Dit protocol bespreekt standaardisatie voor de bereiding van op CAGE gebaseerde ionische vloeistofsystemen om reproduceerbaarheid te garanderen en de algehele workflow in verschillende wetenschappelijke laboratoria te stroomlijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ontwikkeling, karakterisering en evaluatie van op CAGE gebaseerde ionische vloeistofsystemen voor transdermale toediening
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ionische vloeistoffen hebben onlangs opmerkelijke erkenning gekregen voor hun toepassingen binnen de afgifte van geneesmiddelen, met name hun potentieel om cutane geneesmiddelpenetratie mogelijk te maken en de doordringing van geneesmiddelen te verbeteren. Ionische vloeistoffen verbeteren niet alleen de barrièredoorlaatbaarheid, maar hebben ook uitstekende oplossende eigenschappen, waardoor de uitdaging van het oplossen van slecht oplosbare geneesmiddelen wordt aangegaan. Door de grote asymmetrie tussen de organische kationen en anionen blijven deze functionele zouten bij kamertemperatuur vloeibaar. Vanuit een toepassingsperspectief bieden ionische vloeistoffen een veelbelovende en zeer afstembare benadering om meerdere therapeutische gebieden te bedienen. Een biocompatibele ionische vloeistof bestaande uit choline en geraninezuur (CAGE), in een stoichiometrische ionenverhouding van 1:2, heeft een enorm potentieel voor transdermale afgifte van een breed scala aan actieve farmaceutische ingrediënten, waaronder kleine moleculen, peptiden, eiwitten en nucleïnezuren. Dit heeft een minimale impact op de huidbarrièrefunctie. Hierin delen we onze methoden voor de voorbereiding, karakterisering en evaluatie van CAGE. Representatieve resultaten worden getoond voor CAGE-karakterisering met behulp van NMR-spectroscopie, differentiële scanningcalorimetrie, Karl-Fischer-titratie voor analyse van het watergehalte en ex vivo barrière-interactiestudies op varkenshuid.
Inleiding
De huid is het grootste en meest vitale orgaan van het lichaam, dat dient als een beschermende barrière tegen schadelijke stoffen en tegelijkertijd waterverlies voorkomt1. Tegelijkertijd biedt het aanbrengen van medicijnen op en door de huid een breed scala aan voordelen. In vergelijking met injectables en orale toediening verhoogt cutane toediening de therapietrouw van de patiënt en vermijdt het first-pass metabolisme in de lever2. Vooral voor huidaandoeningen blinken huidtoedieningsformules uit in het bieden van een lokaal effect, waardoor de systemische blootstelling wordt verminderd3. De bijna ondoordringbare aard van de huid vormt echter een aanzienlijke uitdaging voor een succesvolle huidafgifte4. De menselijke huid bestaat uit drie verschillende lagen: de epidermis, dermis en hypodermis4. De epidermis is de buitenste laag van de huid en kan verder worden onderverdeeld in verschillende sublagen, waarbij de hoornlaag de buitenste laag is, die voornamelijk uit keratinocyten bestaat. De hoornlaag fungeert als een prominente permeatiebarrière voor de meeste moleculen en remt hun transport naar diepere lagen van de huid5. Deze barrièrefunctie komt voort uit de aanwezigheid van corneocyten ingebed in een dicht opeengepakte lipidenregeling, die voornamelijk fosfolipiden, sterolen en ceramiden omvat, vaak aangeduid als de bakstenen en mortelstructuur6. Om deze huidbarrière te overwinnen, zijn chemische permeatieversterkers (CPE's) ingezet om macromoleculen af te leveren, omdat ze de structuur van de hoornlaag verstoren door interactie met de lipiden en eiwitten die erin aanwezig zijn7.
Ionische vloeistoffen (IL's) zijn naar voren gekomen als de volgende generatie CPE's8. Deze bestaan uit omvangrijke organische kationen en anionen, op een asymmetrische manier gerangschikt en gecoördineerd door zwakke, niet-directionele ionische interacties9. Vanwege deze zwakke intermoleculaire krachten bestaan IL's als vloeistoffen onder de 100 °C en zijn ze niet in staat om in een goed gedefinieerde kristalstructuur te worden verpakt10. IL's zijn in hoge mate afstembaar, omdat hun werkzaamheid sterk afhankelijk is van de keuze van kationen of anionen en de stoichiometrische verhouding tussen deze ionen. Daarom hebben ze een hoog oplosbaar en stabiliserend vermogen voor geneesmiddelen met gevarieerde hydrofobiciteiten11. IL's dienen de unieke eigenschappen van zowel lipiden als polymeren door te zorgen voor een langdurige afgifte en inkapseling van macromoleculen, respectievelijk12.
Biocompatibele IL's op basis van choline en geranzuur (CAGE), aanwezig in een stoichiometrische molaire verhouding van 1:2, hebben belangrijke toepassingen bij transdermale toediening van zowel hydrofiele als hydrofobe verbindingen. Van CAGE is gemeld dat het de transdermale afgifte van eiwitten (insuline13) en nucleïnezuren (siRNA14) aanzienlijk verbetert. CAGE wordt bereid door zoutmetathesereactie tussen cholinebicarbonaat en geranzuur, met CO2 als bijproduct15. Zoutmetathesereactie biedt de vorming van nieuwe verbindingen via ionenuitwisseling onder milde omstandigheden op een directe, snelle en zeer selectieve manier. Over het algemeen is er een gebrek aan gemakkelijk te volgen workflows voor de ontwikkeling en evaluatie van CAGE IL. Daarom bieden we hier zo'n workflow, waarin elke fase van de CAGE-voorbereiding wordt beschreven, zodat onderzoekers met verschillende achtergronden deze onderzoeksruimte kunnen betreden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijn 2010/63 van de Europese Unie en werden goedgekeurd door de Deense Veterinaire en Voedseladministratie (licentienr. DK-13-oth-931833).
1. CAGE-preparatie door zoutmetathesereactie
- Herkristallisatie van geranzuur (85% zuiverheid, mol gewt 168,23 g/mol)
- Neem een kolf met ronde bodem van 500 ml en meet het gewicht.
- Weeg 40,0 g geraninezuur af in de kolf. Dit komt overeen met 0,2 mol geraninezuur.
- Herkristalliseer geranzuur in een 70:30% (g/m) geraninezuur:aceton: Voeg (40 g * 0,85 * 0,30) / (0,70 * 0,784 g / ml) = 18,42 ml aceton toe aan de kolf met ronde bodem.
- Neem een bekerglas van 5 l en bereid ongeveer 0,5 l droogijs en ethanol.
- Plaats de kolf met ronde bodem in de droogijs-ethanol koude mix zonder te zwenken om externe koeling mogelijk te maken. Decanteer aceton en onzuiverheden van het vaste/geherkristalliseerde geranzuur wanneer de kristallisatie een evenwicht heeft bereikt (wat overeenkomt met ongeveer het volume van de toegevoegde aceton, meestal binnen 0,5-2 uur). Herhaal deze stap 5-6 keer om voldoende zuiverheid te garanderen.
- Verwijder de resterende aceton door roterende verdamping onder vacuüm bij 40 tpm gedurende ten minste 20 minuten of totdat de kolf met ronde bodem niet meer koud aanvoelt bij aanraking (aceton heeft een dampspanning van 240 mbar bij 20 °C).
- Weeg en noteer de massa van de kolf en het opnieuw gekristalliseerde geranzuur. Bereken de opbrengst op basis van het initiële gewicht van de lege kolf. Het verwachte rendementsbereik is 60-80%.
- Zout metathese reactie
- Bereken voor een molaire verhouding van 2:1 van geranzuur:choline het aantal mol choline, rekening houdend met de opbrengst van de herkristallisatie van geranzuur. Bij een opbrengst van 70% moet bijvoorbeeld 0,07 mol choline worden toegevoegd (0,2*70/100=0,14, 0,14/2 = 0,07).
- Cholinebicarbonaat heeft een zuiverheid van 80% en een molecuulgewicht van 165,19 g/mol. Voeg dienovereenkomstig 14,45 g (0,07 * 165,19 = 11,56 g; 100/80 * 11,56 g = 14,45 g) cholinebicarbonaat druppelsgewijs toe om spillover te voorkomen.
- Roer het monster een nacht met een snelheid van 300 tpm (of geschikt) bij kamertemperatuur (18 ± 3 uur) of totdat de CO2 -verdamping stopt.
- Droog het monster door roterende verdamping bij 60 °C bij 30 mbar gedurende 40 minuten. Verhoog eerst de temperatuur en verlaag vervolgens langzaam de druk om schuimvorming te voorkomen.
- Variot KOOI in glazen injectieflacons in hoeveelheden die geschikt zijn voor de beoogde toepassing (bv. 2 ml CAGE in glazen injectieflacons van 4 ml).
- Droog de injectieflacons onder vacuüm bij 60 °C gedurende 48 uur.
2. Karakterisering van CAGE
- Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie
- Los de CAGE op tot een concentratie van 25 mg/ml in gedeutereerd dimethylsulfoxide (d-DMSO) en zorg voor een eindvolume van ten minste 500 μl.
OPMERKING: Gedeutereerde oplosmiddelen zijn essentieel in NMR om interferentie van waterstofatomen in het oplosmiddel te voorkomen. - Breng 500 μL van de bereide oplossing over in een schone, droge NMR-buis (meestal 5 mm diameter, afhankelijk van het instrument). Sluit de tube af met een dop om verdamping en vervuiling te voorkomen.
OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen, omdat deze de homogeniteit van het magnetische veld kunnen beïnvloeden. - Gebruik een NMR-spectrometer (bijv. 400 MHz) met de volgende parameters:
-Aantal scans: 8-16 voor 1uur NMR; 1.000-5.000 voor 13C NMR (afhankelijk van concentratie en gewenste signaal-ruisverhouding (S/N).
-Ontspanningsvertraging (D1): 1-2 s voor 1uur en 13C NMR. - Verwerk gegevens met behulp van de juiste software.
- Pas aan voor optimale piekvormen via fase- en basislijncorrectie.
OPMERKING: Dit wordt meestal uitgevoerd in de NMR-software op het tabblad Verwerking of Correctie (afhankelijk van de gebruikte software), waar automatische tools voor faseaanpassing en basislijncorrectie beschikbaar zijn. - Gebruik de resterende oplosmiddelpiek (d-DMSO) als referentie: ~ ongeveer 2,50 ppm gedurende 1uur, ~ ongeveer 39,52 ppm voor 13C NMR. Zie Fulmer et al.15voor verwijzingen naar onzuiverheden.
- Pas aan voor optimale piekvormen via fase- en basislijncorrectie.
- Integreer pieken en wijs ze toe aan protonen in de structuur (zie figuur 1).
- Los de CAGE op tot een concentratie van 25 mg/ml in gedeutereerd dimethylsulfoxide (d-DMSO) en zorg voor een eindvolume van ten minste 500 μl.
- Watergehalte zoals bepaald door Karl Fischer-titratie
- Los 300 mg CAGE op in 300 μL methanol. Doe het in een spuit van 1 ml en weeg voor en na de injectie.
- Bepaal het watergehalte met behulp van een coulometrische Karl Fischer-titrator volgens de instructies van de fabrikant.
- Injecteer het monster via het septum met behulp van een spuit in de titratiecel, voer het lege spuitgewicht in en druk op Enter. Het resultaat wordt weergegeven als % w/w.
- Pas het watergehalte van methanol aan om het werkelijke watergehalte in de kooi te verkrijgen (meestal 1-2% g/g). (Wmonster = Wmonster+verdunningsmiddel*(msteekproef+mverdunningsmiddel) - (Wverdunningsmiddel*mverdunningsmiddel)/msteekproef).
- Thermische stabiliteit van CAGE door differentiële scanningcalorimetrie (DSC)
- Doe 3-5 mg van elk monster in aluminium Tzero-pannen en sluit af met een hermetisch deksel.
- Analyseer de monsters met behulp van een DSC in het temperatuurbereik van 80 °C tot - 80 °C met een isotherme periode van 10 minuten alvorens af te koelen tot - 80°C.
- Gebruik een constante verwarmings-/afkoelsnelheid van 5 °C/min en een stikstofzuivering van 50 ml/min.
- Verwerk de gegevens met behulp van geschikte software.
3. Ex vivo beoordeling van de interactie tussen de huidbarrière
- Dermatoomverwerking van de huid van varkens
- Snijd geëxpandeerd polystyreen (EPS) op maat van het dermatoommes en wikkel het in met enttape. Gebruik de huid die is verzameld uit de lendenstreek van varkens met behulp van een scalpel. Hier werd de huid verkregen van 3,5 maanden oude vrouwelijke Deense Landras- of Yorkshire-varkens (30-40 kg).
- Verwijder de spier- en vetweefsel. Om de dermatovorming van het weefsel te vergemakkelijken, is het belangrijk om te zorgen voor een vlakke en gelijkmatige basolaterale zijde.
- Verwijder zoveel mogelijk haar van de huid met behulp van een tondeuse.
- Spoel de huid af met met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) om bloed en losse haren te verwijderen.
- Snijd de huid met een mes in kleinere stukken (5 cm x 15 cm) om de EPS-blokken te passen.
- Bevestig de huid met naalden aan het EPS-blok.
- Stel het dermatoom in op een dikte van 0,5 mm en snijd de huid in secties.
- Bewaar de dermatose huid tussen twee lagen grafting tape en bewaar bij -70 °C.
- Transepidermaal waterverlies (TEWL)
- Bereid PBS (pH 7,4) voor door 1 tablet op te lossen in 200 ml ultrapuur water. Ontgas gedurende 20 minuten in een ultrasoonbad.
- Zet het waterbad aan dat is aangesloten op de Franz diffusiecellen. Voeg ongeveer 12 ml ontgaste PBS en een magnetische kraal toe aan elke cel. Schakel de magnetische roering in (bijv. bij 600 RPM) en zorg voor een gelijkmatige verdeling in het receptormedium zonder turbulentie te veroorzaken. Merk op dat niet alle Franz-celopstellingen een nauwkeurige regeling van de roersnelheid mogelijk maken. Stel de verwarmingsbron in op een temperatuur van 37 °C in het receptormedium.
- Snijd de dermatose huid met een scalpel in stukken met een diameter van ongeveer 3 cm (of de juiste maat) en monteer de dermatose huid voorzichtig op de Franz diffusiecellen met behulp van klemmen en afdichtringen, met de hoornlaag naar boven.
- Vul vervolgens de receptorkamers volledig met PBS met behulp van een glazen pasteurpipet en zorg ervoor dat ze gevuld zijn tot de markering die het bekende volume van het receptormedium aangeeft. Verwijder luchtbellen door de cellen voorzichtig om te keren. Hydrateer gedurende 30 min.
- Schakel het TEWL-apparaat in en houd het 20 minuten in evenwicht totdat het stabiel is volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Plaats de TEWL-sonde op elke Franz-cel en druk op Start in de software. Houd het vast totdat een meting wordt weergegeven.
- Voeg 300 μL monster toe aan de huid (in drievouden, n=3) en sluit af door enttape op de Franz-cel te plaatsen. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C (receptor medium temperatuur).
- Verwijder het monster door het weefsel af te vegen met pluisvrije doekjes. Laat 30 minuten intrekken.
- Meet TEWL voor elke cel om het effect van de monsters op de huidbarrière te onderzoeken. Bereken TEWL-waarden ten opzichte van pre-expositiewaarden en pas aan ten opzichte van PBS-controle (Relatieve TEWL = (TEWL post-TEWL-pre/TEWLpre)/(TEWL(PBS)post-TEWL(PBS)pre/TEWL(PBS)pre))*100.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
NMR-spectra
Het doel van deze techniek is om de succesvolle vorming van CAGE te bevestigen door de chemische omgevingen van waterstof- en koolstofatomen te analyseren met behulp van 1H en 13C NMR-spectroscopie. De resulterende spectra bieden karakteristieke chemische verschuivingen, splitsingspatronen en integratiewaarden die de moleculaire structuur en samenstelling van de gesynthetiseerde IL weerspiegelen. Het proton-NMR-spectrum in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in dit werk beschreven bereidingsmethode van CAGE is overgenomen uit de literatuur15. Het is echter belangrijk om te erkennen dat het syntheseproces gevoelig is voor verschillende externe factoren, die de eigenschappen van het eindproduct kunnen beïnvloeden. Daarom moet het CAGE-systeem, eenmaal voorbereid, worden gekarakteriseerd met behulp van technieken zoals NMR-spectroscopie om de vorming van CAGE te bevestigen.
Zoals te zien is...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Stichting LEO subsidienr. LF15007 en LF-FE-23-700013.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5 mm NMR tubes | Sigma Aldrich | 41121705 | |
| Acetone | VWR | 23L064039 | |
| Aluminium Tzero Pans | TA Instruments | 90,16,83,901 | |
| Aqua Flux Device | Biox Systems | ||
| Bruker Avance III NMR | Bruker | Instrument voor NMR-spectroscopie | |
| Choline Bicarbonate | Sigma Aldrich | C7519 | |
| Dermatome | Zimmer Biomet | ||
| Differentiële Scanning Calorimeter | TA Instruments | ||
| Ethanol | VWR | 23J314009 | |
| Geëxpandeerd polystyreen | Styrofoam | ||
| Franz-diffusiecellen | PermeGear | ||
| Geraanzuur | Sigma Aldrich | 427764 | |
| Grafting Tape | Parafilm | ||
| Karl Fischer-titrator | Mettler Toledo | 30252662 | |
| Methanol | VWR | 85681.32 | |
| PBS | Fischer Scientific | 10388739 | |
| TA universal analysis 2000 software | TA Instruments | Software voor DSC-gegevensanalyse | |
| TopSpin Software | Bruker | Software voor NMR-gegevensanalyse |
Referenties
- Dąbrowska, A. K., et al. The relationship between skin function, barrier properties, and body-dependent factors. Skin Res Technol. 24 (2), 165-174 (2018).
- Date, A. A., Naik, B., Nagarsenker, M. S. Novel drug delivery systems: Potential in improving topical delivery of antiacne agents. Skin Pharmacol Physiol. 19 (1), 2-16 (2005).
- Phatale, V., Vaiphei, K. K., Jha, S., Patil, D., Agrawal, M., Alexander, A. Overcoming skin barriers through advanced transdermal drug delivery approaches. J Control Release. 351, 361-380 (2022).
- Kasting, G. B., Smith, R. L., Cooper, E. R. Effect of lipid solubility and molecular size on percutaneous absorption. Skin Pharmacokinet. 1, 138-153 (1987).
- Wickett, R. R., Visscher, M. O. Structure and function of the epidermal barrier. Am J Infect Control. 34 (10), S98-S110 (2006).
- Elias, P. M. Epidermal barrier function: intercellular lamellar lipid structures, origin, composition and metabolism. J Control Release. 15 (3), 199-208 (1991).
- Moser, K., Kriwet, K., Naik, A., Kalia, Y. N., Guy, R. H. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 52 (2), 103-112 (2001).
- Lu, Y., Qi, J., Wu, W. Ionic liquids-based drug delivery: A perspective. Pharm Res. 39 (10), 2329-2334 (2022).
- Welton, T. Room-temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis. Chem Rev. 99 (8), 2071-2084 (1999).
- Lei, Z., Chen, B., Koo, Y. M., MacFarlane, D. R. Introduction: Ionic liquids. Chem Rev. 117 (10), 6633-6635 (2017).
- Huang, W., et al. Ionic liquids: Green and tailor-made solvents in drug delivery. Drug Discov Today. 25 (5), 901-908 (2020).
- Mitragotri, S. Choline geranate (CAGE): A multifaceted ionic liquid for drug delivery. J. Control. Release. 376, 593-600 (2024).
- Banerjee, A., Ibsen, K., Iwao, Y., Zakrewsky, M., Mitragotri, S. Transdermal protein delivery using choline and geranate (CAGE) deep eutectic solvent. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1601411(2017).
- Edwardson, T. G., Mori, T., Hilvert, D. Rational engineering of a designed protein cage for siRNA delivery. J Am Chem Soc. 140 (33), 10439-10442 (2018).
- Fulmer, G. R., et al. NMR chemical shifts of trace impurities: common laboratory solvents, organics, and gases in deuterated solvents relevant to the organometallic chemist. Organometallics. 29 (9), 2176-2179 (2010).
- Zakrewsky, M., et al. Ionic liquids as a class of materials for transdermal delivery and pathogen neutralization. Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 111 (37), 13313-13318 (2014).
- Torres, A. M., Price, W. S. Common problems and artifacts encountered in solution-state NMR experiments. Concepts Magn Reson. A. 45 (2), e21387(2016).
- Takeda, J., Iwao, Y., Karashima, M., Yamamoto, K., Ikeda, Y. Structural evaluation of the choline and geranic acid/water complex by SAXS and NMR analyses. ACS Biomater Sci Eng. 7 (2), 595-604 (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
