Method Article

3D Flipwell-engineering voor het ontwikkelen van asynchrone systemen voor toxicologische en immunomodulerende therapieën in bacteriële, darm- en immuuncellen

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol met de belangrijkste stappen om de 3D Flipwell-engineering en -gebruik te begeleiden. We beschrijven en laten zien hoe de co-cultuur insert stacks kunnen worden samengesteld en gebruikt voor het co-kweken van gelaagde lagen darmbacteriën, darmepitheel, en macrofagen om de darmslijmvliesomgeving te modelleren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de rol van bacterieel secretoom in de polarisatie van immuuncellen en de homeostase van het darmslijmvlies te bestuderen, hebben we een 3-dimensionaal co-cultuurmodel ontwikkeld met behulp van in de handel verkrijgbare inserts in een back-to-back gestapeld formaat. We noemden dit systeem 3D Flipwells en hebben met succes bacteriën, colonepitheel en immuuncellen in gelaagde lagen gekweekt om de micro-omgeving van het darmslijmvlies samen te vatten. Dit co-cultuursysteem maakt het mogelijk om colon-epitheelcellen aan de ene kant van het membraan en ongedifferentieerde niet-aanhangende monocyten aan de andere kant te zaaien, waardoor de synchrone progressie van colon-epitheliale polarisatie, slijmvorming en monocyt-macrofaagdifferentiatie en polarisatie binnen een enkele co-cultuur mogelijk is zonder de noodzaak om vooraf gedifferentieerde macrofagen los te maken en opnieuw te plateren. Dit systeem is eenvoudig te bouwen en vereist slechts een paar direct beschikbare materialen en gereedschappen. We hebben het nut ervan getest door de reacties van co-cultuurcomponenten op sepiapterin (SEP) te analyseren, de endogene voorloper van BH4 (tetrahydrobiopterine) - een cofactor van stikstofmonoxidesynthase (NOS). We hebben aangetoond dat SEP-behandeling van 3D Flipwell biofilmvorming door darmbacteriën, slijmproductie door colonepitheel en pro-immunogene polarisatie van macrofagen induceerde. Dit gaf aan dat SEP de activering van een mucosale verdedigingsmechanisme activeerde door middel van overspraak tussen verschillende cellulaire componenten. Verdere experimenten zijn nodig om de rol van mucosale communicatie te onderzoeken die leidt tot herprogrammering van immuuncellen en om het nut van dit co-cultuursysteem te evalueren om te screenen op nieuwe immunomodulerende therapieën.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overspraak tussen immuuncellen en darmmicrobioom heeft een grote invloed op de werkzaamheid van verschillende ziektebehandelingen. Een dergelijke overspraak wordt duidelijk gemodificeerd door externe stimuli, inclusief maar niet beperkt tot metabole afwijkingen van de gastheer, veranderingen in het dieet, manifestatie van de ziekte en farmacologische behandeling. Deze veranderingen kunnen leiden tot een onbalans in de samenstelling van de microflora, een aandoening die dysbiose 1,2,3 wordt genoemd.

Om de interactie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D Flipwell-techniek

  1. Al het werk moet worden gedaan in een celkweekkast. Plaats alle benodigdheden in de kast.
  2. Open het deksel van de petrischaal en zet apart. Open het scalpelmes uit de beschermhoes en plaats het op de rand van de bodem van de petrischaal. Zorg voor steriliteit.
    LET OP: Voorzichtig omgaan met het scalpelmes is vereist. Gebruik indien nodig snijbestendige, met vezels versterkte handschoenen om de handen te beschermen.
  3. Open de steriele beschermende verpakking van de 12-well commercial insert. Zorg voor steriliteit. Neem een steriel pincet. Pak het inzetstuk voorzic....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de biologische relevantie van Flipwell-co-culturen van darmbacteriën, colonepitheel, en macrofagen te bepalen, behandelden we de co-culturen met sepiapterin (SEP), een modulator van het argininemetabolisme, om de productie van stikstofmonoxide 9,10,11 te bevorderen in vergelijking met de controle-DMSO. We bepaalden de effecten van SEP-behandeling op elk onderdeel van co-culturen met behulp va.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de architectuur van het darmslijmvlies in vitro na te bootsen, hebben we een eenvoudig co-cultuursysteem ontworpen dat bestaat uit gelaagde lagen darmbacteriën, slijmproducerende colonepitheelcellen en macrofagen. Dit multi-co-cultuursysteem heeft ons in staat gesteld om de effecten te bestuderen van overspraak tussen het bacteriële secretoom, darmepitheel, en macrofagen op het induceren van immunogene herprogrammering en mucosale afweermechanismen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict. De auteurs wijzen hierbij alle garanties af, expliciet of impliciet, voor zover toegestaan door de wet. In geen geval zullen de auteurs aansprakelijk worden gesteld, hetzij op grond van een statuut, contract, onrechtmatige daad of enige andere juridische theorie, voor enige speciale, incidentele, indirecte, punitieve, meervoudige of gevolgschade die voortvloeit uit of verband houdt met het gebruik van gereedschappen bij de bouw van de Flipwells, het gebruik van BSL-reagentia, cellijnen, bacterieculturen, het gebruik van het Flipwell-systeem in een anaërobe omgeving in een anaërobe kamer. Deze beperking van aansprakelijkheid omvat, maar is niet beperkt tot, elke niet-gespecificeerde manier van Flipwell-gebruik die hierin niet expliciet wordt beschreven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De primaire auteur spreekt zijn oprechte dankbaarheid uit aan Dr. Saori Furuta voor haar uitstekende mentorschapsvaardigheden, voortdurende begeleiding en ondersteuning over lange afstanden, en bekwaam en continu projectontwerp dat fantastische leermogelijkheden bevordert. De auteurs danken ook Dr. Vandana Sharma voor microbiologische expertise en begeleiding en Dr. Veani R. Fernando voor de bereiding van THP-1-macrofagen.  Daarnaast danken de auteurs Drs. Andrew Kleinhenz en William T. Gunning van de Electron Microscopy Facility, en Cassandra Zamora en Kristin Kirschbaum van het Instrumentation Center van de Universiteit van Toledo v....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% PFA (see recipe in Reagents and Solutions)described in text
10-ml serological pipetteCorning4488
12 well TC Plate,  CostarCorning3513
15-ml conical tubes, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 µl tips USA Scientific1111-1700
24-well inserts - Culture Inserts for 24-well plates, PET 0.4 µm BrandTech Scientific782710
3D Flipwells pre-made, UV sterilized Make in lab
4% PFA (see recipe in Reagents and Solutions)described in text
50 mM Sepiapterin stock (SEP, See recipe in Reagents and Solution)Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50-ml conical tubesGreiner Bio-One227261
5-ml serological pipetteCorning4487
70-95% Ethanol (Ethyl Alcohol)Decon Labs04-355-151
Aluminum foilFisher Scientific01-213-100
Animal Feeding needles, 20 gauge 1.5” length, single use Fisher Scientific01-208-87
Antibody Dilution Buffer (see recipe in Reagents and Solutions)described in text
Attofluor Cell Chamber ThermoFisher ScientificA7816
Autoclave tapeFisher Scientific15-901-111
Bacillus subtilis wt (3A1T) strains in glycerol stock ()Bacillus Genetic Stock Center (https:// bgsc. org/
BioGrip Pink Nitrile powder free latex free glovesTop Quality ManufacturingP2810
Blocking Buffer (see recipe in Reagents and Solutions - 10% Normal Goat Serum in PBS)described in text
Blocking Buffer (see recipe in Reagents and Solutions)described in text
Brightfield microscope (Nikon or equivalent) Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2 cellsATCCHTB-37
Cell culture incubator, 37°C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrifuge (Eppendorf, Centrifuge 5804/5804 R or equivalentEppendorf22622501
Centrifuge tubes 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Culture inserts for 12-well plate, PET, 0.4 µm, sterileBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Deep petri dish bottoms, 100 x 25 mm Deep Polystyrene Stackable Petri Dish, sterile USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 Centrifuge with a swing bucket rotor for 50 ml conical tubesEppendorf22622501
Forceps, stainless steel, sterile autoclaved, 2x setsVWR82027-438
Forceps, stainless steel, sterile autoclaved, 2x sets, Specimen ForcepsVWR82027-438
Glass flask 500 mlCorning 4980-500
Hemacytometer (Neubauer with cover slips)Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12 cellsMillipore Sigma12040401
ImmunoPen (optional)Fisher Scientific4021761EA
Kevlar-based or other cut-resistant gloves (optional)Hardware store or Amazon
Lab tape or shipping tapeFisher Scientific 159015R
Laminar Flow hood 1300 Series A2 BSC Class IIThermoFisher Scientific1375
Laminar flow hood with UV light SterilGARDThe Baker CompanySG403A-HE
Markers solvent proofVWR52877-310 or 95042-566
Media for Caco-2 cells (DMEM High Glucose-based, see recipe in Reagents and Solutions)described in  text
Media for HT-29 cells (DMEM High Glucose, see recipe in Reagents and Solutions)described in text
Media for THP-1 cells (RPMI, see recipe in Reagents and Solutions)described in text
Microcentrifuge tube, 1.7 ml, sterile Alkali ScientificC3017-ST
Microcentrifuge tubesThermo Fisher3451
Miller LB media (see recipe in Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich L3522
Needle nose pliers, 2x setsHardware store or Amazon
Nitrile powder free latex free gloves Aurelia AmazingMidSci92885
Petri dish lids, sterile Falcon Petri Dish sterile 100x15 mm styleCorning Inc351029
Phorbol myristate acetate (PMA) (100 ng/μl, see recipe in Reagents and Solutions) InvivoGenTlrl-pma
Pipet tips (10 µl, 200 µl, 1000 µl) PurePoint or equivalentAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Plastic wrapGrocery store
Purecol working collagenase solution (100 µg/mL)Advanced BioMatrix5005-100ML
Round cover slips #1 1 oz (Corning Float Glass or Fisherbrand)Corning or Fisherbrand50143822 or 12-546-2 25CIR-2
Scalpel blades, sterile, disposable Mopec or Feather #10AJ136 or 2975#10
Sepiapterin (SEP, 100 µM, see recipe in Reagents and Solution)Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Shaking incubator set for 220 rpm 37°CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Silicone Adhesive Loctite Clear Silicone IDH or 3M Marine Grade Silicone Sealant Clear with a nosetipLoctite or 3M1745658 or PN08019
Single channel pipet Eppendorf Research Plus, 200 µlEppendorf
Single channel pipettes (10 µl, 200 µl, 1000 µl)Eppendorf2231001122
Spectrophotometer NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Sterile deionized water  
Sterile phosphate buffered serine (PBS) without calcium or magnesiumFisher Scientific BSS-PBS-1X6
Syringe 3 ml or 5 ml with Luer-Lok TipBD309585 or 309603
THP-1 cellsATCCTIB-202
Transfer pipets, sterileFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Trypan blue solutionVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0.25%Thermo Fisher Scientific25200-056
Wipes Kimwipes Professional with LintGuard Anti-Stat PolyshieldKimberly-Clark34120
Primary Antibodies: 
Anti-human CD163Abcam156769
Anti-human CD68Novus BiologicalsNB100-683-0.1 mg
Anti-human CD80, E3Q9VCell Signaling Technologies15416
Anti-human CK20 Life TechnologiesPA5-82875
Anti-human MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Secondary Antibodies:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (for CD80 and CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat anti-Mouse IgG (for MUC2 and CD68 or CD163)ThermoFisherA11005
Reagents and Solutions:  
Caco-2 Medium:
DMEM with high glucose (4.5g/L) and 1% (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) heat-inactivatedSigmaF2242-500ML
Non-essential amino acids 1% for Caco-2 mediaThermo Fisher Scientific11140076
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Medium
DMEM with high glucose (4.5g/L) and 1% (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) heat-inactivatedSigmaF2242-500ML
HEPES (10 mM final concentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Medium:
FBS (10% v:v) heat-inactivated fetal bovine serumSigma F2242-500ML
Glucose (4.5 g/L final concentration)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  2 mM final concentrationThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (10 mM final concentration)Thermo Fisher Scientific15630080
Pen Strep 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumThermo Fisher Scientific11875119
Sodium Pyruvate (1 mM final concentration)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol working collagenase solution (dilution to 1:30 100 µg/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 to 100 µg/ml Advanced BioMatrix5005-100ML
sterile deionized water
L-Sepiapterin stock solution (50 mM):
L-Sepiapterin (SEP)Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Phorbol myristate acetate stock solution (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% Bovine serum albumin Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich L3522
Normal Serum from the same species as the secondary antibodySigma NS02L-1ML
ParaformaldehydeSigma-Aldrich441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Co CultureFlipwell EngineeringGut Mucosal ModelBacterial SecretomeImmune Cell PolarizationColon Epithelial CellsMacrophage PolarizationBiofilm FormationSepiapterin TreatmentImmunofluorescent Staining

Related Articles