Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Niet-invasieve endotracheale toediening van lipopolysaccharide om acute longschade bij knaagdieren te induceren

771 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68700

⸱

5 december 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pharmacology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), Ghaziabad-201002, India

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie is aangetoond dat een niet-invasieve endotracheale installatietechniek ALI bij ratten ontwikkelt met behulp van een basislaryngoscoop om een precieze LPS-afgifte aan de longen te garanderen. De LPS wordt toegediend via een endotracheale buis met behulp van een laryngoscoop. De omvang van het longletsel wordt op meerdere tijdstippen beoordeeld.

Samenvatting

Acuut longletsel (ALI) is een levensbedreigende ontstekingsaandoening die wordt gekenmerkt door arteriële hypoxemie, alveolair oedeem, een verzwakte integriteit van de epiteel-endotheliale capillaire barrière, gevolgd door infiltratie van ontstekingscellen in het longweefsel, vaak met de ernstiger vorm, het Acute Ademhalingsnoodsyndroom (ARDS), dat vaak uitmondt in acuut ademhalingsfalen. De ALI-muismodellen, voornamelijk geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS), zijn een belangrijk instrument in onderzoek gericht op het begrijpen van de mechanismen van longontsteking en de therapieën ervan. Modellen voor directe en indirecte longschade aan knaagdieren bieden duidelijke voordelen en beperkingen, met name wat betreft overlevingskansen, duur van ontstekingsresolutiefase, risico's op chirurgisch trauma en infectie. In de huidige studie is een niet-invasieve endotracheale installatietechniek gebruikt om een direct ALI-model bij ratten te ontwikkelen. Deze techniek zorgt voor gerichte toediening van LPS of testmateriaal in de longen via de endotracheale route met behulp van een basale laryngoscoop. De procedure begint met het verdoven van de rat en het plaatsen van deze in een semi-liggende houding. Vervolgens wordt de LPS-oplossing toegediend nabij de luchtpijpopening met een spuit die is bevestigd aan een endotracheale buis van de ratten. Bij het beëindigen van het experiment worden long- of lavagemonsters verzameld om ontstekingsparameters en longarchitectuur te beoordelen. Deze techniek presteert beter dan andere modellen op het gebied van snelheid, specificiteit en betrouwbaarheid, en biedt specifieke targeting met minimale weefselschade, een laag sterfterisico en verwaarloosbare ontsteking buiten de locatie. Deze methode is vooral waardevol in preklinische studies van ALI, ARDS en aanverwante aandoeningen zoals anafylaxie of hartstilstand. In vergelijking daarmee integreert deze methode meer met geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals intravitale microscopie om de verspreiding van geneesmiddelen en de ziekteprogressie in realtime te monitoren.

Inleiding

Acuut longletsel (ALI) is een levensbedreigende ontstekingsaandoening die wordt gekenmerkt door arteriële hypoxemie, pulmonale oedeem, een verzwakte integriteit van de endotheel-epitheliale barrière en massale infiltratie van immuuncellen in de longen1. De pathofysiologie van ALI is complex en omvat het samenspel en de verstoring van meerdere overlappende en interactieve routes, zoals stolling, weefselbeschadiging en zowel pulmonale als systemische ontsteking. Snelle onderdrukking van deze ontstekingsreactie is cruciaal voor het herstellen van weefselhomeostase. Als deze snel progressieve aandoening niet wordt behandeld, escaleert deze snel ontwikkelende aandoening vaak tot het Acute Aspiratoir Distress Syndroom (ARDS), een ernstigere aandoening die wordt gekenmerkt door refractaire hypoxemie. De pathogenese van ALI is in verband gebracht met longletsel en schade of dood van alveolaire epitheelcellen en microvasculaire endotheelcellen 1,2,3,4.

De etiologie die verantwoordelijk is voor ALI/ARDS omvat een breed scala aan infectieuze en niet-infectieuze agentia, die voortkomen uit zowel directe als indirecte bronnen van longletsel5. Directe oorzaken zijn onder andere longontsteking6, bijna-verdrinking7, aspiratie van maaginhoud8, inademing van toxines zoals chloorgas9, bacteriële infectie10 en virale infectie zoals SARS-CoV-2 11,12,13,14. Indirecte oorzaken ontstaan door systemische processen die secundair invloed uitoefenen op de longen, waaronder sepsis15, trauma16, pancreatitis17, overdosis drugs en bloedtransfusies18.

Het primaire doel van deze methode is het opzetten van een reproduceerbaar en niet-invasief model van ALI bij knaagdieren via endotracheale toediening van endotoxine. De reden voor het ontwikkelen van deze techniek komt voort uit beperkingen van conventionele toedieningsmethoden. De techniek werd gedemonstreerd met als doel het bereiken van nauwkeurige directe toediening aan longalveoli, het minimaliseren van systemische blootstelling en het een veelbelovende aanpak maken voor toekomstige gerichte pulmonale therapieën. Intranasale installatie brengt verschillende uitdagingen met zich mee, waarvan sommige de studieresultaten aanzienlijk kunnen beïnvloeden, zoals slechte targeting naar diepe longgebieden en ademhalingsvariabiliteit bij dieren19. Andere factoren, zoals een beperkt dosisvolume en mogelijke irritatie van de neus, zijn minder kritisch maar kunnen nog steeds de consistentie beïnvloeden. Ter vergelijking: endotracheale toediening zorgt voor een nauwkeurigere en directere toediening aan de onderste luchtwegen, waardoor betere longtargeting en doseringsuniformiteit met minimale variabiliteit tussen dieren worden gegarandeerd, waardoor deze route effectiever en betrouwbaarder wordt voor pulmonale blootstelling20. De inhalatieroute is klinisch relevant vanwege zijn niet-invasieve aard, maar wordt ook geassocieerd met bepaalde beperkingen in preklinisch onderzoek, zoals verlies van medicijnen in de bovenste luchtwegen en verminderde effectiviteit bij het richten op distale longgebieden. Deze beperkingen worden duidelijker bij ernstige modellen, waaronder double-hit injury of genetisch gemodificeerde modellen met knock-in of knock-out muizen. Daarentegen zorgt endotracheale toediening voor meer consistentie bij directe geneesmiddeltoediening naar de onderste luchtwegen, waardoor verlies wordt geminimaliseerd en effectieve targeting mogelijk wordt gemaakt in complexe preklinische modellenook 21. Een andere relevante toedieningsmethode die wordt gebruikt in preklinisch onderzoek is invasieve intratracheale toediening. Hoewel het effectief is, wordt het geassocieerd met het risico op chirurgische stress, infectie, variatie in de uitlezing en de vereiste temperatuuronderhoud22. Daarentegen biedt de endotracheale methode een betrouwbaar niet-invasief alternatief, waardoor het ideaal is voor studies met herhaalde beoordelingen over langere observatieperioden.

Deze methode kan worden toegepast in diermodellen buiten ALI, waaronder astma, longfibrose, COPD, longontsteking en infectieuze longziekten. Het is ook relevant in preklinische onderzoeksgebieden zoals anafylaxie, hartstilstand en hartritmestoornissen. Opmerkelijk is dat de endotracheale methode al is gevestigd in de klinische praktijk voor het toedienen van bepaalde geneesmiddelen, afhankelijk van de urgentie en het klinische scenario 23,24,25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle institutionele en CPCSEA-richtlijnen werden gevolgd voor de verzorging en het gebruik van dieren. De dieren werden na de procedure continu gemonitord om hun welzijn te waarborgen en te voldoen aan de ethische richtlijnen van het CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, Jammu, onder goedkeuringsnummer van het Institutional Animal Ethics Committee (IAEC): 468/87/8/2025. Dit protocol beschrijft de niet-invasieve endotracheale instillatie van lipopolysaccharide (LPS) met behulp van de directe visuele toedieningsmethode, zoals eerder aangetoond, met enkele methodologische verbeteringen die zijn geïntroduceerd in de huidige studie 26,27,28. De techniek is geoptimaliseerd om ALI op een gecontroleerde en consistente manier op te wekken, wat zorgt voor robuuste experimentele resultaten en tegelijkertijd hoge eisen van dierenzorg handhaaft. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Anesthesie en LPS-voorbereiding

  1. Meting van dierlijk gewicht en LPS-dosisberekening
    1. Weeg elk dier met een gekalibreerde balans om de precieze LPS-dosis te berekenen. Selecteer Wistar-ratten die tussen de 140-160 g wegen voor het onderzoek.
    2. Bereid de LPS-oplossing voor door de gelyofilieerde Escherichia coli LPS te verdunnen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de gewenste concentratie te bereiken. Er wordt een vers bereide LPS-oplossing (5 μg/g lichaamsgewicht) 29,30 gebruikt.
  2. Inductie van anesthesie en kritische timing
    1. Verdoof de dieren via een intraperitoneale injectie van een vers bereide ketamine-xylazinecocktail (ketamine: 75 mg/kg en xylazine: 10 mg/kg) met 1 ml spuit. Na de injectie laat je ongeveer 2-5 minuten de verdoving werken, zonder de dieren te storen.
    2. Bevestig voldoende verdoving door te zorgen voor het ontbreken van spontane beweging en een negatieve teenpnijpreflex. LPS wordt toegediend via endotracheale instillatie, 5-8 minuten na de inleiding van de anesthesie. Op de dag van het beëindigen van het experiment voert u procedures uit zoals tracheotomie en thoracotomie 4-7 minuten na de inleiding van de anesthesie.
      OPMERKING: De juiste diepte van de anesthesie is cruciaal voor een succesvolle endotracheale instillatie. Oververdoving kan de kokhalsreflex onderdrukken, terwijl onderverdoving tijdens de procedure stress of beweging kan veroorzaken. Gebruik vers voorbereide LPS om consistentie tussen experimenten te behouden. Houd de dieren nauwlettend in de gaten tijdens en na de procedure om een goed welzijn te waarborgen.

2. Endotracheale installatie van LPS

  1. Beoordeling van de adequate anesthesie: Na het toedienen van de anesthesiecocktail beoordeel je de diepte van de anesthesie door een zachte pootknijpstimulus toe te passen. Na bevestiging van verdoofde toestand, ga je door met het installatieprotocol. Plaats de muis in een halfliggende positie, opgehangen aan snytanden op een stevig ondersteunend platform.
  2. Tracheale visualisatie: Open de mond van het verdoofde dier, pak voorzichtig de tong vast met een tang en plaats voorzichtig de laryngoscoop, waarbij je deze precies uitlijnt voor een optimale visualisatie van de tracheale opening. Zorg ervoor dat het licht goed wordt gericht om het strottenveld te verlichten, zodat er ongehinderd toegang mogelijk wordt.
  3. Tongmanipulatie: Gebruik een gebogen, stompe tang om de tong voorzichtig vast te pakken en voorzichtig omhoog en zijwaarts terug te trekken.
    OPMERKING: Gebruik handvergrootglazen om de helderheid van de larynxanatomie te verbeteren en zorg voor een nauwkeurige uitlijning van het installatieapparaat voor een hogere precisie.
  4. LPS-toediening: Trek 100 μL LPS-oplossing in de spuit en verbind deze aan een 16 G rattenendotracheale buis; Dien de LPS-oplossing toe bij de tracheale opening. Direct na het instilleren sluit je de neusgaten voorzichtig af gedurende 2-4 seconden met een stompe tang om de aspiratie van de LPS-oplossing via de luchtpijp in de longen te bevorderen. Monitor de levering continu met een laryngoscoop met lichtbron om nauwkeurige en volledige toediening te bevestigen.
  5. Postprocedurele monitoring: Na succesvolle LPS-toediening de tong zorgvuldig in zijn normale anatomische oriëntatie herpositioneren. Breng het dier naar de kooi en houd minimaal 1 minuut nauwlettend in de gaten op tekenen van ademhalingsproblemen of verstikking.
  6. Belangrijke overwegingen
    1. Visuele scherpte: Zorg voor optimale uitlijning van de laryngoscoop voor een nauwkeurige LPS-toediening. Gebruik vergrotingsinstrumenten om precisie en efficiëntie te verbeteren.
    2. Pak de tong voorzichtig vast en houd hem tegen de onderkaak of mondrand om hem te stabiliseren.

3. Monsterverzameling

  1. Voer bronchoalveolaire lavage (BAL) uit zoals beschreven in eerdere studies, met kleine aanpassingen 31,32,33. Na de tracheotomie infuus voorzichtig 2 ml koude PBS in de longen en haal het vocht op.
  2. Centrifugeer de verzamelde lavagevloeistof op 5000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gebruik het supernatant voor het detecteren van ontstekingsmarkers. Verzamel de longen voor histopathologisch onderzoek of homogeniseer voor myeloperoxidase (MPO) activiteit. Houd de monsters tijdens het verzamelproces op ijs om de integriteit van het monster te behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het model werd gevalideerd door ontstekingsmarkers te meten, waaronder IL-1β-niveaus, MPO-activiteit, totale eiwitinhoud en histopathologie bij 24 uur en 120 uur na LPS-instillatie. De studie omvatte drie experimentele groepen: een controlegroep (onbehandeld) en twee groepen die werden onderworpen aan LPS-instillatie, waarbij één werd geëuthanaseerd om 24 uur en de andere om 120 uur (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

In vergeli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De endotracheale instillatiemethode biedt een niet-invasieve, reproduceerbare en gerichte aanpak voor pulmonale toediening, waardoor chirurgische ingrepen effectief worden omzeild. Deze methode vermindert aanzienlijk de risico's die gepaard gaan met chirurgisch trauma, zoals weefselschade, en minimaliseert tegelijkertijd de kans op postoperatieve infecties en onbedoelde orgaanschade die kan ontstaan door invasieve ingrepen. Door middelen direct in de longen af te dienen, zorgt de endotra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

De corresponderende auteur, SR, erkent de financiële steun van de Ramalingaswami Fellowship (Ref. Nr. BT/RLF/Herintreding/13/2019), Afdeling Biotechnologie, Regering van India. De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Govind Yadav, Dr. Ramajayan Pandian en het CSIR-IIIM dierenhokpersoneel voor hun steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Prism 8Graphpadhttps://www.graphpad.com/features
Bradford Reagens Himedia, IndiaML106-500 ML     
DL-DithiothreitolHimedia, India RM525-25G
Eosine Loba Chemie, India3660
Ethyleen Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA)Loba Chemie, India6381926
Forceps -
Formaline 10% Sigma Aldrich, USA HT501320
HematoxylineSDFCL74108G05
HEPESHimedia, IndiaMB016
Waterstofperoxide  Avra, India7722841
Ketamine Neon Laboratories Ltd, India- 
LaryngoscopeMedical Sources Co., Ltd., China MS-LA500FV 
Lipopolysaccharide van Escherichia coli O55:B5     Sigma Aldrich, USAL2880     
o-Dianisidine dihydrochloride Sigma Aldrich, USAD3252-5G 
Fosfaat Buffered Saline (PBS) Invitrogen, USA3002
KaliumdiwaterstoffosfaatHimedia, IndiaIN26185530500
Proteïne inhibitor cocktailSigma AldrichP8340
Rat IL-1β ELISA Kit Thermofisher, USABMS630
NatriumchlorideHimedia, IndiaTC046M
NatriumfluorideHimedia, IndiaGRM7502
NatriumorthovanadateSigma Aldrich, USAS6508
NatriumpyrofosfaatMerck, USAMA3M722243
ZwavelzuurSigma Aldrich, USA339741
Triton X-100Thermofisher, USAT8787
Xylazijn Indian Immunologicals Ltd, India-

Referenties

  1. Rayees, S., et al. Macrophage TLR4 and PAR2 signaling: Role in regulating vascular inflammatory injury and repair. Front Immunol. 18 (11), 2091(2020).
  2. Bernard, G. R., et al. The American-European Consensus Conference on ARDS. Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. Am J Respir Crit Care Med. 149 (3), 818-824 (1994).
  3. Banavasi, H., Nguyen, P., Osman, H., Soubani, A. O. Management of ARDS - What works and what does not. Am J Med Sci. 362 (1), 13-23 (2021).
  4. Bellani, G., et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).
  5. Rubenfeld, G. D., et al. Incidence and outcomes of acute lung injury. N Engl J Med. 353 (16), 1685-1693 (2005).
  6. Aliberti, S., Dela Cruz, C. S., Amati, F., Sotgiu, G., Restrepo, M. I. Community-acquired pneumonia. Lancet. 398 (10303), 906-919 (2021).
  7. Gregorakos, L., et al. Near-drowning: clinical course of lung injury in adults. Lung. 187 (2), 93-97 (2009).
  8. Hu, X., Lee, J. S., Pianosi, P. T., Ryu, J. H. Aspiration-related pulmonary syndromes. Chest. 147 (3), 815-823 (2015).
  9. Wang, L., Wu, D., Wang, J. Chlorine gas inhalation manifesting with severe acute respiratory distress syndrome successfully treated by high-volume hemofiltration: A case report. Medicine. 97 (30), e11708(2018).
  10. Sung, P. S., Peng, Y. C., Yang, S. P., Chiu, C. H., Hsieh, S. L. CLEC5A is critical in Pseudomonas aeruginosa-induced NET formation and acute lung injury. JCI Insight. 7 (18), e156613(2022).
  11. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Alblihed, M., Cruz-Martins, N., Batiha, G. E. COVID-19 and risk of acute ischemic stroke and acute lung injury in patients with type II diabetes mellitus: The anti-inflammatory role of metformin. Frontiers Med. 19 (8), 644295(2021).
  12. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Al-Niemi, M. S., Alexiou, A., Batiha, G. E. Calprotectin: The link between acute lung injury and gastrointestinal injury in Covid-19: Ban or boon. Curr Protein Peptide Sci. 23 (5), 310-320 (2022).
  13. Al-Kuraishy, H. M., et al. COVID-19 and phosphodiesterase enzyme type 5 inhibitors. J Micros Ultrastruc. 8 (4), 141-145 (2020).
  14. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Qusty, N., Alexiou, A., Batiha, G. E. Impact of sitagliptin on non-diabetic COVID-19 patients. Current Mol Pharmacol. 15 (4), 683-692 (2022).
  15. Yu, X., et al. Loss of PADI2 and PADI4 ameliorates sepsis-induced acute lung injury by suppressing NLRP3+ macrophages. JCI Insight. 9 (22), e181686(2024).
  16. Calfee, C. S., et al. Acute respiratory distress syndrome network, national heart, lung, and blood institute. Trauma-associated lung injury differs clinically and biologically from acute lung injury due to other clinical disorders. Crit Care Med. 35 (10), 2243-2250 (2007).
  17. Zhou, M. T., Chen, C. S., Chen, B. C., Zhang, Q. Y., Andersson, R. Acute lung injury and ARDS in acute pancreatitis: mechanisms and potential intervention. World J Gastroenterol. 16 (17), 2094-2099 (2010).
  18. Roubinian, N. TACO and TRALI: biology, risk factors, and prevention strategies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1, 585-594 (2018).
  19. Fernandes, C. A., Vanbever, R. Pre-clinical models for pulmonary drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 6 (11), 1231-1245 (2010).
  20. Yu, P., et al. Non-invasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice. J Vis Exp. (193), e65151(2023).
  21. Price, D. N., Muttil, P. Delivery of therapeutics to the lung. Methods Mol Biol. 1809, 415-429 (2018).
  22. Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55 (1), 24-35 (2000).
  23. Hendrix, J. M., Regunath, H. Intubation endotracheal tube medications. [Updated 2025 Jan 19]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  24. DeMasi, S. C., Casey, J. D., Semler, M. W. Evidence-based emergency tracheal intubation. Am J Respir Crit Care Med. 211 (7), 1156-1164 (2025).
  25. Greenberg, M. I. The use of endotracheal medication in cardiac emergencies. Resuscitation. 12 (3), 155-165 (1984).
  26. Rayees, S., et al. PAR2-Mediated cAMP generation suppresses TRPV4-dependent Ca2+ signaling in alveolar macrophages to resolve TLR4-induced inflammation. Cell Rep. 27 (3), 793-805 (2019).
  27. Arfath, Y., et al. TRPV4 facilitates the reprogramming of inflamed macrophages by regulating IL-10 production via CREB. Inflamm Res. 73 (10), 1687-1697 (2024).
  28. Rochford, I., et al. Evidence for reprogramming of monocytes into reparative alveolar macrophages in vivo by targeting PDE4b. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (4), L686-L702 (2021).
  29. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 8 (304), 158-166 (2013).
  30. Hagawane, T. N., Gaikwad, R. V., Kshirsagar, N. A. Dual hit lipopolysaccharide and oleic acid combination induced rat model of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. J Med Res. 143 (5), 624-632 (2016).
  31. Rayees, S., et al. Protease-activated receptor 2 promotes clearance of Pseudomonas aeruginosa infection by inducing cAMP-Rac1 signaling in alveolar macrophages. Front Pharmacol. 20 (13), 874197(2022).
  32. Rayees, S., et al. Therapeutic effects of R8, a semi-synthetic analogue of Vasicine, on a murine model of allergic airway inflammation via STAT6 inhibition. Int Immunopharmacol. 26 (1), 246-256 (2015).
  33. Joshi, J. C., et al. SPHK2-Generated S1P in CD11b+ Macrophages blocks STING to suppress the inflammatory function of alveolar macrophages. Cell Rep. 30 (12), 4096-4109 (2020).
  34. Balzer, C., Cleveland, W. J., Jinka, T. R., Riess, M. L. Video laryngoscopic oral intubation in rats: A simple and effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1032-L1035 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Toediening van lipopolysacharidenendotracheale instillatielongmodel bij knaagdierenniet-invasieve toedieningbronchoalveolaire lavageontstekingsmarkerslonghistopathologiemyeloperoxidase-activiteitgerichte geneesmiddeltoediening
Niet-invasieve endotracheale toediening van lipopolysaccharide om acute longschade bij knaagdieren te induceren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.