Methodenartikel

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

853 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

26 augustus 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.

Samenvatting

Eiwit-glycaaninteracties staan centraal in veel biologische processen en worden steeds meer erkend als veelbelovende doelen voor diagnostische strategieën bij infectieuze, inflammatoire en neoplastische ziekten. Het karakteriseren van deze interacties, vooral wanneer ze zwak en van voorbijgaande aard zijn, blijft echter technisch uitdagend. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie biedt unieke voordelen voor het bestuderen van dergelijke interacties onder bijna-fysiologische omstandigheden, en biedt inzichten in atomaire resolutie in zowel structurele als dynamische aspecten. In deze studie presenteren we een geïntegreerd NMR-protocol dat is ontworpen om eiwit-glycaaninteracties met lage affiniteit te onderzoeken met behulp van het mannose-specifieke lectine cyanovirine-N en het monosacharide D-mannose als modelsysteem. Het protocol combineert op ligand en eiwit gebaseerde NMR-benaderingen om bindingsplaatsen uitgebreid in kaart te brengen en subtiele bindingsgebeurtenissen te detecteren, waaronder mogelijke allosterische effecten of ontmoetingscomplexen. De kritieke stappen van het protocol omvatten zorgvuldige monstervoorbereiding, nauwkeurige controle van concentraties en spectrale standaardisatie om de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen. NMR in oplossing maakt het mogelijk om voorbijgaande interacties te detecteren die vaak ontoegankelijk zijn voor andere technieken. Hoewel zwakke interacties essentieel zijn voor het leven, is er in de literatuur een voorkeur voor complexen met een hogere affiniteit, ook al zijn complexen met een lage affiniteit relevant in veel belangrijke biologische functies, zoals signaaltransductie en cel-celcommunicatie. Deze techniek biedt een krachtig platform voor het onderzoeken van eiwit-glycaanherkenning en kan dienen als een waardevol hulpmiddel voor het identificeren van nieuwe diagnostische markers op basis van glycaanspecifieke interacties.

Inleiding

Eiwit-glycaaninteracties zijn fundamenteel voor een breed scala aan biologische processen, waaronder cel-celherkenning, modulatie van de immuunrespons en pathogeen-gastheerinteracties 1,2. Deze moleculaire interacties zijn zeer specifiek en dynamisch en spelen een cruciale rol in zowel fysiologische als pathologische mechanismen 3,4,5. Een klassiek voorbeeld van dergelijke interacties doet zich voor bij lectines, eiwitten die specifiek glycanen herkennen en eraan binden. Cyanovirine-N (CVN) is bijvoorbeeld uitgebreid bestudeerd als een experimenteel model vanwege het vermogen om met hoge affiniteit te interageren met hoge mannose-oligosacchariden 5,6,7.

Naast lectines spelen ook veel geglycosyleerde eiwitten, zoals integrines, een essentiële rol bij herkenning en cellulaire signalering. Integrines zijn transmembraanreceptoren die vaak glycosylering van hun subeenheden ondergaan, wat hun stabiliteit en affiniteit voor liganden, waaronder glycanen 5,8,9,10, beïnvloedt. De structurele karakterisering van deze interacties blijft echter een uitdaging vanwege de intrinsieke heterogeniteit en flexibiliteit van glycanen, wat de traditionele structurele biologiebenaderingen bemoeilijkt. In deze context is de ontwikkeling van geavanceerde methodologieën die in staat zijn om deze interacties in oplossing vast te leggen, van grote waarde voor dit vakgebied, met name voor glycobiologie11,12.

Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van eiwit-ligandinteracties op atomair niveau. In tegenstelling tot andere technieken, zoals röntgenkristallografie en cryo-elektronenmicroscopie, maakt NMR het mogelijk om biomoleculaire interacties onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen, wat inzicht geeft in zowel structuur als dynamiek. Deze flexibiliteit stelt onderzoekers in staat om omgevingsparameters zoals pH (meestal tussen 4,0-8,0), ionische sterkte (bijv. 0-500 mM NaCl) en temperatuur (meestal 273-330 K) te moduleren, waardoor de omstandigheden worden afgestemd op de specifieke kenmerken van eiwit-glycaancomplexen. Bovendien is NMR bijzonder voordelig voor het analyseren van voorbijgaande en zwakke interacties, die vaak kenmerkend zijn voor eiwit-glycaanherkenningsgebeurtenissen13,14.

Er zijn verschillende NMR-technieken gebruikt om eiwit-glycaaninteracties te onderzoeken, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel eiwit- als ligandgebaseerde benaderingen. Vanuit het eiwitperspectief wordt heteronucleaire enkelvoudige kwantumcoherentie (HSQC)-titratie veel gebruikt om bindingsplaatsen in kaart te brengen door chemische verschuivingsverstoringen bij ligandtoevoeging te monitoren. Experimenten met relaxatiedispersie maken het mogelijk om conformationele en chemische uitwisselingsprocessen te detecteren die plaatsvinden op de tijdschaal van micro- tot milliseconden, wat inzicht geeft in de dynamische aspecten van glycaanherkenning15,16. Deze op eiwitten gebaseerde technieken vereisen doorgaans monsterconcentraties in het bereik van 50 μM tot 2 mM, afhankelijk van de eiwitstabiliteit en etiketteringsefficiëntie17,18.

Op ligand gebaseerde NMR-technieken bieden aanvullende informatie door zich te concentreren op glycaanveranderingen tijdens binding. Verzadigingsoverdrachtsverschil (STD-NMR) is met name nuttig voor het identificeren van glycaanepitopen die betrokken zijn bij herkenning, omdat het selectief de NMR-signalen van ligandgebieden in nauw contact met het eiwit19,20 verzadigt. Waterliganden waargenomen via gradiëntspectroscopie (WaterLOGSY)21,22 en Transferred Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (Tr-NOESY) bieden aanvullende middelen om ligandbinding en conformationele veranderingen tijdens interacties te beoordelen23. Bovendien helpen Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) relaxatie-experimenten bij het identificeren van zwakke en voorbijgaande interacties die moeilijk te detecteren zijn met conventionele methoden24. Op ligand gebaseerde experimenten worden vaak uitgevoerd bij eiwitconcentraties van 10-50 μM en kunnen optimalisatie van mengtijden en verzadigingsparameters25 vereisen. Deze methoden kunnen met name worden beperkt door de lage oplosbaarheid van glycanen of de slechte signaal-ruisverhouding bij het werken met kleine liganden.

Samen bieden deze NMR-methoden een uitgebreid kader voor het ophelderen van de structurele en dynamische eigenschappen van eiwit-glycaaninteracties. Met voortdurende vooruitgang in gevoeligheids- en isotopenlabelingstrategieën, wordt deze techniek steeds belangrijker in de glycobiologie en biedt het nieuwe perspectieven op moleculaire herkenningsmechanismen met mogelijke toepassingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en de ontdekking van biomarkers. Desalniettemin hangt het succes van deze benaderingen af van factoren zoals de homogeniteit van de steekproef, de complexiteit van glycanen en de aanwezigheid van flexibele of ongeordende regio's die NMR-signalen kunnen verbreden of de interpretatie kunnen belemmeren26. NMR is een krachtige methode voor het bestuderen van voorbijgaande gebeurtenissen, wat een grote uitdaging is in de structurele biologie.

CVN herkent α(1,2)-gekoppelde mannosylresiduen die aanwezig zijn in oligosacchariden met een hoog mannosegehalte met nanomolaire affiniteiten 27,28,29. Het herkent de monosacharide D-mannose echter slecht. In dit werk hebben we de interactie van CVN met D-mannose bestudeerd als een manier om te illustreren hoe NMR krachtig is in het begrijpen van voorbijgaande interacties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Voer alle stappen uit met betrekking tot bacterieculturen en bufferpreparaten in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsprotocollen. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en werk bij het hanteren van open culturen of chemicaliën indien nodig in een bioveiligheidskast of chemische zuurkast.

1. Expressie van cyanovirine-N

  1. Transformeer E. coli BL21-cellen met een plasmide dat codeert voor het CVN-gen dat in de pET26a-vector is ingebracht.
  2. Kweek de cellen in 1 L Super Broth (32 g trypton, 20 g gistextract, 5 g NaCl per L), aangevuld met kanamycine (50 μg/ml), 0,5% (w/v) glucose en 1,6 mM MgSO4. Incubeer onder continu roeren bij ~250 tpm bij 37 °C.
  3. Voor de productie van 15N-gelabeld CVN, kweek de cellen in gemodificeerd M9 minimaal medium met 15NH4Cl als de enige stikstofbron.
    1. Bereid 1 L M9 minimaal medium door 200 ml steriele 5x M9-zoutoplossing te mengen met 64 g/L Na2HPO4, 15 g/L KH2PO4, 2,5 g/L NaCl, 5 g/L NH4Cl.
    2. Voeg 2 ml 1 M MgSO4 (0,22 μm gefilterd gesteriliseerd), 0,1 ml 1 M CaCl2 (0,22 μm gefilterd gesteriliseerd) en 4 g glucose (eindconcentratie 0,4%, opgelost in steriel gedestilleerd water en 0,22 μm gefilterd gesteriliseerd) toe.
    3. Breng het uiteindelijke volume op 1 L met steriel gedestilleerd water.
      OPMERKING: Supplementen zoals aminozuren of vitamines kunnen naar behoefte worden toegevoegd.
  4. Bewaak de cultuur totdat deze een optische dichtheid (OD600) van ongeveer 1,2 bereikt. Voeg vervolgens isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan een uiteindelijke concentratie van 1,0 mM om eiwitexpressie te induceren.
  5. Incubeer gedurende 20 uur na de inductie bij 37 °C.
  6. Oogst de cellen door centrifugeren bij 7.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  7. Isoleer de periplasmatische fractie als volgt:
    1. Resuspendeer de celpellets in 0,4 volume 30 mM Tris-HCl-buffer (pH 8,0) met 20% sacharose en 1 mM EDTA en incubeer bij kamertemperatuur met schudden gedurende 10 min.
    2. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 10.000 × g bij 4 °C.
    3. Resuspendeer de resulterende pellets in 0,4 volumes ijskoud gedestilleerd water en incubeer op ijs door gedurende 10 minuten te schudden.
    4. Centrifugeer opnieuw bij 10.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    5. Verzamel het supernatant, dat overeenkomt met de periplasmatische fractie, voor eiwitextractie.
      OPMERKING: Alle buffers moeten een proteaseremmercocktail bevatten om eiwitafbraak te voorkomen.

2. NMR-experimenten

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd bij 14,1 T met behulp van een 1H/15N/13C drievoudige resonantie inverse detectiesonde (zie materiaaltabel) bij 298K.

  1. Op ligand gebaseerde experimenten
    1. Voorbereiding van het monster
      1. Bereid twee monsters voor: één met CVN en één zonder CVN (controle met alleen ligand). Elk monster bevat 600 μL 80 μM CVN in natriumfosfaatbuffer (pH 7,4) met 50 mM NaCl.
      2. Voeg D-mannose toe tot een eindconcentratie van 4 mM.
      3. Voeg 5% (v/v) D2O toe aan elk monster.
      4. Breng het monster over in een NMR-buis van 5 mm.
      5. Gebruik een 50-voudige molaire overmaat van de ligand ten opzichte van het eiwit.
        OPMERKING: Een ligandovermaat in het bereik van 10-voudig tot 1000-voudig wordt doorgaans aanbevolen, met lagere overmaat bij voorkeur voor kleine eiwitten.
    2. Spectrale acquisitie voor D-mannose toewijzing
      1. Verkrijg 2D TOCSY- en 2D 1 H-13C HMBC-spectra met behulp van standaard pulssequenties:
        2D TOCSY: Fasegevoelige totale correlatiespectroscopie (TOCSY) met excitatiesculptuur voor wateronderdrukking (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C heteronucleaire meervoudige bindingscorrelatie met gradiëntselectie en niet-ontkoppelde acquisitie (HMBCGPNDQF).
        OPMERKING: Deze experimenten zijn uitgevoerd met het oog op de toewijzing van D-mannose, maar worden niet getoond, aangezien de toewijzing van chemische verschuivingen niet binnen het bestek van dit onderzoek valt.
    3. In kaart brengen van ligandbinding door chemische verschuivingsverstoring (CSP) van het ligand
      1. Voor de monsterbereiding en het verkrijgen van ¹H-¹³C HSQC-spectra bereidt u een 4 mM-oplossing van D-mannose in natriumfosfaatbuffer (pH 7,4), met 50 mM NaCl en 5% D2O. Verdeel de oplossing in twee monsters: één met 80 μM CVN en één zonder CVN (alleen ligandreferentie).
        OPMERKING: Deze spectra zullen worden gebruikt om de CSP van D-mannose te bepalen bij interactie met CVN.
      2. Gebruik voor het instellen van 1 H-13C HSQC-acquisitieparameters de standaard pulssequentie HSQCETGPSI (gradiëntselectie en gevoeligheidsverbeterde 1 H-13C HSQC). Stel de volgende parameters in voor acquisitie:
        Tijddomein (TD): 1024 × 128 complexe punten (¹H × ¹³C dimensies)
        Spectrale breedte (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) voor ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) voor ¹³C
        Carrier-frequenties: 4,7 ppm voor ¹H, 75 ppm voor ¹³C
        - Aantal scans: 448.
      3. Bereken de CSP met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-1
        waarbij figure-protocol-2 en figure-protocol-3 de chemische verschuivingsverschillen weergeven tussen D-mannose in aanwezigheid van CVN (Figuur 1A, rood gelabeld) en vrije D-mannose (Figuur 1B).
    4. Ligandbinding in kaart brengen via het verzadigingsoverdrachtsverschil (STD)
      1. Maak een nieuwe dataset en configureer parameters voor STD-NMR-experimenten. Er kunnen twee experimentele strategieën worden toegepast: (i) screening van verschillende verzadigingsfrequenties om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren; (ii) het vaststellen van de verzadigingsfrequentie en het variëren van de verzadigingstijd om de opbouw te evalueren.
      2. Zet 1D ¹H NMR-experimenten op met behulp van de zgpr-pulssequentie. Stem de spectrometer af op ¹H, voer shimming uit en meet een harde puls van 90° (bijv. ~10 μs bij -10,6 dB verzwakking, gelijk aan ~11,482 W).
      3. Centreer de draaggolffrequentie ¹H op ongeveer 4,7 ppm, wat overeenkomt met het watersignaal.
      4. Selecteer de STDDIFFESGP.3-pulssequentie en configureer de acquisitieparameters als volgt:
        Stel de spectrale breedte in op basis van de monstervereisten.
        Stel de interscanvertraging (d1) in op 4 s.
        Definieer de verzadigingstijd (d20) op basis van het gewenste experiment.
        Laad de FQ2LIST met de verzadigingsfrequentie buiten resonantie (-40 ppm) en de aan-resonantiefrequenties om alleen het eiwitsignaal te verzadigen.
        OPMERKING: Op-resonantiefrequenties moeten overeenkomen met eiwitprotonen en moeten ten minste 1000 Hz verwijderd zijn van een ligandsignaal om directe verzadiging te voorkomen.
      5. Test de volgende verzadigingsfrequenties bij resonantie om optimale omstandigheden te bepalen: -0,59 ppm, 0,73 ppm en 8,1 ppm (zie figuur 2A).
        OPMERKING: 0,73 ppm werd geselecteerd als een verzadigingsfrequentie bij resonantie, omdat dit de beste signaal-ruisverhouding opleverde. Met behulp van deze frequentie werd de STD-amplificatiefactor (ASOA) gekwantificeerd als functie van de verzadigingstijd. Daartoe werden STD-spectra verkregen op verschillende verzadigingstijden (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 en 4 s) om de STD-opbouwcurve te construeren (Figuur 2B). De overeenkomstige ASTD-waarden werden vervolgens uitgezet als functie van de verzadigingstijd (Figuur 2C), waardoor de efficiëntie van de verzadigingsoverdracht kon worden geëvalueerd, die evenredig is met de tijd en de nabijheid van de ligandwaterstof tot het eiwit. EenSOA-factor wordt gedefinieerd als:
        figure-protocol-4
        ISTD is het verschil in signaalintensiteit tussen de aan- en uit-resonantiespectra, I0 is de signaalintensiteit in het off-resonantiespectrum, [L]T is de totale ligandconcentratie en [P] is de eiwitconcentratie. Deze normalisatie houdt rekening met concentratie-effecten en maakt vergelijking tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. STD is gebaseerd op spindiffusie en langzame moleculaire tuimeling om de verzadiging efficiënt over te brengen van het eiwit naar de gebonden ligand. Grotere eiwitten (langzaam tuimelen) zorgen voor een efficiëntere verzadiging en verspreiding van magnetisatie binnen het eiwit 19,30,31,32.
      6. Stel het aantal scans (ns) in op 64 en neem het gemiddelde van het experiment l4 (lus 4) keer.
      7. Bereken het totale aantal scans als: Totaal aantal scans = ns × l4. Gebruik 32.768 complexe punten in de directe dimensie (TD) met een spectrale breedte (SW) van 10,0171 ppm (6.009,615 Hz).
      8. Stel de interscanvertraging (d1) in op 4 s en de acquisitietijd (AQ) op 2,7262976 s. Totale relaxatievertraging is gelijk aan d1 + AQ.
      9. Configureer de verzadigingspuls als volgt: duur 50 ms; vorm Gaussiaans (p42); aangestuurd via gevormd programma 9 (SP9).
      10. Gebruik een STD-pulssequentievariant die een T1ρ-filter bevat om resterende eiwitsignalen te onderdrukken. Stel de spin-lock-tijd (d29) in op basis van het molecuulgewicht van het eiwit. Gebruik voor grotere eiwitten kortere spin-lock tijden (~20 ms) en voor kleinere eiwitten grotere (> 40 ms).
        OPMERKING: Alle STD-spectra werden verkregen op 599,93 MHz (BF1). Aanpassing van d29 is van cruciaal belang om de eiwitachtergrond te minimaliseren met behoud van de integriteit van het ligandsignaal. Optimaliseer deze parameter indien nodig empirisch.
    5. In kaart brengen van ligandbinding via 1H-R2
      1. Selecteer het CPMG_ESGP2D pulse-programma uit de Bruker-standaardbibliotheek. Deze sequentie is gebaseerd op het Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) -experiment, met excitatiesculpting voor wateronderdrukking33.
      2. Stel het experiment in als een 2D-acquisitie.
        OPMERKING: Dit is een pseudo-2D-experiment waarbij alleen de directe dimensie wordt gebruikt voor informatie over chemische verschuiving.
      3. Configureer de acquisitieparameters als volgt:
        Tijddomein (TD): 32.768 complexe punten in de directe ¹H-dimensie.
        (TD1): 2 punten.
        Spectrale breedte (SW): 7,9932 ppm (4.795,396 Hz).
        Interscanvertraging (d1): 4 s.
        Draaggolffrequentie (o1): 4,7 ppm (gecentreerd op watersignaal).
        Aantal scans (ns): 8.
        Aantal dummyscans (ds): 4.
        CPMG-vertraging (d20): ≤1 ms (d.w.z. korter dan 1/3 J_HH).
        Aantal gemiddelden (TDav): 200.
      4. Voer het experiment uit gedurende 200 cycli van elk 8 scans, wat resulteert in een totale accumulatie van 1.600 scans. Pas de lijst met variabele tellers (vclist) aan op basis van de gewenste totale tijd van de CPMG-cyclus (TCPMG). Hierbij is gekozen voor 2 cycli voor een TCPMG=8 ms en 200 cycli voor een TCPMG=800 ms.
      5. Voer twee 1H-CPMG-experimenten uit, één voor het monster dat het eiwit bevat (4 mM D-mannose en 80 μM CVN) en de andere voor de vrije D-mannose (4 mM D-mannose).
      6. Plot de 1H-spectra voor elke TCPMGvia het commando efp (exponentiële vermenigvuldiging gevolgd door Fouriertransformatie en fasecorrectie) of sinm (sinusvermenigvuldiging verschoven met 90°, SSB=2) gevolgd door fp (Fouriertransformatie en fasecorrectie). Pas de vensterfunctie aan volgens de beste verwerkingsstrategie.
        OPMERKING: In dit experiment werden sinm en fp gebruikt. De 1eserie is de spectra met een TCPMG van 8 ms (eerste in de vclist), en de 2eserie is 800 ms (tweede in de vclist). De verwerkte 1H-spectra zijn uitgezet in Figuur 3.
      7. Bereken het CPMG-quotiënt (Q) via vergelijking 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Experimenten op basis van eiwitten
    1. Voorbereiding van het monster
      1. Bereid 600 μL van een monster met 436 μM gelijkmatig 15N-gelabeld CVN in natriumfosfaatbuffer (pH 7,4) aangevuld met 50 mM NaCl en 5% deuteriumoxide (D2O). Titreer D-mannose in het monster tot een uiteindelijke concentratie van 60 mM. Gebruik voor de titratie een NMR-buis van 5 mm.
    2. Resonantietoewijzing (optionele validatiestap)
      1. Bevestig de toewijzing van vrije CVN in oplossing met behulp van eerder gerapporteerde chemische verschuivingswaarden34. Verkrijg de volgende drievoudige resonantiespectra: HNCO, HNCA, HNCACB en CBCACONH 35,36,37.
        OPMERKING: Deze experimenten dienen alleen om de opdracht te valideren en worden niet getoond, aangezien chemische verschuivingstoewijzing niet het primaire doel van dit protocol is.
    3. Het in kaart brengen van de binding van D-mannose op CVN door chemische verschuivingsverstoring van het eiwit
      1. Verkrijg 1 H-15N HSQC-spectra van 15N-gelabeld CVN bij 298 K. Voer een titratie uit door D-mannose toe te voegen om de volgende eindconcentraties te bereiken: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 en 60 mM.
      2. Stel het 1 H-15N Fast-HSQC-experiment in met behulp van de fasegevoelige FHSQCF3GPPH-pulssequentie uit de Bruker-standaardbibliotheek. Gebruik de volgende parameters:
        Tijddomein (TD): 1024 × 140 complexe punten in de dimensies 1H en 15N.
        Spectrale breedte (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) in de dimensie 1H en 34 ppm (2067,119 Hz) in de dimensie 15N.
        Frequentie van de draaggolf: 4,7 ppm (1uur) en 119 ppm (15N).
        Aantal scans: 128.
      3. Bereken de chemische verschuivingsverstoring (Δδ) met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-6
        waarbij figure-protocol-7 en figure-protocol-8 zijn de chemische verschuivingsverschillen tussen de CVN in de aan- en afwezigheid van D-mannose (Figuur 4A).
        OPMERKING: De factor 10 verklaart het verschil in spectrale breedtes tussen de proton- en stikstofdimensies.
      4. Bereken de dissociatieconstante (KD) door de CSP-waarden voor elk residu uit te zetten als functie van de D-mannoseconcentratie. Pas de resulterende gegevens aan op een single-site bindingsisotherm met behulp van de volgende vergelijking (5).
        figure-protocol-9vergelijking 5
        waarbij [PT] de eiwitconcentratie is die wordt gebruikt bij de titratie (CVN), [PT] de ligandconcentratie (D-mannose) is en CSPmax de CSP is bij de verzadigingsconcentratie van het ligand en CSPmin in afwezigheid van het ligand.
    4. Het in kaart brengen van de binding van D-mannose aan CVN via de 15N-R2 positie van het eiwit.
      1. Meet de 15N-R2-waarden van de individuele residuen van CVN bij afwezigheid en aanwezigheid van 60 mM D-mannose. Voer alle experimenten uit bij 298 K.
      2. Stel het 15N-R2-experiment in met behulp van de fasegevoelige CPMG-gebaseerde pulssequentie-HSQCT2ETF3GPSI3D uit de Bruker-standaardbibliotheek. Gebruik de volgende parameters:
        Tijddomein (TD): 1024 × 128 complexe punten in de dimensies 1H en 15N, met 8 punten in de pseudo-dimensie.
        Spectrale breedte (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Hz) en 34 ppm (15N; 2067,119 Hz).
        Frequentie van de draaggolf: 4,7 ppm (1uur) en 119 ppm (15N).
        Aantal scans: 32. (v) Lijst met variabele tellers: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 en 7, overeenkomend met ontspanningsvertragingen (Trelax) van respectievelijk 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 en 118,72 ms.
      3. Verwerk de pseudo3D-spectra als een reeks HSQC-achtige 1H/15N correlatie-relaxatiespectra met behulp van NMRPipe38, volgens de software-tutorial (zie Materiaaltabel voor een link naar de tutorial).
      4. Importeer de verwerkte spectra in een geschikt NMR-analyseplatform (bijv. CCPNMR39). Selecteer alle spectra en pas de tool "Intensiteitsveranderingen volgen" toe. Zet de intensiteit van elke dwarspiek uit als een functie van Trelax en pas het verval aan op een mono-exponentiële functie om 15N-R2-waarden voor elk residu te extraheren.
      5. Bereken de experimentele fout uit de signaal-ruisverhouding van de HSQC-achtige spectra bij 67,84 ms. Verwerk een gebied van het spectrum dat alleen ruis bevat en converteer het naar een tekstbestand met behulp van de volgende opdracht:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Bepaal de standaarddeviatie van het ruisgebied met behulp van statistische software (bijv. Origin(Pro), versie 2021). Definieer deze waarde als de ruisintensiteit Iruis.
      7. Bereken de experimentele fout voor elk residu met behulp van de volgende vergelijking:
        figure-protocol-10
        OPMERKING: Het is belangrijk om de experimentele fout te gebruiken in plaats van de pasfout. De experimentele fout definieert de interpretatielimieten bij het vergelijken van de 15N-R2 in afwezigheid en aanwezigheid van D-mannose.

figure-protocol-11
Figuur 1: Chemische verschuivingsverstoring van D-mannose in aanwezigheid van CVN. (A) 1 H-13C-HSQC-spectrum van D-mannose in aanwezigheid van CVN. (B) 1 H-13C-HSQC-spectrum van vrije D-mannose. De labels in de spectra tonen elk van de chemische verschuivingstoewijzingen en de respectieve anomere configuratie (α of β). De labels in het rood zijn de labels die zijn toegekend aan de gebonden conformatie, en die in het zwart zijn die zijn toegewezen aan de vrije conformatie. (C) Superpositie van de 1 H-13C-HSQC-spectra in aanwezigheid (groen) en afwezigheid (blauw) van CVN. (D) Chemische structuur van α- en β-D-mannose die de waargenomen CSP markeert, die werd berekend volgens vergelijking (1). De CSP-waarden worden weergegeven onder de groene cirkels. De rode cirkel vertegenwoordigt de β-anomere waterstof die verdween in de aanwezigheid van CVN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-12
Figuur 2: Verzadigingsoverdrachtsverschil (STD) spectra van D-mannose in aanwezigheid van CVN. (A) SOA's verkregen bij verschillende verzadigingsfrequenties: -0,59, 0,73 en 8,1 ppm. (B) SOA verworven op verschillende verzadigingstijden: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 en 4 s. (C) STD-amplificatiefactor (ASTD) berekend volgens vergelijking 2 als functie van de verzadigingstijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-13
Figuur 3: 1H-R2 van D-mannose in aanwezigheid en afwezigheid van CVN. (A) Weergave van de verwachte D-mannose 1H-CPMG-spectra voor een bindmiddel en een niet-bindmiddel verkregen met R 2-relaxatietijden van 8 en 800 ms bij afwezigheid (onder) en aanwezigheid (boven) van CVN. Q werd berekend volgens vergelijking 3. Bij afwezigheid van interactie (Q ≈ 1) blijven de signaalintensiteiten vergelijkbaar op beide relaxatietijden van het ligand met of zonder het eiwit. Bij binding (Q < 1) nemen de signaalintensiteiten af met toenemende relaxatie voor het monster dat het eiwit bevat. (B) Schematische weergave van de chemische uitwisseling tussen vrije en gebonden toestanden van D-mannose. Afhankelijk van de relatieve waarden van het chemische verschuivingsverschil (Δω) en de wisselkoersconstante (kex = kaan + kuit), valt het systeem uiteen in langzame, tussenliggende of snelle uitwisselingsregimes. (C)1H NMR-spectra van vrije D-mannose en D-mannose in aanwezigheid van CVN, met verschillen in signaalintensiteit bij 8 ms en 800 ms relaxatietijden. De berekende Q-factoren voor specifieke waterstofatomen (H6β, H3β, H5α, H4β) worden weergegeven, waarbij lagere Q-waarden duiden op sterkere interacties met CVN en de regio's van de suiker identificeren die betrokken zijn bij binding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-14
Figuur 4: Analyse van chemische verschuivingsverstoring (CSP) die CVN-residuen onthult die betrokken zijn bij de binding van D-mannose. (A) Staafdiagrammen die de CSP's van CVN van de ruggengraatamide (15 N-1H) tonen na titratie met D-mannose bij concentraties van 10 mM (boven) en 60 mM (onder). De horizontale lijnen geven de gemiddelde CSP plus een of twee standaarddeviaties (av + sd, av + 2 sd) aan, die werden gebruikt als drempelwaarden om significant verstoorde residuen te identificeren. (B) Mapping van significant verstoorde residuen op de structuur van CVN gecomplexeerd met de disacharide Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Residuen met CSP's boven de drempelwaarde av + 2 sd zijn rood gemarkeerd en residuen tussen av + sd en av + 2 sd worden blauw weergegeven. De disacharide Manα1-2Manα-moleculen worden in oranje weergegeven om hun bindingslocatie aan te geven. (C) Geselecteerde bindingscurven die CSP's weergeven als functie van de D-mannoseconcentratie. De gegevens werden volgens vergelijking 5 gepast als een single-site bindingsmodel om KD te schatten, waarbij een reeks affiniteiten werd onthuld, waarbij D44 de sterkste interactie vertoonde (KD = 1,1 ± 0,35 mM) en E41 de zwakste (KD = 35 ± 29 mM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-15
Figuur 5: Analyse van 15N-R2 voor CVN-vrij en gebonden aan D-mannose. (EEN, TER) Transversale relaxatiesnelheden (15N-R2) gemeten voor elk residu van CVN in zijn (A) vrije en (B) D-mannose-gebonden toestanden. (C) Verschil in R2-waarden (ΔR2 = R2gebonden− R2vrij) uitgezet per residu. De blauwe en rode lijnen vertegenwoordigen respectievelijk één en twee standaarddeviaties van het gemiddelde (av ± sd en av ± 2 sd). Residuen met significante ΔR2-waarden worden geëtiketteerd. (D) In kaart brengen van de ΔR2-waarden voor de structuur van CVN gecomplexeerd met het disacharide Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Residuen met ΔR2 boven of onder av± 2 sd zijn in het rood aangegeven; Die tussen Av± SD en Av± 2 SD worden in blauw weergegeven. D-mannosemoleculen worden in oranje weergegeven om hun bindingslocatie aan te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit werk presenteerden we NMR-experimenten om eiwit-glycaaninteracties te onderzoeken. Eiwit-glycaan moleculaire herkenning ligt ten grondslag aan tal van biologische processen waarbij de extracellulaire matrix (ECM) betrokken is, waaronder de regulatie van celadhesie, migratie, proliferatie en verschillende andere vormen van cellulaire communicatie.

Hier hebben we ervoor gekozen om te werken met de monosacharide D-mannose, die wordt omschreven als een zwak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

NMR-spectroscopie vertegenwoordigt een veelzijdige benadering voor het onderzoeken van eiwit-glycaaninteracties, vooral vanwege het vermogen om zwakke en voorbijgaande interacties te detecteren, zoals die waargenomen tussen CVN en D-mannose. Het hier beschreven protocol combineert ligand- en eiwitgebaseerde NMR-methoden, waardoor een uitgebreidere karakterisering van de interactie-interface mogelijk is.

De kritieke stappen van het protocol omvatten zorgvuldige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken het Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) voor het gebruik van de NMR-spectrometers. We zijn Dr. Carole Bewley dankbaar voor het delen van de chemische verschuivingsopdrachten van CVN in complex met Manα1-2Manα. We danken ook de financieringsinstanties FAPERJ en CNPq.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
13C GlucoseCambrige Isotopic Lab.CLM-481
15N Ammonium ChlorideCambrige Isotopic Lab.NLM-467
Calcium ChlorideSigma-AldrichC4901
Coquetel inhibit proteaseSigma-Aldrich4693159001
D2OCambrige Isotopic Lab.DLM-4
D-MannoseSigma-AldrichM2069-5G
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266
NMRPipeLink naar de software-tutorial: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Potassium Chloride (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911
Potassium Chloride (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Shigemi tubeBrukerZ1Z10684A
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9625
Sodium phosphate (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Sodium phosphate (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263
Spectrometer Bruker 600 MHzBruker
Spectrometer Bruker 800 MHzBruker
TiamineSigma-AldrichT1270
Triple resonance TXI probeBruker
TryptoneSigma-Aldrich93657
Yeast extractSigma-AldrichY1625
```

Referenties

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NMR spectroscopiechemische verschuivingsperturbatieverzadigingsoverdrachtverschilligandbindingsmappingD mannosebindingCyanovirin Nrelaxatiesnelheidsanalysestructurele dynamica

Gerelateerde artikelen