Methodenartikel

Navigeren door de op massaspectrometrie gebaseerde proteomische gegevens met behulp van gratis computationele tools

DOI:

10.3791/68707

⸱

19 augustus 2025

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op massaspectrometrie gebaseerde proteomische gegevens zijn beschikbaar in open databases en toegankelijk met behulp van gratis tools. Gezien de complexiteit van het doorzoeken en beschrijven van databases, missen veel biologen de kennis om deze datasets te gebruiken. Hier bieden we een gids over het gebruik van gratis tools voor het doorzoeken van basisproteomische gegevens.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics-gegevens, waaronder Data-Dependent Acquisition (DDA) en Data-Independent Acquisition (DIA), worden veel gebruikt in biologisch onderzoek. De toepassing van deze datasets in validatiestudies is echter nog steeds beperkt vanwege het ontbreken van duidelijke demonstraties over hoe proteomische gegevens effectief kunnen worden gezocht en geanalyseerd. Om deze leemte op te vullen, hebben we één DDA- en één DIA-dataset geselecteerd die is gedeponeerd in de PRoteomics IDEntifications Database (PRIDE) datarepository om de workflow voor proteomische data-analyse en de downstream nabewerking van eiwitzoekresultaten beter te illustreren. Voor demonstratiedoeleinden hebben we twee gratis computationele tools gebruikt: FragPipe (v22.0) voor DDA-datasets en DIA-NN (2.1.0) voor DIA-datasets. Nabewerkingsstappen, zoals het genereren van vulkaandiagrammen en lijsten van ontregelde eiwitten, werden gedemonstreerd met behulp van R-code. Deze studie biedt basisprotocollen voor het zoeken en analyseren van proteomische gegevens, die dienen als een essentiële beginnershandleiding om effectief met proteomische datasets om te gaan. Door dit werk willen we onderzoekers de kennis geven die nodig is om proteomische gegevens te gebruiken in hun biologisch onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebied van proteomics heeft een revolutie teweeggebracht door de wijdverbreide acceptatie van open access gegevensopslagplaatsen en vrije softwaretools1, die een belangrijke rol hebben gespeeld bij het bevorderen van onderzoekscapaciteiten en het bevorderen van een cultuur van gegevensuitwisseling. De oprichting van gecentraliseerde bronnen, zoals PRIDE2, en de ontwikkeling van gestandaardiseerde gegevensformaten door het Proteomics Standards Initiative (PSI)3 van de Human Proteome Organization (HUPO) hebben een ongekende kans gecreëerd voor hergebruik en integratie van gegevens. De analyse en interpretatie van proteomische gegevens vormen echter nog steeds aanzienlijke technische barrières, met name voor biologen en arts-wetenschappers die orthogonale validatie van hun eigen experimentele resultaten willen uitvoeren4. Dit manuscript pakt deze uitdaging direct aan door een leverancier-agnostische computationele workflow te presenteren om een toegankelijk kader te bieden voor onderzoekers om onafhankelijk openbare proteomics-gegevens op te vragen, te analyseren en te integreren met hun eigen bevindingen, waardoor robuuste orthogonale validatie mogelijk wordt zonder de noodzaak van extra wet-lab-experimenten. Dit werk is met name geschikt voor onderzoekers die de differentiële expressie van specifieke eiwitten die in hun eigen experimenten zijn geïdentificeerd, orthogonaal willen valideren en nieuwe hypothesen willen genereren door de expressiepatronen van hun interessante eiwitten te onderzoeken in een breed scala aan gepubliceerde studies. Door een stap-voor-stap handleiding te bieden, willen we een breder scala aan wetenschappers in staat stellen het volledige potentieel van openbare proteomics-gegevens te benutten, en uiteindelijk de robuustheid en impact van hun onderzoek te vergroten.

In op massaspectrometrie (MS) gebaseerde proteomics zijn MS1- en MS2-scans van fundamenteel belang voor gegevensverzameling. MS1-scans, of surveyscans, detecteren en meten de massa-tot-lading (m/z) verhoudingen van alle ionen in een monster, waardoor een uitgebreid overzicht wordt verkregen van de ionenpopulatie5. MS2-scans, ook wel fragmentatiescans genoemd, omvatten het isoleren en fragmenteren van specifieke voorloperionen die uit de MS1-scan zijn gekozen, waarbij fragmentionenspectra worden gegenereerd voor peptide-identificatie6.

Data-dependent acquisition (DDA) selecteert de meest voorkomende ionen uit MS1-scans voor MS2-fragmentatie, waardoor eenvoudigere spectra worden geproduceerd die de analyse stroomlijnen. DDA kan echter leiden tot stochastische bemonstering en ontbrekende waarden in complexe monsters, waardoor de reproduceerbaarheid wordt beperkt7. Daarentegen fragmenteert data-onafhankelijke acquisitie (DIA) systematisch alle ionen binnen vooraf gedefinieerde m/z-vensters , waardoor een uitgebreide dekking wordt gegarandeerd en ontbrekende waarden worden geminimaliseerd. Dit verbetert de kwantitatieve nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid8, hoewel DIA geavanceerde rekenhulpmiddelen vereist om zijn zeer complexe MS2-spectra9 te deconvolgeren.

PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride)2is een toonaangevende repository binnen het ProteomeXchange Consortium (https://www.proteomexchange.org)10, een wereldwijd platform voor het delen van proteomics-gegevens. Gebruikers kunnen efficiënt door deze enorme bron navigeren met behulp van zoekopdrachten op trefwoorden om interessante datasets te vinden.

DIA-NN11, een softwaresuite die gebruikmaakt van diepe neurale netwerken, is een gouden standaardtool voor het analyseren van data-onafhankelijke acquisitie (DIA) proteomics-gegevens. Het blinkt uit in identificatie- en kwantificeringsnauwkeurigheid, waardoor het bijzonder effectief is voor het verwerken van complexe DIA-datasets12. Voor data-afhankelijke acquisitie (DDA) workflows biedt MSFragger13, geïntegreerd in de FragPipe-pijplijn, ultrasnelle peptide-identificatie. De innovatieve benadering van fragment-ionenindexering maakt snelle spectrale matching mogelijk en presteert meer dan 100 keer sneller dan traditionele tools.

Uitgerust met deze uitgebreide databases en geavanceerde tools, kunnen onderzoekers proteomische gegevens gemakkelijk hergebruiken voor validatie van verschillende studies en nieuwe biologische ontdekkingen. Deze toegankelijkheid heeft geleid tot de identificatie van talrijke eiwitbiomarkers voor diverse ziekten14,15, een betere prognosevoorspelling16 en een classificatie van moleculaire subtypes op basis van proteomische profielen17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zie Figuur 1voor een overzicht van de workflow en Materiaaltabel voor gedetailleerde beschrijvingen van de gebruikte software.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de onderzoeksopzet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbeeld van bestands- en software-instellingen

OPMERKING: Alle applicaties zijn gratis voor individueel onderzoeksgebruik en kunnen op een pc worden uitgevoerd (Windows en Linux worden ondersteund).

  1. Maak een nieuwe map voor een project.
  2. Download JMU_LM2_8526_55.raw, JMU_LM2_8568_51.raw, JMU_LM2_8696_37.raw, JMU_LM2_2112_87.raw, JMU_LM2_2195_91.raw, JMU_LM2_2377_73.raw, 20150127_liver_XH03_T_01.raw, 20150127_liver_XH03_T_02.raw, 20150127_liver_XH03_T_03.raw, 20150127_liver_XH03_P_01.raw, 20150127_liver_XH03_P_02.raw, 20150127_liver_XH03_P_03.raw van PRIDE.
    OPMERKING: De twee groepen bestanden kunnen afzonderlijk van https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 en https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 worden gedownload (Afbeelding 2).
  3. Download en installeer de benodigde softwaretools.
    1. Download de nieuwste versie van DIA-NN als .msi bestand. DIA-NN is gratis beschikbaar als .msi-bestand voor Windows of .zip-bestand voor Linux vanaf https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
    2. Download de nieuwste versie van MSFileReader als een .exe bestand. MSFileReader is vrij beschikbaar als een .exe bestand van https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe, dat nodig is om onbewerkte geformatteerde Thermo Fisher DIA-gegevens te verwerken.
    3. Download de nieuwste versie van .NET SDK als een .exe bestand. .NET SDK is vrij beschikbaar als een .exe-bestand van https://dotnet.microsoft.com/en-us/download, dat in Windows vereist is om MSFileReader uit te voeren.
    4. Download de nieuwste versie van FragPipe als .zip bestand. FragPipe is gratis verkrijgbaar als .zip bestand van https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases. Het zip-bestand met jre wordt aanbevolen omdat het een Java-runtime voor Windows bevat, die nodig is om FragPipe uit te voeren. MSFragger is ingebed in de FragPipe.
  4. Download de nieuwste versie van R- en Rstudio- en R-scriptbestanden uit aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2. R en RStudio kunnen gratis worden gedownload van https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe en https://posit.co/download/rstudio-desktop/.
  5. Pak de gecomprimeerde bestanden uit en klik op de . exe of .msi Files om de applicaties te installeren.

2. DIA-data-analyse met behulp van DIA-NN

  1. Download het referentie proteoom fasta bestand van UniProt. Om het Homo sapiens-referentieproteoom te downloaden (isovorminformatie niet inbegrepen) gaat u naar https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 (Figuur 3A).
  2. Klik op de knop FASTA toevoegen om het referentieproteoombestand in DIA-NN te laden.
  3. Selecteer de twee opties FASTA digest voor bibliotheekvrij zoeken / bibliotheekgeneratie en op deep learning gebaseerde spectra, RT's en lMs-voorspelling onder het deel Precursor-iongeneratie. Klik op de knop Uitvoeren om een voorspelde spectrale bibliotheek te genereren (Figuur 3B).
    1. Zodra het voorspelde spectrale bibliotheekbestand is gegenereerd, kunt u dat opnieuw gebruiken voor andere experimenten binnen dezelfde experimentele acquisitie-instellingen door op de knop Spectral te klikken om de voorspelde bibliotheek toe te voegen.
  4. Schakel de twee opties onder het deel Precursor-iongeneratie uit en klik op de knop Type die overeenkomt met het bestandsformaat onder het invoergedeelte om de DIA-gegevens te laden.
  5. Stel de massanauwkeurigheid en MS1-nauwkeurigheid onder algoritme in op 0,0 ppm.
  6. Pas de instellingen voor het massabereik van de voorloper en het fragment aan onder het onderdeel Voorloper-iongeneratie op basis van de experimentele instellingen.
  7. Behoud de andere standaardinstellingen.
    1. De voorlopergeneratie van DIA-NN maakt gebruik van trypsine/P (splitst na K/R tenzij gevolgd door proline) met 1 gemiste splitsing om gedeeltelijke spijsvertering te modelleren; N-term M-excisie uitschakelen voor niet-canonieke peptiden (bijv. immunopeptidomics) of gemiste splitsingen verhogen tot 2 voor langere peptiden.
    2. Schakel expliciet variabele modificaties in (standaard uitgeschakeld) voor posttranslationele modificatiestudies (PTM) (bijv. Ox (M) voor oxidatie, K-GG voor ubiquitinatie) en breid peptidefilters uit (lengte: 7-30 aa; lading: 1-4+; voorloper m/z: 300-1800) volgens de experimentele instellingen (bijv. lengte: 5-50 aa, lading = 1-6) voor grote PTM's of niet-tryptische digesten.
    3. Algoritme-instellingen maken gebruik van automatische kalibratie (massanauwkeurigheid = 0,0 ppm) voor nauwkeurige massa-uitlijning - overschrijven met handmatige toleranties (bijv. 10 ppm) voor instrumenten met een lage resolutie - en Match Between Runs (MBR) draagt ID's over tussen runs (uitgeschakeld voor heterogene samples).
    4. Neurale netwerkscores vergroten het vertrouwen in de identificatie (behouden tenzij slechte gegevenskwaliteit), terwijl Quant Unlabeled Mass Spectrometry (UMS) zeer nauwkeurige labelvrije kwantificering mogelijk maakt; schakel over naar MS2-kwantificering voor isobare tags (bijv. TMT). Gebruik alleen bibliotheekvrij zoeken met DIA-gegevens met hoge resolutie om de vereisten voor spectrale bibliotheken te omzeilen.
  8. Klik op de knop Uitvoeren . Wacht op resultaten totdat Voltooid wordt weergegeven in de bedieningsinterface die aangeeft dat de run is voltooid (Afbeelding 3C).

3. DDA-gegevensanalyse met behulp van FragPipe

  1. Klik na installatie op het Fragpipe-pictogram in de map ~\FragPipe\fragpipe\bin. Alle afhankelijke instellingen zijn te zien op het tabblad Config. Controleer of de drie modules (MSFragger, IonQuant, diaTracer, DIA-NN en Python) op uw computer staan. Als dit niet het geval is, downloadt u ze door op Downloaden/bijwerken of Downloaden te klikken (Afbeelding 4A).
  2. Schakel over naar het volgende tabblad, Werkstroom. Selecteer Standaard voor de workflow en klik op Workflow laden. Klik op Bestanden toevoegen om bestandspaden toe te voegen. Wijs de naam van het experiment en het bioreplicaatnummer toe onder Bestanden toewijzen of laat het gewoon staan (Afbeelding 4B).
  3. Klik nu op Database en ga naar dat tabblad. Laad een fasta-bestand of download fasta-bestanden volgens de soort van de monsters. Kies tijdens het downloaden de opties Alleen beoordeelde sequenties, Lokvogels toevoegen en Veelvoorkomende verontreinigingen toevoegen voor een eenvoudige uitvoering (Afbeelding 4C).
  4. Klik vervolgens op MSFragger om het tabblad te wijzigen. Kies de standaardconfiguratie van Gesloten zoekopdracht en klik op Laden.
    OPMERKING: De gesloten zoekopdracht is in feite een zoekopdracht naar de wijzigingen die u hebt ingesteld, terwijl de open zoekopdracht alle mogelijke wijzigingen van de gegevens onderzoekt, wat meer tijd en geheugen kost.
  5. Bewaar voor piekovereenkomsten de standaardinstellingen, behalve dat het wordt aanbevolen om Geen te kiezen voor kalibratie en optimalisatie, omdat dit tijd bespaart.
  6. Pas voor de vertering van eiwitten de parameters aan volgens de experimentele omstandigheden. Houd de volgende standaardinstellingen aan (Figuur 5A).
    OPMERKING: De toleranties voor voorlopers en fragmentmassa's (± 20 ppm) definiëren de maximaal toegestane massafout voor het matchen van experimentele spectra met theoretische peptiden, met strakkere waarden die worden aanbevolen voor instrumenten met een hoge resolutie. Enzymregels (strikte trypsine) specificeren splitsingsspecificiteit (na K/R, tenzij gevolgd door P), waarbij gemiste splitsingen (2) gedeeltelijk verteerde peptiden mogelijk maken. Peptidelengte (5-50 residuen) en massafilters (500-5000 Da) sluiten onwaarschijnlijke kandidaten uit. Variabele modificaties (bijv. +15.9949 Da op methionine voor oxidatie, +79.96633 Da op S/T/Y voor fosforylering) maken detectie van chemische veranderingen mogelijk, terwijl Max-combinaties (5) gelijktijdige modificaties per peptide beperken om de zoekruimte te beheren. Max variabele mods per site (bijv. 3 op M) regelt de wijzigingsfrequentie. Gesplitste database verbetert de efficiëntie voor grote proteomen, en isotopenfout (0/1/2) is verantwoordelijk voor verkeerd toegewezen isotopenpieken. Deze instellingen balanceren gezamenlijk gevoeligheid, specificiteit en rekenbelasting bij peptide-identificatie.
  7. Verander naar het tabblad Validatie. Schakel RT voorspellen en Spectra voorspellen uit, wat voor DIA-gegevens is (Figuur 5B).
  8. Klik op het tabblad Quant (MS1). Selecteer MS1 quant uitvoeren en klik op Load Quant defaults. Selecteer IonQuant en behoud de standaardinstellingen (Figuur 6A). Schakel MBR uit voor onstabiele retentietijden of schakel normalisatie van intensiteit uit als er vertekeningen optreden bij wereldwijde schaling; schakel Index op schijf houden in om RAM te besparen met grote gegevenssets.
    OPMERKING: Quant (MS1) is standaard ingesteld om labelvrije kwantificering te optimaliseren met behulp van MaxLPQ (MaxLFQ-based Protein Quantification, een algoritme dat de MaxLFQ-methode uitbreidt naar eiwitgroepen), waarvoor ≥1 uniek ion per eiwit nodig is (verhoging tot ≥2 voor hogere strengheid ten koste van dekking). Match Between Runs (MBR) brengt identificaties over over runs over met behulp van retentietijd (RT) tolerantie (standaard 0,4 min; aandraaien tot 0,2 min voor stabiele chromatografie of losmaken voor gradiëntvariabiliteit) en ionenmobiliteit (IM) tolerantie (standaard 0,05 1/k0 [inverse verminderde mobiliteit]; aanpassen op basis van IM-precisie), gefilterd op ≤1% FDR (False Discovery Rate; standaard MBR-ion FDR=0,01; lager tot 0,005 voor nauwkeurigheid). Eiwitinferentie maakt gebruik van uniquer+rascor (toewijzing van scheermespeptiden voor eiwitgroepering). Kenmerkdetectie maakt gebruik van een massatolerantie van 10 ppm (verhoging tot 20 ppm voor MS met lage resolutie of verlaging tot 5 ppm voor hoge resolutie).
  9. Klik nu op het tabblad Uitvoeren . Selecteer Uitvoermap. Klik op UITVOEREN om te beginnen met het analyseren van de gegevens (Figuur 6B).
    OPMERKING: Voor labelvrije proteomics-gegevens die niet gericht zijn op wijzigingen of die gebruik maken van op labels gebaseerde kwantificering, worden geen PTM's, Glyco en Quant (isobaar) tabbladen gebruikt.

4. DIA-NN/FragPipe stroomafwaartse analyse

OPMERKING: Gedetailleerde codes die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn opgenomen als aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2. De gebruikte pakketversies in dit onderzoek zijn te vinden in Aanvullend Dossier 3.

  1. Open RStudio en lees de eiwitexpressiegegevens die zijn gegenereerd door DIA-NN of FragPipe. Eiwitgroepmatrixgegevens die eindigen op .pg_matrix.tsv van DIA-NN en gecombineerde eiwitgegevens die eindigen op .tsv van FragPipe worden normaal gesproken gebruikt voor analyse.
  2. Verwijder de ontbrekende waarden zonder NA in te vullen en filter de eiwitgroepen eruit die zijn geïdentificeerd en gekwantificeerd met minder dan twee unieke peptiden.
    OPMERKING: De DIA-cijfers in dit onderzoek zijn gegenereerd door gefilterde eiwitgroepen, terwijl de DDA-cijfers afkomstig waren van ongefilterde eiwitgroepen.
  3. Normaliseer eiwitintensiteiten met behulp van mediane schaling of kwantielnormalisatie over monsters. DIA-gegevens in deze studie werden genormaliseerd door mediane normalisatie, terwijl DDA-gegevens door kwantielnormalisatie werden genormaliseerd om de twee methoden beter te demonstreren.
    OPMERKING: De mediane normalisatie is robuust tegen uitschieters en geschikt voor scenario's waarin de meerderheid van de eiwitten ongewijzigd blijft in de monsters, waardoor de mediane eiwitovervloed een stabiel referentiepunt is. Het kan echter mislukken in scenario's met sterk differentieel tot expressie gebrachte eiwitten18. Kwantitele normalisatie zorgt voor een uniforme verdeling van eiwitabundanties over monsters, wat handig is bij het vergelijken van monsters met ongelijksoortige verdelingen. Het is aangetoond dat het de statistische power vermindert en gegevens kan overnormaliseren, waardoor echte biologische verschillen mogelijk worden gemaskeerd18. In proteomics wordt mediane normalisatie veel gebruikt in labelvrije studies om systematische vertekeningen met betrekking tot de prestaties van MS-instrumenten te verwijderen. Kwantitele normalisatie heeft de voorkeur voor grootschalige datasets, differentiële expressieanalyse en clusteranalyse19,20.
  4. Bereken log2-vouwveranderingen (bijv. PDAC-serum versus normaal) en t-test p-waarden. Bereken gecorrigeerde p-waarden met behulp van de Benjamini-Hochberg methode. Definieer significantiedrempels (bijv. |log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0,05).
    OPMERKING: De afkapwaarden p-waarden die in de cijfers van deze studie worden gebruikt, vertegenwoordigen ruwe waarden, aangezien het gebruik van aangepaste p-waarden (p_adj) alle detecteerbare eiwitten binnen de statistische kracht van deze beperkte datasets zou elimineren.
  5. Controleer of er ontbrekende/NA-waarden zijn en sluit ze uit. Genereer een vulkaanplot om belangrijke treffers te visualiseren.
  6. Selecteer significant ontregelde eiwitten. Pas Z-score-normalisatie toe op eiwitexpressiewaarden. Teken een gegroepeerde heatmap met annotaties voor voorbeeldgroepen.
  7. Wijs eiwitten toe aan Entrez-ID's met behulp van org. Hs.eg.db. Voer GO-verrijking (biologisch proces) en KEGG-routeanalyse uit.
    OPMERKING: Categorieën van biologische processen (BP) worden vaak geselecteerd in de analyse van genontologie (GO) omdat ze de grotere processen of biologische programma's beschrijven die worden bereikt door meerdere moleculaire activiteiten20. Deze termen richten zich op cellulaire functies die misgaan bij ziekten zoals kanker, inclusief essentiële processen zoals regulatie van de celcyclus, metabolische processen, enz. Naast BP omvat GO-analyse ook de categorieën Moleculaire Functie (MF) en Cellulaire Component (CC). MF-termen beschrijven de biochemische activiteiten van genproducten, zoals ionentransport of DNA-bindende capaciteiten. CC-termen definiëren de cellulaire locaties waar genproducten hun functies uitvoeren, zoals de kern, het mitochondriale membraan of het cytoskelet.
  8. Query STRINGdb voor interacties (betrouwbaarheidsscore ≥ 400). Genereer een interactief netwerk met behulp van visNetwork.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de zoektocht naar proteomische datasets beter te illustreren, hebben we voor deze analyse twee soorten datasets geselecteerd. Met als doel ontregelde eiwitten in klinische contexten aan te tonen, zochten we in PRIDE op trefwoorden als kliniek. In het bijzonder hebben we een dataset geselecteerd die geschikt is voor DIA-analyse van het Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)21, en een andere die geschikt is voor DDA-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol illustreert proteomische data-analyse door de integratie van gratis tools zoals DIA-NN en FragPipe. Succes hangt af van kritieke stappen zoals nauwkeurige selectie van voorloperionen en massanauwkeurigheidsinstellingen voor het genereren van spectrale bibliotheken in DIA-NN (stap 2.3)27, die instrumentafhankelijk zijn en cruciaal zijn voor volledige peptide-identificatie. Evenzo is een nauwgezette database-instelling in FragPipe (stap 3...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.Z. is de oprichter van Molemuse Biotech Studio.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project wordt ondersteund door Molemuse Biotech Studio.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
.NET SDK v. 9.0.203Microsofthttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN v. 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 Thermo Fisherhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedrioli, P. G. A., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  2. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database at 20 years: 2025 update. Nucl Acids Res. 53 (D1), D543-D553 (2025).
  3. Deutsch, E. W., et al. Proteomics Standards Initiative at Twenty Years: Current Activities and Future Work. J Proteome Res. 22 (2), 287-301 (2023).
  4. Schubert, O. T., Röst, H. L., Collins, B. C., Rosenberger, G., Aebersold, R. Quantitative proteomics: challenges and opportunities in basic and applied research. Nat Protoc. 12 (7), 1289-1294 (2017).
  5. Wang, X., Shen, S., Rasam, S. S., Qu, J. MS1 ion current-based quantitative proteomics: A promising solution for reliable analysis of large biological cohorts. Mass Spectro Rev. 38 (6), 461-482 (2019).
  6. Vaudel, M. MS2-Based Quantitation. Proteome Inform. , 155-177 (2016).
  7. Meyer, J. G. Qualitative and Quantitative Shotgun Proteomics Data Analysis from Data-Dependent Acquisition Mass Spectrometry. Shotgun Proteomics. 2259, 297-308 (2021).
  8. Fröhlich, K., et al. Data-Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry-Based Proteomics. Mol Cell Proteomics. 23 (8), 100800(2024).
  9. Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry-Based Proteomics and Software Tools: A Glimpse in 2020. Proteomics. 20 (17-18), 1900276(2020).
  10. Deutsch, E. W., et al. The ProteomeXchange consortium at 10 years: 2023 update. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1539-D1548 (2023).
  11. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. DIA-NN:neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Meth. 17 (1), 41-44 (2020).
  12. Zhang, F., et al. A Comparative Analysis of Data Analysis Tools for Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 22 (9), 100623(2023).
  13. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nat Meth. 14 (5), 513-520 (2017).
  14. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
  15. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci. 113 (8), E968-E977 (2016).
  16. Cao, L., et al. Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell. 184 (19), 5031-5052.e26 (2021).
  17. Dong, L., et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Cell. 40 (1), 70-87.e15 (2022).
  18. Dubois, E., Galindo, A. N., Dayon, L., Cominetti, O. Comparison of normalization methods in clinical research applications of mass spectrometry-based proteomics. 2020 IEEE Conf Computat Intelligence Bioinfo Computat Biol. , 1-10 (2020).
  19. Dressler, F. F., Brägelmann, J., Reischl, M., Perner, S. Normics: Proteomic Normalization by Variance and Data-Inherent Correlation Structure. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100269(2022).
  20. Dimmer, E. C., et al. The Gene Ontology - Providing a Functional Role in Proteomic Studies. Proteomics. 8 (23-24), pmic.200800002(2008).
  21. Lih, T. M., et al. Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma-Associated Proteins in Serum. Mol Cell Proteomics. 23 (1), 100687(2024).
  22. Chinese Human Proteome Project (CNHPP) Consortium. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 567 (7747), 257-261 (2019).
  23. Kanehisa, M., Furumichi, M., Sato, Y., Matsuura, Y., Ishiguro-Watanabe, M. KEGG: biological systems database as a model of the real world. Nucl Acids Res. 53 (D1), D672-D677 (2025).
  24. Campello, E., Ilich, A., Simioni, P., Key, N. S. The relationship between pancreatic cancer and hypercoagulability: a comprehensive review on epidemiological and biological issues. Br J Cancer. 121 (5), 359-371 (2019).
  25. Fang, L., Xu, Q., Qian, J., Zhou, J. Y. Aberrant Factors of Fibrinolysis and Coagulation in Pancreatic Cancer. OncoTargets Ther. 14, 53-65 (2021).
  26. Vlodavsky, I., Elkin, M., Ilan, N. Impact of heparanase and the tumor microenvironment on cancer metastasis and angiogenesis: basic aspects and clinical applications . Rambam Maimonides Med J. 2 (1), (2011).
  27. Fröhlich, K., et al. Benchmarking of analysis strategies for data-independent acquisition proteomics using a large-scale dataset comprising inter-patient heterogeneity. Nat Comm. 13 (1), 2622(2022).
  28. Polasky, D. A., et al. MSFragger-Labile: A Flexible Method to Improve Labile PTM Analysis in Proteomics. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100538(2023).
  29. Gerault, M. A., Camoin, L., Granjeaud, S. DIAgui: a Shiny application to process the output from DIA-NN. Bioinfo Adv. 4 (1), (2024).
  30. Hsiao, Y., et al. Analysis and Visualization of Quantitative Proteomics Data Using FragPipe-Analyst. J Proteome Res. 23 (10), 4303-4315 (2024).
  31. Yu, F., Deng, Y., Nesvizhskii, A. I. MSFragger-DDA+ enhances peptide identification sensitivity with full isolation window search. Nat Comm. 16 (1), 3329(2025).
  32. Li, K., Teo, G. C., Yang, K. L., Yu, F., Nesvizhskii, A. I. diaTracer enables spectrum-centric analysis of diaPASEF proteomics data. Nat Comm. 16 (1), 95(2025).
  33. Qiao, R., Li, H., Bian, H., Xin, L., Shan, B. De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery. Biorvix. 10, (2025).
  34. Meissner, F., Geddes-McAlister, J., Mann, M., Bantscheff, M. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Disc. 21 (9), 637-654 (2022).
  35. Zheng, Y., et al. Multi-omics data integration using ratio-based quantitative profiling with Quartet reference materials. Nat Biotechnol. 42 (7), 1133-1149 (2024).
  36. Bubis, J. A., et al. Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity. Nat Meth. 22 (3), 510-519 (2025).
  37. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100129(2021).
  38. Schneider, M., et al. A Scalable, Web-Based Platform for Proteomics Data Processing, Result Storage and Analysis. Proteome Res. 24 (3), 1241-1249 (2025).
  39. Jalili, V., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2020 update. Nucl Acids Res. 48 (W1), W395-W402 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Proteomische data analysedata afhankelijke acquisitiedata onafhankelijke acquisitieprote nekwantificeringvolcano plotGene Ontology analyseKEGG pathwayanalyseprote ne interactienetwerk

Gerelateerde artikelen