Hier presenteren we een protocol om de cardioprotectieve effecten van NRG1/ErbB4-signalering in een rattenmodel van ischemie-reperfusieschade te evalueren door oxidatieve stress en apoptotische signaalroutes te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Hier presenteren we een protocol om de cardioprotectieve effecten van NRG1/ErbB4-signalering in een rattenmodel van ischemie-reperfusieschade te evalueren door oxidatieve stress en apoptotische signaalroutes te beoordelen.
Myocardiale ischemie-reperfusieschade (MIRI) blijft een substantiële belemmering voor de behandeling van hart- en vaatziekten. De pathofysiologie van MIRI is complex en omvat oxidatieve stress, calciumoverbelasting, ontsteking en apoptose. De NRG1/ErbB4-signaalroute is betrokken bij het moduleren van oxidatieve stressreacties in het hart, waardoor cellulaire schade veroorzaakt door vrije radicalen mogelijk wordt verminderd. Deze studie had tot doel de moleculaire mechanismen op te helderen waarmee de NRG1/ErbB4-route bescherming biedt in een rattenmodel van myocardiale ischemie-reperfusie (MIRI) schade. Er werd een MIRI-model voor ratten opgesteld, waarbij 30 volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten willekeurig werden toegewezen aan vijf groepen: controle, schijnoperatie, MIRI, recombinant NRG1 en AG1478. NRG1-concentraties in hartweefsels werden gemeten met ELISA, terwijl p-ErbB4 en totale ErbB4-eiwitniveaus werden beoordeeld met Western blot. Cardiomyocytenapoptose en niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS) werden geëvalueerd door middel van flowcytometrie. In de MIRI-groep waren de NRG1-niveaus significant verlaagd in vergelijking met de controle- en schijnoperatiegroepen (p < 0,05). Behandeling met recombinante NRG1 leidde tot een duidelijke toename van de NRG1-spiegels in hartweefsel, samen met een verbeterde p-ErbB4/ErbB4-expressieverhouding (p < 0,05). De AG1478-groep vertoonde lagere NRG1-niveaus en een verminderde p-ErbB4/ErbB4-ratio in vergelijking met de recombinante NRG1-groep (p < 0,05). In termen van apoptose- en ROS-niveaus vertoonde de MIRI-groep significant hogere percentages dan de controle- en schijnoperatiegroepen (p < 0,05). Recombinante NRG1-behandeling verminderde de apoptose en ROS-spiegels van myocardcellen significant (p < 0,05), terwijl AG1478 deze effecten ook verzwakte, maar in mindere mate. De NRG1/ErbB4-signaalroute speelt een cruciale beschermende rol bij MIRI bij ratten. Suppletie met exogeen NRG1 verhoogt effectief het NRG1-gehalte in het hart, activeert de ErbB4-signaleringsroute, vermindert de apoptose van myocardcellen en verlaagt het ROS-gehalte, waardoor de door MIRI veroorzaakte schade wordt beperkt.
Myocardiale ischemie-reperfusieschade (MIRI) vormt een cruciale uitdaging bij de behandeling van hart- en vaatziekten1. Hoewel het herstellen van de bloedtoevoer naar het ischemische myocardium essentieel is voor de behandeling van een hartinfarct, kan reperfusie zelf hartweefselbeschadiging verergeren, waardoor het therapeutische effect wordt beperkt. De mechanismen die ten grondslag liggen aan MIRI zijn complex en omvatten verschillende pathofysiologische processen, waaronder oxidatieve stress, calciumoverbelasting, ontstekingsreacties en apoptose 2,3,4.
Zenuwgroeifactor 1 (NRG1) en zijn receptor Erb-B2-receptor tyrosinekinase 4 (ERBB4) spelen een cruciale rol in de cardiale fysiologie en pathologie. NRG1, een extracellulair ligand, interageert met de ErbB4-receptor om een cascade van signaalroutes te activeren die cruciaal zijn voor de ontwikkeling van het hart, het behoud van structurele integriteit en het reageren op hartletsel5. Opkomend bewijs benadrukt de rol die de NRG1/ErbB4-signaalroute speelt bij hartaandoeningen. Onder omstandigheden van myocardiale ischemie-reperfusie kunnen de expressie en functie van NRG1 veranderd zijn6. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat NRG1 de overleving van myocardcellen bevordert en overmatige apoptose remt door ErbB4 te activeren. Bovendien kan de NRG1/ErbB4-signaalroute de oxidatieve stressrespons in het hart reguleren en celbeschadiging veroorzaakt door vrije radicalen verminderen. Daarom is het ophelderen van de functie van de NRG1/ErbB4-signaalroute in MIRI van vitaal belang voor het begrijpen van de biologische basis van dit letsel en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën 7,8.
Deze studie speculeert dat de NRG1/ErbB4-signaleringsroute een beschermende rol speelt bij MIRI. Daarom werd in deze studie een rattenmodel van myocardiale ischemie-reperfusie geconstrueerd om het mechanisme van de NRG1/ErbB4-signaleringsroute in MIRI systematisch te onderzoeken. Door de concentratie van NRG1 te reguleren en de veranderingen in de activeringsstatus van ErbB4, de apoptosesnelheid van myocardcellen en het oxidatieve stressniveau te observeren. Deze studie probeert het moleculaire mechanisme te onthullen waarmee de NRG1/ErbB4-signaalroute een beschermend effect uitoefent in MIRI. De nieuwigheid van deze studie ligt in het onthullen van het belang van de NRG1/ErbB4-signaalroute bij myocardiale ischemie-reperfusieschade, en ook in het bieden van een nieuw perspectief voor de behandelingsstrategieën van hartaandoeningen op basis van deze route.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Proefdieren
Dertig volwassen mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, 8 weken oud en met een gewicht van 180-200 g, werden verkregen van een commerciële verkoper. Deze ratten werden gedurende 1 week voorafgaand aan de experimenten gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden. De experimenten kregen goedkeuring van het ethisch comité van het Nanping First Hospital (nr. NPSY202208010).
Diermodellen van myocardiale ischemie-reperfusieschade
Ratten werden verdoofd via intraperitoneale injectie van 3% pentobarbitalnatrium in een dosis van 50 mg/kg. Nadat de afwezigheid van reflexen was bevestigd, werden de dieren in rugligging geplaatst en werden de nek en borst geschoren en gedesinfecteerd met 75% ethanol. Er werd een incisie in de middenlijn (~2 cm) gemaakt om de luchtpijp bloot te leggen, gevolgd door orale intubatie met behulp van een 16 G-katheter om de doorgankelijkheid van de luchtwegen tijdens de operatie te behouden. Vervolgens werd de grote spier van de linker borstspier zorgvuldig ontleed om de derde en vierde intercostale ruimtes bloot te leggen. Een thoracotomie werd uitgevoerd door een incisie te maken tussen deze ruimtes en het hartzakje werd geopend om het hart volledig bloot te leggen. Om ischemie te induceren, werd de linker voorste dalende kransslagader (LAD) afgebonden met behulp van een 8-0 Nylon hechtdraad. Een polyethyleen slang (PE-10) werd ingebracht tussen de LAD en de ligatuur om omkeerbare occlusie mogelijk te maken. Ischemie hield 45 minuten aan, visueel bevestigd door myocardiale blancheren en ECG-veranderingen. De reperfusie werd geïnitieerd door de ligatuur los te laten, waardoor de bloedstroom gedurende 3 uur kon worden hervat. De ligatie werd 45 minuten later verwijderd.
Experimentele groepering
De ratten werden willekeurig toegewezen aan vijf groepen (n = 6 elk). (1) Controlegroep: ratten kregen standaardzorg zonder enige chirurgische ingreep of behandeling. (2) Schijnoperatiegroep: ratten ondergingen thoracotomie en threading van de linker voorste dalende kransslagader (LAD) zonder ligatie, en dienden als chirurgische controles. (3) MIRI-groep: ratten ondergingen myocardiale ischemie-reperfusieschade-inductie en kregen intragastrisch normale zoutoplossing toegediend als mediumcontrole. (4) Recombinante NRG1-groep: ratten kregen een intraveneuze injectie met recombinant humaan NRG1 (rh-NRG1) in een dosis van 5 mg/kg, 30 minuten vóór de thoracotomie, gevolgd door de MIRI-procedure. (5) AG1478-groep: ratten kregen 30 minuten voorafgaand aan de thoracotomie intraveneus rh-NRG1 (5 mg/kg) toegediend in combinatie met AG1478 (20 mg/kg), een ErbB-receptorkinaseremmer, en ondergingen vervolgens de MIRI-procedure.
Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)
Dieren werden geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van pentobarbital-natrium (150 mg/kg). Hartweefsel werd onmiddellijk na reperfusie verzameld en op ijs gehomogeniseerd in een geschikt volume ijskoud PBS. De homogenaten werden vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 1200 x g om het supernatant te scheiden. De concentratie van NRG1 in het bovenstaande werd gekwantificeerd met behulp van een in de handel verkrijgbare NRG1 ELISA-kit, waarbij de instructies van de fabrikant nauwkeurig werden gevolgd. In het kort werden monsters en standaarden toegevoegd aan de ELISA-plaatputten, gedurende de aanbevolen tijd bij kamertemperatuur geïncubeerd, gevolgd door wassen en toevoegen van detectie-antilichamen. De extinctie werd gemeten op de gespecificeerde golflengte met behulp van een microplaatlezer en NRG1-niveaus werden berekend op basis van de standaardcurve. Het monstervolume was 100 μL, de verdunning van het antilichaam was 1:100 en de golflengte voor het meten van de extinctie werd vastgesteld op 450 nm.
Analyse van de westerse vlek
Hartweefsel werd weggesneden van verdoofde ratten en gespoeld in ijskoude PBS om achtergebleven bloed te verwijderen. Voor elk hart werd ongeveer 0,5 g linkerventrikelweefsel gewogen en in 500 μl vers bereide RIPA lysisbuffer geplaatst. Het weefsel werd vervolgens met behulp van een mechanische weefselmolen op ijs gehomogeniseerd totdat het volledig was gelyseerd, gevolgd door incubatie op ijs gedurende 30 minuten om volledige eiwitextractie te garanderen. Lysaten werden gedurende 15 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 12.000 × g om vuil te verwijderen. Eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een BCA-testkit. Gelijke hoeveelheden totaal eiwit (bijv. 30 μg per baan) werden geladen en gescheiden door SDS-PAGE. Eiwitten werden vervolgens overgebracht op membranen van polyvinylideenfluoride (PVDF) met behulp van een nat overdrachtssysteem bij 100 V gedurende 90 minuten. Membranen werden geblokkeerd met 5% magere droge melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de membranen 's nachts bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen gefosforyleerd ErbB4 (p-ErbB4) en totaal ErbB4, elk verdund 1:1000. Na het wassen werden de membranen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van verbeterd chemiluminescentie (ECL) substraat en vastgelegd met behulp van een gelbeeldvormingssysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software en de verhouding van p-ErbB4 tot totaal ErbB4 werd berekend om fosforyleringsniveaus te evalueren.
Flowcytometrie
Apoptose van cardiale myocyten werd beoordeeld door middel van flowcytometrie. Hartweefsel werd fijngehakt en enzymatisch verteerd met behulp van een mengsel van collagenase type II (1 mg/ml) en protease (bijv. trypsine, 0,25%) bij 37 °C met zacht roeren gedurende 20-30 minuten. De enzymatische vertering werd beëindigd door toevoeging van een gelijk volume foetaal runderserum (FBS). De celsuspensie werd gefilterd door een nylon gaas van 70 μm en gedurende 5 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 300 × g om de cellen te verzamelen. De celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer en vervolgens geïncubeerd met Annexin V-FITC en propidiumjodide (PI) volgens het protocol van de fabrikant. Na incubatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker, werden de monsters onmiddellijk geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Vroege apoptotische cellen werden geïdentificeerd als Annexin V-positief en PI-negatief, terwijl late apoptotische of necrotische cellen positief waren voor beide markers. Apoptosepercentages werden gekwantificeerd en vergeleken tussen experimentele groepen. De poortstrategie neemt een cross-gate/rechthoekige poortinstelling aan. Bij het uitvoeren van detectie op de machine werd de dwarspoort ingesteld als een stippellijn en werden alle parameters toegepast om de consistentie van de gegevensscreening te garanderen. Het debiet werd aangepast aan de celconcentratie (op 1000 cellen/s gehouden), en het laden van monsters met lage snelheid kan verstopping van het mondstuk voorkomen.
Detectie van niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS)
Cardiomyocyten werden geïsoleerd uit hartweefsel, gevolgd door centrifugatie bij 300 × g gedurende 5 minuten en tweemaal wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De cellen werden vervolgens geïncubeerd met 10 μM 2',7'-dichloorfluoresceïnediacetaat (DCFDA) kleurstof bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker, volgens de instructies van de fabrikant. Na het kleuren werden de cellen twee keer gewassen met PBS om overtollige ongebonden kleurstof te verwijderen. Intracellulaire ROS-niveaus werden onmiddellijk gemeten door middel van flowcytometrie, waarbij de fluorescentie-intensiteit werd gedetecteerd die werd uitgezonden bij oxidatie van DCFDA. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van elk monster werd gekwantificeerd met behulp van FlowJo-software om ROS-niveaus in experimentele groepen te vergelijken. De poortstrategie is zoals hierboven beschreven (sectie flowcytometrie).
Statistische analyse
De gegevensanalyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS-software, weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Eenrichtingsanalyse van variantie met Tukey's post hoc-test werd uitgevoerd om meerdere groepen te vergelijken, en Student's t-test werd gebruikt voor paarsgewijze vergelijkingen. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
NRG1 oefent een beschermend effect uit tegen MIRI-geïnduceerde apoptose van cardiomyocyten
Flowcytometrische analyse wees op een opmerkelijke verhoging van de apoptosepercentages in de MIRI-groep in vergelijking met zowel de controle- als de schijngroep (P < 0,05). Zowel de recombinante NRG1- als de AG1478-groep vertoonden significant lagere apoptosepercentages in vergelijking met de MIRI-groep (P < 0,05). Daarentegen vertoonde de recombinante NRG1-groep een verlaagd ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
MIRI blijft een belangrijk obstakel vormen bij de behandeling van hart- en vaatziekten, aangezien het herstel van de perfusie naar ischemisch hartweefsel paradoxaal genoeg het myocardletsel kan verergeren. Het optreden van MIRI is multifactorieel, met oxidatieve stress, calciumoverbelasting, ontstekingsreacties en mitochondriale disfunctie 9,10.
NRG1, een extracellulair ligand, activeert stroomafwaarts...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation van de provincie Fujian (subsidienummer.2024J011604,2023J011877) en het Youth Research Project van de Fujian Provincial Hearth Commission (subsidienummer 2019-9-25).
BIJDRAGE VAN DE AUTEUR:
Maozhi Huang leidde de conceptie en het ontwerp van het onderzoeksproject, plande en detailleerde het experimentele protocol, nam deel aan belangrijke experimenten en schreef de eerste versie van het manuscript. Jianping Zheng droeg in gelijke mate bij aan het algemene onderzoek, inclusief het ontwerp, de gegevensverzameling en het opstellen van manuscripten. Xianlu Cheng droeg bij aan de onderzoeksopzet, verzamelde monsters en analyseerde gegevens. Chaoqun You assisteerde bij het schrijven en structureren van het manuscript. Ziguo Chen controleerde gegevens en hielp bij het verbeteren van de sectie methoden en materialen. Ling Jiang zorgde voor academische controle en begeleiding tijdens het onderzoeksproces. Shanghua Xu leidde de algemene richting van het project, coördineerde de middelen en beoordeelde en herzag het uiteindelijke manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AG1478 | BioLab Technology | WD102925 | Interventiedrug AG1478 |
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Meilune | MA0220 | Flow cytometry apoptosis |
| BCA Protein Assay Kit | Meilunbio | MA0082-2 | WB eiwitkwantificering |
| Chemiluminescence Imaging System | Bio-Rad (USA) | ChemiDoc Touch | Western blot beeldvorming |
| Cyamemazine Hydrochloride | Huamu Animal Health | 20220601 | Anesthesie voor diermodellen |
| ECL Detection Kit | Meilunbio | MA0186-1 | WB chemiluminescentie |
| ERbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | WB primaire antilichaam |
| Flow Cytometer | BD | FACSCalibur | Flow cytometry apoptosis detectie |
| GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | WB ladingscontrole antilichaam |
| HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | Immunohistochemische |
| HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | Immunohistochemische |
| Microplate Reader | Thermo | K3 | ELISA detectie |
| PAGE Gel Preparation Kit 15% | Meilunbio | MA0384 | WB elektroforese |
| p-ERbB4 | Affinity | AF3445 | WB primaire antilichaam |
| Pre-stained Protein Marker | Meilunbio | MA0342 | WB elektroforese |
| Rat Neuregulin-1 (NRG-1) ELISA Kit | Meimian | MM-61434R2 | ELISA detectie |
| Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit | Meilune | MA0219 | WB test |
| rhNRG1 | BioLab Technology | WD091127 | Interventiedrug NRG1 |
| RIPA lysis buffer | Meilunbio | MA0151 | Eiwitextractie voor Western blot |
| SDS-PAGE Loading Buffer (5x) | Beyotime | P0015L | WB elektroforese |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | 151-21-3 | WB elektroforese |
| Su Tai 50 | Virbac (France) | 8X22A | Anesthesie voor diermodellen |
| Vertical Protein Electrophoresis System | Bio-Rad (USA) | POWER PAC 200 | Western blot elektroforese |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar