Methodenartikel

Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

26 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

In dit artikel

Samenvatting

De efficiëntie van de Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD)-methode is vergelijkbaar met traditionele micro-injectie, waarbij zygoten moeten worden verzameld bij donorvrouwtjes en moeten worden overgedragen aan pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit protocol demonstreert zijn effectiviteit door CRISPR/Cas9-geïnduceerde mutaties te introduceren in de ROSA26-locus op chromosoom 6.

Samenvatting

Methoden voor het maken van knock-outmuizen omvatten doorgaans drie hoofdstappen: (1) het verzamelen van embryo's van donorvrouwtjes, (2) het micro-injecteren van genetische constructies in de zygoten ex vivo, en (3) het operatief overbrengen ervan in de eileider van pseudo-zwangere vrouwtjes. Dit proces vereist een aanzienlijk aantal dieren, omdat het niet alleen donorvrouwtjes betreft, maar ook gesteriliseerde mannetjes en pseudo-zwangere vrouwtjes. Bovendien brengen micro-injecties in het cytoplasma of de pronucleus van muizenzygoten uitdagingen met zich mee, zoals verstopping van de naald, problemen met de membraanpermeabiliteit als gevolg van hoge elasticiteit en mogelijke embryosterfte. De ontwikkeling van geavanceerde elektroporators, zoals de Nepa21, biedt een unieke kans om muizen te genereren met gerichte genknock-outs in één stap via een methode die bekend staat als Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD). Deze techniek omvat het micro-injecteren van CRISPR-Cas-componenten (Cas9-eiwit en gids-RNA) in de eileiders van zwangere vrouwen 0,7 dagen na de conceptie, gevolgd door in vivo elektroporatie om deze componenten rechtstreeks in de zygoten af te leveren. Na de I-GONAD-procedure draagt de drachtige muis en baart ze pups met de beoogde genknock-out. Dit artikel biedt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor het implementeren van de I-GONAD-methode bij muizen, en biedt een efficiënter en toegankelijker alternatief voor traditionele technieken voor het genereren van knock-outmuizen.

Inleiding

Het begrijpen van de genetische basis van ziekten is van cruciaal belang voor het identificeren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hun etiologie en pathogenese. Een belangrijke stap in dit onderzoek is de ontwikkeling van diermodellen met gerichte genknock-outs die menselijke ziekten simuleren. Muizen zijn bijzonder waardevol voor deze onderzoeken vanwege hun algemene genomische gelijkenis met mensen, kleine omvang, korte levensduur en hoge vruchtbaarheid. Muizenmodellen zijn belangrijk voor zowel fundamenteel onderzoek als preklinisch testen1.

Om een knock-outmuis te maken met behulp van het CRISPR-Cas9-systeem, injecteren onderzoekers doorgaans een complex van gids-RNA en Cas9-nuclease in een zygote, waardoor een dubbelstrengsbreuk in het doel-DNA ontstaat en daardoor het reparatiesysteem van de cel wordt geactiveerd om een mutatie te veroorzaken op de plaats van de breuk 1,2. Micro-injectie in zygoten blijft hiervoor de gouden standaard. Deze methode vereist echter verschillende stappen: het isoleren van embryo's van donorvrouwtjes, het uitvoeren van micro-injecties van genetische constructen in zygoten en het operatief overbrengen ervan naar de eileiders van pseudo-zwangere vrouwtjes. Als gevolg hiervan is het noodzakelijk om een groot aantal dieren te onderhouden, waaronder donorvrouwtjes, gesteriliseerde mannetjes en pseudo-zwangere vrouwtjes. Bovendien maakt de isolatie van zygoten de euthanasie van donorvrouwtjes noodzakelijk. Daarom verdient protocollen die het gebruik van dieren minimaliseren de voorkeur, in lijn met de principes van de 3V's (Vervanging, Vermindering, Verfijning)3.

Vooruitgang in elektroporatietechnologie, zoals het gebruik van het Nepa21-systeem, biedt een unieke kans om in één stap gerichte gen-knock-outmuizen te genereren met behulp van een techniek die bekend staat als verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezurenafgifte (I-GONAD)4. De Super Electroporator NEPA21 Type II maakt gebruik van een 4-staps multi-pulse elektroporatiesysteem, wat zorgt voor een hoge elektroporatie-efficiëntie met behoud van een hoge levensvatbaarheid van het embryo. I-GONAD omvat het micro-injecteren van CRISPR-Cas-componenten (Cas9-eiwit (500-600 ng/μl) en gids-RNA (80-100 ng/μl)) in de eileiders van zwangere muizen 0,7 dagen na de conceptie, gevolgd door in vivo elektroporatie om deze componenten rechtstreeks in zygoten af te leveren5. Na de I-GONAD-procedure bevalt de drachtige muis van pups met de beoogde genknock-out 6,7,8. De werkzaamheid van deze methode varieert afhankelijk van het gewenste doelwit, maar is vergelijkbaar met standaard technieken op basis van micro-injectie (ongeveer 50%)9,10. Bovendien zou I-GONAD mogelijk kunnen worden aangepast voor genoombewerking in andere soorten.

In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het implementeren van de I-GONAD-methode om knock-outmuizen te genereren. De effectiviteit ervan werd bijvoorbeeld aangetoond door zich te richten op de ROSA26-genoomlocus op muischromosoom 6. Deze locus werd gekozen omdat deze constitutieve transcriptie ondergaat zonder daaropvolgende vertaling. Daarom is het onwaarschijnlijk dat het introduceren van een mutatie op deze locus een negatief effect heeft op de gezondheid van de resulterende pups.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dieronderzoek van de Staatsuniversiteit van Sint-Petersburg (goedkeuring nr. 131-03-5, 11 oktober 2022). Alle procedures werden strikt nageleefd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Gemeenschappelijke CD1-muizen van de stam CD1 werden verkregen van het Collective Use Center van het Institute of Physiologically Active Compounds, Russian Academy of Sciences (IPAC RAS). Vrouwelijke CD1-muizen in de leeftijd van 2-3 maanden (gemiddeld gewicht 27-30 g) werden gebruikt om te paren met mannelijke CD1-muizen van 2,5-4 maanden (gemiddeld gewicht 35-37 g). De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Het ontwerp van het enige gidsRNA (sgRNA) en zijn voorbereiding voor transfectie

  1. Gebruik computationele analysetools zoals CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design of CRISPOR om potentiële sgRNA-sequenties te identificeren die gericht zijn op het geselecteerde gen van belang.
    OPMERKING: De software kan potentiële sgRNA-sequenties in het hele gen identificeren en suggereert meerdere varianten aan de uitvoer. Deze tools zullen de meest optimale sgRNA-opties voorstellen en stellen de gebruiker in staat om indien nodig te kiezen uit alle geïdentificeerde varianten. Houd bij het maken van een selectie rekening met de volgende criteria:
    1. Nabijheid van exonen: Kies sequenties in exonen die zo dicht mogelijk bij het gewenste mutatiepunt liggen. Overweeg voor betere resultaten de alternatieve lasisovormen en selecteer de doelsequentie die in de meeste isovormen aanwezig is. Overweeg genoombrowsers (bijv. Ensembl) voor nauwkeurige exonselectie.
    2. Off-target overwegingen: Analyseer mogelijke off-target effecten met behulp van het scoresysteem van de tool, waarbij sequenties worden geselecteerd die de laagste voorspelde off-target activiteit vertonen.
      OPMERKING: Computationele tools zoals CHOPCHOP of Synthego zijn zeer effectief voor het beoordelen van exonnabijheid en off-target-effecten, en helpen bij het identificeren van optimale sgRNA-sequenties voor nauwkeurige genoombewerking. Bij het ontwerpen van gids-RNA's is het belangrijk om rekening te houden met de specifieke sequentie van het gen dat van belang is voor de muizenstam die wordt gebruikt. Voor sommige muizenstammen (bijv. C57Bl, CBA, C3H) is de volledige genomische sequentie beschikbaar. Als dergelijke gegevens niet beschikbaar zijn, kan het raadzaam zijn om voorlopige sequentiebepaling van het doelgen uit te voeren in het geplande bewerkingsgebied. Enkelvoudige mismatches in het gids-RNA, veroorzaakt door polymorfismen, kunnen de bewerkingsefficiëntie in gevaar brengen. De ROSA 26 muisgenoomlocus was het doelwit van de sgRNA-sequentie: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Bestel een set primers voor sgRNA-sjabloon PCR-amplificatie zoals beschreven in Tabel 1.
    OPMERKING: gRNA kan elders worden besteld, hetzij als sgRNA of als crRNA:tracrRNA duplex.
  3. Produceer een lineair dsDNA-sjabloon.
    1. Bereid het mastermengsel voor zoals aangegeven in tabel 1. Voeg aan het einde de polymerase toe en houd het mastermengsel op ijs om de stabiliteit te behouden.
    2. Voer de PCR uit onder de volgende omstandigheden: Eerste denaturatie: 30 s bij 95 °C; 30 cycli van: 20 s bij 95 °C (denaturatie), 20 s bij 55 °C (gloeien), 15 s bij 72 °C (verlenging); Eindrek: 2 min bij 72 °C; Houden op 4 °C.
  4. Gebruik het PCR-reactiemengsel in een verdere In Vitro Transcriptie (IVT) reactie.
    1. Bereid het IVT-mastermengsel zoals aangegeven in tabel 2 en incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C. Gebruik een thermocycler voor een consistente temperatuurregeling.
    2. Voeg 2 μL DNase I toe en incubeer nog eens 30 minuten bij 37 °C om de DNA-sjabloon te verwijderen.
    3. Inactiveer DNase I door het reactiemengsel gedurende 5 minuten bij 75 °C te incuberen.
    4. Zuiver RNA met behulp van TRIZOL-reagens volgens het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: Het weggooien van het TRIZOL-reagens en DNAse1, zijn oplossingen of bijproducten moet worden geplaatst in de daarvoor bestemde containers voor chemisch afval.
    5. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (de typische opbrengst van één reactie is 3-5 μg). Controleer de verhoudingen A260/A280 en A260/A230. A260/A280 moet ten minste 2,0 zijn en de A260/A230-verhouding moet ook ten minste 2,0 zijn (wat betekent dat er geen verontreiniging is door eiwitten of organische oplosmiddelen). Bewaar de sgRNA's bij -80 °C tot gebruik.
  5. Bereid het RNP-mengsel voor transfectie voor
    1. De transfectiemengeling bestaat uit een RNP-complex, dat een mengsel van het Cas9-eiwit en sgRNA is. Volg deze stappen om de RNP-mix te bereiden:
    2. Verdun 1 M Tris-HCl (pH 7,5) buffer tot 100 mM met nucleasevrij water en filtreer met een spuitfilter met een poriegrootte van 0,022 μM, aliquoot in porties van 10 μL, en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
    3. In een nucleasevrije buis, bereid de transfectiemix van de volgende componenten in de definitieve concentraties: 500 ng/μL spCas9-nuclease, 80 ng/μL sgRNA, 10 mM Tris-HCl verdund met DEPC-behandeld water.
      OPMERKING: Hoge concentraties van de RNP-mixcomponenten zijn vereist om een goede efficiëntie van het protocol te garanderen.
    4. Incubeer het transfectiemengsel bij 37 °C gedurende 10 minuten om de vorming van het RNP-complex mogelijk te maken.
    5. Verdeel het mengsel in kleine volumes (2 μL) die geschikt zijn voor een enkele I-GONAD-sessie.
    6. Houd de aliquots op 4 °C tijdens de I-GONAD-sessie. De mix wordt vers bereid voor elke I-GONAD elektroporatiesessie om de stabiliteit te behouden.
      OPMERKING: De RNP-mix moet voor elke I-GONAD-sessie vers worden bereid om optimale activiteit en efficiëntie te garanderen.

2. Voorbereiding van vrouwelijke muizen voor genoombewerking via oviductale nucleïnezuurafgifte

  1. Paring en selectie van vrouwelijke muizen: Koppel CD1 vrouwelijke muizen met single-housed CD1 mannelijke muizen 's nachts. Controleer 's ochtends op de aanwezigheid van copulatiepluggen bij de vrouwelijke muizen. Selecteer vrouwtjes met copulatiepluggen en breng ze over naar een nieuwe kooi voor verdere procedures.
    OPMERKING: Om genetisch mozaïcisme tot een minimum te beperken, is de optimale tijd voor het afleveren van het genetische construct 0,7 dagen na de paring in het eencellige (zygote) stadium10. Dit komt ongeveer overeen met 16:00 uur op de dag dat de copulatieplug werd gedetecteerd. In dit stadium onthult dissectie van de eileider dat zygoten minder cumuluscellen hebben, hoewel ze in de ampulla blijven. Met name cumuluscellen kunnen tijdens elektroporatie ook exogene nucleïnezuren of eiwitten opnemen. Als de procedure eerder wordt uitgevoerd, bijvoorbeeld 10 uur na de paring, omringen de cumuluscellen de zygoten nog steeds strak, wat een efficiënte elektroforetische afgifte van nucleïnezuren in de zygoten kan belemmeren. Gebruik de hormonaal gestimuleerde muizen niet, omdat deze een te groot aantal eicellen kunnen geven en dit kan leiden tot een miskraam.
  2. Voorbereiding van chirurgische instrumenten: Autoclaaf alle roestvrijstalen chirurgische instrumenten om de steriliteit te garanderen.
  3. Anesthesie en voorbereiding van muizen: Weeg de geselecteerde vrouwelijke muizen en verdoof ze via intraperitoneale injectie met een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
    1. Controleer de muizen op verlies van de teenknijpreflex om voldoende anesthesie te bevestigen. Plaats de verdoofde muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur tijdens de procedure op peil te houden. Bescherm de ogen van de muis tegen uitdroging tijdens de anesthesie door veterinaire zalf aan te brengen.

3. Chirurgische ingreep

  1. Desinfecteer het dorsale (rug) gebied van de muis met 70% ethanol.
  2. Maak een longitudinale huidincisie van 0,7 cm in de onderrug.
  3. Veeg de incisieplaats af met een wattenschijfje gedrenkt in 70% ethanol en verwijder alle haren rond de incisie.
  4. Verleng de incisie tot 1,3 cm door zijwaarts te duwen met licht geopende schaarpunten.
  5. Maak voorzichtig een kleine incisie (0,7 cm) in het buikvlies om toegang te krijgen tot de buikholte.
  6. Verleng de incisie tot 1,1 cm door zijwaarts te duwen met licht geopende schaarpunten.
  7. Zoek het vetkussentje dat aan de eierstok is bevestigd en trek het er voorzichtig uit met een tang totdat de eierstok, eileider en baarmoeder duidelijk zichtbaar zijn.
  8. Zet het vetkussen op zijn plaats met behulp van een vaatklem.
  9. Visualiseer de eileider onder een stereoscopische microscoop voor nauwkeurige manipulatie (Figuur 1).
  10. Laad 2 μL van het injectiemengsel in een plastic capillair met behulp van een stripperpipettor.
    OPMERKING: De Stripper Pipettor met plastic haarvaten, oorspronkelijk ontworpen voor manipulaties met embryo's in IVF-klinieken, kan meerdere toepassingen ondersteunen, waaronder embryotransfer en CRISPR/Cas9-constructtoediening in I-GONAD-procedures. De pipettor functioneert als een precisie vloeistofdispenser; In combinatie met flexibele wegwerpcapillairen maakt het steriliteit mogelijk en voorkomt het kruisbesmetting. Plastic haarvaten hebben de voorkeur boven glas voor het injecteren van RNP-mix voor transfectie in de eileider, omdat ze minder traumatisch zijn voor delicate weefsels. In tegenstelling tot glazen capillairen, hoeven plastic wegwerpcapillairen niet vlam te worden gepolijst om scherpe randen glad te strijken voordat ze worden ingebracht, waardoor de voorbereidingstijd en het risico op beschadiging worden verkort.
  11. Maak met een microschaar een kleine incisie (0,2 cm) in de eileiderwand enkele millimeters stroomopwaarts van de ampulla.
  12. Steek de stripper pipettor met plastic capillair voorzichtig in de incisie en verwijder het injectiemengsel in de eileider.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen lucht in de eileider komt, aangezien dit de efficiëntie van elektroporatie kan beïnvloeden.
    Om dit te voorkomen, vult u het injectieplastic capillair met meer injectiemengsel dan nodig is en vermijdt u volledige injectie. Kunststof haarvaten zijn geschikt voor zowel infundibulum transfer als directe eileiderwand dissectie tussen het infundibulum en de ampulla. De directe dissectiemethode van de eileiderwand is mogelijk minder traumatisch dan de overdracht van infundibulum, aangezien de laatste een eerste incisie vereist door het dunne slijmbeursmembraan dat de eileider en het infundibulum bedekt. Bij CD1-muizen is dit membraan sterk gevasculariseerd en het doorsnijden ervan kan lichte bloedingen veroorzaken, wat het zicht kan belemmeren en micro-injectie van het RNP-mengsel kan bemoeilijken.
  13. Verwijder voorzichtig het plastic capillair van de eileider.

4. Elektroporatie en hechten

  1. Schakel de elektroporator in door op de schakelaar op het voorpaneel te drukken.
  2. Stel elektroporatieparameters in: Poringpuls: Spanning: 50 V, Pulslengte: 5 m, Pulsinterval: 50 ms, Aantal pulsen: 3, Vervalsnelheid - 10%, Polariteit: +/-; Overdrachtspuls: Spanning: 10 V, Pulslengte: 50 ms, Pulsinterval: 50 ms, Aantal pulsen: 3, Vervalsnelheid - 40%, Polariteit: +/-; Stroomlimiet: in vivo.
  3. Pak met behulp van de elektroden van het pincet voorzichtig de eileider vast en controleer de weerstandswaarde door op de kΩ-knop op de elektroporator te drukken. Zorg ervoor dat de elektroden voldoende worden samengedrukt zodat de weerstand binnen het optimale bereik van 350-400 Ω blijft.
    OPMERKING: Dit kan worden bereikt door de afstand tussen de twee elektroden aan te passen wanneer de intacte eileider ertussen is ingeklemd.
    1. Druk direct na het meten van de weerstand op de Start-knop om elektroporatie te starten. Deze stap is van cruciaal belang om een efficiënte levering van CRISPR-Cas-componenten in de zygoten4 te garanderen. Wacht tot de Ω-knop een "einde"-signaal weergeeft. Noteer de waarden die worden weergegeven in het kader Metingen.
      OPMERKING: De impedantiewaarde moet ongeveer 250-400 Ω/150-250 mA van de voltage waarde om een optimale balans tussen levensvatbaarheid en overdrachtsefficiëntie te garanderen. Om dit evenwicht te behouden, vermijdt u de bedekking van de eileidergebieden met een stuk nat papier gedrenkt in Dulbecco's gemodificeerde fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), aanbevolen in sommige protocollen, omdat deze stap de weerstand aanzienlijk kan verminderen tot voorbij het optimale bereik. Verminderde weerstand kan de spanning verhogen tot meer dan 250 mA, wat leidt tot celdood.
  4. Nadat de elektroporatie op één eileider is voltooid, plaatst u het voortplantingsstelsel voorzichtig terug in de buikholte. Hecht de incisie met behulp van 4-0 polyglycolzuur chirurgische hechtdraad.
  5. Herhaal de handeling en elektroporatie op de tweede eileider. Eenmaal voltooid, brengt u het voortplantingsstelsel terug naar de buikholte en hecht u de incisie zoals hierboven beschreven.
  6. Monitoring na de procedure: Plaats de muis in een warme (37 °C), maak de kooi schoon voor herstel en controleer totdat deze volledig hersteld is van de anesthesie.
    OPMERKING: Huisvesting de muizen na de operatie in kooien met twee muizen per kooi. Als slechts één muis een operatie heeft ondergaan, geef haar dan een begeleidende vrouwelijke muis. Deze praktijk helpt onnodige stress voor de chirurgische muis te verminderen en bevordert een meer natuurlijke sociale omgeving.

5. Genotypering

  1. Primer ontwerp
    1. Ontwerp voor genotypering primers om een PCR-product met een lengte van 300-600 bp te amplificeren. Primers moeten 18-21 nucleotiden lang zijn met een smelttemperatuur (Tm) van ongeveer 60 °C.
    2. Vermijd sequenties die secundaire structuren of primerdimeren vormen. Gebruik softwaretools zoals PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 of iets dergelijks om de kwaliteit van de primer te garanderen.
    3. Voer een BLAST-zoekopdracht uit in de genoomdatabase van de muis om de specificiteit van de primer te bevestigen en niet-specifieke amplificatie te vermijden11.
      OPMERKING: De volgende primers zijn ontworpen voor genotypering van de doelsequentie: Voorwaartse primer: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTGA-3'; Omgekeerde primer: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', verwachte PCR-productlengte: 320 bp en Tm 62°C. Ontwerp voor Sanger-sequencing een sequencing-primer die 150-200 bp van de Cas9-snijplaats gloeit.
  2. DNA-extractie uitvoeren. Voor snelle DNA-extractie is het Hotshot-isolatieprotocol12 het eenvoudigste.
    1. Verzamel met een oorpons een klein weefselfragment (ongeveer 2 mm) uit het oor van de muis.
    2. Voeg 100 μL lysisbuffer toe (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    3. Incubeer gedurende 60 minuten bij 95 °C en draai het mengsel om de 20 minuten.
    4. Voeg 100 μL neutraliserende buffer toe (40 mM Tris-HCl, pH = 5) en vortex grondig.
    5. Gebruik 1-5 μL van het laatste preparaat voor PCR.
  3. PCR-amplificatie en -sequencing. Bereid het PCR-mastermengsel voor zoals beschreven in tabel 3. Gebruik een proeflezen DNA-polymerase om een hoge betrouwbaarheid te garanderen. Aliquot de master mengen in het vereiste aantal buisjes en voegen genomisch DNA toe.
    OPMERKING: Voeg altijd een wildtype DNA-monster toe als controle voor sequentieanalyse.
  4. Voer de PCR uit voor ROSA26-genotypering . De volgende voorwaarden werden gebruikt: Initiële denaturatie: 30 s bij 95 °C; 28 cycli van: 20 s bij 95 °C (denaturatie), 20 s bij 62 °C (gloeien), 20 s bij 72 °C (verlenging); Eindrek: 2 min bij 72 °C; Houden op 4 °C.
    OPMERKING: Het meegeleverde protocol is nauwkeurig voor ROSA26-locusfragment (geschatte grootte 320 bp) amplificatie met behulp van primers uit stap 1.1.2. Voor een specifiekere en nauwkeurigere versterking beperkt u het aantal versterkingscycli tot 28-30.
  5. Sequencing en analyse
    1. Voer Sanger-sequencing uit van verkregen PCR-fragmenten (stap 5.4).
    2. Analyse van de sequentieresultaten
      OPMERKING: De succesvolle transfectie zal in mozaïekdieren resulteren, die door de totstandkoming van extra sequenties van DNA dichtbij de plaats van de nucleaseknipsel in het sequencing chromatogram kunnen worden geïdentificeerd. Gebruik computationele tools zoals EditCo ICE Analysis of TIDE13 om exacte indels in het genoom te identificeren en te kwantificeren.
      1. Om ICE-analyse te gebruiken, uploadt u eenvoudig de verkregen Sanger-sequencingbestanden (controleer het .ab1-bestand voor de PCR-productsequentie van de muis zonder bewerking en het .ab1-bestand voor het experiment met de PCR-productsequentie van de muis), voert u de gids-RNA-sequentie in en selecteert u de nuclease die in het CRISPR-experiment wordt gebruikt.
        OPMERKING: De ICE-analysetool berekent de algehele bewerkingsefficiëntie en bepaalt de profielen en relatieve abundanties van alle verschillende soorten bewerkingen die in de steekproef aanwezig zijn.
      2. Om TIDE te gebruiken, voert u de gids-RNA-sequentie in, uploadt u de verkregen Sanger-sequencingbestanden (controleer het .ab1-bestand voor de wt-muizen-PCR-productsequentie zonder bewerking en het experiment-.ab1-bestand voor de PCR-productsequentie van experimentmuizen) en vink u parameters aan (in sommige gevallen kunnen geavanceerde instellingen helpen om indels groter dan 10 bp te vinden).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als de elektroporatie succesvol was, zullen de experimentele muizen: (1) een handvol pups baren, en (2) sommige dieren zullen verschillende indels in het genoom hebben. Als de genotyperingsprimers goed zijn ontworpen en het PCR-programma optimaal is, zal het PCR-product op de agarosegel aanwezig zijn als één doorzichtige band van de gewenste grootte. Als de nuclease met succes het doel-DNA knipt, zullen de verkregen dieren waarschijnlijk mozaïek zijn en een reeks indels in het genoom heb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De efficiëntie van het genereren van knock-outmuizen met behulp van de I-GONAD-methode is vergelijkbaar met die van traditionele micro-injectietechnieken. Traditionele methoden omvatten echter het isoleren van zygoten van donorvrouwtjes, het uitvoeren van micro-injecties en het transplanteren van embryo's in de eileiders van pseudo-zwangere vrouwtjes. De I-GONAD-methode daarentegen vereenvoudigt dit proces door genoombewerkingscomponenten rechtstreeks in de eileiders van zwangere vrouwtj...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Auteurs zijn dankbaar voor St Peterburg University Research Park, Center for Molecular and Cell Technologies. Sequencing werd uitgevoerd met behulp van een ABI 3500 xL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, VS) in het Resource Center of Molecular and Cell Technologies, Saint Petersburg State University Scientific Park. De auteurs zijn Maria Rubel dankbaar voor haar hulp bij het redigeren en indienen van de documenten. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Staatsuniversiteit van Sint-Petersburg, onderzoeksproject ID: 129658320, en Luibov Shkodenko werd ondersteund door de Russische Wetenschappelijke Stichting (project 25-26-00247).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,5–5 µL pipette Thermo Scientific4642020
1,5 mL tubeAptaca1003/G
100-1000 µL pipette Thermo Scientific4642090
200 µL tubeAxygenPCR-02-C
20-200 µL pipette Thermo Scientific4642080
2-20 µL pipette Thermo Scientific4642060
4x Gel Loading DyeBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNase I, RNase-free (1 U/µL)Thermo FisherEN0521
dNTP Set, 100 mM SolutionThermo ScientificR0181
DreamTaq Green DNA Polymerase (5 U/µL)Thermo ScientificEP0713
Dulbecco’s modified phosphate-buffered salineSigma AldrichD8537
EditCo ICE Analysishttps://ice.editco.bio/#/accessed on 04.06.2025
EDTA 0,5M solution, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl https://www.ensembl.org/index.htmlaccessed on 09.06.2025
Ethidium bromideBiolabmixEtBr-10
Eye gel drops “Oftagel”URSAPHARM204604
Gel-documenting system ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr accessed on 09.06.2025
Integrated DNA Technologies https://eu.idtdna.comaccessed on 09.06.2025
Microsurgical scissorsMedin URALM124
NEPA21 electroporatorNepa GeneNEPA21With CUY652P2.5X4 electrode
NTP Set, 100 mM SolutionThermo ScientificR0481
OligonucleotidesEvrogendirect order, standard desalting purification
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersion 1.1.21.
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo ScientificF530L
pipette 10 µL tipsUlplastHT-10-960
pipette 1000 µL tipsUlplastHT-1000-576
pipette 200 µL tipsUlplastHT-200-960
Power supply “Elf-4”DNA-technologyPS-400 NEW
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Saline solutionPanEcoP011n
SE-1 horizontal electrophoresis systemHeliconSE-1
Sodium HydroxideSigma-AldrichS5881-500G
Step100 DNA LadderBiolabmixS-8100
Stereomicroscope SMZ1000Nikon5-363376
Stripper micropipetterCooperSurgicalMXL3-STR
Stripper tipsORIGIOMXL3-125
Surgical Needle KMIZ4A1- 0,6×20
Suturing forcepsMedin URALM302.2
Suturing forcepsMedin URALM303
Suturing thread POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
SYNTHEGO Knockout Guide Design https://design.synthego.com/#/accessed on 09.06.2025
T100 amplifierBioRad10014822
T7 RNA polymerase Thermo ScientificEP0111
TBE 10x bufferBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/accessed on 04.06.2025 
Tris hydrochlorideSuzhou Yacoo ScienceSYS-S0005-0.5
Trizma hydrochloride solutionSigma AldrichT2663
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
TrueCut Cas9 ProteinInvitrogenA36499
Universal scissorsMedin URALM147
XylazineInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilVirbac Lab2000443714739.00

Referenties

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9ribonucleoprote necomplexelektroporatie van zygoteSanger sequencingontwerp van gids RNAPCR genotypering

Gerelateerde artikelen