gelijke delen gezuiverd RNA en voorbereid mastermengsel (elk 10 μL) in elke put van een PCR-plaat, waarbij je zorgvuldig de locaties van elke monsteridentiteit volgt. Volg het protocol van de fabrikant in de thermische cycler om de omgekeerde transcriptiereactie te voltooien.
   3. qPCR: Met exon-spanende, sequentie-specifieke primers die gevalideerd zijn om primerdimeer te vermijden, laad je een 384-put qPCR-plaat met voorwaartse primer, omgekeerde primer, template cDNA, nucleasevrij water en master mix in geschikte volumes (meestal 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL) met meerdere technische replicateputten voor elk gen en monster. Verdeel de inhoud indien nodig over meerdere platen om alle gendoelen vast te leggen. Zorg ervoor dat alle monsters voor een bepaald gendoel op dezelfde plaat worden geladen om plaat-tot-plaat variabiliteit in resultaten te voorkomen, en dat elke plaat een passend huishoudelijk gen en geen sjablooncontroles heeft. Meet de fluorescentieintensiteit op een geschikte qPCR-machine en gebruik de ΔΔCt-methode voor relatieve kwantificatie om genexpressie te berekenen.

Resultaten

De microbioreactor maakte monitoring en regulatie van omgevingsfactoren mogelijk gedurende ongeveer 10 dagen in kweek. Omgevingsfactoren, waaronder pH (Figuur 2A), temperatuur (Figuur 2B), opgeloste zuurstof (Figuur 2C) en kooldioxide (Figuur 2D), werden nauwkeurig gemeten en behouden in de microbioreactoromstandigheden, maar niet in kol...

Discussie

In dit protocol wordt een methode beschreven om cellen uit te breiden, te primen en te oogsten met behulp van een microcarrier-microbioreactor-benadering. Dit proces stelt ankerafhankelijke cellen zoals MSC's in staat het aantal cellen te verhogen onder de superieure biochemische controle van een bioreactorplatform (vergeleken met conventionele TCPS-kolven) op tafelschaal, geschikt voor snelle procesontwikkeling. Verder is aangetoond dat de productie van MSC's door microcarrier-microbior...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-adherence rinse solution	Stemcell Technologies	7010
Biosafety cabinet
Breez Microbioreactor	MilliporeSigma
Centrifuge
Conical tube, 15 mL
Conical tube, 50 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, low glucose	Gibco	11885084
Ethanol
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670701
Hemocytometer
Laboratory Tape
Microcarriers
Microcentrifuge tube, 1.5 mL
Microscope
Needle, blunt, 4", 18 gauge	Amazon	B0D663ZR6D
Phosphate Buffered Saline	Corning	21-040-CM
Pronase, from Streptomyces griseus	MilliporeSigma	10165921001
Serological Pipette, 10 mL	VWR	75816-100
Sterile deionized water
Syringe filter, 0.22 um, sterile	Celltreat Scientific Products	229762
Syringe, 1 mL	BD	309628
Syringe, 20 mL	BD	302830
Syringe, 5 mL	BD	309646
Syringe, 50 mL	BD	309653
Tissue Culture Polystyrene Flask, T75	Thermo Fisher Scientific	130190
Trypan Blue	SigmaAldrich	T8154-100ML