Method Article

Botbeschermende rol van bupleurum in een rattenmodel van postmenopauzale osteoporose

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie gebruikten we een ovariëctomisch rattenmodel van postmenopauzale osteoporose om aan te tonen dat Bupleurum (Chai hu) orale vloeistof de microstructuur van het bot verbetert door pro-inflammatoire factoren te onderdrukken en ontstekingsremmende factoren te versterken. Dit suggereert dat het ontstekingsremmende mechanisme de door oestrogeentekort veroorzaakte osteoporose gedeeltelijk vermindert.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol heeft tot doel de effecten van toediening van Chai hu op postmenopauzale osteoporose bij ratten met ovariëctomie (OVX) te onderzoeken. Acht weken oude vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten ondergingen een bilaterale ovariëctomie met behulp van de dorsale benadering om een postmenopauzaal osteoporosemodel op te stellen. Verschillende doses Chai hu orale vloeistof werden gedurende 12 opeenvolgende weken toegediend via een orale maagsonde, gevolgd door evaluaties van de botmicrostructuur en metingen van inflammatoire cytokineniveaus. Behandeling met middelhoge en hoge doses Chai hu remde gedeeltelijk botverlies, verminderde pro-inflammatoire cytokine-expressie en verhoogde gereguleerde ontstekingsremmende cytokinespiegels bij OVX-ratten. Er was een significante vermindering van de ernst van de botafbraak van lage naar hoge doses, en dosisgerelateerde verbeteringen in de microstructurele reconstructie van het bot werden waargenomen. Chai hu verminderde door oestrogeendeficiëntie geïnduceerd botverlies en microstructurele achteruitgang, waardoor OP-progressie in dit OVX-model werd onderdrukt. Dit was waarschijnlijk het gevolg van de ontstekingsremmende effecten van de betrokken routes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoporose (OP) is een veel voorkomende metabole botziekte die wordt gekenmerkt door verminderde botmassa, verminderde botsterkte en vernietiging van botmicroarchitectuur1. OP kan zich manifesteren als primair of secundair, en primaire OP wordt geclassificeerd als postmenopauzale OP (PMOP), seniele OP en idiopathische OP (die vaak voorkomt bij adolescenten). Onder hen komt type I PMOP voornamelijk voor bij PM-vrouwen, waar er een duidelijke afname van de botdichtheid is na de menopauze als gevolg van verminderde circulerende niveaus van oestrogeen2. Het is een systemische metabole botziekte, die resulteert in een verhoogde osteoclastactiviteit en intense differentiatie3. Bovendien is de intensiteit van botresorptie veel groter dan de vorming ervan, wat resulteert in een verminderde botmassa en een verhoogde botfragiliteit en het risico op fracturen4.

Huidig onderzoek heeft uitgewezen dat veel chronische ontstekingsziekten, zoals artrose en parodontitis, geassocieerd zijn met aanzienlijk botverlies, wat suggereert dat ontsteking nauw verwant kan zijn aan OP5. Naarmate PM-vrouwen ouder worden, nemen naast endocriene veranderingen ook de fysiologische en immuunfuncties af en blijft het lichaam gedurende lange tijd in een staat van chronische ontsteking. Veel van deze ontstekingsbevorderende factoren en van T-cellen afgeleide cytokinen spelen een belangrijke rol bij botverlies. Daarom wordt PMOP ook erkend als een chronische ontstekingsziekte 6,7.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft een lange geschiedenis en rijke klinische ervaring in de preventie en behandeling van PMOP, gericht op holistisch beheer en geïndividualiseerde diagnose en behandeling, en kan tegelijkertijd het endocriene en immuunsysteem reguleren, wat een zegen is voor postmenopauzale vrouwen8. Het geeft een groot deel van de vrouwen toegang tot medische behandeling. Moderne farmacologische studies en klinische proeven hebben aangetoond dat TCM de voordelen heeft van multi-targeting, lage toxiciteit en bijwerkingen, en goedkoop is. Het risico op complicaties kan sterk worden verminderd bij de TCM-behandeling van PMOP9.

Chai hu zelf heeft ontstekingsremmende10 en antidepressieve11eigenschappen, en het kan de hormoonsecretie in het lichaam reguleren12 en een goede gezondheid bevorderen13. Chai hu is het belangrijkste ingrediënt dat een belangrijke rol speelt in de TCM-samengestelde formule, Xiaoyao Pills, die het effect heeft van het verzachten van emoties, het bevorderen van de spijsvertering en opname in de maag en darmen. Het staat ook bekend om het aanvullen van qi en bloedenergie en het reguleren van de symptomen van de menstruatiecyclus en het daarmee gepaard gaande ongemak14. Het hoofdbestanddeel van Chai hu is Chai hu-saponine, dat een sterke ontstekingsremmende werking heeft, die zich voornamelijk manifesteert in het remmen van de expressie van pro-inflammatoire cytokines, zoals tumornecrosefactor α (TNF-α), interleukine 1β en IL-615. Bovendien verbetert het de expressie van ontstekingsremmend cytokine, IL-10, waardoor ontstekingen, zoals colitis, endometritis en hepatitis16, worden verlicht.

Vergeleken met standaard OP-behandelingen (inclusief het gebruik van bisfosfonaten17, selectieve oestrogeenreceptormodulatoren18 en denosumab19), heeft Chai hu, als een veelgebruikte TCM, het potentiële voordeel van een werkingsmechanisme met meerdere componenten en meerdere doelen. Standaardtherapieën richten zich meestal op specifieke botmetabole routes20 (remming van osteoclastactiviteit), die in verband kunnen worden gebracht met bepaalde bijwerkingen zoals gastro-intestinaal ongemak, verhoogd risico op osteonecrose van de kaken en griepachtige symptomen, evenals hoge medicijnkosten op lange termijn21.

Uit een overzicht van de relevante literatuur bleek dat het gebruik van Chai hu om in te grijpen bij PM-ratten met OP therapeutisch verlichtende effecten zou kunnen hebben22. Dus, op basis van bio-informatica en farmacologische analyse, evenals moleculaire docking-simulatie om docking-plaatsen te voorspellen23, veronderstelden we dat Chai hu zou kunnen ingrijpen in het ontstekingsproces, de immuunstatus van het lichaam zou kunnen moduleren en de immuunhomeostase van het bot zou kunnen herstellen. Deze zullen de stabiliteit van de botreconstructie bevorderen en het gewenste therapeutische effect van het verlichten van OP bereiken.

Deze studie maakte gebruik van toediening van Chai hu orale vloeistof (concentratie: 1 g/ml) gedurende 12 opeenvolgende weken. Het doseringsschema is ontworpen op basis van klinisch gebruikelijke doses in TCM- en farmacokinetische onderzoeken24.

Het algemene doel van deze toedieningsmethode is het opstellen van een stabiel en klinisch relevant doseringsprotocol, waarbij het aanhoudende interventie-effect van Chai hu in het doelmodel (een rattenmodel van postmenopauzale osteoporose) systematisch wordt geëvalueerd. Deze toedieningsbenadering zorgt ervoor dat het geneesmiddel gedurende de experimentele periode een effectieve plasmaconcentratie behoudt, wat een betrouwbare interventiebasis biedt voor latere beoordelingen (zoals indicatoren voor botmetabolisme en ontstekingsfactorniveaus). Bovendien helpt het de rol van Chai hu bij verwante ziekten te verduidelijken, evenals de dosis-effectrelatie, terwijl het een referentieparadigma biedt voor de gestandaardiseerde toediening van traditionele Chinese medicijnen in experimenteel onderzoek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (8e editie) en werden specifiek goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Youjiang Medical University for Nationalities (goedkeuring nr. 2024071001).

1. Analyseren van netwerkfarmacologie

OPMERKING: Cyberfarmacologie is een benadering die systeembiologie, computationele biologie en farmacologie combineert en tot doel heeft het werkingsmechanisme van geneesmiddelen en geneesmiddelinteracties te begrijpen door biomoleculaire netwerken te analyseren25.

  1. Screen actieve verbindingen met een goede orale biologische beschikbaarheid (OB) en geneesmiddelgelijkenis (DL) met behulp van tools zoals de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Stel de OB in op ≥30% en de DL op ≥0.1826. Zoek Chai hu en klik op Kruidendetails en download alle samengestelde gegevens. Noem het gedownloade bestand Chaihu.
  2. Verkrijg de doelnaam van het kerningrediënt door de MOL-ID van het kerningrediënt in de TCMSP-database te plakken. Plak in TCMSP-batchzoekfunctie en selecteer Doelvoorspelling en klik vervolgens op Verzenden.
  3. Open de UniProtsh-database, kopieer de kolom Doelnaam in de zoekopdracht en zoek de vetgedrukte eiwitnaam, die precies hetzelfde is als de geplakte doeleiwitnaam. Nadat u de bijbehorende eiwitnaam hebt gevonden, verzamelt u de overeenkomstige gennamen in de kolom erachter.
  4. Filter de osteoporose-gerelateerde genen in de GeneCards (https://www.genecards.org) database op basis van de relevantiescore ≥ 1 en verkrijg alle (5741) genen27.
    OPMERKING: De redenen voor de selectie van genen met een relevantiescore ≥ 1 uit de GeneCards-database zijn als volgt: Een score ≥ 1 geeft aan dat het gen gedocumenteerde associaties heeft met de doelziekte, waardoor het duidelijk wordt onderscheiden van genen zonder gerapporteerde associaties (score = 0). Deze drempel zorgt voor het behoud van genen met geloofwaardige ziekterelevantie, terwijl buitensporige interferentie van niet-verwante genen wordt vermeden. Een lagere drempel (<1) kan genen omvatten zonder gevalideerde associaties, waardoor het aantal valse positieven toeneemt.
  5. Verkrijg de kruisende genen na het combineren van ziektegerelateerde genensets met geneesmiddeldoelen voor intersectie. Op basis van de interacties tussen ziektedoelen en actieve ingrediënten van geneesmiddelen, construeert u een traditioneel Chinees medicijn-actief ingrediënt-doelwit-ziekte intersectienetwerk met behulp van Cytoscape-software.
  6. Verkrijg informatie over eiwit-eiwitinteractie (PPI) via de String-database (https://cn.string-db.org/) en bouw een PPI-netwerk. Open Cytoscape (https://www.cytoscape.org), laad het gedownloade TSV-bestand in het uploadnetwerk, selecteer vervolgens > TOP10 of TOP20 berekenen en klik op Verzenden.
  7. Maak twee tabellen voor het importeren in Cytoscape. Maak een elektronisch werkbladbestand met de naam Netwerk. Voer in kolom A dezelfde MOL-ID's (CH1, CH2...) in die zijn vervangen door de afkorting van de traditionele Chinese geneeskunde. Label kolom B als MOL-ID en sorteer deze in oplopende volgorde op MOL-ID's. Label kolom C als symbool. Kopieer component-ID's (MOL-ID's) en gennamen uit Chaihu-gerelateerde bestanden naar respectievelijk kolom B en C. Verwijder vervolgens kolom B en hernoem kolom A als MOL-ID.
  8. Breid de tabel uit tot het einde van de tekst. Voer in de kolom Symbolen de MOL-ID's (CH1, CH2...) in, vervangen door de afkorting van de traditionele Chinese geneeskunde. Voer in de kolom MOL ID de afkorting van de traditionele Chinese geneeskunde in: CH. Met de bovenstaande stappen is de informatieaanvulling en de opbouw van het Traditionele Chinese Geneeskunde - Component - Doelnetwerk voltooid.
  9. Voer vervolgens het tweede formulier uit, het TYPE-bestand. Maak een nieuwe spreadsheet en geef deze de naam TYPE. Label kolom A als Term en kolom B als TYPE. Kopieer de gennaam naar de termkolom en geef het het genkenmerk in de typekolom (het doel is om naar het gen te zoeken; alle gennamen worden geselecteerd, zodat het gemakkelijk te bedienen is). Voer de ingrediënten in de kolom Term in en geef het ingrediënt het kenmerk drug1.
  10. Importeer in de Cytoscape-software. Importeer netwerk om het netwerkbestand te uploaden en importtabel om het typebestand te uploaden. Typ gen in het zoekvak, druk op Enter, zodat alle genen zijn geselecteerd, trek de geselecteerde genen naar links en klik vervolgens op Lay-out > Kenmerk() > Geselecteerd (kies rond of vierkant tussen haakjes).
  11. Combineer de resultaten van netwerkfarmacologische analyse met experimentele gegevens om de belangrijkste verbindingen en moleculaire mechanismen van geneesmiddelwerking te identificeren.

2. Moleculair docken

OPMERKING: Moleculaire docking is een computationele techniek voor het voorspellen van de optimale bindingsmodus en affiniteit tussen een klein molecuul (ligand) en een doeleiwit of biomolecuul28.

  1. Receptor- en ligandpreparaat
    1. Receptor (eiwit) bron: Verkrijg het PDB-bestand van de doeleiwitten uit de RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Zoek 3Q4B (voorbeeld van een IL-6-receptor), klik op Bestanden downloaden > PDB-indeling.
    2. Verwijder kristallografische watermoleculen door te klikken op Bewerken > Verwijder > Water, vreemde ionen en niet-essentiële liganden (behoud kritische cofactoren zoals metaalionen) door te klikken op Bewerken > Verwijderen > Heteroatomen. Voeg ontbrekende waterstofatomen toe door te klikken op Bewerken > waterstofatomen > op Toevoegen. Opslaan als eiwit.pdbqt. door te klikken op Bewerken > Kosten > Compute Gasteiger en vervolgens op Grid > Macromolecule > Kies > Opslaan als PDBQT.
    3. Ligand (Small Molecule) bron: Download ligandstructuur van PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Zoek Saikosaponin A (CID:6443568), klik op 3D Conformer > SDF downloaden.
    4. Gebruik Open Babel-software om het Saikosaponin A-bestand in SDF-formaat te converteren naar een bestand in PDB-formaat met driedimensionale conformaties met lage energie, en noem het saikosaponinA.
  2. Instelling van dockingparameters (AutoDocking-tools)
    1. Load receptor en ligand bestanden. Importeer het kleine molecuulbestand saikosaponine A en sla het op als een PDBQT-bestand. Laad vervolgens de receptor en ligand: klik op Docking > Macromolecule > Open en selecteer IL6_receptor.pdbqt; klik vervolgens op Docking > Ligand > Open en selecteer saikosaponinA.pdbqt.
    2. Het rastervak configureren: Klik op Raster > Rastervak, pas de grootte van het vak aan zodat deze de actieve site volledig omvat (gebruik het regelkeuzelampje in het linkerdeelvenster om te verfijnen) en sla vervolgens de huidige instellingen op door te klikken op Bestand > Sluiten Stroom opslaan en geef het bestand een naam grid.gpf.
    3. Het programma voor het uitvoeren van AutoGrid instellen: Klik op AutoGrid uitvoeren, selecteer het bestand grid.gpf en klik vervolgens op Starten. Configureer vervolgens de dockingparameters: Klik achtereenvolgens onder het menu Docking op Macromolecuul en selecteer het eiwitbestand IL6_receptor.pdbqt; klik op Ligand en selecteer het kleine molecuulbestand saikosaponine A.pdbqt; stel het genetische algoritme in en bevestig het; pas de dockingparameters aan en bevestig ze. Selecteer ten slotte in Uitvoer het Lamarckiaanse (4,2) algoritme, noem het bestand dock.dpf en sla het op.
    4. AutoGrid uitvoeren en de resultaten opslaan: Klik op AutoDock uitvoeren, selecteer het bestand dock.dpf en start de simulatie. Klik na voltooiing op Complex schrijven, geef de complexe structuur een naam en sla deze op in PDBQT-indeling.
  3. Resultaatanalyse met behulp van PyMOL
    1. Converteer het PDBQT-formaatbestand dat is verkregen uit de vorige moleculaire dockingstap naar het PDB-formaat met behulp van de Open Babel-software. Importeer vervolgens het bestand in PDB-formaat in de PyMOL-software voor daaropvolgende visualisatiebewerkingen.
    2. Zoek de ligand en scheid deze afzonderlijk: Nadat u de ligand hebt geselecteerd, wijzigt u de kleur door op Sele te klikken en vervolgens een Kleur uit Kleur te kiezen. Klik in de kolom Sele op Object extraheren onder Actie om de ligand als een nieuw onafhankelijk object te extraheren.
    3. Afstandsmeting van de waterstofbrug: Klik in de kolom op Actie, zoek Polar Contacts en klik op Naar Andere atomen in Object; Waterstofbruggen worden weergegeven als gele lijnen. Klik op de optie Meting in de kolom Wizard, klik op de atomen aan beide uiteinden van de waterstofbrug in volgorde en klik vervolgens op Gereed om de meting te voltooien.
  4. De afbeelding exporteren: Klik op Afbeelding exporteren als PNG in bestand. Als high-definition rendering nodig is, voert u ray 300 in (pixels instelbaar) en drukt u op Enter.

3. Micro-CT-analyse

  1. Injecteer vrouwelijke SD-ratten (32 weken oud, 320-350 g) intraperitoneaal met pentobarbitalnatrium (40 mg/kg) voor diepe anesthesie, bevestigd door afwezigheid van hoornvliesreflex (niet knipperen bij aanraking van het wattenstaafje) en pijnreflex (geen samentrekking van de achterpoot door knijpen in de tang).
    1. Voer een isolatieoperatie van de achterpoten uit. Euthanaseer de ratten door intraperitoneale injectie van pentobarbitalnatrium in een dosis van 3-5 keer de chirurgische anesthesiedosis (40 mg/kg), plaats ze in rugligging en maak een dwarse incisie van 3 cm, 1 cm boven de symfyse van het schaambeen langs het liesligament. Ontleed botweg de opening tussen de gracilis- en sartorius-spieren om de dijbeenslagader (pulserende buisvormige structuur) bloot te leggen. Ligate beide uiteinden van de dijbeenslagader met behulp van 4-0 hechtingen, laat een niet-geligeerd gedeelte ertussen, voordat het vat wordt afgekapt met een oogheelkundige schaar en het doorsnijdt.
    2. Draai de onderste ledematen inwendig om de heupkop van het acetabulum te ontwrichten en snijd het gewrichtskapsel en het ronde ligament door, zodat de integriteit van de heupkop behouden blijft. Dompel de intacte achterpoot onder in voorgekoelde zoutoplossing en fixeer vervolgens 24-48 uur in een 4% formaldehyde-oplossing.
  2. Beeldvormingsopstelling: Lever het vaste dijbeen af aan de faciliteit voor micro-CT-scanning. Schakel het Micro-CT-apparaat in en selecteer het vooraf ingestelde programma Botscanning bij kleine dieren . Gebruik de volgende scanparameters: röntgenspanning = 90 kV, röntgenstroom = 80 μA, gezichtsveld (FOV) = 36 mm, pixelgrootte = 72,0 μm, rotatie = 360°, scanduur = 14 min.
  3. Plaats het linkerbeenbeen van de gefixeerde rat in de monsterhouder, fixeer de te fotograferen femorale epifyse, start het apparaat en wacht tot de zelftest van de machine is voltooid. Start een voorbeeldscan (snelle scan met lage resolutie) om te bevestigen dat het monster gecentreerd is en pas vervolgens het interessegebied aan om het hele dijbeen te bestrijken.
  4. Wanneer het scannen en fotograferen is voltooid, wordt de röntgenlichtbron automatisch uitgeschakeld. Op dit moment overschrijdt de stralingswaarde in de machine de norm en is het absoluut verboden om het monster zonder beschermende uitrusting te verwijderen.
  5. Beeldanalyse: Analyseer botparameters (botmineraaldichtheid [BMD], trabeculair nummer) met behulp van de ingebouwde software van de scanner. Sla gereconstrueerde afbeeldingen op en exporteer ze voor verdere evaluatie.

4. Kwantitatieve real-time PCR voor RNA-extractie uit botweefsel van ratten

  1. Verwijder aanhangende spieren en fascia van het rechter dijbeen. Snijd 100-200 mg botweefsel in kleine stukjes. Voeg 2-3 maalparels en 500 μL RNA-extractiebuffer toe. Homogeniseer met een tissueslijper op 70 Hz gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  2. Fasescheiding: Na centrifugatie scheidt de oplossing zich in een bovenste waterige fase (bevat RNA) en een onderste donkere neerslag (bevat eiwitten, DNA en polysachariden). Breng voorzichtig 500 μl van het bovenstaande over in een nieuwe RNase-vrije buis van 1,5 ml.
  3. Verwerk de bovenste oplossing die uit de isolatie is verkregen voor totale RNA-extractie volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Nadat u isopropanol aan de lysisoplossing hebt toegevoegd, keert u de buis voorzichtig om om de oplossing te mengen en laat u deze 10 minuten op kamertemperatuur staan. Voer op dit punt een visuele controle uit; als witte vlokkige RNA-precipitaten worden waargenomen (die zich aan de buiswand hechten), geeft dit aan dat RNA effectief is neergeslagen.
  5. Gebruik een pipetpunt van 200 μl om restvloeistof op te zuigen. Houd de witte RNA-pellet vast aan de onderkant/wand van de buis. Resuspendeer RNA in 50-100 μL RNasevrij water en bewaar bij -80 °C.
  6. Meng 2 μL RNA-sjabloon, 10 μL mastermix, 2 μL DNase en 5 μL nucleasevrij water in een nucleasevrije buis. Meng voorzichtig door te pipetteren.
  7. Incubeer gedurende 2 minuten bij 37 °C om genomische DNA-besmetting te verwijderen. Incubeer gedurende 15 minuten bij 55 °C. Aan het einde van de reactie wordt gedurende 5 minuten bij 85 °C geïncubeerd om de reactie af te breken.
  8. Configureer het real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-systeem door het omgekeerd getranscribeerde DNA op ijs te plaatsen. Meng alle componenten voor: 10 μL qPCR SYBR Green Master Mix (geen Rox), 0,4 μL elk Forward Primer en Reverse Primer, en 8,2 μL RNase-vrij water, verdeel en voeg 1μL DNA toe, manipuleer op ijs en bescherm tegen licht.
  9. Voer het qPCR-programma als volgt uit: Pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 5 min, 1 cyclus gevolgd door denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s gedurende 40 cycli. Voer gloeien, verlengen en fluorescentie-acquisitie uit bij 60 °C gedurende 30 s gedurende 40 cycli in het SYBR Green-kanaal. Verkrijg een smeltcurve voor een temperatuur van 65-95 °C met stappen van 0,5 °C en 5 s/stap. De gebruikte primers zijn opgenomen in tabel 1.

5. Voorbereiding van dieren

  1. Verkrijg 48 vrouwelijke nulliparae SD-ratten (SPF-kwaliteit, 8 weken oud, lichaamsgewicht 200-220 g).
  2. Voorafgaand aan experimentele procedures moeten alle ratten acclimatiseren met een quarantaineperiode van 7 dagen in een SPF-klasse isolatiefaciliteit en huisvesten in een SPF-gecontroleerde laboratoriumomgeving (temperatuur: 22-24 °C, vochtigheid: 45%-55%).

6. Bereiding van het testgeneesmiddel

  1. Verkrijg Chai hu orale vloeistof (China National Medical Product Approval No. Z41021539). De formulering bevat Chai hu (noordelijke bron) als het actieve ingrediënt, met hulpstoffen zoals smaakstof, sucrose en propyleenglycol. Elke injectieflacon van 10 ml bevat een extract dat overeenkomt met 10 g ruw kruid.

7. Bereiding van het ovariëctomische rattenmodel

  1. Preoperatieve voorbereiding: Snelle ratten gedurende 12 uur met ad libitum toegang tot water. Voer de sterilisatie van instrumenten uit door alle chirurgische instrumenten te autoclaveren.
  2. Anesthesie en preparaatheid: Pentobarbital-natrium toedienen via intraperitoneale injectie (40 mg/kg). Controleer de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van hoornvliesreflexen te beoordelen (niet knipperen bij aanraking van het hoornvlies met wattenstaafje) en afwezigheid van teenknijpreflex (geen terugtrekking van de achterpoot bij het afklemmen). Scheer na 15-20 minuten de operatieplaats, desinfecteer met jodium en dek af met een gefenestreerd laken. Breng tijdens de operatie vitamine A-oogzalf (met 15.000 IE/g) aan om uitdroging van de ogen van het dier te voorkomen (tabel 2).
  3. Eierstokjectomie bij ratten: Voer de operatie uit in een speciale steriele operatiekamer. Al het personeel droeg volledige isolatiejassen. Veeg het aanrecht en de omringende apparatuur vóór de operatie af met 75% ethanol (tabel 2) en zet de ultraviolette lampen ten minste 30 minuten aan om microben in de lucht en op oppervlakken te verwijderen.
    1. Maak een incisie van 1 cm op de dorsale huid, ontleed botweg het onderhuidse weefsel, knijp de spierlaag dicht en maak een incisie van 1 cm. Zoek het vetkussen en extetiliseer het om de eierstok te identificeren (felrood van kleur). Ligate de eileider met 4-0 hechting, snijd het eierstokweefsel weg en plaats het in een centrifugebuis van 50 ml met 4% paraformaldehyde (tabel 2).
  4. Wondsluiting en desinfectie: Strooi penicillinepoeder in de wond voordat u gaat hechten. Hecht de spierlaag vast met nr. 6 niet-resorbeerbare hechtdraad en sluit de huid af met hechtdraad nr. 2. Desinfecteer de gesloten incisie met jodium en breng topisch penicillinepoeder aan.
  5. Postoperatieve zorg: Plaats ratten in schone kooien met warmwaterkruiken en handdoeken om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Snelle (water toegestaan) dieren gedurende 24 uur na de operatie om darmobstructie te voorkomen. Breng penicillinepoeder dagelijks gedurende 3 opeenvolgende dagen aan op de incisieplaats.
    1. Injecteer lidocaïne (concentratie 1%-2%, maximaal 5 mg/kg) rond de chirurgische incisie om onmiddellijke postoperatieve pijn te verminderen. Zorg voor continue analgesie gedurende 3-5 dagen, waarbij u de dosis geleidelijk afbouwt op basis van de ernst van de pijn om abrupte stopzetting te voorkomen.
    2. Houd het dier in zijligging of met het hoofd naar beneden voordat u wakker wordt om te voorkomen dat de tong valt en de luchtwegen worden belemmerd; Zorg voor een autonome, comfortabele positionering na het ontwaken. Isoleer postoperatieve dieren van anderen tot volledig herstel om gevechten of kruisbesmetting te voorkomen (Figuur 1).

8. Experimentele groepering en toediening van geneesmiddelen

  1. Groepsindeling: Verdeel in totaal 40 SD-ratten in vijf groepen (n = 8 per groep), namelijk normale controle, modelcontrole, lage concentratie Chai hu, gemiddelde concentratie Chai hu en hoge concentratie Chai hu.
  2. Selecteer voor de groep met een gemiddelde dosis (5 ml/kg) de dosering op basis van de richtlijnen in 29,30. Volg een concentratiegradiëntverhouding van 1:2:4 voor de lage concentratiegroep: 2,5 ml/kg, de gemiddelde concentratiegroep: 5 ml/kg en de hoge concentratiegroep: 10 ml/kg.
  3. Toediening van het geneesmiddel: Gebruik een maagsonde en dien het geneesmiddel eenmaal daags toe. Voor de normale controlegroep en de modelcontrolegroep (dieren die een bilaterale ovariëctomie ondergaan), moet een orale maagsonde worden uitgevoerd met een gelijke hoeveelheid zoutoplossing. Begin de behandeling in week 1 na de operatie en ga door gedurende 12 weken.

9. Analyse na het experiment en gegevensverzameling

  1. Voer de volgende analyses uit op vijf diergroepen: micro-CT van de botstructuur en bepaling van inflammatoire cytokine-mRNA-expressie in dijbeenweefsels van ratten.
  2. Verzamel gegevens, waaronder gevisualiseerde beelden van de femorale trabeculaire microstructuur; kwantitatieve botparameters (inclusief botmineraaldichtheid, botvolumefractie, standaarddeviatie trabeculaire dikte, trabeculaire afstand, trabeculair aantal en connectiviteitsdichtheid); en relatieve mRNA-expressieniveaus van pro-inflammatoire cytokinen (IL-6, IL-17) en ontstekingsremmende cytokinen (IL-4, IL-10) in dijbeenweefsels.
  3. Voer gegevensanalyses uit met behulp van GraphPad Prism 10.1.2-software door middel van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Statistische significantie voor verschillen in gemiddelden tussen groepen werd gedefinieerd als p < 0,05. Post-hoc meervoudige vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de test van Tukey.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GO-functie en analyse van de verrijking van de KEGG-route

We vertrouwden op GO- en KEGG-verrijkingsanalyse in de bio-informatica om het potentiële werkingsmechanisme van Chai Hu op PMOP te voorspellen. De GO-verrijkingsanalyse van doelgenen die de actieve ingrediënten van Chai hu voor ziekten kruisen, leverde 2138 significante vermeldingen op, en de top tien significante resultaten worden voor elke groep vermeld (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMOP is een systemische aandoening van het botmetabolisme die vaak voorkomt bij PM-vrouwen, en wordt veroorzaakt door een gebrek aan oestrogeen dat resulteert in een verstoring van de osteoblast-osteoclastbalans, wat leidt tot verbeterde osteoclastbotresorptie en verminderde botproductie van osteoblasten31. Een groeiend aantal onderzoeken heeft aangetoond dat de niveaus van ontstekingsfactoren in het lichaam ook van invloed zijn op de differentiatie tussen osteocl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het Baise City Scientific Research and Technology Development Program en het 2025 Guangxi Universities Young and Middle-aged Teachers Scientific Research Basic Ability Enhancement Project (projectnr.: 2025KY0549). De auteurs danken Dr. Dev Sooranna van het Imperial College London en YMUN voor het bewerken van het manuscript. ZY en LYR hebben in gelijke mate bijgedragen aan dit werk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% natriumchloride-injectie Huarenpharmaceuticalh1712059
1×PBS Thermofisher10010023
75% alcohol NanjingreagentC069156931
95% ethanol NanjingreagentC0691520075
Watervrij ethanolMacklinE809056
Bupleurum chinense Henan Baiquan Pharmacy Co.Z41021539
Decalcificatieoplossing solarbioE1171
Erytromycinezalf Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Baiyunshan Hejigong Pharmaceutical FactoryH44023088
Isopropylalcohol Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
Penicilline V kalium capsulesSichuan PharmaceuticalH20103156
Polyformaldehyde (CH2O)nBeyotimeP0099
Povidon-jood desinfectiemiddel Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co.H44023924
Real-Time Fluorescentie PCR KitYeasen Biotechnology11201ES03
RNA-extractiekitMonadbiotechMI20201S
RNA Reverse Transcriptie KitYuGongBiotechEG15123S
Natriumpentobarbital Shanghai Jixiang Biotechnology Co.JX082085
Trizol Thermofisher15596026CN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, H., et al. Hyperoside alleviates postmenopausal osteoporosis via regulating mir-19a-5p/il-17a axis. Am J Reprod Immunol. 90 (1), e13709(2023).
  2. Wang, S., et al. Alginate oligosaccharide alleviates senile osteoporosis via the RANKL-RANK pathway in d-galactose-induced c57bl/6j mice. Chem Biol Drug Des. 99 (1), 46-55 (2021).
  3. Jiang, N., Qi, B., Li, G., Yao, L., Fan, X. Morin improves the bone histomorphology and biochemical markers in an animal model of ovariectomy-induced osteoporosis by suppressing autophagy and apoptosis. Food Sci Nutri. 12 (12), 10099-10109 (2024).
  4. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  5. Juluri, R., et al. Association of postmenopausal osteoporosis and periodontal disease: A double-blind case-control study. J Int Oral Health. 7 (9), 119-123 (2015).
  6. Zhang, C., et al. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114834(2023).
  7. Mansoori, M. N., et al. IL-18bp is decreased in osteoporotic women: Prevents inflammasome-mediated IL-18 activation and reduces Th17 differentiation. Sci Rep. 6, 33680(2016).
  8. Shanshan, J., Baorong, H., Tianyuan, C., Xiaoqiang, H. Research progress of Chinese medicine in treating postmenopausal women with osteoporosis. Front Med Sci Res. 5 (10), 92-98 (2023).
  9. Faiella, E., et al. Percutaneous vertebroplasty: A minimally invasive procedure for the management of vertebral compression fractures. Osteology. 2 (4), 139-151 (2022).
  10. Yue, L. C., et al. Correction: Saikosaponin d exerts an antidepressant effect by regulating Homer1-mGluR5 and mTOR signaling in a rat model of chronic unpredictable mild stress. Chinese Med. 18 (1), 147-147 (2023).
  11. Yue, T., Ge, Z., Ruonan, S., Hanqing, W., Nan, Z. Saikosaponin a activates tet1/dll3/notch1 signalling and promotes hippocampal neurogenesis to improve depression-like behavior in mice. J ethnopharmacol. 319 (P3), 117289-117289 (2023).
  12. Xuedong, A. N., et al. Shugan jieyu capsule improve sleep and emotional disorder in coronavirus disease 2019 convalescence patients: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Tradit Chin Med. 42 (5), 803-809 (2022).
  13. Ying, H. S. H. Experience of professor huang ying in treating postmenopausal syndrome by chaihu guizhi decoction. J Trad Chinese Med. 38 (23), 4557-4560 (2023).
  14. Yang, Y. X., et al. Studies on the anti-inflammatory effect of xiaoyao pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis in mice. J Vis Exp. (210), e67051(2024).
  15. Wu, S. J., Tam, K. W., Tsai, W. H., Chang, C. C., Chao, J. C. Curcumin and saikosaponin a inhibit chemical-induced liver inflammation and fibrosis in rats. Am J Chin Med. 38 (1), 99-111 (2010).
  16. Zhou, Q. R., Chen, M. Y., Wang, M. D. Treatment of chronic endometritis by penning granule: A clinical randomized controlled trial. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 36 (9), 1055-1060 (2016).
  17. Weibing, J., Yankun, D., Jinxin, Z., Suqin, D. Clinical efficacy and safety evaluation of calcitriol combined with bisphosphonates in the therapy of postmenopausal osteoporosis: Based on a retrospective cohort study. BioMed Res Int. 2022, 2711938-2711938 (2022).
  18. Hussain, I., Talaulikar, V. S. A systematic review of randomised clinical trials - the safety of vaginal hormones and selective estrogen receptor modulators for the treatment of genitourinary menopausal symptoms in breast cancer survivors. Post Reprod Health. 29 (4), 222-231 (2023).
  19. Anastasilakis, A. D., et al. Follistatins, activins and inhibins during osteoporosis therapy with denosumab or zoledronate and after their discontinuation. Diabetes Obesity Metab. 27 (4), 2288-2293 (2025).
  20. Si, Y., et al. Curcumin-encapsulated exosomes in bisphosphonate-modified hydrogel microspheres promote bone repair through macrophage polarization and DNA damage mitigation. Materials Today Bio. 32, 101874-101874 (2025).
  21. Shouguo, L. Clinical observation of qiangjin zhuangji decoction combined with denosumab in the treatment of postmenopausal osteoporosis. , (2024).
  22. Yeom, M., Kim, E. Y., Kim, J. H., Jung, H. S., Sohn, Y. High doses of bupleurum falcatum partially prevents estrogen deficiency-induced bone loss with anti-osteoclastogenic activity due to enhanced inos/no signaling. Front Pharmacol. 9, 1314(2018).
  23. Lu, L., Yinliang, X., Liu, Y., Zhenzhong, J., Xiaoyan, L. Analysis of the mechanism of action of euphorbia fischeriana steud on cirrhosis based on network pharmacology. Medicine. 102 (37), e35118(2023).
  24. Nan, L. S. HPLC-UV for the determination of plasma concentration of saikosaponin C in rats' serum. Info Trad Chin Med. 32 (02), 66-68 (2015).
  25. Sakle, N. S., More, S. A., Mokale, S. N. A network pharmacology-based approach to explore potential targets of caesalpinia pulcherima: An updated prototype in drug discovery. Sci Rep. 10 (1), 17217(2020).
  26. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 6, 13(2014).
  27. Bowen, Y., Qiuwen, Z., Xiaodong, W., Jingxin, M., Shuqing, Z. Using network pharmacology and molecular docking verification to explore the mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis. Medicine. 101 (49), e32222(2022).
  28. Belghalia, E., et al. In silico research on new sulfonamide derivatives as brd4 inhibitors targeting acute myeloid leukemia using various computational techniques, including 3D-QSAR, HQSAR, molecular docking, ADME/Tox, and molecular dynamics. J Biomol Struct Dyn. 42 (17), 9201-9219 (2023).
  29. Chinese pharmacopoeia Commission. The Pharmacopeia of the People's Republic of China 2020 Edition: Volume I. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  30. Chinese pharmacopoeia Commission. The pharmacopoeia of the People's Republic of China 2020 edition: volume IV. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  31. Xu, S., et al. Material Basis and Mechanism of Erzhi Pill for Preventing Osteoporosis Based on Network Pharmacology. Chin Pharma J. 53 (22), 1913-1920 (2018).
  32. Lee, D. K., et al. Phospholipase c β4 promotes rankl-dependent osteoclastogenesis by interacting with mkk3 and p38 mapk. Exp Mol Med. 57 (2), 323-334 (2025).
  33. Huang, Q., et al. The effects of Ti and Ta particle surface chemistry on inflammation, osteogenesis, and osteoclastogenesis in vitro and in vivo. Colloid Interf Sci Commun. 54, 100716(2023).
  34. Zhao, M., et al. Comprehensive comparison on the anti-inflammation and gc-ms-based metabolomics discrimination between bupleuri chinense dc. And b. Scorzonerifolium willd. Front Pharmacol. 13, 1005011(2022).
  35. Bin, L., et al. Analysis of mutual-detoxication compatibility rules of "bupleuri radix decreaseing liver's yin essence" based on data mining. Chin Trad Herbal Drugs. 53 (14), 4428-4436 (2022).
  36. Ying, W., Xuefeng, Z., Minjing, L., Tingting, Z., Ping, L. Xiaochaihu decoction in diabetic kidney disease: A study based on network pharmacology and molecular docking technology. Integrat Med Nephrol Androl. 8 (1), 13-13 (2021).
  37. Sheng, Z., Hongcheng, L., Min, X. Identifying immune cell infiltration and effective diagnostic biomarkers in rheumatoid arthritis by bioinformatics analysis. Front Immunol. 12, 726747(2021).
  38. Menon, S. M. P., Elengoe, A. Evaluation of the role of kras gene in colon cancer pathway using string and cytoscape software. Biomed Res Ther. 7 (6), 3835-3842 (2020).
  39. Yang, J., et al. Bioinformatics identification based on causal association inference using multi-omics reveals the underlying mechanism of gui-zhi-shao-yao-zhi-mu decoction in modulating rheumatoid arthritis. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 136, 156332(2024).
  40. Yang, M., et al. Purification of harvested rainwater using gravity-driven ceramic membrane: A visualization study combining micro-CT and Comsol simulations. J Environ Manag. 373, 123333(2024).
  41. Jui-Ting, H., et al. A comparison of micro-CT and dental CT in assessing cortical bone morphology and trabecular bone microarchitecture. PloS one. 9 (9), e107545(2014).
  42. Yang, S. S., et al. Grem1 inhibits osteogenic differentiation of mbmscs in ovx rats through bmp/smad1/5 signaling pathway. Regenerat Ther. 28, 527-535 (2025).
  43. Huang, W., Zheng, X., Yang, X., Fan, S. Stimulation of osteogenic differentiation by saikosaponin-a in bone marrow stromal cells via wnt/β-catenin pathway. Calcified Tiss Int. 100 (4), 392-401 (2017).
  44. Hattori, T., et al. The fixed herbal drug composition "saikokaryukotsuboreito" prevents bone loss with an association of serum IL-6 reductions in the ovariectomized mouse model. Phytomedicine. 17 (3-4), 170-177 (2010).
  45. Wu, X., et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss by saikosaponin d is associated with regulation of the rankl/rank pathway. Drug Des Dev Ther. 15, 4741-4757 (2021).
  46. Yu-Ting, H., et al. Effects of saikosaponin d on differentially expressed genes, Ctla-4, IL-10, and IL-17 in mice with autoimmune hepatitis. J Shanghai Jiaotong Uni. 40 (03), 303-309 (2020).
  47. Allergy, Z. C. F., et al. Sebocytes contribute to skin inflammation by promoting the differentiation of t helper 17 cells. Br J Dermatol. 178 (3), 722-730 (2018).
  48. Piao, C. H., Song, C. H., Lee, E. J., Chai, O. H. Saikosaponin a ameliorates nasal inflammation by suppressing il-6/ror-γt/STAT3/IL-17/nf-κb pathway in ova-induced allergic rhinitis. Chem Biol Interact. 315, 108874(2020).
  49. Zhimeng, L., et al. Il-17/il-17 receptor pathway-mediated inflammatory response in apostichopus japonicus supports the conserved functions of cytokines in invertebrates. J Immunol. 208 (2), 464-479 (2022).
  50. Wang, X., et al. Forsythiaside a repairs uvb-induced skin inflammatory damage by il-17 signaling pathway. Food Biosci. 64, 105845-105845 (2025).
  51. Ridvan, G., Emine, Y. Evaluation of the awareness and knowledge levels of dentists regarding bisphosphonates and bisphosphonate-related jaw necrosis. J Craniofac Surg. 36 (4), e376-e382 (2025).
  52. Lijuan, W., et al. An ultra-performance liquid chromatography photodiode array detection tandem mass spectrometric method for simultaneous determination of seven major bioactive constituents in Xiaochaihutang and its application to a fourteen-compound compatibility study. J Chromatograph Sci. 53 (9), 1570-1576 (2015).
  53. Wang, D. L., Fang, F. F., Liu, C. S., Su, J. C. expert consensus on integrated traditional chinese and western medicine diagnosis and treatment for osteoporotic fractures. Zhongguo gu shang China. J Orthopaed Traumatol. 37 (3), 242-250 (2024).
  54. Shimeng, L., et al. Antidepressant active components of bupleurum chinense dc-paeonia lactiflora pall herb pair: Pharmacological mechanisms. BioMed Res Int. 2022, 1024693-1024693 (2022).
  55. Ran, S., et al. Bupleurum in treatment of depression disorder: A comprehensive review. Pharmaceuticals (Basel). 17 (4), 512(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Postmenopausal OsteoporosisOvariectomized RatsBone MicrostructureChai Hu TreatmentBone Loss InhibitionInflammatory CytokinesAnti Inflammatory PathwaysEstrogen DeficiencyBone DestructionDose Response

Related Articles