Methodenartikel

Muismesenteriene lymfadenectomie voor selectieve verstoring van lymfatische communicatie met regio-specifieke darmen

DOI:

10.3791/68696

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een overlevingsprocedure voor een veilige en goed verdraagde muismesenteriale lymfadenectomyat van elk van vier stations langs de mesenterische lymfeklierketen. Deze procedure is aanpasbaar om selectieve verstoring van lymfecommunicatie met de distale colon, proximale dikke darm en/of dunne darm mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunosurveillance versus antigentolerantie is een fijne balans binnen de darmmicro-omgeving, waarbij de cruciale rol van circulerende T-cel priming binnen lokale lymfeklieren goed bekend is. Na het primen van T-cellen is recente literatuur begonnen een unieke, niet-redundante rol aan te tonen van niet-circulerende T-cellen die zich in de drainerende lymfeklier van een orgaan bevinden. Dit geldt vooral in de darmen, waar lymfedrainage bekend staat als zeer specifiek. Om echter echt het unieke effect van deze lokale cellen versus systemische functionele redundantie te begrijpen, heeft de wetenschappelijke gemeenschap een goed beschreven procedure nodig om deze knopen te isoleren en selectief te verstoren. Hier wordt een overlevingsprocedure beschreven voor een veilige en goed verdraagde muismesenteriene lymfadenectomie op elk van de vier stations langs de mesenterische lymfeklierketen. Deze procedure is aanpasbaar om selectieve verstoring van lymfecommunicatie met de distale colon, proximale dikke darm en/of dunne darm mogelijk te maken. Inbegrepen zijn gedetailleerde instructies, visuele hulpmiddelen, handige tips voor beter succes en probleemoplossing voor suboptimale overleving. Geresecte lymfeklieren zijn direct klaar voor verdere verdere verwerking, indien gewenst. Deze techniek is het meest geschikt voor studies waarbij selectieve verstoring van lymfedrainage vanuit de distale colon, proximale colon en/of dunne darm vereist is.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T-cellen zijn een van de belangrijkste effectorceltypen in adaptieve immuniteit, met beschreven rollen in diverse ziektecategorieën, waaronder infecties, autoimmuniteit en maligniteit 1,2,3. Een cruciale stap voor de functionaliteit van T-cellen is de driefasige priming door antigeen-presenterende cellen binnen secundaire lymfeorganen, zoals lokale lymfeklieren. In de moderne geneeskunde bestaat een vaste waarde van een juiste oncologische resectie over meerdere orgaansystemen uit een zekere mate van lokale bemonstering of en bloc lymfeklierresectie 5,6,7,8. Zo raden consensusrichtlijnen bij darmkanker aan om 12 lymfeklieren te verwijderen en te onderzoeken in curatieve intentie-resectie vanwege een duidelijke correlatie met verbeterde langetermijnoverleving 6,7. Maar kunnen lokale lymfeklieren echt ongestraft worden verwijderd? Recente studies bij muizen hebben aangetoond dat de tumordrainerende lymfeklier een reservoir bevat van antitumor T-celvoorlopers, die mogelijk beschermd zijn tegen de terminale differentiatie en T-celuitputting die plaatsvindt in het tumormicro-milieu 9,10,11. Dit suggereert dat het verwijderen van zo'n kritieke populatie de voortdurende immunosurveillancemogelijkheden zou kunnen verminderen.

Het darmlymfedrainagepatroon bij muizen is bekend als zeer gespecialiseerd langs de mesenterische lymfeklierketen; Zo wordt de proximale colon bijna uitsluitend gedraineerd door het eerste lymfeklierstation, de dunne darm door het tweede/derde station, en de distale colon voornamelijk door het vierde lymfeklierstation12 (Figuur 1, Aanvullende Figuur 1). Zo kan de directe communicatie tussen segmenten van de darm en lymfecellen worden verstoord door gerichte ablatie van deze klieren. Om het verkeer tussen lymfeklieren en weefsels te blokkeren, worden S1P-receptoragonisten, zoals FTY720, en integrineblokkade vaak gebruikt; Deze geneesmiddelen remmen echter de handel in grote lijnen en kunnen daarom niet worden gebruikt om de bijdrage van specifieke lymfeklierente onderzoeken. Het vermogen van de bredere wetenschappelijke gemeenschap om het lokale effect van immuuninteracties binnen darmlymfeklieren te bestuderen wordt echter beperkt door het ontbreken van een goed beschreven chirurgische resectie voor elk station. Met deze kloof in gedachten is een overlevingsprocedure ontwikkeld voor muismesenteriale lymfadenectomie bij elk knooppuntstation die hier wordt beschreven. Het algemene doel van deze procedure is het bereiken van een veilige en betrouwbare excisie van het mesenterische lymfeklierstation(s) bij muizen met een hoge postoperatieve overleving en tolerantie.

Deze procedure is getest en is eenvoudig uit te voeren bij jonge en volwassen muizen over meerdere stammen (bijv. Balb/c, C57BL/6J, 129S4), maar wordt beperkt door de noodzaak van toegankelijke en gemakkelijk identificeerbare lymfeklieren. Daarom is het mogelijk niet goed geschikt om te combineren met muismodellen of genotypen met kleinere dan gebruikelijke of onmerkbare lymfeklieren (bijvoorbeeld lymfotoxine-alfa-deficiënte muizen)15. Bovendien hebben oudere muizen (>15 weken) vaak meer viscerale vet, waardoor het identificeren en isoleren van lymfeklieren moeilijker wordt, en hoewel dit geen contra-indicatie is, kan het wel succes- of procedurebeperkend zijn. Naast deze beperkingen biedt de mesenterische lymfadenectomie een sterk gecontroleerde en zeer selectieve verstoring van lymfeklieren. Deze procedure is het beste geschikt om vragen te ontrafelen over het lokale effect van lymfeklieren en hun bijbehorende residente immuuncellen en interacties op segmenten van de darm (bijv. proximale colon, distale colon, dunne darm).

figure-introduction-1
Figuur 1: Anatomische herkenningspunten van stations in de mesenterische lymfeklierketen. (A) Ongelabelde en (B) gelabelde weergave van vier grote mesenterische lymfeklierstations in situ. De proximale dikke darmdrainage verloopt voornamelijk via station 1, de dunne darm is voornamelijk station 2/3, en de distale colon is voornamelijk station 4. (DC= distale colon, ICV= ileocolische vaten, PC= proximale colon, CEC= cekum, IV/JV= ileale vaten/jejunale vaten, SI= dunne darm). Schaalbalken: 1,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van de Yale Institutional Animal Care and Use Committee. Om deze procedure te ontwikkelen, werden C57BL/6-stam van 8-12 weken oud, wildtype-muizen en leeftijd/geslacht/genotype-gematchte nepcontroles gebruikt. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden opgenomen. Het lichaamsgewicht varieerde van 18-25 g. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van instrumenten, dieren en de operatiekamer

  1. Steriliseer alle chirurgische instrumenten. Zorg ervoor dat het werkoppervlak en de neuskegel van het verdovingsmiddel met 70% ethanol zijn gereinigd.
  2. Stel de inhalatie-anesthesie-vaporizer in met een neuskegel en zuiging voor overtollige verdovingsverdoving. Richt een bedieningsoppervlak in met een warmwatercirculatiepad om de lichaamstemperatuur en voorraden van het dier op een handige, steriele locatie te behouden.
    OPMERKING: Deze procedure vereist geen bedieningsmicroscoop; Overweeg echter om dit instrument toe te voegen om de visualisatie te verbeteren.
  3. Induceer anesthesie door 2%-3% ingeademde isofluraan toe te dienen met een zuurstofstroom van 2 L/min via de neuskegel van een ingeademde anesthesie-vaporizer (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    1. Zorg voor een passend vlak van anesthesie door een ademhalingsfrequentie van ongeveer 30-40 ademhalingen per minuut te bevestigen en geen reactie op een knijp in de achtervoet. Controleer periodiek opnieuw op het juiste vlak van de anesthesie en pas de isoflurane stroomsnelheid dienovereenkomstig aan.
      OPMERKING: Alternatief is een injecteerbaar anestheticum ook geschikt.
  4. Volg de richtlijnen van het instituut voor geschikte analgesie en lokale verdoving. Dien bijvoorbeeld een langwerkende pijnstiller, zoals 3,25 mg/kg buprenorfine XR, subcutaan toe en dien tot 0,04 mL/5g lichaamsgewicht van 1 mg/mL lidocaïneoplossing subcutaan toe bij de geplande incisie.
  5. Bereid het dier voor op de procedure door het liggen te plaatsen, oogglijmiddel aan te brengen, de buikvacht te plukken of te knippen en de buik te steriliseren met povidon/jodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol (Figuur 2A).
  6. Gebruik steriele handschoenen en leg steriele gordijnen over het dier met een venster naar het operatieveld. Houd de onvruchtbaarheid gedurende de hele procedure.

figure-protocol-1
Figuur2: Representatieve beelden van belangrijke procedurele stappen bij de mesenteriale lymfadenectomie. (A) Geplukte en steriliseerde buikvenster. (B) 0,5 cm incisie door de huid en linea alba. (C) Blootstelling van de mesenterische lymfeklierketen door het ileum naar rechts, proximale colon links en het inferior cecum te oriënteren. De eerste mesenterische lymfeklier ligt langs de arteria ileocolica (witte pijl). (D) Verwijderde mesenteriale lymfeklier (vervaagde pijl). Schubbalken: 0,5 cm. (E) Ex vivo mesenterische lymfeklier (witte pijl; 2,5 mm x 3 mm). Tikken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding van een mesenterische lymfadenectomie

  1. Maak een incisie in het midden van 0,5-1 cm door de huid. Ontleed de huid bot van de buikwand en identificeer de linea alba. Maak een incisie van 0,5-1 cm door de linea alba om toegang te krijgen tot de peritoneale holte (Figuur 4B).
    OPMERKING: Om de toegang tot de knopen van station 2/3/4 te verbeteren, overweeg het verlengen van de incisie-cephalad, maar niet om het kraakbeen-xiphoïdproces te overstijgen.
  2. Breng 1 ml steriele zoutoplossing bij lichaamstemperatuur in de peritoneale holte via een stompe punt-gavagenaald en bevochtig de steriele gordijnen ter voorbereiding op de darmpositie. Gebruik steriele, bevochtigde wattenstaafjes om het ceum te identificeren en te ontleden via de incisie.
    1. Vermijd het gebruik van scherpe instrumenten om de darm te behandelen, omdat dit tot letsel kan leiden. Maak regelmatig de gordijnen en darmen opnieuw bevochtigd om uitdrogende schade te voorkomen.
      OPMERKING: Het muiscekumum bevindt zich meestal in het linker onderste kwadrant van het achterlijf, maar kan in elk kwadrant worden gehuisvest.
  3. Verduidelijkt de doel-mesenterische lymfeklierstation(en) voor resectie en volg de specifieke instructies hieronder (d.w.z. 3.1-3.4). Zie Figuur 1A,B voor anatomische herkenningspunten en identificatie.

3. Dissectie en excisie van mesenterische lymfeklierstations

  1. Eerste lymfeklierstation (proximale colondrainage; Aanvullende figuur 1A,B').
    1. Oriënteer de exterioriseerde darm op bevochtigde gordijnen met het cekumum onder, proximale colon boven, en het terminale ileum naar rechts van de chirurg (linkerzijde van het dier; Figuur 1A, Figuur 2C).
    2. Identificeer de mesenterische lymfeklierketen, die longitudinaal langs de dikke darm loopt. Met schuine fijnpuntige pincet dissectie je het eerste lymfeklierstation bot weg van de ileocolische vaten door gesloten pincetten in de ruimte tussen deze structuren te plaatsen en de pincet zachtjes te laten openen.
      1. Verwijder de pincet en herhaal deze manoeuvre 2-3 keer of totdat er een voldoende vlak is gemaakt voor veilige excisie. Voorkom schade aan grote colonische bloedvaten (Figuur 3A, B).
        OPMERKING: Als er aanzienlijke bloedingen optreden, aborteer de procedure en euthanace het dier op humane wijze (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    3. OPTIONEEL: Om het theoretische risico op nevenhechtingen aan nabijgelegen klieren te verkleinen, voer een optionele hechtingsligaturen uit met enkele onderbroken hechtingen langs de lymfeklierketen (één 1 mm distaal en één 1 mm proximaal van het eerste lymfeklierstation) met behulp van 9-0 zwarte monofilament nylon hechting en fijnpuntige pincetten om de naald te drijven (Figuur 3C, D).
    4. Trek voorzichtig het geligeerde lymfestation caudad terug en verwijder met fijnpuntschaar het doellymfeklierstation van cephalad naar caudad (Figuur 3E).
      OPMERKING: Vaak hebben muizen een klein maar zichtbaar voedingsvat van de ileocolische slagader naar het achterste deel van de lymfeklier. Het bloeden uit dit vat kan worden gecontroleerd door zachte druk met een wattenuitstaf totdat hemostase is bereikt.

figure-protocol-2
Figure3: Geannoteerde stills en commentaar van de mesenteriale lymfadenectomie (eerste station). (A) Een juiste oriëntatie van de darm onthult het eerste mesenterische lymfeklierstation (witte pijl). (B) Er wordt een vlak gevormd tussen de ileocolicale slagader (bluearrow) en de knoop. (C) Hechting van voedingsvaten die de top van de lymfeklier binnengaan (blauwe pijl) wordt uitgevoerd terwijl de ileocolische vaten worden uitgesloten door de ruimte tussen deze structuren te verlaten (witte pijl). (D) Hechtingsligatering van de basis van de lymfeklier wordt uitgevoerd, waarbij opnieuw de distale takken van de ileocolikale arteria worden genoteerd en vermeden. (E) De knoop wordt verwijderd langs het eerder gevormde weefselvlak, blijft hoog richting de lymfeklier en laat hechtingsligaties achter (zwarte pijlen). (F) Hemostase is bevestigd, distale takken van de ileocolische slagader worden geobserveerd om een goede bloedstroom te waarborgen, en de lege ruimte (vervaagde pijl) waar de eerder gevestigde knoop was, blijkt vrij te zijn van restknoop. Schaalbalken: 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Tweede lymfeklierstation (middistale dunne darmdrainage)
    1. Snijd ook voorzichtig de dunne darm uit. Oriënteer de buitenste darm op vochtige gordijnen met het cekumum onder, proximale colon boven, en dunne darm naar rechts van de chirurg (linkerzijde van het dier; Figuur 1A).
    2. Identificeer de mesenterische lymfeklierketen, die longitudinaal langs de dikke darm loopt. Het tweede station begint bij de samenvloeiing van ileale/jejunale vaten (Figuur 1B).
      1. Met een schuine fijnpuntige pincet dissectie je het tweede lymfeklierstation bot van de colonische vaten door gesloten pincetten in de ruimte tussen deze structuren te plaatsen en de pincet voorzichtig te laten openen.
      2. Verwijder de pincet en herhaal deze manoeuvre 2-3 keer of totdat er een voldoende vlak is gemaakt voor veilige excisie. Voorkom schade aan grote bloedvaten in de colone. Let ook extra op de ileale en jejunale vaten, die nadelig zouden zijn als ze gewond raken.
        OPMERKING: Als er veel bloeding wordt opgetreden, moet de procedure worden afgebroken en het dier op humane wijze geëuthanaseerd.
    3. OPTIONEEL: Om het theoretische risico op nevennaaste klieren te verkleinen, voer een optionele hechting uit met enkele onderbroken hechtingen langs de lymfeklierketen (één 1 mm distaal en één 1 mm proximaal van het tweede lymfeklierstation) met 9-0 zwarte monofilament nylon hechting en fijnpuntige pincetten om de naald te drijven (Aanvullende Figuur 2A).
    4. Trek voorzichtig het geligeerde lymfestation terug caudad en verwijder met fijnpuntschaar het doelpunt van de lymfeklier van cephalad naar caudad (Aanvullende Figuur 2B).
      OPMERKING: Vaak hebben muizen een klein maar zichtbaar voedingsvat van de ileocolische slagader naar het achterste deel van de lymfeklier. Het bloeden uit dit vat kan worden gecontroleerd door zachte druk met een wattenuitstaf totdat hemostase is bereikt.
  2. Tweede en derde lymfeklierstation (prox-midden-distale dunne darmdrainage; Aanvullende figuur 1C,D'
    1. Snijd voorzichtig de gehele dunne darm uit tot het punt van posterieure tethering (ligament van Treitz). Oriënteer de buitenste darm op vochtige gordijnen met het cekumum onder, proximale colon boven, en dunne darm naar rechts van de chirurg (linkerzijde van het dier; Figuur 1A).
    2. Identificeer de mesenterische lymfeklierketen, die longitudinaal langs de dikke darm loopt. Het tweede station begint bij de samenvloeiing van ileale/jejunale vaten (Figuur 1B).
      1. Met een schuine fijnpuntige tang ontleed je het tweede en derde lymfeklierstation bot weg van de colonische vaten door gesloten pincet in de ruimte tussen deze structuren te plaatsen en de pincet voorzichtig te laten openen.
      2. Verwijder de pincet en herhaal deze manoeuvre 2-3 keer of totdat er een voldoende vlak is gemaakt voor veilige excisie. Voorkom schade aan grote bloedvaten in de colone. Let ook extra op de ileale en jejunale vaten, die nadelig zouden zijn als ze gewond raken.
        OPMERKING: Als er veel bloeding wordt opgetreden, moet de procedure worden afgebroken en het dier op humane wijze geëuthanaseerd.
    3. OPTIONEEL: Om het theoretische risico op collateralen aan nabijgelegen klieren te verkleinen, voer een optionele hechting uit met enkele onderbroken hechtingen langs de lymfeklierketen (meestal één 1 mm distaal, twee 1 mm lateraal en één 1 mm proximaal van de tweede/derde lymfeklierstation) met 9-0 zwarte monofilament nylon hechten en fijn getipte tang om de naald te drijven (Aanvullende Figuur 3B, C).
      1. Let op de afferente lymfebanen, die slechts oppervlakkig liggen ten opzichte van de ileale/jejunale vaatbundels (aanvullende figuur 3B). Wees voorzichtig om hechtingsverbindingen diep in lymfekaten en oppervlakkig te laten liggen bij grote vaatstructuren, aangezien schade aan ileale/jejunale vaatbundels schadelijk zou zijn.
    4. Trek voorzichtig de geligeerde lymfestations in cephalad en verwijder met fijne of extra fijne puntschaar de doel-lymfeklierstations van caudad tot cephalad.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de dunne darm roze en goed doorbloed blijft voordat u verder gaat. Toevallige ligatie van de ileale/jejunale vaten zal resulteren in ischemische dunne darm.
  3. Vierde lymfeklierstation (distale colondrainage; Aanvullende figuur 1E,F')
    1. Snijd voorzichtig de gehele dunne darm uit tot het punt van posterieure tethering (ligament van Treitz). Oriënteer de buitenste darm op vochtige gordijnen met het cekumum onder, proximale colon boven, en dunne darm naar rechts van de chirurg (linkerzijde van het dier; Figuur 1A).
    2. Identificeer de mesenterische lymfeklierketen, die longitudinaal langs de dikke darm loopt. Het vierde station bevindt zich net mediaal van de distale dikke darm en lateraal van het derde station (Figuur 1B, Figuur 4A).
      1. Met een schuine fijnpuntige pincet of extra fijne schaar dissectie je het vierde lymfeklierstation bot weg van de colonvaten en omliggende vetstof door gesloten pincet/schaar in de ruimte tussen deze structuren te plaatsen en de pincet/schaar voorzichtig te laten openen.
      2. Verwijder de pincett/schaar en herhaal deze manoeuvre 2-3 keer of totdat er een voldoende vlak is gemaakt voor veilige excisie. Voorkom schade aan grote bloedvaten in de colone.
        OPMERKING: Als er veel bloeding wordt opgetreden, moet de procedure worden afgebroken en het dier op humane wijze geëuthanaseerd.
    3. OPTIONEEL: Om het theoretische risico op collateralen aan nabijgelegen klieren te verkleinen, voer een optionele hechtingsligater uit met enkele onderbroken hechtingen bij elke identificeerbare lymfeklier (meestal één 1 mm van de knoop) met 9-0 zwarte monofilamentnylon en fijnpuntige tang om de naald te drijven (Figuur 4B - D).
    4. Trek voorzichtig de geligeerde lymfestations cephalad terug en verwijder met extra fijne scharen het doel-lymfeklierstation van caudad naar cephalad (Figuur 4D,E).

figure-protocol-3
Figuur4: Geannoteerde stills en commentaar van de mesenteriale lymfadenectomie (vierde station). (A) Een juiste darmoriëntatie brengt het vierde mesenterische lymfeklierstation (witte pijlen) naar voren, mediaaal van de distale colon en lateraal van het derde station. (B,C) Na de stompe dissectie van het knooppunt wordt bij elke identificeerbare knoop een hechtingsligater (zwarte pijl) uitgevoerd, waarbij alle lymfekliervoedingsvaten (blauwe pijlen) worden opgenomen. (D) De knoop wordt verwijderd langs het eerder gevormde weefselvlak, blijft hoog naar de lymfeklieren toe en laat hechtingsligaties achter (zwarte pijlen). (E) Na het verwijderen van het knooppunt (witte pijlen) wordt hemostase bevestigd, zijn hechtingsligaties zichtbaar (zwarte pijlen), en de lege ruimte (vervaagde pijlen) waar de eerder gevestigde knoop was, blijkt vrij te zijn van residuele knoop. Schaalbalken: 0,2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Voltooiing van mesenteriale lymfadenectomie

  1. Let op de distale takken van de ileocolische vaten, ileale vaten en/of jejunale vaten om te zorgen dat de bloedtoevoer intact is. Goed doorbloedde darm is fel en roze met zichtbare pulsaties.
    1. Met wattenuitjes wordt de buikinhoud teruggebracht in de peritoneale holte. Zorg ervoor dat je eventuele stukjes katoen, pluis, doek of hechting uit de darmen verwijdert voordat je terugkomt, omdat dit kan leiden tot extra chirurgische ontsteking.
    2. Zorg ervoor dat de darm niet gedraaid is op de mesenterie door te controleren of de darm helder/roze blijft (doorbloed) in plaats van dof/grijs/paars (ischemisch).
  2. Breng 1 ml steriele zoutoplossing bij lichaamstemperatuur in de buik vlak voor sluiting om ongevoelig vochtverlies/verdamping te voorkomen. Sluit de buik in twee lagen (buikwand en huid) met 6-0 monofilament polypropyleenhechting in een lopende vorm.
  3. Breng steriele chirurgische lijm aan op de wond.
    OPMERKING: Alternatief kunnen onderbroken hechtingen of wondklemmen worden gebruikt voor het sluiten van de huid.

5. Postoperatieve zorg

  1. Breng het dier naar een schone kooi, die half op en half op een warmwater-circulerende plek staat met toegang tot voedsel en water op vrije hand.
  2. Laat het dier herstellen van de narcose en houd nauwlettend in de gaten op tekenen van stress. Als dieren niet snel herstellen van de narcose met passend gedrag (zoals verhoogde ademhalingsfrequentie, zelfherstellen, lopen, verzorgen), euthanasen het dier dan op humane wijze.
  3. Wanneer alle dieren van de narcose zijn hersteld, breng dan de kooien terug naar de dierenverzorgingsfaciliteit met toegang tot water, voer, beddengoed en verrijkingsmaterialen ad libium.
  4. Controleer muizen postoperatief elke 12 uur gedurende 3 dagen op tekenen van pijn of stress (bijvoorbeeld gebogen houding, verminderde activiteit, verminderde betrokkenheid, slechte verzorging). Muizen die tekenen van stress vertonen, op humane wijze inslapen.
  5. Als je permanente hechtingen gebruikt (zoals 6-0 monofilament polypropyleen), controleer dan de incisies op postoperatieve dag 10 en verwijder eventueel resterende hechtingsmateriaal.

6. Lymfeklierbehandeling

  1. Voer onmiddellijk een drijfvermogenstest uit door het verwijderde weefsel in een 1,5 mL microcentrifugebuis te plaatsen met 500 μL fosfaatgeboterde zoutoplossing (PBS). Bevestig de excisie van lymfeklieren door te observeren dat weefsel in PBS zakt versus per ongeluk geresecteerd vetweefsel, dat zal drijven (Figuur 5A).
    OPMERKING: De verwijderde lymfeklierstation(en) zijn direct klaar om verder in de downstream verwerking te gaan.
  2. Voor live-celtechnieken plaats je het verwijderde lymfeklierstation(s) in celkweekmedia (bijv. DMEM, RPMI) of PBS op ijs. Voor geplande histologie plaats je de verwijderde lymfeklierstation(en) in het fixatief (bijv. 10% neutraal gebuffreerd formaline, 4% paraformaldehyde).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de nauwkeurigheid van deze procedure te bevestigen, werden mesenteriale lymfadenectomieën uitgevoerd bij elf C57BL/6J-stamgenooten van 4-6 weken oude, leeftijd, geslacht en genotype-gematchte C57BL/6J-stam. De proceduretijden varieerden van 5-15 minuten per muis. Alle muizen verdroegen de procedure goed, met 100% perioperatieve overleving. Verwijderde monsters werden in PBS op ijs gelegd. Alle monsters zonken onmiddellijk, wat een laag vetgehalte bevestigde. Verwijderde monsters (en v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een overlevingsprocedure beschreven voor een veilige en goed verdragen muismesenteriale lymfadenectomie op elk van de vier knooppuntstations. De belangrijkste beperking van deze procedure is de indirecte relatie tussen blootstelling en de progressie van lymfeklieren langs de mesenterische keten. Het eerste lymfeklierstation is gemakkelijk en gemakkelijk volledig blootgelegd. Het tweede lymfeklierstation is vaak zichtbaar, en blootstelling aan de2e tot 4estation...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.A.F. is adviseur van GlaxoSmithKline, Plythera Inc. en Ventus Therapeutics. Alle andere auteurs geven geen concurrerende belangen aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken J. Alderman, B. Cadugan, E. Hughes-Picard en J. Horrocks voor administratieve hulp, en C. Hughes voor het beheer van de muizenkolonie. H.N.B. is fellow van het Yale Surgeon Scientist Training Program, dat dit project gedeeltelijk financierde en ondersteunde. Dit werk werd ook gefinancierd door het Howard Hughes Medical Institute (aan R.A.F.) en de American College of Surgeons Resident Research Award (aan H.N.B.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AnesthesiegebruikElkOf injecteerbaar anestheticum
BD LSRII flow cytometer (of equivalent)BD BiosciencesUitgerust met FACS Diva Software, (voor flowcytometrie) 
Buprenorfine XRElkVoor pijnbestrijding
Celcultuurmedia Elk(voor levende celtechnieken; dwz. DMEM of RPMI)
DAPIBiolegend422801Werkconcentratie: 15 ug/mL
Ethanol (70% in water)ElkVoor schoonmaken
FITC-geconjugeerd anti-muis CD45.2 (104)Biolegend109806Werkconcentratie: 5 ug/mL
Pincet: Gebogen fijnpuntpincetRobozRS-5058Materiaal: Dumoxel; Patroon #5, 45 graden hoek; tipgrootte 0,1 X 0,06mm
Pincet: FijnpuntpincetRobozRS-4960Materiaal: Dumostar; Patroon #1; Tipgrootte: 0,20 X 0,12mm
Pincet: FijnpuntpincetRobozRS-4966Materiaal: Dumostar, biologietip; Patroon #3; Tipgrootte: 0,08 x0,04mm
LidocaineElkVoor pijnbestrijding
Metalen slangenspuitenElk20/22 gauge herbruikbare rechte orale slangenspuit, roestvrij staal.
NaalddriversRobozRS-6410Castroviejo-naaldhouder; Recht
OPTIONEEL:    Dubbele/tweehals microscoop LED-verlichtingElk
OPTIONEEL: Evans Blue kleurstofSigmaE2129-10GVoor optioneel lymfatisch traceren.
OPTIONEEL: OperatiemicroscoopLeicaMZ9.5Leica Mz9.5 stereo hoofd operatiemicroscoop
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Elk
Povidon/JodiumoplossingElkVoor huidvoorbereiding/sterilisatie
Schaar: Extra fijnpuntschaarRobozRS-5605McPherson-Vannas; 3 mm snijrand; gebogen (voor station 3/4 knooppunten)
Schaar: FijnpuntschaarRobozRS-5650SCSurecut Castroviejo schaar (voor station 1/2/3 knooppunten)
Schaar: Medium schaarRobozRS-5676Noyes; 13 mm snijrand; recht
Chirurgisch lijmElk3M Vetbond weefselkleefstof
Hechtdraad: 6-0 blauwe monofilament polypropyleenxElk
Hechtdraad: 9-0 zwarte monofilament nylonnaaldElk(optioneel) Kan ook de iets grotere 8-0 maatnaald gebruiken.
WeefselfixatiefElk(voor geplande histologie; dwz. 10% neutraal gebufferde formaline of 4% paraformaldehyde)
Warmwatercirculerend verwarmingskussenElk

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology. J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).
  2. Rouiz-Argüelles, A. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
  3. Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).
  4. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  5. Divi, V., et al. Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer. J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).
  6. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review. JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).
  7. Simoes, P., et al. Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better. Surg Oncol. 43, 101806(2022).
  8. Resio, B. J., et al. Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection. Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).
  9. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  10. Saddawi-Konefka, R., et al. Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC. Nat Commun. 13, 4298(2022).
  11. Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology. Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).
  12. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  13. Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation. Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).
  14. Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).
  15. Mariathasan, S., et al. Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration. J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).
  16. Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice. PLoS One. 9 (8), e106034(2014).
  17. Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection. Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).
  18. Shaikh, H., et al. Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract. Front Immunol. 12, 689896(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Immunosurveillance van de darmprimen van T cellenlymfeklierexcessielymfekliinketenflowcytometriehechtingligatieabdominale chirurgieCD45 positieve cellen

Gerelateerde artikelen