Verbetering van het welzijn van gerbils door positieve bekrachtigingstraining in onderzoeksomgevingen

Samenvatting

Clickertraining dient als positieve bekrachtigingstechniek voor laboratoriumgerbils. Deze methode heeft tot doel stress te verminderen en de efficiëntie van de hantering te verbeteren door middel van positieve bekrachtiging, en zo bij te dragen aan het welzijn van proefdieren.

Samenvatting

Het verbeteren van het welzijn van proefdieren door het minimaliseren van stress en het bevorderen van soortspecifieke hantering is een centraal doel van hedendaags biomedisch onderzoek wereldwijd. Clickertraining, een algemeen erkende vorm van positieve bekrachtigingstraining, maakt gebruik van een klikgeluid als geconditioneerde bekrachtiger om het gewenste gedrag en de beloning te overbruggen, waardoor dieren sneller en met minder stress kunnen leren. Onze onderzoeksgroep heeft eerder aangetoond dat clickertraining functioneert als een vorm van cognitieve verrijking bij muizen en ratten. In de huidige studie hebben we deze trainingsaanpak met succes aangepast voor Mongoolse gerbils (Meriones unguiculatus), waarbij we het protocol hebben afgestemd op de soortspecifieke gedragskenmerken van gerbils. Een cohort van 43 ingeteelde gerbils (27 vrouwtjes en 16 mannetjes) onderging een gestandaardiseerd 10-daags clickertrainingsprotocol, waarin ze leerden om vrijwillig de hand van de onderzoeker te benaderen en ermee om te gaan in ruil voor een voedselbeloning. Na de trainingsperiode werden de dieren onderworpen aan gedragsbeoordelingen, waaronder een Open Field Test en een gestandaardiseerde menselijke interactietest, om de effecten van training op verkennend gedrag en interactie tussen mens en dier te evalueren. Onze bevindingen tonen aan dat de implementatie van clickertraining bij gerbils snel, efficiënt en goed verdragen wordt. Getrainde dieren, met name vrouwtjes, vertoonden een verhoogde vrijwillige interactie met de hand van de onderzoeker en verminderd angstachtig gedrag. Deze resultaten suggereren dat soort-aangepaste clickertrainingsprotocollen de ontwikkeling van vertrouwen tussen onderzoeker en dier kunnen vergemakkelijken, waardoor uiteindelijk stress wordt verminderd en zowel het dierenwelzijn als de betrouwbaarheid van experimentele resultaten worden verbeterd.

Inleiding

Het verfijnen van het gebruik van dieren in biomedisch onderzoek om stress te verminderen en het welzijn te verbeteren, is een algemeen erkende internationale doelstelling ^1,2,3. In 2022 meldde de Europese Commissie dat van de 838.539 dieren die in de Europese Unie (Alures) worden gebruikt, er 3.440 gerbils⁴ waren. In Duitsland werden in 2023 ongeveer 1,46 miljoen gewervelde dieren en koppotigen gebruikt in dierproeven op grond van artikel 7, lid 2, van de dierenwelzijnswet (TierSchG)⁵. In combinatie met dieren die voor wetenschappelijke doeleinden zijn gedood, bedroeg het totale aantal proefdieren dat in 2023 in Duitsland werd gebruikt ongeveer 2,1 miljoen⁶. Deze cijfers benadrukken het belang van het gebruik van gerbils in biomedisch onderzoek en benadrukken de noodzaak van voortdurende verbeteringen in protocollen voor dierenwelzijn.

De gedragsbehoeften van proefdieren en het belang van managementstrategieën die soortspecifiek welzijn ondersteunen, worden algemeen erkend als essentieel voor de ethische en wetenschappelijke praktijk⁷. Interacties tussen mens en dier in de veehouderij zijn vaak beperkt tot de essentiële taak om dieren over te brengen van vuile naar schone kooien, zonder een band tussen de geleider en het dier te bevorderen. Dit gebrek aan sociale interactie kan leiden tot stress, wat een negatieve invloed heeft op het gedrag en de fysiologie van dieren, wat uiteindelijk de experimentele resultaten beïnvloedt⁸. Onjuiste behandeling is een bekende bron van variabiliteit in onderzoeksgegevens⁹. Het optillen van muizen aan de staart verhoogt bijvoorbeeld angst en stress, terwijl tunnel- of open-handmethoden een vrijwillige aanpak bevorderen en angstachtig gedrag verminderen ^10,11. Behandeling wordt zelfs gebruikt als een gestandaardiseerde acute stressor in studies bij kleine zoogdieren vanwege de consistente effecten op fysiologische markers zoals glucocorticoïdespiegels¹². Deze bevindingen benadrukken de substantiële impact van korte menselijke interacties en de noodzaak van verfijnde behandelingstechnieken met weinig stress¹³.

Verfijning op basis van training wordt steeds meer erkend als een effectieve methode om zowel het welzijn van dieren als de onderzoekskwaliteit te verbeteren^10,14. Een van de meest effectieve trainingsmethoden die in dierproeven worden gebruikt, is clickertraining, die vaak gepaard gaat met voedselbeloningen^15,16. In de afgelopen decennia zijn 34 studies over clickertraining gepubliceerd, wat de groeiende wetenschappelijke belangstelling voor deze trainingsbenadering weerspiegelt¹⁷. Studies tonen aan dat honden (47%) en paarden (30%) de meest getrainde proefdieren zijn, gevolgd door katten, runderen, vissen, geiten en apen (elk 3%)¹⁷. Getrainde dieren kunnen vrijwillig deelnemen aan procedures, waardoor stress wordt verminderd en de noodzaak van fysieke fixatie wordt geminimaliseerd¹⁸.

Protocollen voor positieve bekrachtiging zijn ook toegepast op kleine zoogdieren. Recente studies rapporteren succesvolle training bij konijnen voor houderijprocedures en gerbils voor gedragsonderzoek^19,20. In sommige eerdere werken hebben we aangetoond dat clicker-getrainde muizen meer contact vertoonden met onderzoekers en minder gedragsindicatoren geassocieerd met stress, zoals plassen, ontlasting, vocalisatie en zweefgedrag 21,22,23. Dit komt overeen met bevindingen uit de veterinaire sector, waar is aangetoond dat training van kleine zoogdieren - zoals konijnen, knaagdieren en fretten - angstreacties vermindert en het hanteren vergemakkelijkt door middel van positieve bekrachtigingstechnieken²⁴. We zagen met name ook een seksespecifiek verschil in trainingsprestaties: vrouwelijke muizen vertoonden een grotere motivatie en een hogere responsfrequentie dan mannen tijdens trainingssessies. Dit suggereert dat vrouwelijke muizen onder gestandaardiseerde omstandigheden gemakkelijker kunnen deelnemen aan vrijwillige trainingstaken²¹.

Hoewel veelbelovend, zijn de bestaande trainingsbenaderingen voor gerbils meestal gebonden aan specifieke gedragsparadigma's en niet ontworpen voor algemeen gebruik in de dagelijkse houderijroutines²⁵. Een breed toepasbaar, gestandaardiseerd protocol voor Mongoolse gerbils (Meriones unguiculatus) - onafhankelijk van een bepaalde experimentele opstelling - is nog niet vastgesteld. Om deze lacune te dichten, was de huidige studie gericht op het ontwikkelen en valideren van een eenvoudig clickertrainingsprotocol dat is afgestemd op de soortspecifieke kenmerken van gerbils. Het protocol richt zich op stressvermindering door middel van zachte behandeling en vrijwillige betrokkenheid bij de onderzoeker. Onze hypothese is dat deze aanpak het dierenwelzijn zal verbeteren, consistentere gedragsbasislijnen zal vaststellen en de betrouwbaarheid van experimentele resultaten zal vergroten. Vanwege zijn eenvoud en flexibiliteit kan het gemakkelijk worden geïmplementeerd in een breed scala aan laboratoriumomgevingen.

Om de effectiviteit en toepasbaarheid van het voorgestelde trainingsprotocol te beoordelen, hebben we de volgende specifieke, toetsbare voorspellingen geformuleerd:
Getrainde gerbils zouden het doelgedrag betrouwbaar uitvoeren - vrijwillig zittend op de hand van de onderzoeker - binnen een trainingsperiode van 10 dagen.
Getrainde dieren zouden in een gestandaardiseerde test meer vrijwillige interactie met de onderzoeker vertonen in vergelijking met ongetrainde controles.
Getrainde dieren zouden gedragsindicatoren vertonen die consistent zijn met verminderd angstachtig gedrag, met name door meer tijd door te brengen in de middenzone van een open veldtest.
Vrouwelijke gerbils kunnen sterkere gedragsreacties op training vertonen dan mannetjes, wat mogelijk een weerspiegeling is van sekseverschillen in aanpassing aan menselijke interactie.
Deze voorspellingen leidden het ontwerp van de gedragsbeoordelingen en vormden de basis voor de evaluatiecriteria voor het protocol.

Protocol

De behandeling van de gerbils en de experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor dierenverzorging. Goedgekeurd door de vergunning G 21-1-100 van de lokale autoriteiten. Het protocol omvat 10 dagen training (maandag tot en met vrijdag), met pauzes in het weekend (zaterdag en zondag). Het protocol kan eenvoudig worden aangepast aan specifieke behoeften. Alle benodigde materialen staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

1. Verkrijg het vereiste aantal dieren bij de institutionele fokkerij. Houd de dieren in een licht/donker-cyclus van 12 uur in een open huisvestingssysteem.
2. Speen nakomelingen op een leeftijd van 5 weken. Oormerk de dieren na het spenen en huisvesten ze in groepen van hetzelfde geslacht van 2-3 personen per kooi.
3. Achterlaat en huisvest alle gerbils in kooien van het type 4 (590 x 380 x 200 mm; 1.815^m2). Rust elke kooi uit met ten minste drie tunnels en kauw op hout voor verrijking. Zorg voor voedsel en water ad libitum (zie Materiaaltabel).
4. Wijs dieren willekeurig toe aan getrainde (vrouwtjes: n=27; mannetjes: n=16) en ongetrainde (vrouwtjes: n=16; mannetjes: n=5) groepen om selectiebias te minimaliseren en te zorgen voor vergelijkbare basislijncondities voor alle behandelingen. Wen dieren aan zowel de voedselbeloning als de hand van de onderzoeker in de broedkooiomgeving, zoals beschreven in stap 2.2. van het protocol. Bij aanvang van de training waren de dieren (vrouwtjes en mannetjes) ongeveer 8 weken oud.

2. Gewennen aan dieren

LET OP: Als gerbils niet zijn vervoerd, kan de gewenningstijd worden verkort. Het grafische overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Bij zelf gefokte dieren kan de gewenningsperiode voor jonge dieren drastisch worden verkort als de ouderdieren goed gewend zijn en de gewenning met de hand ten minste eenmaal per week wordt voortgezet vanaf het moment dat de jongen mobiel worden. Deze voorbereidende fase is bedoeld om neofobie te verminderen en een positieve associatie met voedselverwerking tot stand te brengen, waardoor een soepele overgang naar clicker-gebaseerde training wordt gegarandeerd.

Figuur 1: Overzicht van gewennings- en trainingsprotocollen voor extern en zelf gefokte dieren: Deze figuur schetst de tijdlijn en de belangrijkste procedurele stappen van het gewennings- en trainingsprotocol dat wordt gebruikt voor extern gefokte gerbils en intern gefokte gerbils. Het protocol omvat de eerste behandeling, voedselgewenning, clickerintroductie en clickertraining, aangepast op basis van de herkomst en pre-blootstelling van de dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Week 1: Gewenning voor dieren van buitenaf
   1. Bij aankomst huisvesten gerbils in groepen van hetzelfde geslacht van 2-3 dieren per kooi. Voeg nest- en strooiselmateriaal uit de transportbox toe, samen met een kleine hoeveelheid bekende voedselpellets om de acclimatisatie te ondersteunen.
   2. Voorzie elke kooi van ten minste 3-4 tunnels (bijv. kartonnen kokers of plastic schuilplaatsen) en vul de bodembedekking tot een diepte van ongeveer 8-10 cm om soorttypisch graafgedrag mogelijk te maken.
   3. Vermijd het optillen van gerbils aan de staart, omdat dit stress kan veroorzaken en staartletsel kan veroorzaken²⁶. Gebruik in plaats daarvan een holle handgreep om de dieren indien nodig voorzichtig over te brengen (zie figuur 2A).
   4. Begin onmiddellijk met gewenning op basis van voedsel door ~5 g pompoen- of zonnebloempitten in het beddengoed te strooien (zie Materiaaltabel). Dit stimuleert het graven en maakt de dieren vertrouwd met de beloning.
   5. Breng de volgende dag een hand met ~10 beloningszaden 2-3 minuten in de kooi. Als de dieren de zaden niet rechtstreeks opnemen, doe dan ~5 g zaden in het strooisel.
   6. Herhaal deze procedure eenmaal daags totdat de dieren voedsel uit de hand nemen. Dit duurt meestal ongeveer een week. Als dit eerder lukt, ga dan verder met clickertraining (zie stap 3).
   7. Beoordeel tijdens de gewenning de voedselvoorkeuren door verschillende zaadsoorten in de hand te geven en de resterende zaden na 2-3 minuten te tellen.
      OPMERKING: Geef voedsel in kleine porties uitsluitend als beloning om het gewenste gedrag te versterken. Zorg ervoor dat de voedselbeloning voldoet aan de voedingsrichtlijnen voor proefdieren. Hoewel dit protocol pompoen- en zonnebloempitten gebruikt, kunnen andere geschikte beloningen worden gebruikt als ze voldoen aan de hygiëne-eisen van de faciliteit. In de handel verkrijgbare traktaties die zijn ontworpen voor proefdieren zijn ook acceptabel.
2. Week 1: Gewenning voor in eigen huis gefokte dieren
   1. Begin met gewenning aan de voedselbeloning direct in de kweekkooi door ~5 g pompoen- of zonnebloempitten in het strooisel te plaatsen, zoals beschreven in stap 2.1.3. Deze stap moet vóór de bevalling met het broedpaar worden gestart om vertrouwd te raken met de beloning.
   2. Zodra de fokdieren op betrouwbare wijze zaden uit het strooisel consumeren, biedt u de beloning uit de hand van de onderzoeker aan volgens de procedure die in stap 2.1.4 wordt beschreven. Laat dieren verkennen en neem de beloning vrijwillig gedurende 2-3 minuten per dag.
   3. Nadat het vrouwtje is bevallen, schort u de gewenning aan de hand op voor minimaal 1 week. Blijf gedurende deze tijd 1-5 keer per week voedselbeloningen rechtstreeks in het beddengoed van de kooi geven om de blootstelling te behouden.
   4. Hervat de gewenning aan de hand zodra de pups mobiel worden (ongeveer dag 18-21 na de bevalling). Laat de dieren de hand verkennen met een beloning van 2-3 minuten per sessie. Dit ondersteunt de vroege vertrouwdheid van het nageslacht met de trainingscontext.
   5. Als ze 5 weken oud zijn, spenen de jongen en huisvesten ze in groepen van hetzelfde geslacht van 2-3 dieren per kooi. Zet de gewenning voort door de voedselbeloning op de dag van overdracht in het nieuwe beddengoed van de kooi te leggen.
   6. Op de dag na het spenen moet opnieuw met de hand worden gerezen zoals hierboven beschreven (stappen 2.1.4 en 2.1.5).
   7. Herhaal deze procedure eenmaal daags totdat de dieren voedsel uit de hand nemen.
   8. Zodra jongeren de beloning consequent uit de hand nemen, gaat u verder met het trainingsprotocol (zie stap 3). Dit duurt meestal ongeveer 1 week. Als dit eerder lukt, ga dan verder met clickertraining (zie stap 3).

Figuur 2: Behandeling en gewenning van een gerbil met behulp van positieve bekrachtiging. (A) Komvormige behandeling van een gerbil: Een gerbil wordt voorzichtig met beide handen op een komvormige manier geschept om stress te minimaliseren. (B) Begin van de training: De hand van de onderzoeker wordt op de vloer van de kooi gelegd met voedselbeloningen in de handpalm. De gerbil krijgt een beloning en een klik wordt gebruikt om het gedrag te markeren. (C) De gerbil gaat vrijwillig op de hand van de onderzoeker zitten, wat wijst op een succesvolle training. De voedselbeloning wordt zichtbaar op de handpalm geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Clicker training

OPMERKING: Begin pas met trainen als de gerbil voedsel uit de hand van de onderzoeker accepteert. Als dit niet het geval is, verleng dan de gewenningsfase van het voedsel tot na de duur zoals beschreven in stap 2.1. of 2.2.

1. Overzicht van trainingen
   1. Voer één trainingssessie per gerbil per dag uit, elk van 4 minuten. Voer de training direct in de kooi van het dier uit om stress te verminderen en een vertrouwde omgeving te behouden. Het is niet nodig om alle verrijkingsitems te verwijderen, maar zorg ervoor dat er ten minste één buis of tunnel in de kooi blijft en dat er voldoende ruimte is voor de hand van de onderzoeker op de vloer van de kooi.
      OPMERKING: Idealiter zou de training moeten worden gegeven in een speciale stilteruimte. Als dit niet haalbaar is, kan een geluidwerende kast in de dierenopvang worden gebruikt, op voorwaarde dat deze de blootstelling aan omgevingslawaai en storingen effectief vermindert.
   2. Om te voorkomen dat auditieve signalen verstorende variabelen worden, moet u verbale communicatie of vocale geluiden tijdens de trainingssessies strikt vermijden. Beperk elke vocale interactie met de dieren tot perioden buiten de trainingscontext.
   3. Gebruik herhaling van het doelgedrag (bijv. vrijwillig op de hand van de experimentator zitten) als een praktische indicator van succesvolle gewenning en leren tijdens de training. Overweeg om succesvol te trainen wanneer dit gedrag ten minste 5x per sessie gedurende drie opeenvolgende dagen wordt waargenomen (zie stap 3.4.4).
2. Voorbereiding van de training
   1. Bereid alle benodigde materialen voor: snijd zonnebloempitten doormidden of pompoenpitten in drieën als beloning. Zorg voor een voetklikker, een timer-app die kleuraanwijzingen gebruikt (geen geluid) of een andere stille timer (digitaal of analoog) en een schone secundaire kooi (zie Materiaaltabel).
   2. Verplaats de thuiskooi naar een rustige, afleidingsvrije ruimte waar de training zal plaatsvinden om omgevingsstressoren te minimaliseren. Vermijd plotselinge of harde geluiden zoals praten, dichtslaande deuren of geluiden van apparatuur tijdens de sessie, aangezien gerbils zeer gevoelig zijn voor auditieve prikkels.
   3. Verwijder alle verrijkingsitems behalve één tunnel. Zorg ervoor dat de resterende tunnel de toegang tot het trainingsgebied niet belemmert. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte is voor een hand.
   4. Breng gezelschapsdieren over naar de schone secundaire kooi, inclusief een kleine hoeveelheid bodembedekking en verrijking in de thuiskooi om stress tijdens de scheiding te verminderen.
   5. Plaats de voetklikker (een mechanisch apparaat dat een klikgeluid produceert wanneer er met de voet op wordt gedrukt; zie Materiaaltabel) onder de tafel of het trainingsoppervlak. Hierdoor kan de trainer het gewenste gedrag markeren zonder zijn handen te gebruiken, waardoor een consistente timing wordt gegarandeerd terwijl beide handen beschikbaar blijven voor interactie met het dier.
3. Trainingsdag 1-5: Clicker introductie
   1. De timer starten: tik op Start in de app of druk op de knop op de stille timer.
   2. Ga voor de kooi staan of zitten. Leg vijf stukken van het geselecteerde zaad in de handpalm en leg de hand plat op het substraat in een hoek van de kooi.
   3. Klik op het moment dat de gerbil een zaadje uit de hand pakt (Figuur 2B). Als er meerdere zaadjes achter elkaar worden genomen, klik dan na elk zaadje. Gebruik het klikgeluid om de voedselbeloning te associëren met het gedrag van het voeren uit de hand.
   4. Beëindig de training wanneer het dier 5x het gewenste gedrag vertoont of wanneer de timer nul bereikt (na 4 min).
   5. Begin vanaf dag 3, afhankelijk van het gedrag van de gerbil, met het één voor één aanbieden van de zaden. Houd de hand net boven de vloer van de kooi om het dier aan te moedigen zich uit te rekken of kort contact te maken met zijn voorpoten (Figuur 2C). Dit helpt het gedrag geleidelijk vorm te geven en bereidt het dier voor op de volgende trainingsfase (zie stap 3.4).
4. Trainingsdag 6-10
   OPMERKING: Optionele trainingstip: Als een gerbil terughoudend is om op de hand te klimmen, verdeel de taak dan in kleinere, vertrouwenwekkende stappen. Versterk eerst het gedrag van het aanraken van de hand voordat je verwacht dat het dier zal klimmen. Gebruik deze vormgevende strategie om stress te verminderen en dieren te ondersteunen die meer tijd nodig hebben om te wennen aan het hanteren.
   1. Bied slechts één zaadje per keer aan. Houd de hand iets boven het substraat om de gerbil aan te moedigen volledig op de hand te klimmen om toegang te krijgen tot de beloning. Deze stap bouwt voort op het vorige vormgevingsproces en vertegenwoordigt de overgang naar het uiteindelijke doelgedrag.
   2. Zodra de gerbil consequent op de hand klimt, klik je om het gedrag te versterken. Begin met het aanbieden van het zaad met je tweede hand (zie afbeelding 3). Houd de trainingshand boven de bodem van de kooi, zodat de gerbil er volledig op moet klimmen. Gebruik één hand om het zaad tussen duim en wijsvinger te houden (Figuur 3A) of gebruik één hand om de beloning boven de palm van de andere hand te presenteren, waar het dier op wordt aangemoedigd om op te klimmen (Figuur 3B).
   3. Beoordeel het trainingssucces als de gerbil 5x per sessie vrijwillig op de hand van de onderzoeker gaat zitten en de beloning van de handpalm of van de secondehand accepteert.
   4. Beëindig de training na een maximale duur van 3 weken (5 dagen per week) of wanneer het trainingsdoel consequent wordt gedemonstreerd over een periode van 3 opeenvolgende dagen.
      OPMERKING: Hoewel het protocol een gestructureerde trainingsfase van maximaal 3 weken definieert, kunnen versterkingssessies indien nodig na deze periode worden voortgezet, vooral wanneer er een vertraging wordt verwacht tussen het einde van de training en het begin van de experimentele procedures. Voortdurende positieve bekrachtiging kan helpen het aangeleerde gedrag te behouden en betrouwbaarheid in de loop van de tijd te garanderen. We raden aan om één keer per week door te gaan met versterken na succesvolle afronding van de trainingsfase. Om consistentie en vergelijkbaarheid tussen dieren te garanderen, moet echter een duidelijk trainingseindpunt - gedefinieerd door de stabiele en herhaalde uitvoering van het doelgedrag - worden gedocumenteerd voordat wordt overgegaan op experimentele taken.

Figuur 3: Voorbeelden van de positionering van de hand tijdens het uitreiken van de beloning. (A) De beloning wordt tussen de duim en wijsvinger van dezelfde hand gehouden, terwijl het dier op de handpalm zit. (B) De beloning wordt vastgehouden met de tweede en wijsvinger, terwijl het dier op de palm van de andere hand zit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Gedragstesten afnemen na de training (dag 10+)

1. Test van interactie
   OPMERKING: Afhankelijke variabelen: De primaire afhankelijke variabele is de duur van vrijwillige interactie tussen het dier en de hand van de onderzoeker gedurende de tweede minuut van de test. Interactie wordt gedefinieerd als direct fysiek contact, zoals snuiven, klimmen of het aanraken van de hand met de voorpoten¹⁰. Gedragsscoring is gebaseerd op video-opnamen en kan handmatig of met behulp van gedragsanalysesoftware worden uitgevoerd.
   1. Plaats een camera die op een statief is gemonteerd boven de tafel waar de interactietest zal worden uitgevoerd.
   2. Als dieren in groepen worden gehuisvest, breng de dieren dan over naar een schone secundaire kooi met een handvol strooisel uit de huiskooi.
   3. Verwijder alle tunnels of schuilplaatsen uit de kooi en plaats ze in de schone kooi. Laat alleen het strooisel in de testkooi (=thuiskooi). Plaats de thuiskooi, die nu alleen beddengoed bevat, onder de camera.
   4. Gebruik een komvormig handvat om het testdier voorzichtig terug te brengen naar de thuiskooi.
   5. Begin met opnemen. Blijf 1 minuut stil voor de kooi. Plaats na 1 minuut een gehandschoende hand nog 1 minuut in de kooi bij de voorkant van de kooi.
   6. Wissel handschoenen af tussen dieren van verschillende geslachten.
2. Open veld test
   OPMERKING: Afhankelijke variabelen: Gemeten variabelen zijn onder meer de totale afgelegde afstand, de tijd doorgebracht in de middenzone versus de periferie, het aantal centrale inzendingen en opfokgebeurtenissen. Deze indicatoren weerspiegelen algemene locomotorische activiteit en angstachtig gedrag. Verhoogde centrumtijd wordt meestal geïnterpreteerd als verminderde angst. Gedrag wordt vastgelegd door middel van video en geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde trackingsoftware (zie Materiaaltabel).
   1. Plaats een camera boven de open veldbak (100 cm x 100 cm x 40 cm).
   2. Begin met video-opname en plaats het dier vervolgens voorzichtig in het midden van de arena met behulp van een komvormige hantering. Gedrag opnemen gedurende 7 minuten.
   3. Breng het dier na de test terug naar zijn thuiskooi. Reinig de open veldbak en wanden na elk dier met 70% ethanol. Wacht tot de ethanol volledig is verdampt voordat u het volgende dier in de bak plaatst.

5. Statistische analyse

1. Hoewel volledige blindering van de onderzoeker tijdens de trainingssessies niet haalbaar was vanwege de aard van directe interactie met de dieren, moet u gedragsgegevensanalyse op een geblindeerde manier uitvoeren om de vooringenomenheid van de waarnemer te verminderen.
2. Voor zowel de interactie- als de open veldtesten neemt u alle sessies op video op. Verzamel afhankelijke variabelen, hetzij handmatig door getrainde waarnemers (interactietest) of automatisch met behulp van gedragsanalysesoftware (zie materiaaltabel) voor opnames in het open veld (tijd doorgebracht in de middenzone).
3. Voorafgaand aan de statistische analyse test u alle gegevens op normale verdeling met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Identificeer uitschieters en sluit ze uit met behulp van de ROUT-methode (Robust Regression and Outlier Removal) met een percentage valse ontdekkingen (Q) dat is ingesteld op 10%. Om de effecten van training en seks op gedragsresultaten te analyseren, voert u een ANOVA met herhaalde metingen in twee richtingen uit voor de interactietest en een gemengde tweerichtings-ANOVA om de tijd die in het midden van de open veldtest wordt doorgebracht, te evalueren.
4. Categoriseer de interactietest en de cumulatieve tijd doorgebracht in de middenzone van het open veld als de belangrijkste afhankelijke variabelen. Voer post-hocvergelijkingen uit met behulp van Tukey's Honest Significant Difference (HSD)-test. Een p-waarde van < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van statistische software (zie Materiaaltabel).

Resultaten

Alle getrainde gerbils leerden de toegewezen taak binnen 10 dagen, wat de haalbaarheid van clickertraining bij deze soort aantoont. Figuur 4 toont het trainingssucces van vrouwelijke (n=27) en mannelijke (n=16) gerbils van dag 1 tot dag 10. De ANOVA met herhaalde metingen die de prestaties op trainingsdag 1 versus dag 10 bij mannelijke en vrouwelijke gerbils analyseerde, toonde geen significant interactie-effect tussen tijd en geslacht (F_{(1, 41)} = 0,003; p = 0,955), wat aangeeft dat de verbetering in de loop van de tijd voor beide geslachten vergelijkbaar was. Er werd een zeer significant effect van de tijd waargenomen (F_{(1, 41}) = 38,83, p < 0,0001), wat aantoont dat gerbils van beide geslachten op dag 10 volledig voldeden aan het trainingsprotocol.

Het feit dat getrainde gerbils hun toegewezen taak binnen 10 dagen volbrachten, bevestigt de effectiviteit van de clickertrainingsmethodologie bij deze soort. Dit slagingspercentage komt overeen met de fundamentele principes van operante conditionering, waarbij de clicker functioneert als een secundaire bekrachtiger die de kloof overbrugt tussen het gewenste gedrag en de primaire beloning (zonnebloem-/pompoenzaden). De clicker dient als een brug tussen het gedrag en de beloning, waardoor de trainer het exacte moment waarop het gewenste gedrag zich voordoet met precieze timing kan markeren. Dit helpt bij het creëren van een duidelijk en onmiddellijk verband tussen de actie en het positieve gevolg ervan.

Gedragstesten werden uitgevoerd na voltooiing van het trainingsprotocol, met name na trainingsdag 10. Tweeweg gemengde ANOVA-analyse toonde aan dat getrainde gerbils de vrijwillige interactie met de hand van de onderzoeker verhoogden (Figuur 5A). Er werd een significant effect van training gedetecteerd (F _{(1, 60)} = 22,89; p < 0,0001), waarbij getrainde dieren vaker met de onderzoeker omgingen. Post-hocanalyse onthulde de specifieke verschillen in training bij vrouwen (p < 0,0001, n = 27) en mannen (p = 0,049, n = 16). Sekse-effect werd niet waargenomen (F_{(1, 60)} = 0,621, p = 0,434), wat suggereert dat mannelijke en vrouwelijke gerbils over het algemeen vergelijkbaar presteerden. De analyse onthulde geen significante interactie tussen geslacht en training (F_{(1, 60)} = 0,078, p = 0,781).

De verhoogde vrijwillige interactie door de gerbils geeft aan dat clickertraining aangeboren angstreacties effectief verminderde door positieve bekrachtiging. Dit kan helpen om stress tijdens hantering en experimentele procedures te minimaliseren, waardoor zowel het dierenwelzijn als de gegevenskwaliteit worden verbeterd.

Een beoordeling van angstachtig gedrag na de training werd uitgevoerd met behulp van de Open Field Test. Figuur 5B illustreert de cumulatieve duur die in de middenzone wordt doorgebracht. Er werd geen interactie tussen geslacht en training waargenomen in de cumulatieve duur in de middenzone van de Open Field Test (F_{(1, 60)} = 0,101, p = 0,751). Bovendien werd er geen significant hoofdeffect van seks gevonden (F_{(1, 60)} = 0,001, p = 0,969. Er werd een zeer significant hoofdeffect van training waargenomen (F_{(1, 60)} = 17,26, p < 0,0001; HSD Tukey-test: p = 0,003 en p = 0,052 bij respectievelijk vrouwtjes en mannetjes), wat aangeeft dat getrainde gerbils significant meer tijd in het centrum doorbrachten in vergelijking met ongetrainde. Deze resultaten weerspiegelen gedragsreacties die zijn gemeten nadat de dieren de trainingsperiode van 10 dagen hadden voltooid.

Het OFT maakt gebruik van het natuurlijke benaderingsvermijdingsconflict dat knaagdieren ervaren bij het verkennen van nieuwe omgevingen²⁷. Gerbils kunnen hun aangeboren drang om te verkennen in evenwicht brengen met hun natuurlijke neiging om potentieel gevaarlijke open ruimtes te vermijden. Daarom geeft het feit dat getrainde gerbils meer tijd doorbrachten in de angstaanjagende middenzone aan dat de clickertraining hun algehele gedragsbereidheid om te verkennen verbeterde, wat kan duiden op verbeteringen in het algemene welzijn.

Figuur 4: Validatie van clickertraining. Trainingssucces op dag 1 versus dag 10 voor mannelijke en vrouwelijke proefpersonen: Het trainingssucces werd beoordeeld bij vrouwelijke (witte balken, n = 27) en mannelijke (grijze balken, n = 16) gerbils op dag 1 en dag 10 van het trainingsprotocol. Een in twee richtingen herhaalde metingen ANOVA onthulde een significant hoofdeffect van de trainingsdag (p < 0,0001). Meerdere vergelijkingen met behulp van Tukey's HSD-test toonden een significante toename van het trainingssucces van dag 1 tot dag 10 bij zowel vrouwen (p < 0,0001, n = 27) als mannen (p < 0,0001, n = 16). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Gedragsbeoordeling. (A) Test van interactie: De duur van de interactie met de hand van de onderzoeker (in s) werd gemeten in getrainde (grijze balken) en ongetrainde (witte balken) vrouwelijke en mannelijke Gerbils nadat de dieren de trainingsperiode van 10 dagen hadden voltooid. De tweeweg gemengde ANOVA toonde een significant hoofdeffect van training (p < 0,05) en een significant interactie-effect (p < 0,05). Post-hocanalyse met behulp van de HSD-test van Tukey toonde aan dat getrainde muizen significant langer interactie hadden met de hand van de onderzoeker in vergelijking met ongetrainde muizen (vrouwtjes: p < 0,0001, mannetjes: p = 0,0497). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Getrainde vrouwtjes: n= 27; vrouwtjes ongetraind: n =16; getrainde mannetjes: n = 16; Mannetjes ongetraind: n = 5. (B) Open Field Test: De test is afgenomen na voltooiing van het trainingsprotocol, met name na trainingsdag 10. De cumulatieve duur doorgebracht in de middenzone(s) werd gemeten bij getrainde (grijze balken) en ongetrainde (witte balken) vrouwelijke en mannelijke gerbils. Een tweeweg gemengde ANOVA werd uitgevoerd om de effecten van training op de exploratie van de middenzone te analyseren. Meerdere vergelijkingen met behulp van Tukey's HSD-test toonden aan dat getrainde vrouwtjes significant meer tijd in de middenzone doorbrachten in vergelijking met ongetrainde vrouwtjes (p = 0,003). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Getrainde vrouwtjes: n= 27; vrouwtjes ongetraind: n =16; getrainde mannetjes: n = 16; Mannetjes ongetraind: n = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De bevindingen tonen de effectiviteit aan van het voorgestelde protocol om gerbils te laten wennen aan menselijke interactie in experimentele omgevingen. Het vermogen van alle getrainde dieren om de gewenste taak binnen 10 dagen te voltooien, benadrukt de efficiëntie van deze methode.

Een cruciale stap in het protocol is de geleidelijke gewenning aan de hand van de experimentator, zodat de gerbils menselijke interactie associëren met een positieve stimulus. Het gebruik van soortspecifieke beloningen optimaliseert het trainingsproces verder. Aanpassingen, zoals het aanpassen van de duur van trainingssessies of het wijzigen van het beloningstype, kunnen het protocol verder afstemmen op individuele verschillen tussen gerbils en het optimaliseren voor de specifieke vereisten van het experiment.

We richten ons op de opvallende soortspecifieke verschillen in gedrag en leerdynamiek tussen muizen en Mongoolse gerbils. Met dergelijke verschillen moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen van trainingsprotocollen. Muizen zijn bijvoorbeeld vaak neofoober en stressgevoeliger, waardoor ze vaak meer tijd nodig hebben om te wennen aan nieuwe omgevingen en menselijke interactie²⁸. Gerbils vertonen daarentegen een hogere exploratieve drang en sociale nieuwsgierigheid, wat een snellere betrokkenheid bij trainingstaken kan vergemakkelijken²⁹. In de huidige studie naderden gerbils gemakkelijk de hand van de onderzoeker en leerden ze de clicker te associëren met een beloning in minder sessies dan normaal gerapporteerd voor muizen^21,22. Gerbils vertoonden echter ook een grotere individuele variabiliteit, vooral bij mannen, wat een weerspiegeling kan zijn van seksespecifieke stress of motiverende factoren die minder uitgesproken zijn in muismodellen. Deze verschillen benadrukken het belang van soort-aangepaste trainingsstrategieën en suggereren dat gerbils baat kunnen hebben bij kortere, op beloning gerichte sessies met meer nadruk op vrijwillige interactie, terwijl muizen mogelijk meer geleidelijke desensibilisatie en consistente herhaling nodig hebben. Het begrijpen van deze gedrags- en cognitieve verschillen is cruciaal voor het verfijnen van trainingsprotocollen en het maximaliseren van hun effectiviteit bij verschillende soorten.

Mongoolse gerbils kunnen aanzienlijk profiteren van niet-specifieke of gegeneraliseerde clickertraining, die zich richt op positieve interactie tussen mens en dier en basale gedragsconditionering in plaats van voorbereiding op een bepaalde experimentele opstelling. Een dergelijke gegeneraliseerde training verbetert de hanteringstolerantie, verlaagt de basale stressniveaus en bevordert een meer voorspelbare gedragsbasislijn factoren die waardevol zijn in een breed scala van experimentele contexten³⁰. Niet-specifieke training bevordert gedragsflexibiliteit en consistente vrijwillige interactie met de onderzoeker, waardoor dieren zich beter kunnen aanpassen aan verschillende omgevingen, opstellingen of testparadigma's 16,31,32. Dit is vooral gunstig bij langetermijnstudies of meerfasenexperimenten, waarbij dieren worden blootgesteld aan verschillende procedures. In de huidige studie vertoonden gerbils, hoewel de training niet direct gekoppeld was aan een enkel testprotocol, een verbeterde interactie met de onderzoeker en verminderd stressgerelateerd gedrag, wat het idee ondersteunt dat algemene gewenning door positieve bekrachtiging de algehele experimentele veerkracht en het dierenwelzijn kan verbeteren.

Naast een verhoogde interactie met de onderzoeker, brachten getrainde vrouwelijke dieren aanzienlijk meer tijd door in de middenzone van de open veldtest. Dit gedragspatroon wordt gewoonlijk geïnterpreteerd als een vermindering van angstachtig gedrag bij knaagdieren, met name als reactie op nieuwe of licht aversieve omgevingen³³. Deze bevindingen suggereren dat clickertraining kan bijdragen aan verminderde gedragsindicatoren van angst, waardoor het vermogen van de dieren om met experimentele procedures om te gaan wordt vergroot. Dit ondersteunt de bredere conclusie dat gewenningsprotocollen op basis van positieve bekrachtiging de stressbestendigheid en gedragsstabiliteit bij laboratoriumgerbils kunnen verbeteren. Naast stressvermindering heeft clickertraining bredere implicaties voor experimentele resultaten³⁴. Getrainde gerbils vertoonden een grotere tolerantie voor hantering, waardoor door stress veroorzaakte fysiologische variaties die onderzoeksresultaten zouden kunnen verwarren, tot een minimum worden beperkt. Soortgelijke bevindingen zijn gerapporteerd bij andere soorten, waaronder laboratoriumkonijnen en muizen, waar clicker-getrainde dieren meer interactie met de onderzoeker vertoonden en minder angst- en depressiegerelateerd gedrag, zoals verminderd urineren, ontlasting, vocalisatie en zweefgedrag^19,21.

Deze resultaten benadrukken het potentieel van clickertraining om zowel het dierenwelzijn als de consistentie van gedragsgegevens te verbeteren door de variabiliteit in stressgerelateerde reacties te verminderen. Het is belangrijk om te verduidelijken dat het doel van dit protocol niet is om dieren te conditioneren om inherent aversieve procedures - zoals bloedafnames - te associëren met positieve stimuli zoals de clicker. Het doel is eerder om basisstress te verminderen, dieren te laten wennen aan menselijke interactie en vrijwillige deelname aan neutrale of licht uitdagende taken te bevorderen. Hoewel sommige studies het gebruik van positieve bekrachtiging hebben onderzocht om dieren voor te bereiden op meer invasieve procedures³⁵, vereist dit een zorgvuldig gestructureerd desensibilisatieproces en valt het buiten het toepassingsgebied van het huidige protocol. Verkeerde toepassing van clicker-cues in contexten die verband houden met ongemak kan inderdaad leiden tot onbedoelde negatieve associaties. Wanneer positieve bekrachtigingstechnieken echter correct worden toegepast, kunnen ze dieren helpen om te gaan met potentieel aversieve procedures door de voorspelbaarheid te vergroten en een zekere mate van controle mogelijk te maken³⁶. Verdere studies zijn nodig om te bepalen of gerbils betrouwbaar kunnen worden getraind voor dergelijke contexten, zoals met succes is aangetoond bij andere soorten zoals honden en niet-menselijke primaten^37,38.

Ondanks het succes heeft de methode beperkingen. Sommige gerbils hadden langere gewenningsperioden nodig, wat wijst op individuele variabiliteit in leersnelheid. Bovendien beperkt het relatief lage aantal ongetrainde mannelijke gerbils de statistische kracht van de analyse, waardoor het moeilijk is om robuuste conclusies te trekken. Het vergroten van de steekproefomvang in deze groep zou waarschijnlijk de betrouwbaarheid en interpreteerbaarheid van de resultaten verbeteren. Verdere studies moeten mogelijke sekseverschillen in stressreacties en leermechanismen onderzoeken.

De bredere implicaties van deze studie reiken verder dan stressvermindering. Het implementeren van gestructureerde trainingsprotocollen als onderdeel van de standaardveehouderij kan de variabiliteit veroorzaakt door door stress veroorzaakte fysiologische reacties verminderen en de betrouwbaarheid van experimentele resultaten verbeteren^39,40. Dit is vooral relevant in disciplines zoals neurowetenschappen of metabolisch onderzoek, waar stress een kritische verstorende factor is. Zorgvuldige rapportage en standaardisatie van trainingsprocedures zijn essentieel om onbedoelde verrijkingseffecten te voorkomen.

In de toekomst moet toekomstig onderzoek alternatieve versterkingsschema's, automatisering van trainingsprocedures en langetermijneffecten tussen soorten onderzoeken. Met toenemende wetenschappelijke ondersteuning vertegenwoordigt clickertraining een waardevolle verfijningsstrategie die zowel de gegevenskwaliteit als het dierenwelzijn kan verbeteren. Het standaardiseren van trainings- en behandelingsprotocollen in laboratoria kan de reproduceerbaarheid helpen verbeteren en een bredere acceptatie van humane en effectieve praktijken in biomedisch onderzoek ondersteunen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cages	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
Camera	Sony	HDR-CX240E	digital HD Video Camera Recorder
Food pellets	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. I-Clicker-Blau
Foot Clicker		https://www.hundeschulen.com
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	Versie 10 voor Windows
Open field Box	Noldus	MXO1S-M001	opaal 100 x 100 x 40 cm
Pumpkin seeds	REWE	8820911	REWE Bio
Pylon viewer	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Sunflowerseeds	Seeberger	4744292
Tripod	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
Tunnels	Plexx	14179	152 x 76 x 3 mm