Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen

649 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 oktober 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met de belangrijkste stappen om de 3D Flipwell-engineering en -gebruik te begeleiden. We beschrijven en laten zien hoe de co-cultuur insert stacks kunnen worden samengesteld en gebruikt voor het co-kweken van gelaagde lagen darmbacteriën, darmepitheel, en macrofagen om de darmslijmvliesomgeving te modelleren.

Samenvatting

Om de rol van bacterieel secretoom in de polarisatie van immuuncellen en de homeostase van het darmslijmvlies te bestuderen, hebben we een 3-dimensionaal co-cultuurmodel ontwikkeld met behulp van in de handel verkrijgbare inserts in een back-to-back gestapeld formaat. We noemden dit systeem 3D Flipwells en hebben met succes bacteriën, colonepitheel en immuuncellen in gelaagde lagen gekweekt om de micro-omgeving van het darmslijmvlies samen te vatten. Dit co-cultuursysteem maakt het mogelijk om colon-epitheelcellen aan de ene kant van het membraan en ongedifferentieerde niet-aanhangende monocyten aan de andere kant te zaaien, waardoor de synchrone progressie van colon-epitheliale polarisatie, slijmvorming en monocyt-macrofaagdifferentiatie en polarisatie binnen een enkele co-cultuur mogelijk is zonder de noodzaak om vooraf gedifferentieerde macrofagen los te maken en opnieuw te plateren. Dit systeem is eenvoudig te bouwen en vereist slechts een paar direct beschikbare materialen en gereedschappen. We hebben het nut ervan getest door de reacties van co-cultuurcomponenten op sepiapterin (SEP) te analyseren, de endogene voorloper van BH4 (tetrahydrobiopterine) - een cofactor van stikstofmonoxidesynthase (NOS). We hebben aangetoond dat SEP-behandeling van 3D Flipwell biofilmvorming door darmbacteriën, slijmproductie door colonepitheel en pro-immunogene polarisatie van macrofagen induceerde. Dit gaf aan dat SEP de activering van een mucosale verdedigingsmechanisme activeerde door middel van overspraak tussen verschillende cellulaire componenten. Verdere experimenten zijn nodig om de rol van mucosale communicatie te onderzoeken die leidt tot herprogrammering van immuuncellen en om het nut van dit co-cultuursysteem te evalueren om te screenen op nieuwe immunomodulerende therapieën.

Inleiding

Overspraak tussen immuuncellen en darmmicrobioom heeft een grote invloed op de werkzaamheid van verschillende ziektebehandelingen. Een dergelijke overspraak wordt duidelijk gemodificeerd door externe stimuli, inclusief maar niet beperkt tot metabole afwijkingen van de gastheer, veranderingen in het dieet, manifestatie van de ziekte en farmacologische behandeling. Deze veranderingen kunnen leiden tot een onbalans in de samenstelling van de microflora, een aandoening die dysbiose 1,2,3 wordt genoemd.

Om de interacties tussen microben en immuuncellen van de gastheer in de darm beter te begrijpen, zijn door verschillende groepen uitgebreide co-cultuursystemen ontwikkeld in een poging de omgeving van het darmslijmvlies samen te vatten. Van het gut-on-chip-systeem ontwikkeld door Kim et al.4 tot een complexere assemblage met behulp van een gespecialiseerd absorberend substraat5, deze co-cultuursystemen zijn niet eenvoudig te bouwen en zijn niet in staat om het volledige spectrum van uitgescheiden componenten vast te houden vanwege hun absorptie door het co-cultuursubstraat. Noel et al. ontwikkelden dus een alternatief co-cultuursysteem om het darmslijmvlies te modelleren dat relatief gemakkelijker te fabriceren is6. Dit nieuwe systeem maakt gebruik van een enkel kweekinzetstuk met colonepitheelcellen die aan de ene kant van het membraan zijn gezaaid en aan de andere kant voorgedifferentieerde macrofagen6. Het zaaien van voorgedifferentieerde macrofagen vereist echter hun predifferentiatie ergens anders en hun dissociatie en herplatatie in een co-cultuur, wat mogelijk hun cellulaire integriteit en levensvatbaarheid kan beïnvloeden.

Door verbeteringen aan deze eerdere systemen aan te brengen, ontwikkelden we een nieuw driedimensionaal (3D) meerlagig co-cultuursysteem dat we het 3D Flipwell-systeem 7,8 noemden. Dit systeem bestaat uit celkweekinserts die rug aan rug zijn gestapeld, waardoor de synchrone progressie van colonepitheliale polarisatie, slijmvorming, macrofaagdifferentiatie en polarisatie binnen een enkele co-cultuur mogelijk is. Dit systeem stelt ons in staat om veranderingen in de omgeving van het darmslijmvlies en interacties tussen darmbacteriën, epitheelcellen en immuuncellen te onderzoeken. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt om de effecten van externe stimuli, waaronder bacteriële metabolieten, toxines, voedingsvoedingsstoffen en geneesmiddelen, op het darmslijmvlies en de rest van het lichaam te onderzoeken 7,8.

Door gebruik te maken van het nieuwe co-cultuur insertiesysteem, onderzochten we de reacties van verschillende cellulaire componenten op sepiapterine (SEP), de endogene voorloper van BH4 (tetrahydrobiopterine) - een cofactor van stikstofmonoxidesynthase (NOS). We hebben eerder aangetoond dat SEP pro-immunogene activiteiten uitoefent op de micro-omgeving van de borsttumor door tumor-geassocieerde macrofagen te herprogrammeren tot een pro-immunogeen type 9,10,11,12. We hebben aangetoond dat SEP synchrone gebeurtenissen van biofilmvorming door darmbacteriën, slijmproductie door colonepitheel en pro-immunogene polarisatie van macrofagen in co-culturen induceert, wat wijst op activering van een mucosale afweermechanisme7. Deze bevindingen ondersteunen het nut van dit nieuwe co-cultuursysteem bij het modelleren van de micro-omgeving van het darmslijmvlies7.

Het algemene doel van dit protocol is om stapsgewijze instructies te geven voor de constructie van deze nieuwe co-cultuur van darmbacteriën, darmepitheel, slijm en immuuncellen om de darmslijmvliesomgeving te modelleren. We laten ook zien hoe we de overspraak van co-gekweekte cellen onder invloed van een externe stimulus, bijvoorbeeld een SEP-behandeling, in beeld kunnen brengen. Verder onderzoek met behulp van dit co-cultuursysteem is nodig om uitgescheiden cellulaire componenten te bepalen die de interacties tussen verschillende cellen in co-cultuur vergemakkelijken, en om het nut van dit co-cultuurmodel voor high-throughput screening van nieuwe therapieën te testen. Om de fysiologische toestand van de darmslijmvliesomgeving te bereiken, zou dit co-cultuursysteem bovendien verdere aanpassingen vereisen. Om bijvoorbeeld aërobe zoogdiercellen samen te kweken met anaërobe bacteriën, moeten deze bacteriën afzonderlijk worden gekweekt in anaërobe media die zuurstof verwijderen of bedekt met vloeibare paraffine die het binnendringen van zuurstof voorkomt, zoals elders gemeld. Een dergelijk geavanceerd nut en toepassing van dit co-cultuursysteem zou verder onderzoek rechtvaardigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. 3D Flipwell-techniek

  1. Al het werk moet worden gedaan in een celkweekkast. Plaats alle benodigdheden in de kast.
  2. Open het deksel van de petrischaal en zet apart. Open het scalpelmes uit de beschermhoes en plaats het op de rand van de bodem van de petrischaal. Zorg voor steriliteit.
    LET OP: Voorzichtig omgaan met het scalpelmes is vereist. Gebruik indien nodig snijbestendige, met vezels versterkte handschoenen om de handen te beschermen.
  3. Open de steriele beschermende verpakking van de 12-well commercial insert. Zorg voor steriliteit. Neem een steriel pincet. Pak het inzetstuk voorzichtig vast en haal het uit de verpakking.
  4. Houd het inzetstuk zo vast dat de onderkant naar boven wijst. Neem met de andere hand het steriele scalpelmes en breng het naar het inzetstuk.
  5. Doorboor met een C-vormige beweging het membraan aan de rand en schuif het scalpelmes voorzichtig rond de bodem van het insteekstuk, dicht bij de plastic wand.
  6. Knip het PET-membraan uit en gebruik het tweede pincet om het membraan te verwijderen. Gooi het membraan weg.
  7. Gebruik het scalpelmes om eventuele witte vlieskrullen te schrapen om de rand en rand van het inzetstuk schoon te maken. Plaats het nieuw voorbereide inzetstuk voorzichtig terug in de originele steriele verpakking.
  8. Pak vervolgens de siliconen kleefbuis en snijd de punt van het mondstuk af met het scalpelmes om een opening te maken. Deze opening moet 3 mm breed zijn.
  9. Test de grootte van de kraal door de lijm uit te knijpen op de papieren handdoek. De kraal moet 2-3 mm dik zijn. Pas het mondstuk aan als de hiel kleiner is dan 2 mm en moeilijk uit de buis te persen is.
    1. Een andere manier om de lijmparel aan te brengen en te verspreiden, is door een pipetpunt van 200 μL te gebruiken waarvan de punt is afgesneden. Knip 3-4 mm af met een schaar en gebruik een spatel om de lijm rond de rand van het inzetstuk te verspreiden.
  10. Trek de beschermkap van het tweede inzetstuk en zet opzij. Pak de steriele pincet op, pak het tweede inzetstuk uit de verpakking met het membraan naar boven.
  11. Verspreid voorzichtig een dunne druppel siliconen van 2-3 mm helemaal rond de onderkant van het inzetstuk en zorg ervoor dat u het membraan niet aanraakt.
  12. Pak de tweede set steriele pincetten op en til het eerste inzetstuk (zonder membraan) voorzichtig uit de beschermende verpakking.
  13. Breng de twee inzetstukken van onder naar beneden naar elkaar samen, zodat de onderste velgen op één lijn liggen. Overtollige lijm kan uit de voeg worden geperst. Laat de lijm drogen. Het kan worden afgesneden nadat de lijm volledig is opgedroogd (24-72 uur). Dit is optioneel.
    OPMERKING: De uiteindelijke Flipwell Co-culture Insert (FCI)-stapel mag slechts één PET-membraan in het midden hebben. Het is het beste om de L-vormige handgrepen van de in de handel verkrijgbare inzetstukken zo te plaatsen dat ze 180° van elkaar verwijderd zijn (op 3 en 6 uur). Volg de aanbevelingen van de fabrikant van siliconenlijm voor de droogtijd, die afhankelijk van het merk 24-72 uur kan zijn. Voor de meeste lijmen op siliconenbasis wordt de voorkeur gegeven aan een droogtijd van 72 uur. De lijm kan ook slechts 24 uur worden gedroogd met UV-sterilisatie.
  14. Wanneer de FCI-stapel is gelijmd, plaatst u deze in de originele steriele verpakking om te drogen of in een diepe petrischaal. Gebruik het deksel van de gespecificeerde petrischaaltjes om de stapel af te dekken.
  15. Om de stapelassemblages te steriliseren, opent u het deksel van de petrischaal. Gebruik een steriele pincet om de FCI-stapel op de rand van de gespecificeerde diepe petrischaalrand te overhandigen.
  16. Sluit de glazen vleugel van de BSC-kast. Zet het UV-licht aan. Stap voor de veiligheid uit de kast en steriliseer elke kant van het membraan 30 min-1 uur. Schakel het UV-licht uit wanneer elke sterilisatiecyclus is voltooid.
  17. Plaats het deksel van het petrischaaltje (zoals aangegeven) over het petrischaaltje met de insteekstapels en zet apart.

2. Testen op lekkage voorafgaand aan de collageencoating

  1. Verwijder het deksel van het petrischaaltje. Voeg 500 μL steriel PBS of steriel gedeïoniseerd water toe.
    OPMERKING: Voor visuele hulpmiddelen werd DMEM gebruikt om te helpen bij het visualiseren van de integriteit van de FCI-stacks.
  2. Dek de petrischaal af. Laat het een nacht rusten. Controleer 's ochtends de FCI-integriteit. Gooi de FCI's weg als er lekkage wordt gedetecteerd. Maak indien nodig nieuwe wisselplaatstapels.
  3. Zuig de vloeistof (PBS of water) op die voor het testen is gebruikt. Dek de petrischaal af met een deksel.
  4. Laat de stapels drogen (1-2 uur) in de BSC. Bewaar de FCI's in een BSC tot ze klaar zijn voor gebruik of ga verder met het coaten met collageen voor het zaaien van de aanhangende cellen.

3. Collageencoating van het Flipwell-membraan

  1. Bereid een werkvoorraad van de collageenoplossing voor door de collageenoplossing die bij 3 mg/ml wordt geleverd, te verdunnen tot een verdunning van 1:30 bij 100 μg/ml. Voeg 33 μL commercieel gemaakte collageenoplossing toe aan 1 ml steriel gedeïoniseerd water in een microcentrifugebuisje. Mengen door vortexing.
    OPMERKING: Voor een groter volume schaalt u op en gebruikt u een conische buis van 15 ml, afhankelijk van het aantal wisselplaatstapels dat aan beide zijden van het membraan moet worden gecoat. Maak dit elke keer vers. Gebruik het werkmateriaal niet opnieuw.
  2. Open het deksel van het petrischaaltje. Laat de Flipwell aan de rand van de petrischaal hangen. Voeg voorzichtig 200 μL collageenoplossing toe aan één kant van de stapel inlegvellen.
  3. Laat het 1 uur staan. Zuig de collageenoplossing op. Voeg 200 μL steriel PBS toe. Aspireren PBS.
  4. Dek de petrischaal af met deksel en laat het membraan 60 minuten drogen in de kast. Als het membraan droog is, pak je de steriele tang/pincet en draai je de Flipwell naar de andere kant en laat je hem aan de rand van de petrischaal hangen.
  5. Voeg 200 μL collageenoplossing toe aan de ongecoate (nu bovenste) kant van het membraan. Laat het 1 uur staan.
  6. Zuig de collageenoplossing op. Voeg 200 μL steriel PBS toe. Aspireren PBS. Dek de petrischaal af met een deksel en laat het membraan 60 minuten drogen in de kast. Laat de FCI-stapel een nacht drogen of zaai dezelfde dag.
    OPMERKING: De integriteit van de collageencoating is niet getest onder lange opslagomstandigheden. Zodra de Flipwells zijn voorgecoat, moeten ze binnen 24 uur worden gebruikt.

4. Bacteriële inzetconstructie voor bacterieculturen

  1. Plaats twee sets steriele pincetten en de 24-gaats inserts in de BSC. Open de inleggers voorzichtig en laat ze in de steriele verpakking.
  2. Til het inzetstuk met een steriel pincet uit de steriele verpakking. Breek met de tweede set pincetten/pincet de kleine plastic voetjes aan de onderkant van het inzetstuk af.
  3. Test het inzetstuk met 24 putjes door het in een van de steriele FCI-stapels of originele inzetstukken met 12 putjes te plaatsen.
  4. Als het inzetstuk niet in de put glijdt, gebruik dan opnieuw een pincet om meer plastic materiaal van de rand af te breken waar de rand en de voeten samenkomen.
  5. Test de pasvorm opnieuw totdat het inzetstuk met 24 putjes in het inzetstuk met 12 putjes kan schuiven. Plaats het inzetstuk in de steriele verpakking of in een steriel petrischaaltje.
  6. UV steriliseren of ethanol van het inzetstuk (optioneel). Dek de verpakking weer af of dek af met het deksel van de petrischaal tot gebruik.

5. Naald constructie

  1. Breng het gereedschap en alle benodigdheden naar een BSC. Houd een naald voorzichtig vast met de neustang.
  2. Meet de locatie van elke bocht op de naald met behulp van een liniaal. Pak met de tweede tang de naald vast op de geselecteerde plaats en buig de naald.
  3. Maak de tweede bocht. Om de naald te draaien, pakt u de naald vast met een tang aan de basis en bij de U-vormige bocht en draait u in de tegenovergestelde richting om een draai van 4-5 mm te creëren. Deze stap is van cruciaal belang om de naald gemakkelijk in de Flipwell te steken voor het verwijderen van de luchtbel.
  4. Bevestig de naald op een steriele spuit van 3 of 5 mm. Steriliseer de naald en de spuitbasis in 20 ml 70%-95% ethanol in een conische buis van 50 ml.
  5. Trek ethanol door de naald en spuit om ervoor te zorgen dat de naald en de basis van de spuit worden gesteriliseerd.
  6. Haal de spuit en naald uit de conische tube met ethanol en laat aan de lucht drogen door ze op een petrischaaltje te laten rusten. Spoel de naald met lucht om te drogen en laat hem een paar minuten drogen.

6. Het zaaien van de celepitheliale Caco-2: HT29-MTX-E12 cellijnen

  1. Begin 2-3 weken voor het experiment met het kweken van Caco-2- en HT29-MTX-cellijnen in afzonderlijke 100 mm TC-gecoate schaaltjes in hun respectievelijke groeimedia.
    1. Gebruik voor HT-29-MTX-media 440 ml DMEM met hoge glucose (4,5 g/l) en 1% (v:v) glutamax-media met 50 ml 10% (v:v) door warmte geïnactiveerde FBS, 5 ml 1% (v:v) penstreptokokken en 5 ml HEPES 10 mM eindconcentratie.
    2. Gebruik voor Caco-2-media 440 ml DMEM met hoge glucose (4,5 g/l) en 1% (v:v) glutamax-media met 50 ml 10% (v:v) door warmte geïnactiveerde FBS, 5 ml 1% (v:v) Pen Strep en 5 ml niet-essentiële aminozuren.
      OPMERKING: Bepaal de zaaidichtheid voor de Caco-2-cellijn met behulp van met weefselkweek beklede plaatputjes met 12 putjes. Bereken het aantal dagen tot 100% samenvloeiing, afhankelijk van de startdichtheid van het zaaien. We geven een zaaidichtheid als richtlijn; dat zal echter variëren afhankelijk van de formulering van de groeimedia, de leverancier en de gebruikte FBS. Deze stap is van cruciaal belang om een monolaag voor de darmepitheelzijde van de Flipwell te garanderen nadat THP-1-cellen zijn geplateerd en bacteriële/SEP-behandelingen zijn uitgevoerd.
  2. Om Caco-2- en HT-29-cellen te passeren, aspireert u de kweekmedia op. Wassen met 10 ml PBS.
  3. Trypsiniseer de cellen door 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe te voegen. Incubeer 5-10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  4. Voeg 7 ml van de juiste groeimedia van het celtype toe aan de platen. Breng de cellen over naar afzonderlijke steriele conische buisjes van 15 ml.
  5. Pellet door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur. Zuig het bovenstaande op zonder de celpellet te verstoren.
  6. Resuspendeer de pellet in 1 ml voorverwarmde HT-29-media op basis van DMEM. Tel cellen met een hemacytometer of een cellenteller.
  7. Combineer de twee celtypen Caco-2:HT-29 cellen met een verhouding van 9:1 in een nieuwe 15 ml of 50 ml conische buis, afhankelijk van het aantal cellen dat nodig is voor het gewenste aantal Flipwells.
  8. Gebruik met collageen voorgecoate flipwells voor de onderstaande stappen. Hang de met collageen voorgecoate FCI-stapels aan de rand van de diepe petrischaal.
  9. Zaad 500 μL van 7,5 x 104 cellen per cm2 (2,6 x 105 cellen/12 putjes) per apicale zijde van Flipwell. Bereken het aantal startcellen op basis van het aantal stapels dat wordt gebruikt. Dit omvat beide celtypen in een verhouding van 9:1.
  10. Dek de assemblages af met een petrischaaltje. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen zich hechten. De cellen beginnen ongeveer 7-10 dagen in cultuur slijm te produceren. Verander om de dag van media om culturen in stand te houden.
    OPMERKING: Het totale aantal dagen in de kweek met behandelingen moet van tevoren worden berekend. De flip en initiële plaatsingsdichtheid zijn afhankelijk van die duur.

7. Het omdraaien van de 3D Flipwell ter voorbereiding op het zaaien van THP-1 cellen

  1. Wanneer Caco-2:HT-29-cellen zich hechten en beginnen te prolifereren (de exacte samenvloeiing moet worden geschat op basis van de gebruikte media/FBS en de duur van de kweek) maar niet 100% samenvloeien, draai de Flipwell om om THP-1-cellen aan de andere kant van het membraan te zaaien.
    OPMERKING: THP-1-cellen moeten op dit punt in een aparte cultuur zijn geëxpandeerd en de exacte benodigde celaantallen worden geschat op basis van het aantal gebruikte FCI-stacks.
  2. Open het deksel van de petrischaal en zuig de DMEM-media op vanaf de apicale (darmepitheelzijde) van de FCI-stapel.
  3. Pak de Flipwell met een steriele tang voorzichtig bij de haak op en draai 180°. Pak met de tweede set steriele pincet de FCI-stapel vast bij de andere haak die nu naar boven wijst.
  4. Laat het geheel weer in de petrischaal zakken en hang de haak over de rand van de petrischaal. Als u nog niet klaar bent om de THP-1-cellen te zaaien, voeg dan voldoende media toe aan de diepe petrischaal om het medianiveau omhoog te brengen en net naar de bovenkant van het membraan.
    OPMERKING: De Flipwell zou stabiel moeten zijn in deze positie, en zaaien met THP-1-cellen en mediatoevoeging moet nu meteen worden overwogen. Deze stappen zijn snel uitgevoerd. THP-1-cellen moeten worden geteld en klaar zijn om te worden geplateerd. De THP1-cellen werden als eerste gezaaid om de FCI-stack te verzwaren voor meer stabiliteit en eindgewicht. DMEM-media werden vervolgens aan de diepe petrischaal toegevoegd om het medianiveau naar de onderkant van het membraan te brengen. De op maat gemaakte naald werd vervolgens gebruikt om de luchtbel te verwijderen, waardoor de FCI-stapel verder werd gestabiliseerd en de laatste volumeaanpassingen mogelijk waren.
  5. Gebruik de naald om de luchtbel te verwijderen zoals beschreven in de volgende stap.

8. Verwijdering van luchtbellen

  1. Steriliseer de naald en spuit voor gebruik voor gebruik voor in ethanol en laat ze aan de lucht drogen (zie stap 5). Dompel de zuiger van de spuit onder.
  2. Houd de FCI-stapel bij de arm vast met een steriele tang. Laat de naald voorzichtig in en onder de inzeteenheid zakken en plaats de zachte punt van de sondenaald heel voorzichtig tot aan de luchtbel.
  3. Trek voorzichtig en heel langzaam de zuiger van de spuit omhoog en kijk hoe de luchtbel langzaam verdwijnt. Stop wanneer de luchtbel ongeveer 2 mm in diameter is, wat voldoende is om een goede DMEM-dekking voor de colonepitheelcellen te behouden.
  4. Haal de naald en spuit voorzichtig uit de Flipwell. Ga verder met het andere inzetstuk in de diepe petrischaal.

9. THP-1 zaaien en PMA-behandeling

  1. Maak THP1-media met 420 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium, 50 ml 10% (v:v) door warmte geïnactiveerde FBS, 5 ml Glutamax 1% (v:v), 5 ml HEPES (10 mM eindconcentratie), 11 ml glucose (4,5 g/L eindconcentratie) en 5 ml Pen-Strep (1% v:v).
    OPMERKING: THP-1-cellen moeten enkele dagen in een op RPMI gebaseerd kweekmedium worden gekweekt voordat ze in de inserts worden gezaaid. Maak berekeningen van het aantal cellen voorafgaand aan het zaaien en schaal op op basis van het aantal te gebruiken FCI-stacks.
  2. Bereid de celsuspensie voor op basis van een volume van 500 μl en bij 0,5 x 106 cellen per 500 μl THP-1-media. Als PMA moet worden gebruikt voor differentiatie en polarisatie, voeg het dan toe aan de RPMI-media met 100 ng/μL.
    1. Om PMA te maken, reconstitueert u 5 mg phorbol myristaatacetaat (PMA) in 1 ml DMSO om een 5 mg/ml stockoplossing te maken. Mengen door vortexing. Verdunnen in microcentrifugebuisjes van elk 20 μl en bewaren bij -20 °C.
    2. Om PMA te gebruiken, maakt u een werkvoorraad van 50 μg/ml door 1 μl van 5 mg/ml bouillon te verdunnen in 99 μl (1:100) volledige groeimedia. Voeg 1 μL werkmateriaal toe aan 500 μL media, of 20 μL werkmateriaal aan 10 ml media.
  3. Centrifugeer THP-1-cellen bij 94 x g gedurende 5 minuten bij RT tot pellet. Resuspendeer in 5-10 ml RPMI-media. Tel THP-1-cellen met een willekeurige telmethode.
  4. Centrifugeer opnieuw bij 94 x g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer bij 0,5 x 106 cellen per 500 μl THP-1-media.
  5. Voeg 500 μL THP-1-celsuspensie toe aan de apicale zijde van de co-cultuurinsteekstapel. Pas HT-29-media aan voor de colon-epitheelcellen door media toe te voegen aan de petrischaal met diepe put.
  6. Verwijder de luchtbel met een sondenaald volgens stap 8, indien nodig. Kweek beide celtypen in de celkweekincubator bij 37°C, 5% CO2, 100% luchtvochtigheid totdat THP-1-cellen zich hechten ('s nachts) en gedurende 1-2 dagen prolifereren.
  7. Bereid u voor op behandelingen met SEP of andere geneesmiddelen of bereid u voor op bacteriële inserts (zie stap 4). Begin 1 dag voor de volgende FCI-stackflip met het kweken van bacteriën.

10. Tweede Flipwell Flip en verwijdering van luchtbellen voor SEP en bacteriële inzetstukken

  1. Open het deksel van het petrischaaltje. Zuig de RPMI-media op vanaf de apicale zijde. Houd de Flipwell bij de arm vast met een steriel pincet en til de stapel op.
  2. Draai de stapel ondersteboven. Houd met het tweede pincet de stapel vast, de beschikbare arm.
  3. Laat de stapel zakken in een nieuwe steriele petrischaal met diepe put en hang deze over de rand. Voeg 500 μL DMEM-media toe aan de nu epicale/darmepitheliale zijde.
  4. Voeg voldoende RPMI-media toe aan de diepe petrischaal totdat de media net tot aan de bovenkant van het membraan zijn. Het RPMI-volume werd geschat op ongeveer 40-55 ml, maar dit zal veranderen afhankelijk van het aantal FCI-stapels dat per diepe petrischaal wordt gebruikt.
  5. Verwijder de luchtbel met stap 8 en laat een luchtbel van 2-3 mm over. Pas RPMI-media indien nodig aan. Dek het bord af.
  6. Kweek totdat de epitheelcellen van de dikke darm slijm beginnen te produceren. Verander de media gedeeltelijk om de dag.
    OPMERKING: Als de colonepitheelcellen lang genoeg zijn gekweekt en al slijm hebben geproduceerd, kunnen ze doorgaan met de bacteriële insert of behandelingen. Zorg ervoor dat de media in het onderste compartiment niet onder de onderkant van het membraan van het inzetstuk komen. Voeg meer DMEM-media toe om het medium waterpas op het membraan te houden. De ideale methode voor het verwisselen van media is om de helft van de media uit het basolaterale compartiment te verwijderen en een kleine hoeveelheid media in het apicale compartiment achter te laten om luchtinfiltratie te voorkomen.
  7. Voeg voor de SEP-behandelingen SEP op dit moment toe aan de eindconcentratie van 100 μM aan putjes als de bacteriecultuur niet wordt gebruikt. Als bacteriecultuur en inzetstuk worden gebruikt, voeg dan SEP toe aan de bacteriecultuur. Voor de bacteriecultuur, zie stap 11.
    1. Om SEP te maken, voegt u 100 mg L-sepiapterine toe aan 84,3 ml DMSO en mengt u door vortexing. Aliquot in microcentrifugebuisjes van elk 100 μl. Bewaren bij -20 °C. Gebruik SEP-aliquots van 1 μl per 500 μl media per insert-assemblage (eindconcentratie van 100 μM).

11. Starten van de bacteriecultuur (optioneel)

  1. Om het effect van bacteriële metabolieten op de immuuncellen, het slijm en het colonepitheel te bestuderen, voegt u een bacterieel inzetstuk toe aan de apicale zijde van het inzetstuk. Voor de constructie van het bacteriële inzetstuk volgt u stap 4. We hebben Bacillus subtilis gekweekt de dag voor het gebruik van de bacteriële inzet.
  2. Maak en autoclaaf de Miller LB 2 dagen voor het gebruik van de bacteriële inzet. Om LB te maken, combineert u 6,25 g Miller LB met 250 ml gedeïoniseerd water in een glazen kolf van 500 ml. Dek af met aluminiumfolie. Autoclaaf, afkoelen tot RT. Kan steriele LB opslaan bij 4 °C of RT.
  3. Begin de dag voor het gebruik van de bacterie met het kweken van Bacillus subtilis-bacteriën uit glycerolvoorraad.
  4. Om de bacteriecultuur te starten, inoculeert u 10 ml Miller LB met Bacillus subtilis uit een bevroren glycerolvoorraad in een steriele conische buis van 50 ml. Laat de glycerolvoorraad niet ontdooien.
  5. Gebruik een steriel tipje van 200 μL om een kleine hoeveelheid bacteriën uit de glycerolvoorraad te halen. Werp de punt uit in 10 ml LB in de steriele conische buis van 50 ml.
  6. Als u SEP gebruikt, begin dan de behandeling met 20 μl SEP-voorraad (de uiteindelijke concentratie moet 100 μM zijn). Voeg direct toe aan de 10 ml bacteriecultuur in de 50 ml conische tube startercultuur.
  7. Kweek Bacillus subtilis gedurende 8 uur in een schudbroedmachine bij 220 tpm en 37 °C. Voeg aan het einde van de dag de tweede behandeling van SEP toe - voeg 20 μL SEP toe aan de uiteindelijke concentratie van 100 μM aan de 10 ml LB met bacteriën.
  8. Cultuur 's nachts bij 220 tpm, 37 °C. Voeg de volgende ochtend de derde behandeling van 20 μL SEP toe aan 10 ml LB met Bacillus subtilis en blijf schudden tot u klaar bent om de bacteriële inserts te doen.

12. Toevoeging van bacterieel inzetstuk aan de Flipwell (optioneel)

  1. Voer de constructie van het bacteriële inzetstuk uit zoals beschreven in stap 4. Voer de bacteriekweek uit zoals beschreven in stap 11.
    LET OP: Als er een aparte celkweekkast beschikbaar is, werkt dat het beste. Verdeel anders het werkgebied in een celkweekkast in tweeën. Houd bacterie- en celculturen uit elkaar. De celculturen mogen niet worden teruggebracht naar de celcultuurincubator. De BSC moet worden gesteriliseerd en gedurende 24 uur of langer worden blootgesteld aan UV nadat deze methode is uitgevoerd.
  2. Gebruik twee steriele pincetten voor de onderstaande stappen. Alle onderstaande stappen moeten worden uitgevoerd in de BSC.
  3. Til met een tang het kant-en-klare steriele inzetstuk met 24 putjes uit de verpakking. Plaats het inzetstuk in een steriel petrischaaltje en dek het deksel af.
  4. Herhaal dit voor het aantal benodigde bacteriële inzetstukken. Breng het petrischaaltje met de Flipwells uit de broedmachine over in de BSC en zet opzij aan de andere kant van het schaaltje met bacteriële inzetstukken.
  5. Haal 300 μL van de DMEM-media uit de apicale (bovenkant) van de Flipwell om het bacteriële inzetstuk mogelijk te maken. Laat ongeveer 200 μL in de bovenkant van de FCI-stapel zitten. Plaats het deksel van de petrischaal over de insteekconstructies.
  6. Voeg 50-100 μL B.subtilis-cultuur toe aan de bacteriële inzetstukken met 24 putjes. Zorg ervoor dat u de buitenwand en de rand van het bacteriële inzetstuk niet morst of besmet. OD600 kan worden gebruikt om de groeifase van de cultuur te volgen.
  7. Til met een steriele tang het bacteriële inzetstuk met cultuur op en steek het voorzichtig in de Flipwell-bovenkant. Draai de arm en hang hem aan de rand van de FCI-stapel. Houd de stapel vast met de tweede set steriele pincetten.
  8. Herhaal dit voor de rest van de FCI-stapels. Dek de petrischaal af en rust 3 uur uit in de BSC. Niet in de couveuse brengen.
  9. Gebruik na 3 uur een steriele tang om het bacteriële inzetstuk van de Flipwell te verwijderen. Herhaal dit voor de rest van de inzetstukken. Gooi de bacteriële inzetstukken weg.
    OPMERKING: Gooi bacteriën en bacteriële bijsluiters weg volgens het beleid voor de verwijdering van biologisch gevaarlijk afval en de veiligheids- en gezondheidsrichtlijnen van de instelling. Bacteriële componenten of bacteriën zelf werden niet onderzocht.
  10. Om veranderingen in de mucosale, epitheliale en immuuncellulaire compartimenten te analyseren, gaat u verder met het wassen van de membranen en het voorbereiden ervan voor beeldvorming.
  11. Zuig de DMEM-media op van de Flipwell-top. Wassen met 500 μL steriel PBS. Til met een tang de FCI-stapel uit de petrischaal en breng deze over in een nieuw petrischaaltje.
  12. Draai de Flipwell om en hang hem over de rand van de petrischaal. Was het membraan met 500 μL steriel PBS.
  13. Als opslag nodig is, bewaar de FCI-stapels dan op korte termijn (30 minuten 's nachts) in steriele PBS in een conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Het is belangrijk om te bepalen welke beeldvormingsmethode vervolgens zal worden gebruikt en of het membraan in tweeën zal worden gesneden voor zowel elektronenmicroscopie als fluorescerende antilichaamlabeling.

13. De Flipwell uit elkaar halen voor scanning-elektronenmicroscopie (SEM)

OPMERKING: Om morfologische veranderingen in colonepitheelcellen en macrofagen na SEP/bacteriële behandelingen te onderzoeken, hebben we de membranen in een fixatiebuffer gefixeerd en vervolgens de Flipwells gedemonteerd voor scanning-elektronenmicroscopie (SEM). PFA werd gebruikt als fixeermiddel; Glutaaraldehyde kan echter ook worden gebruikt. Het is belangrijk om met de Microscopiekern te overleggen over hun voorkeursfixatiebuffer, specifieke dehydratatiestappen en de initiële fixatiebufferconcentraties. Membranen kunnen in de fixatiebuffer worden opgeslagen als opslag nodig is. De werkzaamheden kunnen buiten de BSC worden uitgevoerd. Als de beeldvormingskern het membraan vastlijmt, kan het in tweeën worden gesneden en zo worden geplaatst dat beide zijden afzonderlijk worden afgebeeld.

  1. Label met een oplosmiddelbestendige marker de plastic zijkanten van de FCI-stapel met een symboolcodering voor het gebruikte celtype. U kunt het membraan ook rechtstreeks labelen met een punt, een vinkje of een x om het gebruikte celtype te labelen.
  2. Plaats de Flipwell in een conische buis van 50 ml zonder demontage. Voeg 4% PFA toe, genoeg om de stapel onder te dompelen. Houd 's nachts 4% PFA binnen.
    1. Om 4% PFA (methanolvrij) te maken, lost u 40 g paraformaldehyde op in 800 ml 1x PBS. Om 0,4% PFA te maken, lost u 4 g paraformaldehyde op in 800 ml 1x PBS of verdunt u 4% PFA 1:10 met 1x PBS door 100 ml 4% PFA toe te voegen aan 900 ml 1x PBS.
  3. Wissel PFA in voor 0,4% voor langere opslag. Raadpleeg de Microscopiekern voor opslagduur en buffers.
  4. Om de Flipwell uit elkaar te halen, houdt u deze met beide handen vast en draait u elk gelijmd deel van de stapel eraf. De stapel valt uiteen in twee delen: het ene deel heeft het membraan en het andere is het inzetstuk zonder het membraan. Gooi het inzetstuk weg zonder het membraan.
  5. Draai het inzetstuk met het membraan en leg het neer met het membraan naar boven. Kan het membraan labelen met een kleine stip of x aan de rand van het membraan om te weten welke kant welk celtype heeft.
  6. Houd het inzetstuk met een tang aan de muur vast. Snijd het membraan voorzichtig uit met een scalpelmes en plaats het in een tube van 1,7 ml of een klein glazen flesje met 500 μl-1 ml 0,4%-4% PFA-oplossing.
  7. Onderwerp aan microscopiekern voor de uitdrogingsstappen en beeldvorming. Stappen van uitdroging worden beschreven in Beamer et al7.
  8. Gooi PFA of andere fixeermiddelen weg volgens het door de organisatie voorgeschreven beleid voor de verwijdering van gevaarlijk afval en de gezondheids- en veiligheidsrichtlijnen.

14. Grote druppelmethode om de Flipwell uit elkaar te halen voor confocale microscopie

OPMERKING: Er is een nieuwe methode ontwikkeld om de membranen te kleuren en af te beelden. De co-cultuur insert stack werd intact gehouden met initiële fixatie-, permeabilisatie- en blokkeringsstappen in een conische buis van 50 ml. Immunofluorescerende labeling en confocale microscopie werden gebruikt om beide zijden van het membraan in beeld te brengen. De nieuw genoemde 12-putjesplaatmethode werd gebruikt voor de nachtelijke incubatiestappen en een grote druppelmethode werd gebruikt om de bodem van het gedemonteerde inzetstuk te kleuren. Confocale Z-stack werd gebruikt voor het afbeelden van beide zijden met het membraan. De bevlekte membranen werden ingeklemd tussen twee ronde glazen dekglaasjes en de ingeklemde assemblage werd in het midden geplaatst tussen twee metalen ringen van de commercieel gemaakte ronde kamer om af te beelden. Multi-foton laserscanning confocale microscoop werd gebruikt met commerciële beeldvormingssoftware.

  1. Om het membraan te wassen, plaatst u de stapel co-cultuurinzetstukken rechtstreeks in een conische buis van 50 ml en voegt u 15 ml steriel PBS toe of wast u elke kant afzonderlijk (hieronder beschreven).
  2. Zuig de DMEM op en voeg 300 μL steriel PBS toe aan de apicale zijde. Zuig PBS aan en verwijder voorzichtig de stapel van de petrischaal.
  3. Draai de Flipwell om en voeg 300 μL PBS toe aan de nu naar boven gerichte RPMI van de FCI-stack. Aspireer de PBS.
  4. Gebruik een oplosmiddelbestendige marker om de boven- en onderkant van de stapel te labelen om te weten welke kant welk celtype heeft.
  5. Plaats de Flipwell in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg 15 ml steriele 4% PFA toe als initiële fixatiebuffer gedurende 10 minuten. Als een nacht incubatie nodig is, vervang dan 15 ml 0,4% PFA in PBS, dek af en laat een nacht staan.
  6. Om door te gaan met de immunokleuring, maakt u een bankje ruimte voor de methode met grote druppels.
    Scheur 10 x 14 inch stukjes plasticfolie af en plak deze op de hoeken op de bank om een glad oppervlak te creëren.
  7. Gebruik een pipet van 200 μL om een grote druppel te creëren met 200 μL PBS. Draai de inzeteenheid eraf om deze in de inzetstukken te scheiden.
  8. Plaats met een oplosmiddelbestendige marker een kleine stip dicht bij de rand van een kant van het membraan om te weten welk celtype wordt gebruikt voor kleuring en beeldvorming.
  9. Verwijder eventuele resterende siliconenpakking van de bodem van het inzetstuk als er nog lijmresten op het inzetstuk met het membraan zitten. Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de insert rechtop blijft staan voor de onderstaande stappen.
  10. Plaats de FCI-stapel (met THP-1-cellen) voorzichtig bovenop de 200 μL grote druppel PBS. Voeg 200 μL permeabilisatiebuffer toe aan de bovenzijde met colonepitheelcellen en bewaar gedurende 10 min.
    1. Om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden, gebruikt u 0,1% v/v Triton-X100 in PBS.
  11. Zuig op en voeg 200 μL PBS toe. Herhaal deze wasbeurt 2x. Maak een nieuwe druppel met 250 μL blokkeerbuffer.
    1. Om een blokkerende buffer te maken, voegt u 250 μL normaal geitenserum toe in 5 ml 1x PBS (laatste 5% serum). Voeg 15 μL Triton-X100 toe (laatste 0,3% v:v). Meng goed en bewaar 1-2 dagen bij 4 °C.
  12. Plaats het inzetstuk bovenop de blokkeerbuffer. Blok gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Zuig PBS op vanaf de apicale zijde en voeg 200 μL blokkeerbuffer toe aan de bovenkant van de insert. Beide zijden van het membraan zijn nu klaar voor antilichaamkleuring 's nachts.

15. Immunofluorescerende (IF) kleuring

OPMERKING: Het kleuren gebeurt 's nachts met behulp van een 12-well plaatmethode of op een bank met behulp van een grote druppelmethode.

  1. Bereid de nodige antilichamen voor die kunnen worden gebruikt voor het kleuren van beide zijden van het membraan 's nachts bij 4 °C of op de bank bij RT. Verdun alle antilichamen 1:100 in 1% BSA in PBS. U kunt ook de aanbevelingen van de fabrikant volgen en de kleuring optimaliseren om de ideale concentraties en de verdunningsbuffer van antilichamen te bepalen.
  2. Methode met grote druppels
    1. Maak een grote rechthoek met behulp van plasticfolie op de bank en plak de hoeken vast. Pipetteer 200 μL antilichaam verdund bovenop het plastic om een grote druppel te creëren. Plaats het insteekmembraan op de grote druppel.
    2. Voeg 200 μL primaire Ab toe aan de bovenkant van de insert. Incubeer 2 uur bij RT.
  3. Plaatmethode met 12 putjes
    1. Als u 's nachts een plaatmethode met 12 putjes gebruikt, voegt u 300 μL primair antilichaam toe aan de bovenkant van de insert.
    2. Voeg 300 μL primair antilichaam toe aan het putje van de plaat met 12 putjes. Plaats het inzetstuk in de plaat met 12 putjes bovenop de druppel. Dek de plaat af met een deksel en zet hem een nacht op 4 °C.
  4. Wanneer het kleuren is voltooid, wast u beide zijden van het membraan met PBS. Spoel met een pipet en een tip van 200 μL de onderkant van het inzetstuk voorzichtig 3x met 200 μL PBS. Was voor de bovenkant van het inzetstuk door 200 μL PBS aan de bovenkant toe te voegen, op te zuigen en 3x te herhalen.
  5. Bereid alle secundaire antilichamen voor (zie materiaaltabel voor de specifieke antilichamen die worden gebruikt) volgens de aanbevelingen van de fabrikant of 1:1000 verdunning in 1% BSA in PBS of andere. Secundaire antilichaamkleuring moet in het donker worden gedaan; Gebruik een kartonnen doos of een lade van een kast om een lichtvrije omgeving te creëren.
  6. Gebruik een methode met grote druppels of een plaatmethode met 12 putjes om een nieuwe steriele plaat voor te bereiden. Incubeer gedurende 2 uur bij RT in een donkere omgeving. Wassen zoals beschreven in 15.4.

16: Voorbereiding op confocale beeldvorming

  1. Als het membraan nog niet is gelabeld zoals beschreven in stap 14, label het dan om de locatie van het celtype te kennen. Plaats op elke plaats een kleine markering (punt, x, vinkje, enz.) met een oplosmiddelbestendige markering (bij voorkeur rand).
  2. Verwijder de ronde dekglaasjes voorzichtig uit de opbergdoos en plaats ze voorzichtig op het werkblad van de bank.
  3. Verdun DAPI in PBS bij een verdunning van 1:100. Voor het doseren van DAPI met de druppeldispenser voegt u 1-3 druppels toe aan het midden van de dekbon. Piket anders 1-3 druppels DAPI in het midden van het dekglaasje.
  4. Houd het inzetstuk vast met een tang. Knip het membraan voorzichtig uit met een scalpelmes in een cirkelvormige beweging helemaal rond de rand/onderrand. Laat het membraan niet op de bank vallen. Leg het plastic inzetstuk op de bank en houd het membraan vast met een tang terwijl u de laatste vezels afsnijdt met het scalpelmes.
  5. Plaats het inzetstuk op de DAPI. Doseer 1-3 druppels DAPI (verdunning 1:100) naar de bovenkant van het membraan, zodat beide zijden van het membraan DAPI hebben.
  6. Til het afdekglaasje van de tweede ronde met de vingers op (draag PBM's). Gebruik geen tang, want het dekglaasje is erg kwetsbaar.
  7. Lijn het tweede dekglaasje uit over het eerste dekglaasje en laat het voorzichtig op het membraan zakken.
  8. Gebruik een oplosmiddelbestendige marker om de kant van de dekstrook zorgvuldig te labelen indien nodig om het celtype/de oriëntatie te coderen (optioneel). Als het membraan is gelabeld, slaat u deze stap over.
  9. Afhankelijk van het aantal dekglaasjes dat moet worden afgebeeld en het aantal beschikbare metalen ringen, monteert u de dekglaasjes tussen de commercieel gemaakte metalen ringen om de ronde dekglaasjes bij elkaar te houden voor beeldvorming of bewaart u ze in het donker tot beeldvorming.
  10. Om een afbeelding te maken, monteert u het dekglaasje met het membraan tussen de metalen ringen van de celkamer en plaatst u het in de confocale microscoophouder. Neem contact op met de confocale microscopiekern voordat u kijkt welke houder nodig is om de ronde dekglaasjes af te beelden.
  11. Als je klaar bent om een beeld te maken, wikkel je elke sandwich in aluminiumfolie en breng je hem naar de faciliteit.
  12. Gebruik de Z-stack-functie om elke kant van het membraan afzonderlijk te scannen met de juiste golflengte, afhankelijk van de gebruikte fluoroforen. Draai om en beeld de tweede kant af. Om de dekglaasjes te bewaren, bewaart u ze in het donker bij 4 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de biologische relevantie van Flipwell-co-culturen van darmbacteriën, colonepitheel, en macrofagen te bepalen, behandelden we de co-culturen met sepiapterin (SEP), een modulator van het argininemetabolisme, om de productie van stikstofmonoxide 9,10,11 te bevorderen in vergelijking met de controle-DMSO. We bepaalden de effecten van SEP-behandeling op elk onderdeel van co-culturen met behulp va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om de architectuur van het darmslijmvlies in vitro na te bootsen, hebben we een eenvoudig co-cultuursysteem ontworpen dat bestaat uit gelaagde lagen darmbacteriën, slijmproducerende colonepitheelcellen en macrofagen. Dit multi-co-cultuursysteem heeft ons in staat gesteld om de effecten te bestuderen van overspraak tussen het bacteriële secretoom, darmepitheel, en macrofagen op het induceren van immunogene herprogrammering en mucosale afweermechanismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict. De auteurs wijzen hierbij alle garanties af, expliciet of impliciet, voor zover toegestaan door de wet. In geen geval zullen de auteurs aansprakelijk worden gesteld, hetzij op grond van een statuut, contract, onrechtmatige daad of enige andere juridische theorie, voor enige speciale, incidentele, indirecte, punitieve, meervoudige of gevolgschade die voortvloeit uit of verband houdt met het gebruik van gereedschappen bij de bouw van de Flipwells, het gebruik van BSL-reagentia, cellijnen, bacterieculturen, het gebruik van het Flipwell-systeem in een anaërobe omgeving in een anaërobe kamer. Deze beperking van aansprakelijkheid omvat, maar is niet beperkt tot, elke niet-gespecificeerde manier van Flipwell-gebruik die hierin niet expliciet wordt beschreven.

Dankbetuigingen

De primaire auteur spreekt zijn oprechte dankbaarheid uit aan Dr. Saori Furuta voor haar uitstekende mentorschapsvaardigheden, voortdurende begeleiding en ondersteuning over lange afstanden, en bekwaam en continu projectontwerp dat fantastische leermogelijkheden bevordert. De auteurs danken ook Dr. Vandana Sharma voor microbiologische expertise en begeleiding en Dr. Veani R. Fernando voor de bereiding van THP-1-macrofagen.  Daarnaast danken de auteurs Drs. Andrew Kleinhenz en William T. Gunning van de Electron Microscopy Facility, en Cassandra Zamora en Kristin Kirschbaum van het Instrumentation Center van de Universiteit van Toledo voor constructieve suggesties voor EM-beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door het startfonds van de University of Toledo Health Science Campus, College of Medicine and Life Sciences, Department of Cancer Biology tot SF; Ohio Cancer Re-search Grant (Project #: 5017) aan SF; De medische Maatschappij van het Onderzoek (Stichting Toledo, #206298) Prijs aan S.F; American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-18-238-01-CSM) aan SF; en National Cancer Institute Research Grant (R01CA248304) aan SF.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4% PFA (zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
10-ml serologische pipetCorning4488
12 well TC Plate,  CostarCorning3513
15-ml conische buizen, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 µl tips USA Scientific1111-1700
24-well inserts - Culture Inserts for 24-well plates, PET 0.4 µm BrandTech Scientific782710
3D Flipwells voorgevormd, UV gesteriliseerd Make in lab
4% PFA (zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
50 mM Sepiapterin stock (SEP, Zie recept in Reagents and Solution)Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50-ml conische buizenGreiner Bio-One227261
5-ml serologische pipetCorning4487
70-95% Ethanol (Ethyl Alcohol)Decon Labs04-355-151
AluminiumfolieFisher Scientific01-213-100
Dierenvoer naalden, 20 gauge 1.5” lengte, eenmalig gebruik Fisher Scientific01-208-87
Antibody Dilution Buffer (zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
Attofluor Cell Chamber ThermoFisher ScientificA7816
Autoclaaf tapeFisher Scientific15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) stammen in glycerol stock ()Bacillus Genetic Stock Center (https:// bgsc. org/
BioGrip Pink Nitrile poedervrije latexvrije handschoenenTop Quality ManufacturingP2810
Blocking Buffer (zie recept in Reagents and Solutions - 10% Normaal Geitenserum in PBS)beschreef in tekst
Blocking Buffer (zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
Brightfield microscoop (Nikon of equivalent) Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2 cellenATCCHTB-37
Celcultuur incubator, 37°C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrifuge (Eppendorf, Centrifuge 5804/5804 R of equivalentEppendorf22622501
Centrifuge buizen 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Culture inserts voor 12-well plate, PET, 0.4 µm, sterieleBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield montagemediumVector LaboratoriesH-1000
Diepe petrischaalbodems, 100 x 25 mm Deep Polystyrene Stackable Petri Dish, steriele USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 Centrifuge met een swing bucket rotor voor 50 ml conische buizenEppendorf22622501
Forceps, roestvrij staal, sterieel geautoclaveerd, 2x setsVWR82027-438
Forceps, roestvrij staal, sterieel geautoclaveerd, 2x sets, Specimen ForcepsVWR82027-438
Glaskolf 500 mlCorning 4980-500
Hemacytometer (Neubauer met dekglasjes)Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12 cellenMillipore Sigma12040401
ImmunoPen (optioneel)Fisher Scientific4021761EA
Kevlar-gebaseerde of andere snijbestendige handschoenen (optioneel)Hardwarewinkel of Amazon
Lab tape of verzendtapeFisher Scientific 159015R
Laminaire stroomkap 1300 Series A2 BSC Class IIThermoFisher Scientific1375
Laminaire stroomkap met UV-licht SterilGARDThe Baker CompanySG403A-HE
Markers oplosmiddelbestendigVWR52877-310 of 95042-566
Media voor Caco-2 cellen (DMEM High Glucose-based, zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in  tekst
Media voor HT-29 cellen (DMEM High Glucose, zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
Media voor THP-1 cellen (RPMI, zie recept in Reagents and Solutions)beschreef in tekst
Microcentrifugebuis, 1.7 ml, steriele Alkali ScientificC3017-ST
MicrocentrifugebuizenThermo Fisher3451
Miller LB media (zie recept in Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich L3522
Naaldneustang, 2x setsHardwarewinkel of Amazon
Nitrile poedervrije latexvrije handschoenen Aurelia AmazingMidSci92885
Petrischaal deksels, steriele Falcon Petri Dish steriele 100x15 mm stijlCorning Inc351029
Phorbol myristaat acetaat (PMA) (100 ng/μl, zie recept in Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
Pipet tips (10 µl, 200 µl, 1000 µl) PurePoint of equivalentAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
PlasticfolieSupermarkt
Purecol werkende collagenase oplossing (100

Referenties

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

3D-cocultuurdarmmucosa-modelbacterieel secretoompolarisatie van immuuncellencolon-epitheelcellenmacrofaagpolarisatiebiofilmvormingsepiapterine-behandelingimmunofluorescente kleuring
3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.