Methodenartikel

FRET-verdunningstest voor het analyseren van dynamische uitwisseling tussen eiwitassemblages

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 september 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de zuivering en covalente labeling van reflectine A1, evenals een FRET-verdunningstest voor het karakteriseren van de dynamische uitwisseling van reflectine-eiwit tussen eiwitassemblages als functie van de leeftijd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als de moleculaire aanjager voor afstembare irisatie bij koppotigen, blijft het afstembare fasegedrag van het reflectine A1-eiwit een aandachtspunt van biomateriaalengineering. Het moduleren van de zoutconcentratie en de netto ladingsdichtheid van het eiwit van reflectine A1 drijft het eiwit aan om dynamische assemblages te vormen als tussenproducten voor vloeistof-vloeistoffasescheiding. Reflectine-assemblages, hoewel beperkt in grootte door de mate van ladingsneutralisatie van de kationische, Coulombische afstoting van het eiwit, zijn aanvankelijk in dynamische uitwisseling met monomeren of oligomeren uit de omringende oplossing. Een nieuwe verdunningstest voor fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) werd gebruikt, in combinatie met dynamische lichtverstrooiing (DLS) en eiwitconcentratietests, om de tweerichtingsflux van eiwit tussen reflectine A1-assemblages en een verdunde fase te karakteriseren als functie van de assemblageleeftijd. Deze FRET-verdunningstest maakt onderscheid tussen eenrichtings- en tweerichtingsflux van eiwit in en uit eiwitassemblages en kan daarom worden toegepast tijdens de assemblagevorming. Differentiëren tussen dynamische en kinetisch gestopte eiwitassemblages is cruciaal voor het begrijpen van hun biofysische oorsprong, en deze nieuwe FRET-verdunningstest kan worden aangepast om biofysisch onderzoek van andere eiwitassemblages aan te vullen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afstembare irisatie in loliginide inktvis wordt gemedieerd door reflectine-eiwitten in iridocytcellen 1,2,3. Iridocyten bevatten uitgebreide en regelmatige membraaninvaginaties die stapels eiwitdichte Bragg-lamellen vormen, die licht weerkaatsen op een hoek- en golflengte-afhankelijke manier 1,4,5,6. Een door acetylcholine getriggerde signaalcascade culmineert in de fosforylering van kationische reflectine-eiwitten 1,2,7, waardoor intra- en interproteïne elektrostatische afstoting wordt verminderd en de condensatie van reflectines in Bragg-lamellen wordt aangedreven van deeltjes met een hydrodynamische straal van 10-50 nm naar een dicht vloeibaar condensaat 3,8,9. Reflectine A1 in vitro vormt groottestabiele assemblages met een straal van 10+ nm waarvan de afmetingen nauwkeurig zijn afgestemd op de netto ladingsdichtheid van het eiwit 10,11,12, en dit afstembare colloïdale gedrag heeft veel bio-engineeringinteresse gewekt bij het ontwerpen van op reflectine gebaseerde afstembare biofotonische materialen 13,14,15,16,17,18. Onlangs is aangetoond dat NaCl reflecteert op A1-assemblage en LLPS (vloeistof-vloeistoffasescheiding) door de energetische bijdrage van het hydrofobe effect entropisch te verhogen en door de afstotende ladingen van de afwisselende kationische linkers te screenen19.

Voor eiwitdichte vloeistofachtige condensaten kan de dynamische uitwisseling tussen de dichte fase en de verdunde fase gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) met hele druppels20; Een analoge test voor eiwitassemblages op nanometerschaal is nodig. Recente rapporten van fysiologisch relevante eiwitassemblages als tussenproducten volgens LLPS 19,21,22 suggereerden de noodzaak van equivalente methoden om de assemblagedynamiek en dynamische uitwisseling tussen assemblages en de naast elkaar bestaande verdunde fase te ondervragen. Eiwitclusters kunnen kinetisch gestopte glasachtige colloïden omvatten die worden geproduceerd door gestopte spinodale ontleding, dynamische evenwichtsassemblages die monomeren of oligomeren uit de verdunde fase uitwisselen, en metastabiele clusters 23,24,25,26,27. Leeftijdsafhankelijke eiwitassemblagedynamiek is daarom de sleutel tot het begrijpen van de fysische processen die de vorming van eiwitassemblages aansturen in de context van complexer fasegedrag.

Op FRET gebaseerde benaderingen die de interactie analyseren tussen assemblages van donorfluorofoor-gelabeld eiwit en assemblages van acceptor-fluorofoor gelabeld eiwit zijn gebruikt om de dynamiek van metastabiele eiwitclusters te karakteriseren21. Bij het mengen van deze clusters toont het ontstaan van FRET de uitwisseling en het transport van eiwitten naar de clusters21. Voor sommige eiwitten, zoals reflectine A1, vormen en groeien er echter continu clusters tijdens de duur van het experiment19. Voor dergelijke eiwitten is een benadering nodig die eenrichtingstransport van eiwit in clusters deconvolueert, zoals kan gebeuren tijdens de voortdurende vorming van dynamisch gestopte clusters, en tweerichtingstransport van eiwit tussen assemblages.

Een FRET-verdunningsbenadering bereikt dit via fluorofoorverdunning (Figuur 1), waarbij een afname van FRET duidt op tweerichtingstransport van eiwit tussen assemblages. Er werden eiwitassemblages van reflectine-eiwit bereid die gelijke hoeveelheden eiwit bevatten die waren gelabeld met acceptor-fluorofoor of donor-fluorofoor. Deze co-gelabelde reflectine-assemblages werden verdund met een oplossing die niet-gelabelde reflectine-assemblages bevatte, en de dynamische uitwisseling van eiwitten tussen assemblages werd geanalyseerd als een functie van de assemblageleeftijd. Deze methode onderscheidt de continue vorming van kinetisch gestopte eiwitclusters van dynamische clusters, inclusief maar niet beperkt tot metastabiele clusters, clusters die groeien als gevolg van Ostwald-rijping of soortgelijke verruwingsprocessen, clusters die groeien door fusie en clusters die geen tussenproducten zijn voor LLPS. Het maakt niet alleen onderscheid tussen deze verschillende mechanismen van dynamische uitwisseling, waarvoor orthogonale methoden nodig zijn zoals dynamische lichtverstrooiing, analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA) en Bradford-assays19,21. Dit protocol beschrijft methoden voor de zuivering van reflectine A1 wildtype en de enkelvoudige cysteïne-bevattende mutant A1-C232S, de covalente labeling van A1-C232S en de FRET-verdunningsanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Eiwitzuivering en covalente etikettering

  1. Transformatie
    1. Kloon reflectine A1 en reflectine A1 C232S genen (GenBank KF661517.1) in de pj411 plasmiden.
    2. Transfect Rosetta 2 (DE3) cellen met plasmiden met behulp van hitteschokbehandeling28.
    3. Plaat getransfecteerde cellen op agar die 50 μg/ml kanamycine bevat.
    4. Selecteer een geïsoleerde kolonie en voeg toe aan 5 ml TB (Terrific Broth) met 50 μg/ml kanamycine en incubeer een nacht bij 37° C op een shaker bij 250 tpm.
    5. Isoleer plasmiden met behulp van het plasmide-isolatiekitprotocol voor sequencing.
  2. Eiwitexpressie, lysis en inclusie lichaamszuivering
    1. Voeg 5 ml cultuur toe aan 1 L LB (lysogeniebouillon) met 50 μg/ml kanamycine en incubeer bij 37° C tijdens het schudden. Bij een A600 van 0,6-0,7 wordt expressie geïnduceerd door IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 5 mM.
    2. Na 16 uur werden de pelletcellen gedurende 10 minuten gecentrifugeerd op 12.000 x g . Decanteer supernatans en vriescelpellets in een vriezer van -80° C.
    3. Lyse cellen en zuiveren van inclusielichamen met behulp van inclusie lichaamszuiveringsreagens volgens het protocol van de fabrikant, inclusief 20 minuten behandeling met 1 μL (25-29 eenheden) benzonase en 3-5 KU lysozym per ml inclusie lichaamszuiveringsreagens na initiële resuspensie van celpellet. Gezuiverde insluitingslichaampjes verschijnen als donkerbruine korrels.
  3. FPLC (snelle eiwitvloeistofchromatografie)
    1. Bereid 2 L 8 M ureum: 5% v/v azijnzuuroplossing (Buffer A) en 1 L 8 M guanidiniumhydrochloride: 5% v/v azijnzuuroplossing (Buffer B). Filter beide met behulp van een vacuümkolffilter van 0,22 μm.
      LET OP: Vermijd inademing, oog- en huidcontact met guanidiniumhydrochloride en draag de juiste PBM (persoonlijke beschermingsmiddelen) bij het hanteren. Gooi het weg in een daarvoor bestemde afvalcontainer.
    2. Resuspendeer de opgenomen lichaamspellets in 8 M ureum: 5% azijnzuuroplossing door krachtig te roeren met een magnetische roerstaaf. De oplossing zal troebel lijken. Centrifugeer voor het afkoelen tot 4 °C, centrifugeer bij 18.000 x g bij 4 °C gedurende 70 minuten en verzamel supernatans voor FPLC. Het bovenstaande ziet er bruin en transparant uit.
    3. Gebruik een debiet van 2 ml/min voor alle volgende stappen, breng 10 ml van de kationenuitwisselingskolom in evenwicht met 5 kolomvolumes (CV's) van 95% Buffer A, 5% Buffer B en laad het monster. Was het ongebonden monster uit met 5 CV's en voer vervolgens het stapsverloop uit: 5 CV's van 94% Buffer A/6% Buffer B, dan 5 CV's 10% Buffer B. Reflectin A1-eluaties bij 10% Buffer B.
    4. Beoordeel de zuiverheid van de fracties die overeenkomen met de eerste stap, verander naar 10% Buffer B door SDS-PAGE en pool indien vergelijkbaar. Koel een centrifuge voor tot 4 °C en concentraat de fracties tot een eindvolume van 4-5 ml met behulp van een MWCO-spinconcentrator van 15 ml 10 kDa.
  4. HPLC (hoogwaardige vloeistofchromatografie)
    1. Bereid 2 L 18 mΩ water met 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) en 2 L acetonitril met 0,1% TFA. Filter beide met behulp van een vacuümkolffilter van 0,22 μm.
      LET OP: TFA is een sterk rokend zuur. Hanteren in een zuurkast, het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, en alleen overbrengen met glas. Vermijd inademing, oog- en huidcontact met acetonitril en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren. Gooi het weg in een daarvoor bestemde afvalcontainer.
    2. Gebruik een debiet van 1 ml/min voor alle volgende stappen en breng de C4-kolom in evenwicht met 5 CV's van 85% 18 mΩ water, 0,1% TFA en 15% acetonitril, 0,1% TFA.
    3. Begin te stromen en injecteer het monster. Stroom 2 CV's en begin dan met een constante gradiënt naar 80% acetonitril, 0,1% TFA over 5 CV's. Reflectine A1 elueert meestal bij 73% acetonitril.
    4. Bevriezingsfracties die reflectine-eiwit bevatten in buisjes van 5 ml met behulp van een ethanol- en droogijsbad. Vriesdrogen en bewaren bij -80 °C. Eiwit verschijnt als dunne witte vellen.
  5. Ongelabeld eiwitbouillonpreparaat
    1. Bereid 4 L pH 4, 25 mM azijnzuurbuffer (21,05 mM azijnzuur, 3,95 mM natriumacetaattrihydraat) met ijsazijn en natriumacetaattrihydraat. Pas de pH indien nodig aan met 4 M HCl of 4 M NaOH. Filter met een vacuümfilter van 0,22 μm.
      LET OP: Behandel sterke zuren/basen en draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. Voeg nooit water toe aan geconcentreerd sterk zuur of base.
    2. Ontdooi de buis met gevriesdroogd reflectine-eiwit en los met de buis in een ijsbad opnieuw op met pH 4,25 mM azijnzuurbuffer. Een volledig oplosbare eiwitoplossing ziet er kleurloos uit zonder zichtbare troebelheid of neerslag.
      1. Met behulp van een afgesneden dialysecassette met een molecuulgewicht van 10 kDa, dialyseer het opgeloste reflectine-eiwit in een monstervolume van 1000x met een pH van 4, 25 mM azijnzuurbuffer voorgekoeld tot 4 °C met behulp van twee 12-uurs veranderingen bij 4 °C.
    3. Verdun het monster met een azijnzuurbuffer van pH 4, 25 mM om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 100 μM en een eindvolume van ten minste 150 μl te verkrijgen. Meet met een UV-VIS-spectrometer de extinctie bij 280 nm en gebruik de molaire absorptiecoëfficiënt29 van reflectine A1 (123.685 M-1 cm-1) om de eiwitconcentratie te bepalen.
    4. Breng de reflecterende eiwitvoorraad over in een microcentrifugebuis van 0,5 ml met klikdop en bewaar deze tot 7 dagen bij 4 °C. Centrifugeer direct voorafgaand aan de experimenten de reflectine-eiwitvoorraad bij 4 °C in een voorgekoelde microcentrifuge bij 18.000 x g gedurende 15 minuten. Bereid reflectine A1 C232S-voorraad op dezelfde manier voor met behulp van de molaire absorptiecoëfficiënt van 123,540 M-1 cm-1.
  6. Eiwit etikettering
    1. Bereid afzonderlijk 10 mg/ml voorraden FMTS (fluoresceïne-methanethiosulfonaat) en SRMT (sulforhodamine methanethiosulfonaat) door 1 ml droog dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan een injectieflacon met 10 mg fluorescerende sonde en pipetmenging.
      LET OP: Vermijd inademing, oog- en huidcontact met methanethiosulfonaatreagentia.
    2. Voeg 7,7 μl van de 10 mg/ml FMTS-voorraad of 10,4 μl van de 10 mg/ml SRMT-voorraad toe aan een pH 4,25 mM azijnzuurbuffer tot een eindvolume van 150 μl en een eindconcentratie van 500 μM FMTS of SRMT. De oplossing zal troebel lijken. Aliquot en vries de rest van de fluorescerende sondevoorraden in bij -80 °C.
    3. Combineer met 150 μL 100 μM reflectine eiwitbouillon en pipetteermeng grondig. De uiteindelijke eiwitconcentratie is 50 μM en de uiteindelijke fluorescerende sondeconcentratie is 500 μM. De troebelheid van de oplossing zal afnemen.
    4. Wikkel in folie en broed rechtop en voorzichtig orbitaal roeren bij kamertemperatuur gedurende 4 uur en vervolgens een nacht bij 4 °C. De troebelheid van de oplossing mag niet veranderen.
    5. Als er neerslag aanwezig is, suspendeer dan door krachtig pipetmengen. De oplossing zal troebel zijn. Concentraat reflectine met behulp van een MWCO-centrifugaalfilter van 10.000 kDa tot een doelvolume van 100 μl en een concentratie van 150 μM.
    6. Gebruik dezelfde HPLC- en vriesdroogmethode als voor eiwitzuivering om ongebonden fluorescerende sonde te verwijderen en eiwit op te slaan bij -80 °C verpakt in folie. Los het gelabelde eiwit opnieuw op met behulp van dezelfde methode voor het niet-geëtiketteerde eiwit. Bepaal de mate van etikettering.
      OPMERKING: Resolubilized fluorescerend gelabeld reflectine-eiwit zal geelgroen (C199-F) of donkerrood (C199-R) lijken zonder troebelheid of neerslag.
  7. Co-gelabeld eiwitbouillonpreparaat
    1. Voeg 27 μL 100 μM A1 eiwitbouillon toe aan een microcentrifuge van 0,5 ml.
    2. Voeg 1,5 μL fluoresceïne-gelabeld reflectine A1-C232S (aangeduid als C199-F om de aminozuurpositie van fluoresceïne aan te geven) toe aan dezelfde buis.
    3. Voeg 1,5 μL sulforhodamine-gelabeld reflectine A1-C232S (aangeduid als C199-R om de aminozuurpositie van fluoresceïne aan te geven) toe aan dezelfde buis. De uiteindelijke concentraties zijn 90 μM A1, 5 μM C199-F en 5 μM C199-R.
    4. Wikkel in folie en bewaar bij 4 °C tot 7 dagen.

2. FRET tijdreeksen

  1. Buffers en filtratie voorbereiden
    1. Bereid 500 ml 25 mM 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS) buffer. Stel de pH van de oplossing in op 7 door langzaam 4 M natriumhydroxide toe te voegen. Filtreer 10 ml met behulp van een spuit van 10 ml en een spuitfilter van 0,22 μm.
  2. Centrifugeren van eiwit
    1. Koel de tafelmodel microcentrifuge voor tot 4 °C. Centrifugeer niet-gelabelde en co-gelabelde reflectine A1-bouillons bij 18.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  3. Voorbereiden van gelabelde A1-assemblages
    1. Om drie replicaten te bereiden, pipetteert u 9,6 μL MOPS-buffer (pH 7,25 mM) in drie microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
    2. Voeg 0,4 μL geëtiketteerde eiwitbouillon toe aan elke tube die al 9,6 μL MOPS-buffer bevat tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 4 μM. Pipettemeng langzaam tweemaal door het volledige monstervolume op te zuigen en te doseren.
    3. Onmiddellijk in aluminiumfolie wikkelen en bij 25 °C in de broedmachine plaatsen. Deze en alle volgende oplossingen van assemblages missen duidelijke troebelheid of neerslag voor of na de incubatie.
  4. Voorbereiden van niet-gelabelde A1-assemblages
    1. Om drie replicaten te bereiden, pipetteert u 38,4 μL MEPS-buffer in drie microcentrifugebuisjes van 0,5 ml.
    2. Voeg 1,6 μl reflectine A1-eiwitbouillon toe aan elke buis die al 38,4 μl MOPS-buffer bevat tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van 4 μM. Pipetmeng langzaam twee keer door het volledige monstervolume op te zuigen en te doseren.
    3. Onmiddellijk in aluminiumfolie wikkelen en bij 25 °C in de broedmachine plaatsen.
  5. Timing en mengen van co-gelabelde en niet-gelabelde A1-assemblages
    1. Bestel de voorbereiding van assemblages als volgt: bereid gelijktijdig en afzonderlijk assemblages voor van experimentele één co-gelabelde reflectine en experimentele één niet-gelabelde reflectine. Herhaal stap 2.3 en 2.4.
    2. Meng door 40 μL niet-gelabelde A1-assemblage experimenteel toe te voegen aan 10 μL respectievelijke co-gelabelde experimentele, en pipetteerig meng voorzichtig door het hele volume twee keer op te zuigen en te doseren. Metingen worden 24 uur na deze stap uitgevoerd.
    3. De tijd tussen het aansturen van de assemblage van reflectine A1 door verdunning in MOPS-buffer (pH 7, 25 mM) en het mengen van gelabelde en niet-geëtiketteerde assemblages is de assemblageleeftijd. De leeftijden van de vergaderingen die voor deze gegevens werden gebruikt, waren 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min en 1620 min.
  6. Besturingselementen
    1. Positieve controle
      1. Bereid van de A1 en geëtiketteerde eiwitvoorraden 20 μL eiwitbouillon, dat is 80 μM A1 en 20 μM co-gelabelde eiwitbouillon.
      2. Voeg 38,4 μL MEPS-buffer toe aan een microcentrifugebuisje van 0,5 ml met klikdop en voeg vervolgens 1,6 μL 80 μM A1/20 μM geëtiketteerd eiwit toe en pipettemeng tweemaal door langzaam het hele volume op te zuigen en te doseren. Dek onmiddellijk af met folie en plaats in de broedmachine bij 25 °C. Herhaal dit voor een totaal van 9 samples.
    2. Negatieve controle
      1. Voeg 0,4 μl geëtiketteerd papier toe aan een microcentrifugebuisje van 0,5 ml met klikdop dat al 9,6 μl MEPS-buffer bevat. Pipetmeng langzaam twee keer door het volledige monstervolume op te zuigen en te doseren.
      2. Voeg tweemaal 40 μL MEPS-buffer toe en pipetteermix door het volledige monstervolume op te zuigen en te doseren. Dek onmiddellijk af met folie en plaats in de broedmachine bij 25 °C. Herhaal dit voor een totaal van 9 samples.
  7. Cuvet en buffer blank
    1. Stel de fluorimeter in op excitatie op 488 nm en registreer continue spectra van 520-700 nm.
    2. Vul een schone kwarts sub-micro fluorimeter cuvet met 50 μL MOPS-buffer (pH 7, 25 mM) en meet.
    3. Buffer verwijderen.
  8. Experimentele procedure
    OPMERKING: Alle experimenten moeten 24 uur na het mengen van co-gelabelde en niet-gelabelde reflectine A1-assemblages worden opgenomen. Piket voorzichtig 50 μl van de experimentele oplossing in de cuvet en meet af.
    1. Verwijder het monster, spoel af met 500 μl azijnzuurbuffer en vervolgens met 500 μl 0,22 μm gefilterd 18 mΩ water. Voer de buffer leeg uit.
  9. Besturingselementen
    1. Meet op 1440 min, 1960 min en 3060 min na het voorbereiden van de bedieningselementen (overeenkomend met montageleeftijden van 0 min, 520 min en 1620 min). Deze metingen sluiten het experimentele deel van het protocol af.

3. Gegevensanalyse

  1. Trek de spectra van de bufferblanco af van de experimentele spectra.
  2. Bepaal de verhouding van Em588/Em520.
  3. Bepaal vervolgens voor elke replicaat het gemiddelde en de standaarddeviatie van elke groep van drie replicaten. Perceel Em588/Em520 als functie van de assemblage leeftijd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na verdunning van reflectine A1-assemblages die zowel donorfluorofoor-gelabeld eiwit als acceptorfluorofoor-gelabeld eiwit bevatten met niet-gelabelde reflectine A1-assemblages, werd een initiële afname van de FRET-emissie bij 588 nm ten opzichte van onverdunde assemblages waargenomen (Figuur 2A). De FRET voor assemblages van 0 min oud was vergelijkbaar met de positieve controle, en de FRET voor assemblages van 1620 min oud (de tijd tussen de vorming van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een veelvoorkomend punt van eiwitverlies tijdens de zuivering is onvolledige resuspensie van inclusielichaamspellets voor alle stappen in het zuiveringsprotocol voor inclusielichaam, en uiteindelijke resuspensie van gezuiverde inclusielichaampjes in 8 M ureum 5% v/v azijnzuur. Het oplossen van het inclusielichaam kan tot 24 uur krachtig roeren duren met een kleine magnetische roerstaaf in een conische buis van 40 ml. Om aanzienlijk eiwitverlies aan filters te voorkomen, werd de filtratie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoek werd ondersteund door het Institute for Collaborative Biotechnologies door middel van subsidies W911NF-19-2-0026 en W911NF-23-1-0330 van het U.S. Army Research Office. De inhoud van de informatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs het standpunt of het beleid van de regering, en er mag geen officiële goedkeuring worden afgeleid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 µL capaciteit micropipet
2 µL capaciteit micropipet
2-[(5-Fluoresceinyl)aminocarbonyl]ethyl MethanethiosulfonateSanta Cruz Biotechnologiessc-216155CAS 351330-42-2
20 µL capaciteit micropipet
200 µL capaciteit micropipet
3-(N-Morpholino)propaansulfonzuur, 4-MorpholinepropaansulfonzuurSigma-AldrichM1254CAS 1132-61-2
AzijnzuurSigma-AldrichA6283CAS 64-19-7
AcetonitrilSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Agar poederCarolina Biological842133CAS 9002-18-0
Aluminiumfolie
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC5010080.5 ml capaciteit
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC90100815 ml capaciteit
Analytische balans
BenzonaseMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
BugBuster Protein Extraction ReagentMillipore Sigma70584-3
Cary Eclipse Fluorescerend SpectrometerCary-Eclipse
Cary Eclipse Software
Corning 50 ml centrifugeerbuisjesMillipore-SigmaCLS430829
Weggeefspuiten, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418CAS 67-68-5
Droge ijs
Dual-pomp FPLC systeem
Dual-pomp HPLC systeem
EthanolMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Vloerstaande centrifuge rotor 500 ml flescapaciteit
Vloerstaande centrifuge 
Vriezer, -80° C
Afzuiphoed
Guanidine hydrochlorideThermo ScientificAAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP kationenuitwisselingschromatografiekolomCytiva17115101
ZoutzuurSigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0
Incubator
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosidSigma-AldrichI6758-1G
Kanamycin sulfaatSigma-AldrichK1637CAS 25389-94-0
Lyofilisaat
LysozymThermo Scientific90082
Magneetschedeerder
Magneetscheerplaat
Micro pH elektrode S7Metler Toledo51343160
Microcentrifuge met temperatuurregeling
Millex PVDF spuitfilterMilliporeSLGVR33RS0.22 µm, 33mm dia.
Milli-Q Millipak FilterMillipore SigmaMPGP002A1
Milli-Q UltraPure WaterzuiveringssysteemMillipore Sigma
NaClThermo ScientificAA12314A9CAS 7647-14-5
Nalgene centrifugeerflessen, stijl 3120Millipore-SigmaB1283-4EAVoor het pelleten van bacteriën
Orbitale lab  shaker met incubator
PC
PetrischalenSigma-AldrichP5731-500EA
pj411 plasmideDNA 2.0
Protein LoBind  Conische buizenEppendorfEP301083025 ml capaciteit
Protein LoBind  MicrocentrifugebuisjesEppendorfEP0224311020.5 ml capaciteit
Pyrex beker met klep 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Voor het incuberen van bacterieculturen
Pyrex Griffin bekers 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LVoor alle buffer- en oplossingsvoorbereiding 
Pyrex ronde mediaopslagflessen 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LVoor opslag van alle buffer- en oplossingsvoorbereiding, gebruik met vacuümkolvenfilters
Qiaprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Koelkast
Rosetta 2(DE3) Competente cellenNovagen71397-3
Slide-a-lyzer dialysecassettes 10K MWCOThermo ScientificPI663830.5 ml capaciteit
Natriumacetaat trihydraatSigma-AldrichS8625CAS 6131-90-4
NatriumhydroxideSigma-Aldrich567530-250GMCAS 1310-73-2
Steritop Vacuüm Flessen Top FilterMillipore SigmaS2GPT05RE0.22 µm steriele filter
Sub-microcuvet, 50 uL capaciteitStarna Cells16.40F-Q-10/Z15
sulforhodamine methaanthiosulfonaatSanta Cruz Biotechnologiessc-220172CAS 386229-71-6
TrifluorazijnzuurSigma-Aldrich106232-25GCAS 407-25-0
TryptonSpectrum Chemical T1333
UreaThermo ScientificAAA123600ECAS 57-1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reflectine A1vloeistof vloeistof fasescheidingzoutconcentratieladingsdichtheiddynamische lichtverstrooiingprote nenfluxbiofysisch onderzoek

Gerelateerde artikelen