Hier presenteren we een methode om een grote hoeveelheid bloed van varkens af te nemen met behulp van percutane intracardiale canulatie aangesloten op een vacuümpomp, als een terminale procedure.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bloedafname van grote hoeveelheden van varkens voor in-vitrotoepassingen : gebruik van intracardiale canulatie en een vacuümpomp als terminale procedure
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Routinematige bloedafname is vereist in veel fundamentele en toegepaste onderzoeken. Meerdere methoden voor het afnemen van varkensbloed zijn goed beschreven. Deze omvatten het gebruik van de auriculaire aders voor het verzamelen van kleine bloedvolumes, en de halsaders of craniale vena cava voor het verzamelen van grotere bloedvolumes. Sommige experimenten vereisen grote hoeveelheden bloed van één individueel dier tegelijk voor analyse of gebruik in primaire celculturen, wat het beste kan worden bereikt door verbloeding. Bloed dat wordt verzameld voor primaire celcultuur moet vers en zorgvuldig worden verwerkt om de cellulaire integriteit te behouden. We beschrijven een methode voor het aseptisch oogsten van bloed van varkens onder een chirurgisch vlak van anesthesie, met behulp van een intravasculaire katheter met grote diameter die percutaan in het hart wordt ingebracht en een vacuümpomp, die efficiënt is, een grote opbrengst biedt en cellyse minimaliseert. Deze techniek wordt eenmaal uitgevoerd op een dier, op een chirurgisch vlak van anesthesie, als een terminale procedure, met een minimaal risico op pijn of angst.
Inleiding
Varkens zijn gebruikt in onderzoek in onderzoeken variërend van cardiovasculaire onderzoeken tot wondgenezing en toxicologie, maar ook op landbouw gebaseerd onderzoek, immunologie en ziektestudies1. Bloed dat tijdens onderzoek wordt verzameld, kan worden gebruikt om ziekten, farmacologie, genetica, onderzoek naar het immuunsysteem en ontdekking van biomarkers te bestuderen. Celcultuur is een van de meest elementaire procedures die in onderzoek worden uitgevoerd en stelt onderzoekers in staat om celgedrag en -functie te bestuderen, evenals ziektemodellen en vaccinontwikkeling2. De teelt van ziekteverwekkende ziekteverwekkers, zoals het Afrikaanse varkenspestvirus, gebeurt vaak in een vooraf bepaald kweekmedium onder strikte aseptische laboratoriumomstandigheden. Ziekteverspreiding kan plaatsvinden door invasie, verspreiding of gehechtheid, waarvoor gezonde, stabiele cellen nodig zijn3. Bestudeerde pathogenen kunnen een specifiek celtropisme hebben waarin ze kunnen worden vermeerderd, en het hebben van een grote hoeveelheid bloed levert grotere hoeveelheden cellen op om te gebruiken.
Om een hoge opbrengst aan cellen van een individueel dier te bereiken, moet voor cellulaire differentiatie voorzichtig een grote hoeveelheid bloed worden verzameld om de celintegriteit te behouden voorafgaand aan celscheiding. Bij varkens kan het totale bloedvolume worden berekend op 65 ml/kg 4,5. Onze ervaring is dat bij het gebruik van grote volumeafname ongeveer de helft van het totale bloedvolume van een dier kan worden teruggewonnen. Daarom is bij grote volwassen varkens, met een gewicht tot 600 pond (273 kg), een opbrengst van 6-8 L mogelijk. Bij varkens kunnen grote hoeveelheden bloed percutaan worden verzameld uit de craniale vena cava, de uitwendige halsader, de vena saphena via canulatie of het hart 4,5,6. Intracardiale bloedafname met een canule met grote diameter maakt het echter mogelijk om het grootste bloedvolume efficiënt te verzamelen met een minimaal risico op cellyse. Als terminale ingreep moet dit worden uitgevoerd onder een chirurgisch vlak van anesthesie5. Dit artikel beschrijft een methode om een vacuümpomp te gebruiken om meerdere liters bloed van varkens af te nemen met behulp van een percutane benadering van het hart met een IV-katheter met grote diameter die is aangesloten op een vacuümpomp 7,8.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie is goedgekeurd door de Midwest Veterinary Services Inc. Animal Care and Use Committee. Aangezien de door de IACUC goedgekeurde, primaire methode van euthanasie tijdens deze procedure verbloeding is, wordt verwacht dat sommige varkens een hartstilstand zullen krijgen als gevolg van bloedverlies. Wanneer dit gebeurt, wordt een secundaire euthanasiemethode, zoals bilaterale thoracotomie, uitgevoerd. Nadat het vereiste bloedvolume is afgenomen en er een voelbare hartslag is, wordt een spuit met euthanasie-oplossing aan het stilet bevestigd en intracardiaal toegediend als de primaire euthanasiemethode, gevolgd door een secundaire fysieke methode. Varkens worden onderhouden in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van landbouwdieren in onderzoek en onderwijs, de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de Wet op het welzijn van dieren, voor zover van toepassing.
1. Voorbereiding van materialen en dieren (materiaaltabel en figuur 1A-C)
- Monteer de slang op roestvrijstalen rietjes en bevestig het slanguiteinde aan de noppenbuis.
- Bevestig de slang aan de rollerfles met behulp van een rubberen stop met twee ongelijke metalen rietjes en een glazen fles.
OPMERKING: Het glas verhindert het instorten van de container door de vacuümpomp, maar elk materiaal dat niet onder druk instort, kan worden gebruikt. - Druppel aseptisch 10 ml natriumheparine (1.000 USP/ml) door de zuigslang en de katheterstilet om stolling te voorkomen. Voeg aseptisch 50 ml natriumheparine (1.000 USP/ml) toe aan elke rollerfles om een eindconcentratie van 50 IE/ml in elke liter bloed te bereiken en stolling van het bloed tijdens het afnemen te voorkomen. Zorg ervoor dat de vacuümpomp is ingesteld op niet meer dan 7 pond trekkracht om schade aan de cellen te voorkomen.
2. Anesthesie en positionering van dieren
- Weeg het dier niet meer dan 24 uur voorafgaand aan de ingreep om de vereiste dosis van de anesthesiecombinatiemedicatie te berekenen.
- Injecteer Telazol (3,0-5,0 mg/kg), ketamine (8-12 mg/kg) en xylazine (4,0-6,0 mg/kg) intramusculair in de nek of andere dikke spierbuikspieren (bijv. epaxiale spieren), met behulp van een 30 inch verlengingsset en een naald van 18 G x 1,5 inch om diepe anesthesie te induceren.
OPMERKING: Bij grote varkens is het maximaal aanbevolen IM-injectievolume 10 ml, dus het kan nodig zijn om na elke 10 ml toediening van locatie te veranderen9. Hoewel we voor deze cocktail hebben gekozen, kan deze procedure worden uitgevoerd onder elk door de IACUC goedgekeurd anesthesieprotocol dat een chirurgisch anesthesievlak produceert. - Zodra is bevestigd dat het dier zich in een chirurgisch vlak van anesthesie bevindt (~5-8 min), geen ooglidreflex, losse kaaktonus en geen reactie op pijnprikkels vertoont, plaatst u het varken op een heftafel, vloer of ander plat oppervlak, in rechter zijdelingse lighouding.
- Knip het haar op de thorax boven het hart, indien nodig, in de buurt van de vierde en vijfde intercostale ruimte, net caudaal tot aan de punt van de elleboog.
- Gebruik indien beschikbaar een echografie (Figuur 2A) om de linker hartkamer te identificeren. Indien niet beschikbaar, bevindt de linkerventrikel zich het dichtst bij de vierde of vijfde intercostale ruimte mediaal bij het punt van maximale impuls8.
- Schrob het gebied aseptisch met gaassponzen van 4 inch x 4 inch gedrenkt in 2% chloorhexidinescrub en gaassponzen van 4 inch x 4 inch gedrenkt in 70% isopropylalcohol. Bereid de huid voor door op een cirkelvormige manier te schrobben, beginnend bij het injectiepunt en naar buiten draaiend, minimaal 3x, afwisselend tussen de twee ontsmettingsmiddelen.
3. Intracardiale bloedafname
- Controleer of het dier in een chirurgisch vlak van anesthesie is gebleven door de ooglidreflex, de kaaktonus en de pedaalreflex te controleren.
OPMERKING: Controleer de anesthesiediepte, evenals de hart- en ademhalingsfrequentie, tijdens de procedure om er zeker van te zijn dat het dier in een chirurgisch vlak van anesthesie blijft. - Verwijder de stilet uit de infuuskatheter. Plaats het stilet over de linkerventrikel en schuif deze loodrecht op de huid om de stilet in de linkerventrikel in te brengen (Figuur 2B). Wanneer het bloed uit de stilet begint te pulseren, bevestigt u deze aan de aansluiting van de bellenslang die aan de rolfles is bevestigd en zet u vervolgens de vacuümpomp aan (Figuur 1A en Figuur 2C).
- Controleer of het bloed in een gestage stroom stroomt. Terwijl het bloed in de rollerfles wordt getrokken, draait u de fles voorzichtig rond om het bloed met het antistollingsmiddel te kunnen mengen om stolselvorming te voorkomen.
- Zodra 1 L bloed is verzameld, gebruikt u hemostaten om de bellenslang in de buurt van de rollerfles te klemmen. Koppel de rubberen stop los en breng deze aan op de volgende rollerfles. Verwijder de hemostaat en laat het bloed vrij stromen terwijl u de rollerfles voorzichtig ronddraait.
- Ga door met dit proces totdat het benodigde bloed is afgenomen. Als u klaar bent, klemt u de slang vast om overmatig bloedmorsen te voorkomen en zet u de pomp uit.
- Verwijder de slangconnector van de katheterstilet en bevestig de natriumpentobarbitalspuit aan de stilet. Trek de spuit terug om er zeker van te zijn dat er een flits bloed aanwezig is en injecteer vervolgens de euthanasie-oplossing. Bevestig de dood door de afwezigheid van hartslag, ademhaling, spierspanning en reflexen. Zodra de dood is bevestigd, verwijdert u de naald uit het hart en plaatst u deze in een naaldencontainer.
- Gooi noppenslangen weg in een container voor biologisch afval. Verwijder het grove bloed van de resterende roestvrijstalen voorwerpen (bijv. roestvrijstalen rietjes, slangeinden) met behulp van een buisborstel en autoclaaf vervolgens voor toekomstig gebruik.
- Plaats de gereinigde rubberen stoppen, rietjes, slangeindconnectoren en hemostaten in een nieuw autoclaafzakje en steriliseer ze voor het volgende gebruik.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voorafgaand aan de bloedafname werden zeugen vooraf gescreend op Mycoplasma hyopneumoniae, varkensadenovirus, varkensparvovirus, varkenscoronavirussen (overdraagbare gastro-enteritis, varkensepidemische diarree), hemoagglutinerende encefalomyelitis bij varkens, reproductief en respiratoir syndroom bij varkens, influenza groep A, circovirus 1 en 2 en Seneca-virus A. We hebben deze procedure meerdere keren herhaald bij vrouwelijke Yorkshire-kruiszeugen met een gewicht van 300-600 ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De procedure beschrijft hier een katheter-stijl-naar-vacuümpomp voor het verzamelen van een eenmalige grote hoeveelheid bloed uit het hart van zeugen. Vanwege de kans op pijn en angst mag deze procedure alleen worden uitgevoerd bij dieren die zich in een chirurgisch vlak van anesthesie bevinden. Door de immobiliteit van de anesthesie kan deze procedure door beginners worden geleerd en snel onder de knie worden gekregen. Meerdere aders kunnen worden gebruikt om bloed van dieren af te neme...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen in het bijzonder Plum Island Animal Disease Center Animal Resource Branch, zowel Animal Health Techs als Animal Care bedanken voor uitstekende technische hulp. Financiering voor het project bij de contractonderzoeksorganisatie werd verstrekt door de USDA, ARS, Animal Resources Unit bij NBAF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1/8 HP Lab Model Diafragmapomp – 115 vac, 60 max psi | Base Supply Center | 80058845 | |
| 10 G x 6 inch catheter-over-needle | Covetrus North American Veterinary Supplies | 024616 | |
| 50 mL spuit, luer lock | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 echografiegel blauw | Midwest Veterinary Supply | 001.02109.2 | |
| Argyl buis, niet-geleidend (¼") | Fisher Scientific | NC2282605 (Vendor catalog # 8888280412) | |
| Chlorhexidine Q Scrub 2% | Midwest Veterinary Supply | 562.30804.3 | |
| Corning wegwerprollerflessen. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning PYREX smalhals zware glazen Erlenmeyerkolf of soortgelijk vacuüm creërend | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Eisco nylon testbuispenseel | Fisher Scientific | S13962 | |
| Fisherbrand rubber stoppen met twee gaten | Fisher Scientific | Afhankelijk van de grootte | |
| Ketamine (10 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 275.22100.3 | |
| MLL naar 6 mm slangeinde (roestvrij staal) | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL naar 8 mm slangeinde (roestvrij staal) | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet gaasje 4 x 4 4 lagen | Midwest Veterinary Supply | 000.30156.2 | |
| MVet isopropylalcohol 70% | Midwest Veterinary Supply | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly hemostatische pincet recht 5,5” | Midwest Veterinary Supply | 000.36800.2 | |
| Natriumheparine (1000 U/mL) | Midwest Veterinary Supply | 191.46701.3 | |
| Natrium pentobarbital (390 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 749.20000.3 | |
| Roestvrijstalen rietjes | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 275.40000.3 | |
| Xylazine (100 mg/mL) | Midwest Veterinary Supply | 310.01150.3 |
Referenties
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
