Regulatie van epitheel-mesenchymale overgang bij eierstokkanker door LncRNA MALAT1 via SNAI2 en MiR-200c-3p

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden om de rol van MALAT1 bij het bevorderen van epitheel-mesenchymale overgang bij epitheliale eierstokkanker te evalueren door middel van de regulatie van de miR-200c-3p/SNAI2-as.

Samenvatting

Lang niet-coderend RNA MALAT1 reguleert epitheel-mesenchymale overgang (EMT) en metastase bij epitheliale eierstokkanker (EOC) via een concurrerend endogeen RNA (ceRNA) mechanisme waarbij miRNA-modulatie betrokken is. Deze studie had tot doel de moleculaire route op te helderen waarmee MALAT1 EMT en metastatisch gedrag beïnvloedt via interactie met miR-200c-3p en SNAI2. MALAT1-expressie werd genetisch gemanipuleerd in de EOC-cellijn SK-OV-3 door overexpressie of knockdown. Functionele effecten op EMT-gerelateerde eiwitniveaus, celmigratie en invasie werden beoordeeld met behulp van respectievelijk Western blotting, wondgenezing en Transwell-testen. Bio-informaticaanalyse identificeerde miR-200c-3p als een gemeenschappelijk doelwit van MALAT1 en SNAI2. De MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2-as werd verder gevalideerd door middel van dual-luciferase reporter-assays en immunofluorescentiekleuring om directe moleculaire interacties te bevestigen. Overexpressie van MALAT1 verhoogde de migratie van SK-OV-3-cellen met 20% en invasie met 5%, vergezeld van een significante toename van SNAI2-expressie (P < 0,01). Omgekeerd onderdrukte MALAT1 knockdown deze fenotypes. Dual-luciferase-assays bevestigden dat miR-200c-3p direct bindt aan zowel MALAT1 als SNAI2 (P < 0,001). overexpressie van miR-200c-3p verminderde MALAT1-gedreven EMT door SNAI2 te downreguleren (P < 0,05), terwijl het herstellen van SNAI2 de remmende effecten van MALAT1-uitschakeling op metastase omkeerde. Dit protocol toont aan dat MALAT1 EMT en metastase in EOC bevordert door te functioneren als een ceRNA dat miR-200c-3p sekwestreert, wat leidt tot derepressie van SNAI2. De bevindingen bieden een nieuw mechanistisch inzicht en identificeren de MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2-as als een potentieel therapeutisch doelwit om metastasen van eierstokkanker te remmen.

Inleiding

Eierstokkanker (OvCa) is een zeer verraderlijke en laat gediagnosticeerde maligniteit. Het vordert doorgaans asymptomatisch tot het bereiken van latere stadia, gekenmerkt door agressieve groei, voornamelijk in de peritoneale holte. Dit pathologische proces presenteert zich meestal met ascites, verminderde therapeutische respons en een slechte prognose¹. Epidemiologische statistieken uit 2018 onthulden wereldwijd ongeveer 295.000 nieuw gediagnosticeerde gevallen, met 185.000 sterftegevallen, wat een aanhoudend opwaarts traject in ziektelast weerspiegelt². Hoewel moderne behandelingsprotocollen chirurgische ingrepen en farmacologische regimes omvatten, zorgen de aanhoudende beperkingen van vroege opsporing in combinatie met metastase en therapeutische resistentie ervoor dat de overlevingspercentages op lange termijn onder de 45%³ blijven. Recidief binnen 12-18 maanden wordt vaak waargenomen bij veel patiënten met gevorderde ziekte⁴. Deze klinische realiteit onderstreept de dringende noodzaak om klinisch relevante diagnostische markers en therapeutische monitoringstrategieën te identificeren. Daarom is het waardevol voor het identificeren van klinisch relevante diagnostische markers.

Momenteel hebben onderzoekers ontdekt dat een aanzienlijk deel van het menselijk genoom lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) ^genereert5. LncRNA's coderen niet voor eiwitten, bestaan uitsluitend in RNA-vorm en spelen een regulerende rol in verschillende biologische functies van cellen. LncRNA's vertonen niet-conservering en vertonen zeer weefselspecifieke expressiepatronen⁶. Met name is specifieke overexpressie van lncRNA's waargenomen in meerdere kankerweefsels⁷. Het concurrerende endogene RNA (ceRNA) mechanisme heeft een nieuwe manier van RNA-interactie onthuld. Het is algemeen bekend dat microRNA's (miRNA's) genen tot zwijgen kunnen brengen door sequentiespecifieke interacties met 3'untranstranse regio's (UTR) van mRNA. Ondertussen kunnen niet-coderende RNA's (ncRNA's) competitief binden aan miRNA, waardoor hun vermogen om zich aan doelgenen te hechten wordt belemmerd en genexpressie wordt beïnvloed⁸. Het ceRNA-mechanisme is momenteel de meest algemeen aanvaarde hypothese voor de regulerende rol van lncRNA's. De tripartiete overspraak tussen coderende transcripten, miRNA's en regulerende RNA's construeert ingewikkelde moleculaire netwerken die de initiatie en progressie van tumoren beïnvloeden⁹.

MALAT1 werd voor het eerst geïdentificeerd in niet-kleincellige longkankermetastasen en is naar voren gekomen als een wijd tot overexpressie gebracht lncRNA bij tal van maligniteiten¹⁰. In onze eerdere studies hebben we een verhoogde expressie van MALAT1 in OvCa-weefsels geïdentificeerd die direct geassocieerd is met OvCa-stadiëring¹¹. Hier presenteren we een protocol om MALAT1-expressie genetisch te moduleren in de epitheliale OvCa (EOC) cellijn SK-OV-3 en beoordelen we de impact ervan op epitheliale-mesenchymale transitie (EMT)-gerelateerde eiwitexpressie, migratiecapaciteit en invasief potentieel via moleculaire assays zoals qPCR, western blotting, dual-luciferase reporter-assays en functionele assays zoals wondgenezingsassays en Transwell-assays. Het doel is om het moleculaire mechanisme op te helderen waarmee MALAT1 EMT en metastatische disseminatie in EOC reguleert door interacties met miR-200c-3p en SNAI2.

Bestaande methoden voor het bestuderen van lncRNA-miRNA-interacties maken vaak alleen gebruik van in silico-voorspellingsinstrumenten , die mogelijk niet experimenteel zijn gevalideerd. Voor EMT-regulatiestudies bieden traditionele histologische methoden mogelijk geen gedetailleerde moleculaire inzichten. Door gebruik te maken van dual-luciferase reporter-assays voor experimentele validatie, overwint onze studie deze beperkingen en biedt het een betrouwbaardere bevestiging van voorspelde interacties. Bovendien maakt de combinatie van meerdere functionele assays, zoals scratch- en Transwell-assays, naast moleculaire technieken, een uitgebreid begrip van EMT op zowel cellulair als moleculair niveau mogelijk, en overtreft het de diepgang van single-assay-benaderingen.

Protocol

Celcultuur en transfectie

De SK-OV-3 menselijke OvCa-cellijn werd onder standaardomstandigheden gekweekt. De cellen werden bewaard in een kweekmedium bestaande uit 89% McCoy's 5A, 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine-oplossing, in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO₂. Het medium werd elke 2-3 dagen vervangen en de cellen werden gepasseerd bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing met behulp van 0,25% trypsine-EDTA. Lentivirale constructen voor MALAT1-overexpressie en MALAT1-knockdown (shRNA), evenals miR-200c-3p mimic, inhibitor en negatieve controles, samen met SNAI2-gericht siRNA en het bijbehorende controle-siRNA, werden verkregen uit commerciële bronnen. Voor transfectie werden de cellen sk-ov-3 gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/well in 500 μL volledig medium en toegestaan om 's nachts te hechten. Transfecties werden uitgevoerd met behulp van een op lipiden gebaseerd transfectiereagens (RRID: AB_2548650) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort, werden de nucleïnezuren (miRNA-nabootsers/inhibitoren of siRNA's) en een lipide-gebaseerd transfectiereagens in verminderd-serummiddel afzonderlijk verdund, geïncubeerd gedurende 5 min, dan samen gemengd en geïncubeerd voor een extra 15 min bij kamertemperatuur om complexatie toe te staan. De complexen werden druppelsgewijs aan de cellen toegevoegd. Na 6 uur werd het medium vervangen door vers compleet medium. De cellen werden 24-48 uur na de transfectie geoogst voor stroomafwaartse analyses.

Real-time fluorescerende kwantitatieve PCR (qPCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit gekweekte SK-OV-3-cellen met behulp van het RNA-extractiereagens volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden cellen gelyseerd in 1 ml reagens per putje van een plaat met 6 putjes, en RNA werd geïsoleerd met behulp van een commerciële RNA-extractiekit volgens het meegeleverde protocol. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden bepaald met behulp van een spectrofotometer en monsters met een A₂₆₀/A_{280-verhouding} tussen 1,8 en 2,0 werden gebruikt voor downstream-toepassingen. Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met behulp van de RT Master Mix (RRID: SCR_018597) met 500 ng totaal RNA in een reactievolume van 20 μL. De thermische cyclusomstandigheden waren als volgt: 37 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 85 °C gedurende 5 s om de reverse transcriptase te inactiveren. Het resulterende cDNA werd tot gebruik bewaard bij -20 °C. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van een commerciële miRNA qRT-PCR-detectiekit op een real-time PCR-instrument. Elke reactie werd uitgevoerd in een volume van 20 μl met 10 μl 2x qPCR-mastermix, 1 μl specifieke primers (vooruit en achteruit, 10 μM), 2 μl cDNA-sjabloon en 7 μl RNasevrij water. De thermische cyclusomstandigheden waren: 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s. Er werd een analyse van de smeltcurve uitgevoerd om de productspecificiteit te verifiëren. Expressieniveaus werden berekend met behulp van de ΔΔCt-methode, met GAPDH (voor mRNA) of U6 (voor miRNA) als interne controles. Alle reacties werden in drievoud uitgevoerd en de gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.
OPMERKING: Het RNA-extractiereagens is een gevaarlijke chemische stof. Het moet in een zuurkast worden gehanteerd, omdat het bijtend is en huid- en oogirritatie kan veroorzaken. Afval dat het reagens bevat, moet worden verwijderd in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften voor de verwijdering van gevaarlijk afval.

Scratch test

SK-OV-3-cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/putje en gekweekt totdat ze een samenvloeiing van ongeveer 90-100% bereikten, waarbij een uniforme monolaag werd gevormd. Een steriele pipetpunt van 10 μl werd vervolgens gebruikt om een lineaire kras door de celmonolaag in het midden van elk putje te creëren. Om de consistentie te garanderen, werd tijdens de krasvorming dezelfde hoek en druk uitgeoefend op alle putten. Na het krabben werd PBS toegevoegd om losgeraakte cellen te verwijderen met twee zachte wasbeurten. Cellen werden vervolgens gekweekt in serumvrij McCoy's 5A-medium om proliferatie-effecten te minimaliseren. Beelden van het krasgebied werden onmiddellijk (0 uur) en opnieuw om 24 uur en 48 uur vastgelegd met behulp van een omgekeerde microscoop met een vergroting van 10x. De breedte van de kras op elk tijdstip werd gemeten met behulp van ImageJ-software en het percentage wondsluiting in vergelijking met de initiële breedte die werd gebruikt om de migratiesnelheid te berekenen.

Transwell-test

SK-OV-3-cellen werden gezaaid in de bovenste kamers van Transwell-inserts (bovenste kamer bevat 200 μL 1% compleet medium, onderste kamer bevat 1 ml 5% compleet medium) met een dichtheid van 5 × 10³ cellen per insert, geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO₂ bevochtigde omgeving gedurende 24 uur vóór verdere analyse. Na een incubatie van 24 uur werden de inserts verwijderd en 3x gewassen met PBS, gevolgd door fixatie in 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten. Na het wassen met PBS werden de cellen gekleurd met een 1% kristalviolette oplossing. Na kleuring werden de cellen gespoeld met PBS en geobserveerd onder een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Kristalviolet is een biologische vlek en kan schadelijk zijn bij inslikken of in contact komen met de huid. Er moet voorzichtig mee worden omgegaan en afval moet op de juiste manier worden verwijderd in overeenstemming met de lokale regelgeving.

Dual-luciferase reporter-test

Getransfecteerde cellen worden geïncubeerd onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO₂ bevochtigde omgeving) gedurende 48 uur vóór lysis. Na 48 uur incubatie werden de cellen gelyseerd en gecentrifugeerd bij 5.000 g × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Een aliquot van 50 μL van het bovenstaande werd overgebracht naar een plaat met 96 putjes, gevolgd door de opeenvolgende toevoeging van 100 μL firefly luciferase reagens en 100 μL Renilla luciferase reagens aan elke put. Firefly- en Renilla-luciferase-activiteiten werden gemeten met behulp van het Dual-Luciferase Reporter Assay-systeem op een Luminometer. De luciferase-activiteit van Renilla werd genormaliseerd naar Firefly-luciferase-activiteit om rekening te houden met variaties in transfectie-efficiëntie.

Immunofluorescentie-test

SK-OV-3-cellen werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd in 4% PFA en vervolgens 3x gewassen met PBS. Om niet-specifieke binding te blokkeren, werden cellen geïncubeerd met 5% geitenserum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na blokkering werden de cellen 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen E-cadherine (RRID: AB_2833860), N-cadherine (RRID: AB_2837725) en Vimentin (RRID: AB_2835318), elk verdund 1:200. De volgende dag werden de cellen 3x gewassen met PBS en geïncubeerd met geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen [anti-muis IgG-FITC (RRID: AB_2843438) en anti-konijn IgG-FITC (RRID: AB_2843439)] verdund 1:500 gedurende 1 uur bij 37 °C in het donker.
OPMERKING: Paraformaldehyde is giftig en potentieel kankerverwekkend. Er moet voorzichtig mee worden omgegaan, met het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) zoals handschoenen en een veiligheidsbril. Afval dat PFA bevat, moet als gevaarlijk afval worden verwijderd.

Statistische analyse

Voor vergelijkingen tussen twee groepen werd een t-toets gebruikt en voor vergelijkingen met meerdere groepen werd ANOVA toegepast. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Statistische significantie werd vastgesteld op *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Alle experimenten werden uitgevoerd met drie biologische replicaten (n = 3).

Resultaten

Migrerende en invasieve capaciteiten van SK-OV-3-cellen gemoduleerd door MALAT1

De experimentele workflow wordt geschetst in Figuur 1. Om de rol van MALAT1 in de migratie en invasie van OvCa-cellen te onderzoeken, hebben we de expressie ervan in SK-OV-3-cellen gemoduleerd. Na knockdown van MALAT1 bevestigd...

Discussie

OvCa, de vijfde belangrijkste gynaecologische kanker, blijft een grote zorg voor de gezondheid van vrouwen². De meeste gevallen worden echter in een vergevorderd stadium geïdentificeerd, wat de effectieve behandelingsopties aanzienlijk beperkt, wat resulteert in een minimale verbetering van de totale overlevingspercentages¹². Kankermetastasen vallen op als een belangrijke bijdrage aan de mortaliteit van patiënten in EOC^13<...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 μm PVDF membranes	Beyotime	FFP32
All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit	FulenGen	QP115
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025
Chemiluminescence substrate	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Chemiluminescence substrate	Millipore	WBKLS0100
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit	beyotime	RG027
Foetal bovine serum	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
Goat Anti-Mouse IgG FITC	Affinity	S0007
Goat Anti-Rabbit IgG FITC	Affinity	S0008
Lipofectamine 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	sj-lip-2500
MALAT1 interference lentivirus	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-sh
MALAT1 overexpression lentivirus	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	LV-MALAT1-OE
McCoy's 5A	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p mimic	SHANGHAI GENECHEM Co., Ltd.	mic-hsa-200c-3p
Multifunctional enzyme immunoassay analyzer	Perkin Elmer	Envision 2100
Penicillin-streptomycin solution	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Phosphatase inhibitor cocktail	GSbioth	GS1439A
Primary antibody E-cadherin	Affinity	BF0219
Primary antibody N-cadherin	Affinity	AF5239
Primary antibody Vimentin	Affinity	AF7013
PrimeScript RT Master Mix	Takara	RR036A
Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	CFX96
Refrigerated Centrifuge	eppendorf	5810R
RIPA lysis buffer	GSbioth	GS504A
SDS-polyacrylamide gels	Beyotime	P0012A
Secondary antibody Goat Anti-Mouse IgG FITC	Affinity	S0007
Secondary antibody Goat Anti-Rabbit IgG FITC	Affinity	S0008
SNAI2 siRNA	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-hsa-snail2
StarBase database	Sun Yat-sen University	http://starbase.sysu.edu.cn
The BCA assay kit	Dingguo Biotech	BCA02
The Cell culture incubator	Heraeus	Hera cell 150
The imaging analysis system	Bio-Rad	GEL DOC 1000
The inverted microscope	Mshot	MI152-N
The RNA extraction kit	ECOTOP	EK-1328-50T
TRIzol reagent	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Universal electrophoresis power supply	wixscientific	WIX-EP600