Optimaliseren en evalueren van handtekenen en nat spinnen voor de productie van recombinante spinragvezels

Anupama Ghimire; Hina Batool; Sara Evans; Suad Rashid; Donovan L. Rainey; Andrew A. Y. Chen; Xiang-Qin Liu; Jan  K. Rainey

doi:10.3791/68714

Methodenartikel

Optimaliseren en evalueren van handtekenen en nat spinnen voor de productie van recombinante spinragvezels

DOI:

10.3791/68714

⸱

29 juli 2025

Anupama Ghimire^*¹ , Hina Batool^*¹ , Sara Evans^*² , Suad Rashid^*¹ , Donovan L. Rainey¹ , Andrew A. Y. Chen¹ , Xiang-Qin Liu¹ , Jan K. Rainey¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, ²Department of Chemistry, Dalhousie University, ³School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol biedt een veelzijdige reeks methoden om de oplosbaarheid van recombinante zijde-eiwitten voor spinnen te optimaliseren; de spinbaarheid testen door met de hand te tekenen; produceer lange, continue vezels met geautomatiseerd nat spinnen; en evalueer vergelijkend morfologie, moleculaire uitlijning, mechanisch gedrag en secundaire structurele eiwitinhoud van of in vezels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinrag staat bekend om hun mechanische eigenschappen, met als kenmerk hoge sterkte, hoge rekbaarheid of een combinatie hiervan die leidt tot een hoge taaiheid. Een typische vrouwelijke wielwevende spin produceert zeven verschillende soorten zijde, elk meestal gesponnen van typespecifieke eiwitten en mechanisch op maat gemaakt voor een duidelijke overlevingsfunctie. De productie van recombinant spinrag biedt een veelbelovende route om deze materialen te verkrijgen, waardoor uitdagingen bij het verkrijgen van grote hoeveelheden natuurlijke zijde worden omzeild en voordelen worden geboden bij het mogelijk maken van eiwitaanpassing, bijvoorbeeld door plaatsgerichte mutagenese of fusie-eiwitconstructie.

In het gepresenteerde protocol schetsen we een methodologie voor het evalueren van de geschiktheid van eiwitten voor spinnen door middel van zowel handtekenen als nat spinnen. Beginnend met een geschikt gezuiverd gevriesdroogd eiwitpoeder, worden methoden voor het optimaliseren van de initiële opgeloste eiwittoestand om een "spinning dope"-toestand met hoge concentratie te bieden, gedetailleerd. Vervolgens worden benaderingen voor handmatig tekenen en nat spinnen vergeleken, inclusief een discussie over methoden om vezelgedrag te moduleren met behulp van een trekking na het spinnen als onderdeel van het spinproces. Een typische workflow om de resulterende zijdevezels te karakteriseren en een beslissing te nemen over welke spinomstandigheden het meest waarschijnlijk vruchtbaar zijn, wordt vervolgens gedetailleerd, inclusief optische microscopie om de vezeldiameter en de uniformiteit ervan te evalueren; gepolariseerde lichtmicroscopie om de mate van (supra)moleculaire uitlijning in de vezel te schatten; trektesten om sterkte, rekbaarheid, Young's modulus en taaiheid te evalueren; en Fourier-transformatie infrarood (FTIR) spectromicroscopie om de secundaire structurering van eiwitten in de vezel te evalueren.

Dit protocol is geschikt gebleken voor verschillende recombinante spinrageiwitten op basis van repetitieve en niet-repetitieve domeinen van aciniforme (wikkel)zijde; pyriforme zijde; en fusie-eiwitten bestaande uit aciniforme, pyriforme en/of zijde met grote ampullaten (dragline). Bredere toepasbaarheid wordt geboden door verschillende gemarkeerde stappen waarbij de omstandigheden en parameters kunnen worden gevarieerd om aan te sluiten bij het gedrag van een individueel eiwit en om verschillen in functionele uitkomst te bereiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinnen produceren zijde voor verschillende gespecialiseerde taken, waaronder webconstructie, het vangen van prooien en het beschermen van eieren¹. Spinrag vertoont uitstekende mechanische eigenschappen die die van de meeste bekende natuurlijke en synthetische materialen overtreffen², wat leidt tot aanzienlijke inspanningen voor de productie van technische en verbeterde spinragmaterialen voor diverse industriële en biomedische toepassingen. Spidroin, het eiwit dat spinrag vormt, is samengesteld uit een relatief groot, repetitief domein begrensd door niet-repetitieve N-terminale en C-terminale domeinen³, waarbij de unieke mechanische eigenschappen van sommige zijdesoorten in verband zijn gebracht met de herhaling van korte motieven binnen het repetitieve domein ^4,5,6. In tegenstelling tot de commercieel gekweekte moerbeizijderups (Bombyx mori), die grote hoeveelheden zijde produceert in een consistent coconformaat dat geschikt is om te oogsten, zijn spinnen inherent kannibalistische en territoriale organismen die zijde in beperkte hoeveelheden produceren, waardoor ze een uitdaging vormen voor de landbouwproductie en -verzameling⁷. Gezien deze beperkingen is de productie van recombinant spinrag ontwikkeld als een haalbaarder en duurzamer alternatief om gecontroleerd voldoende hoeveelheden spinrag te verkrijgen voor toepassing.

De productie van recombinant spinrag vereist de selectie van een geschikte gastheer voor eiwitexpressie. Spinrag is tot expressie gebracht in verschillende gastsystemen, waaronder bacteriën ^8,9, gisten^10,11, insectencellen¹², planten^13,14 en zoogdiercellen^15,16, waarbij Escherichia coli het meest gebruikte gastheersysteem is. De hoge molecuulgewichten van spidroins, die kunnen oplopen tot 700 kDa⁷, vormen aanzienlijke uitdagingen voor de expressie van constructies van volledige lengte. Om recombinant spinrag te produceren met vergelijkbare of verbeterde eigenschappen ten opzichte van die van natuurlijk spinrag, is de primaire strategie die wordt gebruikt de expressie van afgekapte varianten, zoals constructies met een beperkt aantal herhalingseenheden (met of zonder niet-repetitieve domeinen), chimaera's bestaande uit combinaties van verschillende zijdesoorten en hybride zijde versmolten met niet-zijde-eiwitten. Recombinant major ampullaat spidroin (284,9 kDa) werd bijvoorbeeld met succes tot expressie gebracht in een metabolisch gemanipuleerde E. coli, en de resulterende zijde vertoonde mechanische eigenschappen die vergelijkbaar waren met die van natuurlijke major ampullate zijde⁹. Bovendien vertoonde een gemanipuleerde zijdevezel bestaande uit twee herhalingseenheden van pyriform spidroin en twee herhalingseenheden van aciniform spidroin een superieure rekbaarheid ten opzichte van een van de samenstellende pyriforme of aciniforme zijden, vergelijkbaar met die van natuurlijke flagelliforme zijde¹⁷.

De productie van recombinante eiwitten maakt het ook mogelijk om functionele peptiden of eiwitsegmenten eenvoudig in zijde-eiwitten op te nemen, waardoor biomaterialen kunnen worden vervaardigd met eigenschappen die zijn afgestemd op specifieke toepassingen. De genetische en chemische fusie van RGD-celbindende motieven met een genetisch gemanipuleerde zijde afgeleid van grote ampullaatspidroins resulteerde bijvoorbeeld in films die de adhesie en proliferatie van fibroblasten aanzienlijk verbeterden¹⁸. In een afzonderlijke studie werd aangetoond dat een hybride zijdeconstructie bestaande uit een zenuwgroeifactor-β (NGF)-bindend motief gefuseerd met een chimeer eiwit bestaande uit twee herhalingseenheden van aciniform spidroin en het C-terminale domein van een major ampullate spidroin werd aangetoond dat het de groei en differentiatie van neuronenachtige cellen ondersteunt¹⁹.

Bij succesvolle expressie en zuivering van een recombinant zijde-eiwit kan het vervolgens worden verwerkt tot verschillende vormen, zoals hydrogels, films, vezels, nanodeeltjes, schuimen en sponzen, afhankelijk van de beoogde toepassing^20,21. Om de productie van kunstmatige zijdevezels mogelijk te maken, zijn spinmethoden ontwikkeld die bepaalde aspecten van het zeer complexe en strak gereguleerde natuurlijke vezelspinproces van spinnen imiteren. In natuurlijke zijde met grote ampullaten worden spidroins geproduceerd door epitheelcellen in de grote ampullaatklier en opgeslagen in een oplosbare toestand in het lumen in hoge concentraties (tot 50% (w/v))²², waardoor een waterige draaiende dope wordt gevormd. Terwijl de draaiende dope door het draaiende kanaal beweegt, ervaart het veranderingen in pH, ionenconcentratie, watergehalte en schuifkrachten van zowel de vernauwing van het kanaal als het vezelpultrusieproces, dat de transformatie van vloeibare zijde-eiwitten in vaste vezels induceert^23,24. De identificatie van een geschikt oplosmiddel dat recombinante zijde-eiwitten in hoge concentratie kan oplossen of suspenderen om een draaiende dope te vormen, is daarom een cruciale eerste stap in het proces van het spinnen van kunstmatige vezels.

Er is een breed scala aan oplosmiddelen gebruikt voor de formulering van dopes voor het spinnen van zijde-eiwit, en het is aangetoond dat de keuze van het oplosmiddel van invloed is op de vezelvorming en mechanische eigenschappen^25,26. Daarom is een zorgvuldige afweging van de selectie van dope-oplosmiddelen essentieel om de resulterende vezeleigenschappen te optimaliseren. Draaiende dopes kunnen worden geformuleerd met behulp van organische of waterige oplosmiddelen, zoals 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol (HFIP)²⁷, hexafluoraceton (HFA)²⁸, mengsels van trifluorazijnzuur (TFA) en 2,2,2-trifluorethanol (TFE)²⁶, mierenzuur²⁹ en natriumfosfaat/Tris-buffer³⁰. Aangezien de oplosbaarheid van eiwitten doorgaans wordt beïnvloed door factoren zoals pH, ionische sterkte en concentratie, omvat de identificatie van een geschikt dope-oplosmiddel over het algemeen systematische evaluatie van verschillende oplosmiddelen, optimalisatie van pH- en eiwitconcentraties en in sommige gevallen het gebruik van oplosmiddel-watermengsels om optimale omstandigheden voor draaiende dope te bepalen. Bovendien is de viscositeit van de draaiende dope een belangrijke parameter om voorafgaand aan het spinproces te beoordelen, omdat een zeer viskeuze dope-oplossing de vloeistofstroom tijdens het centrifugeren kan belemmeren, terwijl een onvoldoende viskeuze dope doorgaans niet geschikt is voor vezelvorming^31,32. Opgemerkt moet worden dat het gebruik van barre spin-dope-omstandigheden de eiwitstructuur kan veranderen bij langdurige blootstelling; Daarom blijft de ontwikkeling van milieuvriendelijke dope-oplosmiddelen een actief onderzoeksgebied.

Met de hand tekenen en nat spinnen zijn twee veelgebruikte methoden voor het spinnen van recombinante zijdevezels. De mechanische eigenschappen van de vezels die met elke methode worden geproduceerd, zijn sterk afhankelijk van zowel de spinomstandigheden zelf als van de verwerking na het centrifugeren. Met de hand tekenen, ook wel trekspinnen genoemd, is een eenvoudige vezelproductiemethode waarbij vezels worden getrokken uit oplossingen van gezuiverde eiwitten, normaal gesproken met behulp van een pipetpunt, tang of pincet, gevolgd door luchtdroging en karakterisering 33,34,35,36,37. Hoewel met de hand tekenen een uitstekende benadering biedt om snel een verscheidenheid aan zijdevezelvormingsomstandigheden te screenen en in het algemeen het resulterende mechanische vezelgedrag te classificeren, is deze techniek niet gemakkelijk schaalbaar naar lange (d.w.z. meerdere meter lengte) continue vezels. Als alternatief gebruiken we natdraaien, waarbij continue extrusie van een draaiende dope met een constante snelheid in een stollingsbad wordt toegepast, meestal een waterig of organisch oplosmiddel dat bestaat uit een mengsel van water en ethanol of methanol 9,15,31,38,39,40 . De onderdompeling van de draaiende dope in het stollingsbad veroorzaakt een snelle eiwitoplossing, wat resulteert in de vorming van continue vezels²⁴. Vervolgens worden vezels met een constante snelheid uit het stollingsbad getrokken, ofwel afgestemd op de extrusiesnelheid om as-spun (AS) vezels te leveren of onderworpen aan een post-spin trekking om post-spun (PS) vezels te leveren die doorgaans verbeterde mechanische eigenschappen hebben. De trekking na het centrifugeren omvat meestal het uitrekken van vezels tot een verhouding van 2-8x hun oorspronkelijke lengte in lucht, in een oplosmiddel of na onderdompeling in het oplosmiddel, waarbij elke parameter bijdraagt aan specifieke mechanische eigenschappen 15,17,31,38.

Hoewel dit protocol zich richt op methoden voor handmatig tekenen en nat spinnen, is het belangrijk om deze methoden in context te plaatsen. Er zijn elektrospinmethoden gerapporteerd voor recombinant spinrag uit zowel waterige als organische omstandigheden, waardoor de productie van vezelmatten, uitgelijnde vezels en garens mogelijk is, waarbij vezels doorgaans op nanometerschaal zijn met een diameter^{van 41}. Dit biedt het potentiële voordeel van vezels op nanoschaal, en een overeenkomstige uitdaging als vezels op micronschaal gewenst zijn, meestal met een vereiste om verwerking na het centrifugeren uit te voeren om transformatie naar een structuur met β vellen te induceren om de mechanica en watercompatibiliteit te verbeteren. Multi-meter recombinante spinraglinten met een breedte en dikte op micronschaal zijn verkregen door droog spinnen van organisch oplosmiddel⁴², met recente demonstratie dat de opname van metaalionen in het spindope-stadium de mechanica verbetert⁴³. Op microfluïdica gebaseerd spinnen⁴⁴, inclusief een recente combinatie van 3D-printtechnologie met micronaaldspintepels die zijn ontworpen om de natuurlijke spindop⁴⁵ na te bootsen, is geschikt voor zeer controleerbaar recombinant spinnen van zijdevezels. Ondanks de grote verscheidenheid aan methoden die naar verluidt geschikt zijn voor de productie van zijde (of zijdeachtige) vezels, beschrijft het huidige protocol de productie van recombinante zijdevezels door met de hand te tekenen en nat te spinnen, aangezien deze methoden vertaalbaar zijn gebleken naar verschillende recombinante zijdevarianten in onze handen en een hanteerbaar uitgangspunt bieden voor de ontwikkeling van biomaterialen en vergelijkende evaluatie.

Na het spinnen en verzamelen van vezels wordt routinematig een combinatie van optische, mechanische en spectroscopische technieken gebruikt om de eigenschappen na het spinnen te karakteriseren. Elke methode biedt belangrijke inzichten in het vezelvormingsproces en de correlatie met materiaalprestaties. Hier richten we ons op een subset van deze methoden, waarbij we opmerken dat er veel andere methodologieën zijn die belangrijke informatie verschaffen over de eigenschappen en prestaties van zijdevezels. Optische microscopie wordt gebruikt om de vezelmorfologie te beoordelen, waardoor de diameters van gesponnen vezels onder zowel identieke als variërende omstandigheden kunnen worden vergeleken 17,31,38,46. Deze techniek is ook belangrijk voor het identificeren en elimineren van vezelsegmenten met defecten of anomalieën vóór latere karakterisering. Bovendien kan gepolariseerde lichtmicroscopie worden gebruikt om de mate van moleculaire uitlijning in de vezel te evalueren, aangezien hogere niveaus van uitlijning doorgaans worden geassocieerd met verbeterde mechanische eigenschappen 17,26,47. Mechanische karakterisering wordt uitgevoerd door middel van trekproeven, waarbij spanning-rekcurven worden gemeten en gebruikt om parameters zoals treksterkte, rekbaarheid, Young's modulus en taaiheid te kwantificeren, wat essentiële informatie oplevert om de geschiktheid van vezels in structurele of biomedische toepassingen te evalueren 17,33,48. De laatste techniek die hier wordt behandeld, Fourier-transform infrarood (FTIR) spectromicroscopie, wordt toegepast om de secundaire structuur van eiwitten te onderzoeken, met name de mate van vorming van β-vellen, aangezien dit een cruciale rol speelt bij de stabiliteit en mechanische sterkte^{van de vezels} 17,46,49. Samen zorgen deze technieken voor een uitgebreid begrip van de morfologie, structuur en mechanisch gedrag van recombinant geproduceerde zijdevezels.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol gaan we ervan uit dat het uitgangspunt een gevriesdroogd zijdeproteïnepoeder is. Dit zou meestal een recombinant spinnenzijde-eiwit zijn in ons werk. Een overzicht van het protocol wordt gegeven in figuur 1, met elk van de volgende vijf stappen die hieronder worden beschreven: (1) bereiding en optimalisatie van spinning dope; (2) zijdevezel met de hand tekenen of nat spinnen; (3) vezeldiameter en morfologische evaluatie door optische microscopie; (4) mechanische evaluatie door middel van trekproeven; en (5) evaluatie van de secundaire structuur door middel van FTIR-spectromicroscopie.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de belangrijkste stappen in het protocol voor de productie, verzameling en karakterisering van recombinante spinrag-eiwitvezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Spinning dope voorbereiding en optimalisatie

OPMERKING: Voor optimalisatie van de vezelspinnende dope-oplossing, probeer verschillende concentraties recombinant spinrageiwit in verschillende oplosmiddelen op te lossen om dope-oplossingen te bereiden (Tabel 1). Alleen de oplosmiddelen die het eiwit oplossen, waardoor een neerslagvrije en heldere dope-oplossing ontstaat, mogen worden gebruikt voor pogingen tot vezelspinning.

Bereiding van oplosmiddelen
1. Om 8:1:1 TFA/TFE/H₂O te maken, meet u 800 μL TFA, 100 μL TFE en 100 μL type 1 ultrapuur water af in een glazen buis in een zuurkast. Meng alle componenten grondig. Sluit de glazen buis af en bedek deze met parafilm om verdamping van vluchtige componenten te voorkomen.
  OPMERKING: Bereid altijd een verse oplossing voor het spinnen van vezels.
  LET OP: Ga voorzichtig om met TFA en TFE, TFA is zeer corrosief en vluchtig, terwijl TFE ontvlambaar en giftig is. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, laboratoriumjassen en veiligheidsbrillen, om contact met de huid en de kans op inademing te voorkomen.
2. Om 3:1:1 TFA/TFE/H₂O te maken, brengt u in een zuurkast 300 μL TFA, 100 μL TFE en 100 μL ultrapuur water van type 1 over in een glazen buis en mengt u de componenten. Sluit de glazen buis af en bedek deze met parafilm om verdamping van vluchtige componenten te minimaliseren.
  OPMERKING: Bereid altijd een verse oplossing voor het spinnen van vezels.
3. Om 7:3 HFIP/H₂O te maken, mengt u 700 μL 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) met 300 μL ultrapuur water type 1 om een oplossing van 1 ml te maken. Bereid de oplossing vers wanneer dat nodig is.
  LET OP: Hanteer HFIP in een zuurkast en vermijd inademing of huidcontact.
4. Om 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,5) te maken, neemt u 800 ml gedeïoniseerd water in een bekerglas en lost u 1,199 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH₂PO_4-MW) op. 136. 09 g/mol) en 7.173 g kaliumfosfaat dibasisch (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) erin. Meng alle componenten grondig en pas de pH van de oplossing aan met NaOH of HCl. Vul het volume aan tot 1 L met gedeïoniseerd water en bewaar bij kamertemperatuur.
5. Om 10 mM Tris-Cl buffer (pH 8,0) te maken, lost u 1,21 g Tris-hydrochloride (MW. 157,60 g/mol) op in 800 ml gedeïoniseerd water. Pas de pH aan met NaOH en vul het uiteindelijke volume bij tot 1 L met gedeïoniseerd water. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
6. Om 20 mM Na-acetaatbuffer (pH 5,0) te maken, lost u in 450 ml gedeïoniseerd water 0,55 g natriumacetaat (MW. 82,03 g/mol) en 0,02 M (6 ml) azijnzuur op. Vul het volume bij tot 500 ml met gedeïoniseerd water en bewaar het bij kamertemperatuur.
7. Om 1 M citraatfosfaatbuffer (pH 7,0) te maken, lost u 11,69 g dinatriumwaterstoffosfaat (Na₂HPO_4-MW. 141,96 g/mol) en 1,85 g citroenzuur (MW. 192,12 g/mol) op in 400 ml gedeïoniseerd water. Pas de pH van de oplossing aan met behulp van HCl of NaOH en stel het uiteindelijke volume in op 500 ml met behulp van gedeïoniseerd water.
8. Om de 98% mierenzuur-CaCl_2-oplossing te maken, verdunt u mierenzuur tot 98% door 98 ml mierenzuur te mengen met 2 ml gedeïoniseerd water voor een totaal van 100 ml oplossing. Voeg nu 4 g CaCl₂ toe aan 100 ml 98% mierenzuuroplossing om 4% w/v mierenzuur-CaCl_2-oplossingte bereiden. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
  OPMERKING: Zie tabel 1. Alleen de oplosmiddelen die het eiwit oplossen, waardoor een neerslagvrije en heldere dope-oplossing ontstaat, mogen worden gebruikt voor pogingen tot vezelspinning.
Bereiding van vezelspinnende dope-oplossing
1. Weeg het gevriesdroogde spinrageiwit af volgens de gewenste concentratie (bijv. 10 mg voor een oplossing van 10% (m/v) in 100 μl oplosmiddel) en meng met het juiste volume oplosmiddel (bijv. 100 μl voor een concentratie van 10% (m/v).
2. Vortex het mengsel totdat het eiwitpoeder volledig is opgelost in het oplosmiddel.
3. Aangezien de oplosbaarheid van spinrageiwit varieert afhankelijk van het oplosmiddel en het eiwittype, begint u met een lage eiwitconcentratie (10% w/v) en verhoogt u de concentratie geleidelijk (25-30% w/v) indien nodig.
4. Beoordeel na volledige oplossing van het eiwit de viscositeit van de dope-oplossing kwalitatief. Als de dope-oplossing onvoldoende stroperig lijkt, verhoog dan geleidelijk de eiwitconcentratie totdat een heldere, stroperige oplossing is verkregen. Gebruik water als referentiestandaard.

Oplosmiddel	Eiwitconcentratie (% - w/v)	Referentie
8:1:1 TFA/TFE/H₂O	10 – 25	¹⁹
3:1:1 TFA/TFE/H₂O	10 – 30	²⁶
7:3 HFIP/H₂O	15 – 30	³¹
50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,5)	10 – 25	⁵⁰
10 mM Tris-Cl buffer (pH 8,0)	10 – 20	³⁴
20 mM Na-acetaat buffer (pH 5,0)	10 – 25	⁴⁹
1 M citraat fosfaatbuffer (pH 7,0)	10 – 25	⁵¹
98% mierenzuur – CaCl₂	20 – 25	⁵²

Tabel 1: Aanbevolen oplosmiddelen en eiwitconcentraties voor het bereiden van vezelspinnende dopes.

2. Vezel spinnen en verzamelen

NOTITIE: Raadpleeg Figuur 2 voor een schematische weergave van het met de hand tekenen en Figuur 3 voor de verschillende configuraties van het natdraaiende apparaat die hieronder worden beschreven.

figure-protocol-2
Figuur 2: Handtekening van spinnenzijdevezels. (A) Een C-vormig papieren frame wordt voorbereid en bevestigd aan een glasplaatje met transparante tape aan de linkerkant en dubbelzijdige tape aan de rechterkant om vezeltrekken van links naar rechts mogelijk te maken. (B) Een druppel draaiende dope wordt op de transparante tape geplaatst en een enkele vezel wordt met de hand naar de dubbelzijdige tape over de opening van het C-vormige frame getrokken met behulp van een plastic pipetpunt. (C) De vezel wordt aan de linker- en rechterkant met tape aan het papieren frame op de glasdia bevestigd. (D,E) Demonstratie van representatief (D) handtekenproces voor een recombinant spinrag dat effectief is opgelost in een spindope en (E) de resulterende vezel voordat deze met tape wordt vastgezet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Natspinnen van spinragvezels. In alle gevallen wordt de draaiende dope in een glazen luchtdichte spuit geplaatst en met een constante snelheid geëxtrudeerd met behulp van een spuitpomp door een metalen naald met stomp uiteinde (d.w.z. de spindop) in een stollingsbad (bijv. 95% ethanol). (A) As-gesponnen vezels worden verzameld op rol 1 en roteren onder computerbesturing met een snelheid die overeenkomt met de extrusiesnelheid. (B) Het uitrekken na het centrifugeren in lucht wordt bereikt door vezels over rol 1 te leiden en ze op rol 2 te verzamelen, die draait met een veelvoud van de snelheid van rol 1 (bijv. dubbele snelheid voor een 2x trekverhouding). Evenzo kunnen vezels worden geproduceerd (C) na onderdompeling in oplosmiddelen (bijv. 40% ethanol, water, enz., indien geschikt voor een bepaalde zijde) door vezels van rol 1 naar rol 3 te leiden (ondergedompeld in een oplosmiddelbad en met dezelfde snelheid als rol 1) voordat ze op rol 2 worden geleid (roterend met een veelvoud van de snelheid van rollen 1 en 3); of (D) in oplosmiddel door vezels van rol 1 naar rol 3 te leiden (ondergedompeld in een oplosmiddelbad en roterend met dezelfde snelheid als rol 1) vervolgens naar rol 4 (ook ondergedompeld in oplosmiddel en roterend met een veelvoud van de snelheid van rollen 1 en 3) voordat ze worden verzameld op rol 2 (snelheid afgestemd op die van rol 4). De modulaire configuratie betekent dat verschillende permutaties in vezelspincondities gemakkelijk kunnen worden getest, zeker niet beperkt tot de vier die hier schematisch worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Handtekening
1. Bereid een C-vormige papieren lijst voor met een venster van 1 cm x 0,5 cm (l x b) en plaats deze op een glasplaat (Figuur 2). Bevestig het bovenste gedeelte van het papierframe met plakband aan de glasplaat. Plak transparante tape op een arm van het papierframe om een hydrofoob oppervlak te creëren voor afzetting van dope-oplossing en bevestig dubbelzijdige tape aan de andere arm voor het vastzetten van vezels.
2. Breng bij kamertemperatuur (22 ± 2 °C) een 10-20 μL spinning dope-oplossing aan op de transparante tape.
3. Dompel een plastic pipetpunt van 200 μl onder in de druppel dope-oplossing en trek deze verticaal uit de oplossing met een constante snelheid (~6 mm/s), zodat de vezels uit de oplossing kunnen worden getrokken.
4. Leid de met de hand getrokken vezel over het kozijnraam en bevestig deze op de dubbelzijdige tape. Droog de vezel aan de lucht bij kamertemperatuur en zet vervolgens beide uiteinden van de vezels vast met extra tape.
5. Concentreer u op het deel van de vezel dat het papieren frame overspant voor daaropvolgende karakterisering.
Nat-spinnen
1. Bouw een apparaat voor nat draaien, waarbij het apparaat dat hier wordt beschreven verbeterde motorbesturingsmogelijkheden heeft ten opzichte van eerdere iteraties^31,38.
  1. Fabriceer een stijve metalen montageplaat die verticaal wordt vastgehouden en machinaal wordt bewerkt met een geschikte configuratie om een set stappenmotoren te bevestigen (zie afbeelding 3). Elke motorbevestiging vereist gaten die zijn geboord om veilige bouten van stappenmotoren aan de achterkant van de montageplaat mogelijk te maken (d.w.z. vier gaten op de juiste afstand en grootte) en een vijfde gat om de motoras door te laten.
  2. Kies bipolaire stappenmotoren met een stap van 1,8°, een houdkoppel van 45 N∙cm, een lengte van 24 mm en een as met een diameter van 5 mm met een 15 mm lange "D"-snede, een behuizing van 39 mm, een nominale stroom van 1,50 A, een faseweerstand van 2,3.
  3. Ontwikkel een systeem om de snelheid en rotatierichting voor elke motor te regelen, zoals eerder gebruikt voor een verscheidenheid aan zijdevezeltypes 17,53,54, dat gebruikmaakt van een grafische gebruikersinterface (GUI) gecodeerd in Python voor een Raspberry Pi die is aangesloten op verschillende stappenmotorcontrollers zoals beschreven in https://github.com/raineylab/MotorController.git.
  4. Voor het centrifugeren bevestigt u elke motor die in een bepaalde spinconfiguratie wordt gebruikt aan een machinaal bewerkte metalen cilinder (diameter 6 cm, lengte 8 cm voor die op de posities 1 en 2 in figuur 3, gegroefde rollen met een diameter van 9 cm aan beide uiteinden taps toelopend naar een diameter van 6 cm in het midden van de rol; lengte van 7 cm op posities 3 en 4 in figuur 3; zie bijvoorbeeld figuur 4 voor de configuratie van de steekproef).
  5. Gebruik voor de spindop (Figuur 3) een glazen spuit van 0.25 ml met een permanent bevestigde metalen naald met een stomp uiteinde (binnendiameter 0.127 mm) gemonteerd in een spuitpomp die de spindope met een gecontroleerde snelheid in een stollingsbad extrudeert.
2. Centrifugeer de dope-oplossing bij 20.000-21.000 g × gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en verzamel het bovenstaande voor het spinnen van vezels.
  OPMERKING: Verwijder achtergebleven deeltjes om verstopping van de extrusienaald tijdens het natcentrifugeren te voorkomen.
3. Laad 50-80 μL spinning dope-oplossing in de spuit die als spindop dient.
4. Zet de spuit vast in een spuitpomp en stel de extrusie in op een snelheid van 600 μL/h.
  OPMERKING: Pas de extrusiesnelheid aan en optimaliseer deze om vezelvorming mogelijk te maken voor een bepaalde eiwitdraaiende dope-toestand.
5. Bereid een stollingsbad voor (95% ethanol/5% gedeïoniseerd water, v/v).
6. Plaats de spuitpomp zo dat de naald van de spuit met de dope-oplossing in het stollingsbad is ondergedompeld.
7. Bevestig de rol(len) aan het draaiende apparaat, pas de rolsnelheid aan met behulp van motorbesturingssoftware en zet de motor(en) aan die nodig zijn voor een bepaalde centrifugeconfiguratie.
  NOTITIE: Zorg ervoor dat de rotatiesnelheid van rol 1 overeenkomt met de extrusiesnelheid. Extrusiesnelheden van 400 μL/h of 600 μL/h komen overeen met 6 rpm of 9 rpm voor rol 1. Als er na het draaien een trekking wordt gegeven, moeten een of meer van de rollen 2-4 worden ingesteld om dienovereenkomstig sneller te draaien.
8. Start de spuitpomp en gebruik een pincet om de vezel die zich in het stollingsbad vormt op een van de volgende manieren te geleiden.
  1. Om AS-vezels te verzamelen, leidt u de in het stollingsbad gevormde vezel op de eerste rol (snelheid gelijk aan de extrusiesnelheid) voor verzameling.
  2. Om na het centrifugeren in lucht te rekken, stelt u de rotatiesnelheid van rol 2 in op een veelvoud van die van rol 1. Leid de vezel van de coagulatie over rol 1 zonder lus om rol 1 en verzamel deze op rol 2.
    OPMERKING: Een trekverhouding na het centrifugeren van 2x vereist dat de rotatiesnelheid voor rol 2 het dubbele is van die van rol 1; 3x, drievoudig; enzovoort.
  3. Om na onderdompeling in oplosmiddel na het centrifugeren te rekken, vult u het oplosmiddelbad met het gewenste oplosmiddel (bijv. gedeïoniseerd water; 2:3 v/v ethanol/H₂O; enz.) en leidt u de vezel van het coagulatiebad rond rol 1 (rotatiesnelheid afgestemd op de extrusiesnelheid), rond rol 3 (rotatiesnelheid gelijk aan rol 1) in het oplosmiddelbad, en verzamel de vezel op rol 2 in lucht (roterend met een snellere snelheid dan rollen 1 en 3).
    OPMERKING: De rotatiesnelheid van rol 2 ten opzichte van rollen 1 en 3 bepaalt de trekverhouding na het centrifugeren zoals in stap 2.2.8.2.
  4. Om na het centrifugeren in oplosmiddel uit te rekken, vult u het oplosmiddelbad met het gewenste oplosmiddel (bijv. gedeïoniseerd water; 2:3 v/v ethanol/H₂O; enz.) en leidt u de vezel van het coagulatiebad rond rol 1 (rotatiesnelheid afgestemd op de extrusiesnelheid), rond rol 3 (rotatiesnelheid gelijk aan rol 1) in het oplosmiddelbad, rond rol 4 in het oplosmiddelbad (rotatiesnelheid een veelvoud van die van rollen 1 en 3) en verzamel de vezel op rol 2 in lucht (rotatiesnelheid afgestemd op rol 2).
    OPMERKING: De rotatiesnelheid van rollen 2 en 4 ten opzichte van die van rollen 1 en 3 bepaalt de trekverhouding na het centrifugeren zoals in stap 2.2.8.2.
    Verzamel vezels in gecontroleerde omgevingsomstandigheden om de invloed van vochtigheid en temperatuur op het vezelgedrag te voorkomen. We streven naar een relatieve luchtvochtigheid ~ 28,2 ± 2,4% en temperatuur ~ 28,0 ± 2,2 °C.

figure-protocol-4
Figuur 4: Belangrijke stappen bij het nat spinnen van spinragvezels. (A) Draai dope-extrusie in een coagulatiebad, gevolgd door het verzamelen van vezels (rode rechthoek aan de linkerkant markeert de naald die wordt gebruikt voor dope-extrusie; rode rechthoek aan de rechterkant is het pad van de nat gesponnen zijdevezel. (B) Illustratie van vezels die na het centrifugeren worden uitgerekt in lucht (rode rechthoek om het oog te geleiden). (C) Illustratie van het uitrekken van de vezels na het centrifugeren na onderdompeling in water (rode rechthoek om het oog te leiden). (D) Continue recombinante zijdevezel verzameld op een rol (bijv. gespoelde vezel bij rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Optische microscopische evaluatie van vezels

Glasvezel montage
1. Maak een C-vormige papierhouder door een vierkant van 1 x 1 cm uit een rechthoekig stuk papier van 3 x 2 cm te knippen (Figuur 5).
2. Bevestig de C-vormige houder met tape aan een glazen microscoopglaasje.
3. Plak twee stukken dubbelzijdig plakband aan weerszijden van de opening van 1 cm van de C-vormige papierhouder.
4. Verwijder een vezel van de rol waarop deze is verzameld en snijd een segment van ongeveer 2 cm lang.
  OPMERKING: Vermijd het gebruik van overmatige kracht bij het hanteren van vezels om materiaalvervorming of andere veranderingen van eigenschappen te voorkomen.
5. Plaats het vezelsegment op de bovenkant van de dubbelzijdige tape en zorg ervoor dat de lengteas van de vezel evenwijdig aan de onderkant van de houder is uitgelijnd (Afbeelding 5).
6. Zet de vezel vast met plakband bovenop dubbelzijdig plakband aan beide zijden.
7. Bevestig een extra stuk afplaktape om de onderkant van de papierhouder stevig aan de glasschuif te bevestigen om te voorkomen dat de vezel beweegt tot gebruik.
8. Bewaar gemonteerde vezels in een opbergdoos voor dia's tot ze worden gebruikt voor beeldvorming en trekproeven.
Diameterbepaling en evaluatie van defecten
1. Onderzoek de gemonteerde vezels met behulp van optische microscopie. Screen eerst de hele lengte van de vezel op zichtbare onvolkomenheden, zoals nekken, draaien, uitpuilen of dubbele vezels. Als er defecten worden waargenomen, sluit die vezels dan uit van mechanische tests.
2. Voor vezels die vrij lijken van defecten, maakt u drie microfoto's met een vergroting van 10x langs de lange as van de vezel, één in het midden en één aan elk uiteinde van de vezel.
3. Meet de vezeldiameter met behulp van ImageJ^55-software :
  1. Ga in ImageJ naar het menu Analyseren en selecteer Schaal instellen (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S1). Pas de schaal aan volgens de kalibratie-instellingen van de microscoop en stel de meeteenheid in op micrometers (μm) (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S2).
  2. Teken met het lijngereedschap een rechte lijn loodrecht op de lange as van de vezel die zich uitstrekt van de ene vezelrand naar de andere rand.
  3. Meet voor elke microfoto de vezeldiameter in zes verschillende gebieden langs de vezel.
  4. Klik na het tekenen van elke lijn op Meten in het menu Analyseren om de vezeldiameter weer te geven (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S3).
Kwalitatieve beoordeling van moleculaire uitlijning door middel van gepolariseerde lichtmicroscopie
1. Gebruik gepolariseerde lichtmicroscopie om de moleculaire uitlijning in de vezel te evalueren na diameter- en defectevaluatie door optische microscopie.
  1. Onderzoek de vezel met behulp van een omgekeerde optische microscoop die is uitgerust met een draaibare tafel, een vaste analysatorschuif en een 90° draaibare polarisator.
  2. Plaats de vezel op ongeveer 45° ten opzichte van het invallende vlakgepolariseerde licht om de helderheid als gevolg van dubbele breking te maximaliseren, waardoor de zichtbaarheid van de moleculaire structuur wordt verbeterd.
  3. Maak een foto van de vezel onder deze omstandigheden om de dubbele breking te beoordelen.
    OPMERKING: Hoge dubbelbreking suggereert een goed uitgelijnde moleculaire structuur, terwijl lage of geen dubbelbreking een meer amorfe of willekeurig georiënteerde structuur suggereert.

figure-protocol-5
Afbeelding 5: Montage van spinragvezel op een glazen slede die stroomafwaartse analyse mogelijk maakt met behulp van een C-vormige papierhouder en een reeks lagen tape. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

4. Het trekken het testen

OPMERKING: Een trektestapparaat dat geschikt is voor een nauwkeurige evaluatie van zijdevezels kan gemakkelijk worden geproduceerd tegen relatief lage kosten ^25,56. Kortom, fabriceer een paar roestvrijstalen klemmen om elk uiteinde van elke vezel stevig vast te grijpen in een C-vormig frame dat wordt getest (bijv. Figuur 6). Bevestig een van deze klemmen aan een gewicht dat op een analytische balans is geplaatst en de andere aan een spuitpomp. De spuitpomp moet zo zijn geconfigureerd dat er constant kan worden getrokken met een ingestelde reksnelheid. De analytische balans moet worden gekoppeld aan een computer voor het verzamelen van geregistreerde gewichts-/massagegevens als functie van de tijd.

figure-protocol-6
Afbeelding 6: Schematisch diagram met de voorbereidende stappen voor trekproeven. (A) Papierhouder met vezel (zie afbeelding 5 voor configuratie) wordt losgemaakt van de glasplaat en verticaal gemonteerd met behulp van een clip die aan een gewicht is bevestigd. (B) Deze verzwaarde klem wordt op de analytische balans geplaatst en het bovenste deel van de papierhouder wordt bevestigd aan een klem die is bevestigd aan een staaf die stevig in een spuitpomp is bevestigd. De papierhouder wordt horizontaal in het midden gesneden voordat met de trektest wordt begonnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gegevensverzameling van stress-rekcurve
1. Voer na het meten van de vezeldiameter trekproeven uit op dezelfde vezel met een zelfgebouwd apparaat (Figuur 6).
  1. Maak het C-vormige papieren frame dat de vezel vasthoudt los van de glasplaat en bevestig het aan een klem die aan een gewicht is bevestigd (Figuur 6A).
  2. Sluit de analytische balans aan op de datalogging-/besturingssoftware en navigeer naar de Workbench (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S4).
  3. Stel het experiment in de software voor balanscontrole in door op de knop Start te klikken. Voer de naam van het experiment in wanneer daarom wordt gevraagd (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S5).
  4. Zorg ervoor dat de analytische balans leeg is en plaats de verzwaarde klem met de vezel erop.
  5. Bevestig de bovenkant van het papierframe aan een klem die is aangesloten op de spuitpomp en knip een kant van de papierhouder af zodat de vezel vrij kan bewegen (Afbeelding 6B).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat beide clamps evenwijdig aan elkaar en dat de vezel gecentreerd is in de clamp op een meetlengte van 10 mm.
  6. Tarreer de balans om de massa van het gewicht en de klem op nul te zetten en druk op de Run-knop op de spuitpomp en klik op OK in de balansbesturingssoftware (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S6).
  7. Wanneer de vezel breekt, drukt u op Stop op de spuitpomp en op de Ja-knop in de balansbesturingssoftware (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S7) om het gemeten gewicht te registreren als functie van de tijd.
  8. Breng gegevens over naar een spreadsheet of een ander geschikt softwarepakket voor gegevensverwerking voor verwerking. Kopieer het gegevenslogboek voor gewicht versus tijd naar het klembord en plak het in de meegeleverde spreadsheet voor mechanisch testen (aanvullend bestand 2) of door de gegevens als tekstbestand te exporteren en te importeren met de juiste parsing.
Gegevensverwerking van stress-rekcurve
OPMERKING: Het volgende protocol is gebaseerd op de spreadsheet voor mechanische tests die is opgemaakt voor gebruik in Microsoft Excel (aanvullend bestand 2).
1. Zorg ervoor dat de experimentele parameters correct zijn (kolom C).
2. Voeg de massa-opnames als functie van de tijd toe aan de spreadsheet (de "Nettomassa" in kolom F). Als er massawaarden zijn geregistreerd voordat het uitrekken begon, verwijder deze dan door de overeenkomstige cellen te verwijderen met een verschuiving van de gegevens naar boven. Als er massawaarden worden geregistreerd nadat de vezel is gebroken, verwijdert u deze gegevenscellen.
3. Vul de indexwaarden in kolom E automatisch in door stappen van 1 toe te voegen, zodat het totale aantal indices overeenkomt met het totale aantal gemeten massawaarden in kolom F.
4. Herschaal de nettomassa zodat deze begint bij 0 g en tijdens het rekexperiment toeneemt door de initiële nettomassa af te trekken van elke nettomassawaarde en dit verschil te vermenigvuldigen met -1 (kolom G).
5. Bereken de verandering in vezellengte bij elke meting door de meetindex te vermenigvuldigen met de treksnelheid van de spuitpomp en het tijdsverloop tussen de geregistreerde massametingen (kolom H).
6. Bereken de technische belasting door de verandering in vezellengte te delen door de oorspronkelijke lengte (kolom I).
  OPMERKING: Deze berekening geeft de technische rek in mm/mm. Als u de technische rekwaarden wilt omrekenen naar %, vermenigvuldigt u de waarden in kolom I met 100%.
7. Noteer de uitbreidbaarheid als de maximale technische rekwaarde (cel T3).
8. Bereken de kracht (in N) die nodig is om elke geregistreerde lengteverandering te bereiken door de massa om te rekenen van g naar kg en te vermenigvuldigen met de standaardzwaartekracht (9,81 m/s²; Kolom J).
9. Bereken de technische spanning (in Pa) door de kracht die bij een bepaalde mate van uitbreiding wordt bepaald, te delen door de dwarsdoorsnede van de vezel en te vermenigvuldigen met ^10-6 om te converteren naar MPa (kolom K).
10. Noteer de maximaal waargenomen stress als de ultieme spanning (cel U3) en de stress bij pauze als de uiteindelijke stresswaarde die is geregistreerd voorafgaand aan het breken van de vezel (cel V3).
11. Bereken het gebied onder de spanning-rekcurve om de taaiheid te verkrijgen met behulp van de trapeziumregel om het gebied onder de curve na elke meting te berekenen (kolom L). Tel deze gebieden op om de taaiheid te vinden (cel W3).
12. Bereken de modulus van Young (in MPa) door de helling van het initiële lineaire gebied van de spannings-rekcurve te bepalen met behulp van de LINEST-functie. Converteer naar GPa door te vermenigvuldigen met 10,³ (cel X3).

5. Fourier-transformatie infrarood (FTIR) spectromicroscopie

Bereid een monster voor FTIR voor door een tweede glasplaatje op de bodem van een objectglaasje te plakken dat is voorbereid voor optische microscopie.
Optisch beeld en FTIR spectrale collectie
1. Vul de dewar van de detector met vloeibare stikstof om de detector af te koelen.
2. Open FTIR-software voor instrumentbesturing.
3. Open in het venster Weergeven en verzamelen (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S8) het tabblad Verzameling , stel de Verzamelingsmodus in op ATR en de detector op Gekoeld (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S9).
4. Plaats de glijbaan in de diahouder en plaats de houder op het podium.
5. Zet de bovenste verlichting op 100 en het diafragma en de onderste verlichting op 0.
6. Stel het midden van het gezichtsveld voor het optische microscoopbeeld van het monster scherp op de vezel met behulp van de fysieke joystick of de digitale joystick in de software om de positie van het midden van het gezichtsveld en het brandvlak te regelen.
7. Stel de verzamelmodus in op Map (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S8).
8. Selecteer de regio die moet worden afgebeeld en gemeten met behulp van Kaartweergave - Gebiedstool. Klik en sleep de cursor om het gebied op te geven waarvoor spectra moeten worden verkregen in het voorbeeld van de microfoto (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S8). Elke cirkel op de afbeelding vertegenwoordigt een verworven spectrum op die positie. Wijzig indien nodig de randen van dit vak door de cursor boven een bepaalde vakrand te plaatsen en vervolgens naar de gewenste locatie te klikken en te slepen. Vertaal het hele vak door binnen de rechthoek te klikken en te slepen. Wijzig de oppervlakte van het vak en het aantal gegevenspunten onder Fase, Diafragma en Weergave (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S10).
9. Klik met de rechtermuisknop op het voorbeeld van de microfoto en selecteer Capture Mosaic om de afbeelding op te slaan (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S8).
10. Stel de ATR-druk in door op het vervolgkeuzemenu Huidig drukprofiel te klikken. Gebruik voor eiwitvezels 2% druk (d.w.z. de laagst mogelijke ATR-druk) om schade aan de vezel te minimaliseren (Aanvullend Dossier 1 - Aanvullende Figuur S8).
11. Plaats de ATR FTIR-tip.
12. Klik op de knop Verzamelen (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S8) om een achtergrondspectrum te verkrijgen en vervolgens het spectrum op elk van de geselecteerde punten. Nadat het verzamelen is voltooid, worden de gegevens in een nieuw venster weergegeven.
Gegevensvoorbereiding voor downstream-analyse
1. Klik met de linkermuisknop op de heatmap of de microfoto om het spectrum te bekijken dat op de overeenkomstige positie is verkregen (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S11).
2. Klik met de rechtermuisknop op een spectrum dat moet worden geanalyseerd en selecteer Kopiëren (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S11).
3. Klik met de rechtermuisknop in de Windows-balk bovenaan het scherm en selecteer Nieuw venster (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S11).
4. Klik op de knop Plakken bovenaan het scherm wanneer het nieuwe venster wordt geopend (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S11).
5. Gebruik dezelfde aanpak om alle andere spectra die voor analyse gewenst zijn in dit venster te kopiëren en te plakken .
6. Markeer een spectrum of spectra door op Ctrl te drukken terwijl u op elk gewenst spectrum klikt of door de gewenste spectra te markeren in het vervolgkeuzemenu.
7. Klik op Opslaan als... en sla de bestanden op als .spa-bestanden om de gegevens in de spectrometerbesturingssoftware te analyseren of als .csv om de gegevens in een ander softwarepakket te analyseren (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S12).
Tweede afgeleide analyse met behulp van instrumentspecifieke software
1. Open de spectra die moeten worden geanalyseerd in het instrumentspecifieke softwarepakket voor spectrale verwerking en analyse.
2. Om te converteren tussen % doorlaatbaarheid en absorptie modi gebruikt u Ctrl+A (% doorlaatbaarheid naar absorptie) of Ctrl+T (absorptie naar % doorlaatbaarheid).
3. Selecteer de interesseregio door op Weergave | Limieten weergeven (of Ctrl+D) (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S13A). Als u de banden Amide I (1.700-1.600 ^cm-1) en amide II (1.600-1.500 ^cm-1) wilt bekijken, stelt u specifiek de limieten voor de begin- en eind-X-as in op de juiste golfnummers. Als u meer dan één spectrum analyseert, selecteert u Toepassen op alle spectra. Klik op OK (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S13B).
4. Als u de tweede afgeleide wilt plotten, klikt u op Proces | Derivaat... en kies Tweede in het vervolgkeuzemenu (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S14A). Selecteer Norris-afgeleide met een segmentlengte van 5 en een afstand tussen segmenten van 5 (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S14B). De minima van het tweede afgeleide spectrum vallen samen met componentpieken binnen het oorspronkelijke absorptiespectrum.
  1. Als het spectrum te veel ruis bevat om de minima te beoordelen, maakt u het spectrum vloeiend door te klikken op Proces>Automatisch vloeiend (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S15). Bereken vervolgens de tweede afgeleide en zoek de minima.
5. Relateer de golfgetallen op de tweede afgeleide minima aan karakteristieke bandposities voor secundaire structuren met behulp van een referentietabel (bijv. Tabel 2) om inzicht te krijgen in de secundaire eiwitstructuur.
Piekdeconvolutie met behulp van instrumentspecifieke analysesoftware
1. Stel het weergavegebied in op het gebied dat moet worden gedeconcorteerd, zoals in stap 5.4.3. Alleen deze regio zal worden ontwricht.
2. Basislijn Corrigeer het geselecteerde spectrale gebied met behulp van een van de volgende methoden:
  1. Klik op Proces | Automatische basislijn correct (aanvullend bestand 1 - aanvullende figuur S16); of
  2. Klik op Proces | Basislijn correct (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S17A) en selecteer vervolgens Lineair in het vervolgkeuzemenu en specificeer het spectrale gebied dat moet worden gecorrigeerd voor basislijn in het positiespectrum door te klikken en te slepen naar de twee punten die de onder- en bovengrenzen specificeren van het gebied dat moet worden gecorrigeerd voor deconvolutiedoeleinden. Selecteer vervolgens Toevoegen aan venster in het tweede vervolgkeuzemenu en klik op de knop Toevoegen (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S17B).
3. Selecteer het spectrum met correctie voor basislijn en klik op Analyseren | Piek vastberadenheid... om het venster Peak Resolve te openen (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S18).
4. Selecteer de spectra en curven die moeten worden geanalyseerd met behulp van de selectiebalk aan de linkerkant van het scherm.
5. Kies Gaussian/Lorentzian met een gevoeligheidsinstelling van Laag en FWHH-instelling van 2 op het tabblad Pieken zoeken en klik vervolgens op de knop Pieken zoeken (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S19).
6. Klik op de knop Pieken om een tabel te openen met een beschrijving van de pieken.
  1. Als er meer pieken zijn geplukt dan fysiek redelijk zijn, klikt u op Piek verwijderen totdat het juiste aantal pieken is verkregen voor analyse (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S20). Voor het amide I-gebied bijvoorbeeld worden in de literatuur doorgaans 5-11-pieken gerapporteerd (tabel 2).
  2. Om ervoor te zorgen dat alle pieken positief zijn na het passen, klikt u op Piek bewerken en stelt u de minimale hoogte in op 0. Klik vervolgens op Volgende en herhaal voor elke piek, gevolgd door OK om het bewerkingsvenster te sluiten (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S21).
  3. Als er specifieke golfgetallen aanwezig moeten zijn in de uiteindelijke deconvolutie, klikt u op Piek bewerken en stelt u het piekcentrum in op het golfgetal dat is opgegeven in het vak Waarde door Vast te selecteren of een bereik op te geven met behulp van de vakken Lage limiet en Hoge limiet . Klik op OK om deze instellingen toe te passen op de opgegeven piek.
    OPMERKING: In deze stap is het optimaal om piekposities te gebruiken die zijn gevonden tijdens de tweede afgeleide analyse of pieken uit een referentietabel van secundaire FTIR-structuren, idealiter geannoteerd voor een vergelijkbaar type zijdemonster (bijv. Tabel 2).
7. Klik op de knop Fit Peaks (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S22).
  1. Als het algoritme voor piekaanpassing niet lukt, klikt u nogmaals op Pieken aanpassen om iteratief door te gaan met het passen van de pieken.
8. Klik op de knop Pieken... om informatie te krijgen over positie, hoogte, FWHH en de oppervlakte van alle pieken die fit waren.
  1. Deze pieken kunnen naar het klembord worden gekopieerd door op Klembord te klikken om ze in een ander venster of bestand te plakken (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S23).
  2. Kopieer pieken en spectra naar een ander venster door de bestemming te selecteren in het vervolgkeuzemenu voor vensterselectie naast de knop Toevoegen (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S24).
  3. Klik op de knop Alles selecteren en gebruik Bestand | Opslaan als om de pieken en spectra op te slaan als .spa- en/of .csv-bestanden (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S25).
9. Relateer elke componentpiek aan een secundaire structuur met behulp van een referentietabel. De relatieve oppervlakte van de piek(en) die overeenkomt met een bepaalde secundaire structuur ten opzichte van de totale oppervlakte van alle toegewezen pieken, geeft het aandeel van het eiwit dat die secundaire structuur heeft.
Gegevensvoorbereiding voor downstream-analyse met behulp van software van derden
1. Open een werkmap en laad de spectrale gegevens in de spectrale verwerkings- en analysesoftware van derden door de Data | Verbinding maken met bestand | Tekst/CSV-menu-item (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S26). Selecteer het gewenste bestand in Verkenner en klik op Openen.
2. Teken het spectrum door de kolommen te markeren die moeten worden uitgezet en selecteer de Plot | Basis 2D | Regelmenu-item (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S27).
3. Dubbelklik op de x-as en gebruik het tabblad Schaal om het bereik aan te passen aan de Amide I-piek (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S28).
4. Als de gegevens veel ruis bevatten, strijkt u de curve glad door de optie Analyse | Signaalverwerking>Soepel > dialoogvenster openen... menu-item (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S29A).
  1. Stel de optie Herberekening in op Auto, de methode op Savitzky-Golay, Vensterpunten op 5, Randvoorwaarde op Geen en Polynomiale volgorde op 2 (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S29B).
  2. Klik op OK om te verwerken.
Tweede afgeleide analyse met behulp van software van derden
1. Selecteer de analyse | Wiskunde | Differentiëren | Open dialoog... menu-item (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S30).
2. Stel de optie Herberekenen in op Auto, stel de Afgeleide Volgorde in op 2, selecteer de optie Plot Derivative Curve en klik op OK (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S31).
3. Als de resulterende tweede afgeleide curve veel ruis bevat, volgt u stap 5.7.1. en 5.7.2, door Savitzky-Golay Smooth te selecteren op het tabblad Smooth van het dialoogvenster Differentiete .
4. Net als in 5.4.5, relateer de golfgetallen bij de minima van de tweede afgeleide aan secundaire structuren.
Piekdeconvolutie met behulp van software van derden
1. Nadat u op de grafiek van het amide I-absorptiespectrum hebt geklikt, selecteert u de Analyse | Pieken en basislijn | Piek Analyzer | Open dialoog... menu-item (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S32).
2. Stel in het dialoogvenster Doel - Pieken aanpassen (Pro) de optie Opnieuw berekenen in op Automatisch, selecteer Pieken aanpassen en klik op Volgende. (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende figuur S33A).
3. Stel in het dialoogvenster Basislijnmodus de parameter Basislijnmodus in op Rechte lijn en klik op Volgende (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S33B).
4. Selecteer in het dialoogvenster Basislijnbehandeling de optie Basislijn automatisch aftrekken, klik op de knop Nu aftrekken en klik op Volgende (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S33C).
5. Schakel in het dialoogvenster Pieken zoeken Automatisch zoeken inschakelen uit en klik op Toevoegen.
  1. Dubbelklik op het venster met de grafiek van een spectrum met de pieken die moeten worden aangepast.
  2. Selecteer pieken op basis van de minima die zijn waargenomen in de tweede afgeleide (stap 5.7.4) of referentietabellen (bijv. Tabel 2).
  3. Klik op Gereed en klik vervolgens op Volgende (Aanvullend bestand 1 - Aanvullende afbeelding S33D).
6. Selecteer in het dialoogvenster Fit Peaks (Pro) de optie Rapport genereren op basis van huidig aanpassingsresultaat en klik op Passend maken. gevolgd door Finish (Aanvullend Bestand 1 - Aanvullende Figuur S33E).
7. Evalueer het tabblad PeakProperties1 van de werkmap om het midden, het geïntegreerde gebied en de FWHM van elke piek te zien (aanvullend bestand 1 - aanvullende afbeelding S34). Net als in stap 5.5.9, relateer je elke componentpiek aan een secundair structuurtype en evalueer je het percentage van de eiwitstructuur met die secundaire structuur.

Golfgetalbereik (^cm-1)	Taak
1605−1615	Tyr zijkettingen/Geaggregeerde β-strengen
1616-1621	Geaggregeerde β-strengen/Intramoleculaire β-vellen [zwak]
1622-1627	Intermoleculaire β-vellen [sterk]
1628-1637	Intramoleculaire β-vellen [sterk]
1638-1646	Willekeurige spoel/verlengde kettingen
1647-1655	Willekeurige spoel
1656-1662	α-Helices
1663-1696	Draait
1697-1703	Intermoleculaire β-vellen [zwak]

Tabel 2: Amide I regio trillingsbandtoewijzingen voor Bombyx mori zijde op basis van vergelijkende evaluatie van verschillende studies door Hu et ^al.57.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een ideale spinbare dope-oplossing is een heldere, neerslagvrije en stroperige oplossing, wat wijst op volledige eiwitoplossing (Figuur 7A). Omgekeerd resulteert onvolledige oplossing in een melkachtige suspensie of zichtbare neerslag (Figuur 7B,C). De tijd die nodig is voor volledige eiwitoplossing varieert als functie van het oplosmiddel, waarbij sommige oplosmiddelen, zoals TFA/TFE/H₂O-mengsels, het eiwit doorgaans volledig oplossen binnen een tijdsinterval van 30 minuten, terwijl andere, zoals HFIP, 's nachts moeten worden geschud naast af en toe vortexen.

figure-results-1
Figuur 7: Optimalisatie van de spinning dope-oplossing. (A) Een oplosmiddel dat in staat is het eiwit volledig op te lossen, geeft een heldere en stroperige spinbare dope-oplossing. Gedeeltelijke oplossing of suspensie van het eiwit door een niet-optimale oplosmiddelkeuze kan resulteren in (B) een te viskeuze toestand, meestal met zichtbaar neerslag of (C) een melkachtige suspensie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2E toont een representatieve met de hand getekende vezel, terwijl Figuur 4D een gespoelde, natgesponnen vezel toont. Voorafgaand aan elke stroomafwaartse analyse is optische microscopie essentieel om de vezelkwaliteit te evalueren. Representatieve optische microfoto's van nat gesponnen recombinante zijdevezels die geschikt zijn voor stroomafwaartse analyse en gesponnen onder twee verschillende omstandigheden (zie figuur 3 voor voorbeeldconfiguraties voor nat spinnen) worden getoond in figuur 8. Door optische microscopie (Figuur 8A) is het duidelijk dat deze vezels een uniforme diameter vertonen, met een kleinere diameter die zichtbaar is bij toepassing van een trekking na het centrifugeren (d.w.z. as-gesponnen (AS) versus post-gesponnen uitgerekt in een verhouding van 4x in 40% ethanol (4x-EtOH)). De grotere mate van dubbelbreking die resulteert in een groter contrast in gepolariseerde lichtmicroscopie (Figuur 8B) komt overeen met een verbeterde moleculaire uitlijning in de vezel als gevolg van het trekproces na het centrifugeren. Ten slotte moet worden opgemerkt dat defecten hoogstwaarschijnlijk zullen worden waargenomen in een deel van de geëvalueerde vezels, waardoor een bepaald vezelsegment ongeschikt wordt voor stroomafwaartse analyse. Twee van dergelijke voorbeelden worden weergegeven in figuur 9.

figure-results-2
Figuur 8: Representatieve optische microfoto's van nat gesponnen recombinante spinragvezels. Vezels in de AS-toestand en na een 4x post-spin stretch in ethanol (EtOH) worden geïllustreerd voor een chimere pyriforme-aciniforme zijdeconstructie (Py₂W₂) waargenomen door optische microscopie (linkerkolom) en gepolariseerde lichtmicroscopie (rechterkolom). Afbeeldingen zijn gereproduceerd met toestemming van Ghimire et ^al.17. Schaalbalken = 30 μm. Afkortingen: AS = as-spun; EtOH = ethanol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 9: Voorbeeld van mogelijke vezeldefecten die waarneembaar zijn met optische microscopie. (A) Een voorbeeld van een "uitpuilend" defect. (B) Een voorbeeld van een "nek"-defect. Schaalbalken = 20 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nadat is nagegaan of er geen defecten aanwezig zijn in een bepaald vezelsegment en na bepaling van de diameter (protocolparagraaf 3.2), kunnen trekproeven worden uitgevoerd (bijv. Figuur 6). Representatieve spanning-rekcurven verkregen voor een chimeer recombinant spinrag gesponnen onder verschillende omstandigheden worden weergegeven in figuur 10. Afhankelijk van de spinomstandigheden variëren de resulterende vezels van broos (AS-toestand) tot zeer rekbaar met een vergelijkbare sterkte als de AS-toestand (2x-luchttoestand) tot veel sterkere en minder rekbare vezels (4x-EtOH-toestand). Opgemerkt moet worden dat meerdere vezelsegmenten en batches gesponnen vezels moeten worden geëvalueerd om het mechanische gedrag ondubbelzinnig en rigoureus te beoordelen.

figure-results-4
Figuur 10: Representatieve spanning-rekcurve van vezels gesponnen onder verschillende omstandigheden. Vezels werden geanalyseerd in de as-spun toestand (AS) of door productie met behulp van geautomatiseerd rekken na het centrifugeren (trekverhouding en rektoestand (lucht versus oplosmiddel) aangegeven). Figuur aangepast met toestemming van Ghimire et al.(2024)¹⁷. Afkorting: AS = as-spun. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte kan de secundaire structuur van de vezeltoestand worden geëvalueerd met behulp van ATR-FTIR-spectromicroscopie. Typische zijdevezelspectra die met deze methodologie worden verkregen (Figuur 11A,B) zouden karakteristieke eiwitbanden hebben, waaronder een brede amide A-piek (gecentreerd rond ~3.300 cm-1), een amide ^I-piek (~1.600-1.700 cm-1) en een amide ^II-piek (~1.500-1.600 ^cm-1). Hier richten we ons op de evaluatie van het amide I-gebied (bijv. Figuur 11C,D). Ten tweede is afgeleide analyse nuttig als middel om de belangrijkste componenten van de amide I-piek te identificeren (Figuur 11E,F), die geloofwaardigheid biedt aan kwantitatieve piekdeconvolutie (Figuur 11G-J) die evaluatie en vergelijking mogelijk maakt van de verhoudingen van het secundaire structuurtype dat wordt waargenomen in een zijdevezel die onder een bepaalde omstandigheid wordt gesponnen.

figure-results-5
Figuur 11: FTIR-spectra en analyse van secundaire structuren. (een, b) FTIR-spectra van Py₂W_2-vezels geproduceerd door nat spinnen in de (A) as-spun (AS) toestand en (B) met een rek van 4 na het centrifugeren in ethanol. (C,D) Amide I-gebieden van de FTIR-spectra weergegeven in respectievelijk A en B. (E-F) Tweede afgeleide van de amide I-regio's weergegeven in respectievelijk C en D, berekend met behulp van het aangegeven softwarepakket. (G-J) Amide I piekdeconvolutie uitgevoerd met behulp van de (G en I) OMNIC of (H en J) OriginPro-softwarepakketten , waarbij de panelen G en I de deconvolutie zijn die overeenkomt met C en H en J met D . Afkortingen: FTIR = Fourier transform infra-rood; AS = as-gesponnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naast de individuele technieken is correlatie van secundaire structurering, mechanische prestaties en (supra)moleculaire oriëntatiegegevens doorgaans essentieel, zowel voor het begrijpen van de invloeden van verschillende spinparameters op het resulterende materiaal als voor rationele optimalisatie van het spinproces. In de FTIR-deconvoluties die in figuur 11 worden getoond, bijvoorbeeld, waarbij de AS wordt vergeleken met 4×-EtOH-condities voor een chimere zijde, zijn substantiële bijdragen van β vellen aan de amide I-band duidelijk voor beide omstandigheden, maar omvatten ze een groter deel van de totale secundaire structuur voor de post-gesponnen uitgerekte toestand ten opzichte van de AS-toestand, ongeacht de deconvolutiemethode (bijv. Figuur 11G,H vs. Figuur 11I,J). Dit komt overeen met zowel de aanzienlijk hogere sterkte die werd waargenomen voor de 4×-EtOH-conditie dan de AS-toestand (Figuur 10) als de verbetering van de moleculaire uitlijning in de 4×-EtOH-conditie ten opzichte van de AS-toestand (Figuur 9). Gedetailleerde karakterisering en analyse, die het bereik van de omstandigheden bestrijken die in figuur 10 worden weergegeven, werden eerder gerapporteerd¹⁷. We hebben daarom hier niet de hele analyse samengevat, maar in plaats daarvan deze paarsgewijze vergelijking gebruikt als een demonstratie van de manier waarop deze drie klassen van gegevens complementair zijn aan elkaar en de ontwikkeling van een veel uitgebreider begrip van vezelgedrag mogelijk maken dan welke techniek dan ook afzonderlijk.

Aanvullend bestand 1: Een bestand met aanvullende figuren S1-S34 met afbeeldingen van vezeldiametermeting, mechanische gegevensverwerking en FTIR-gegevensverzameling en -verwerking. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Een spreadsheet waarmee de belangrijkste mechanische eigenschappen (d.w.z. spanning, rek, Young's modulus en taaiheid) kunnen worden bepaald op basis van massa- versus tijdgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De productie van recombinante eiwitten biedt het opwindende potentieel om materialen in een breed scala aan formaten te fabriceren, waarbij recente ontwikkelingen impliceren dat deze op eiwitten gebaseerde materialen een wijdverbreid industrieel gebruik naderen⁵⁸. Hier hebben we ons gericht op de vezelproductie van recombinante zijde, aangezien dit het formaat is van recombinante zijde dat rechtstreeks verwant is aan inheemse vezelachtige spinrag. Zijdevezels worden aangeprezen als tal van potentiële toepassingen vanwege de befaamde mechanische eigenschappen van natuurlijk spinnenrag en vanwege het potentieel om duurzaam hoogwaardige vezels te produceren³². Voorgestelde toepassingen variëren van hoogwaardig textiel tot energieabsorberende materialen tot producten voor persoonlijke verzorging tot gebruik in de gezondheidszorg^58,59. Apparaten en materialen op basis van spinrag in draagbare formaten of in andere contexten waar de elektrische geleidbaarheid wordt verbeterd, worden ook actief onderzocht voor zowel biomedische als bredere toepassingen⁶⁰. Er is dan ook een brede belangstelling voor het ontwikkelen, optimaliseren en aanpassen van materialen op basis van spinrag. In dit protocol schetsen we een reeks procedures die gericht zijn op een snelle vezelproductie, hetzij na de bereiding van een nieuw recombinant zijde-eiwit, hetzij na het moduleren van de materiaaleigenschappen van een recombinante zijde waarvan al is vastgesteld dat deze spinbaar is.

Ongeacht de spinmethode die wordt gebruikt, is het van cruciaal belang om de omstandigheden te bepalen die de productie van spindope mogelijk maken door middel van screening van oplosmiddel-/bufferomstandigheden en eiwitconcentratie, zoals hierin beschreven. Het uiteindelijke doel is oplosbaarheid van het eiwit in een voldoende hoge concentratie om een snelle omzetting in een vezel mogelijk te maken zonder zelfassemblage buiten de route in aggregaten of andere onoplosbare soorten die "productief" spinnen voorkomen. Dit is typisch een transparante, relatief stroperige oplossing, die meer dan waarschijnlijk bestaat uit zelfgeassembleerde soorten zoals micellen/nanodeeltjes^26,61 en/of vloeistof-vloeistoffasescheiding⁶². Dit protocol beschrijft geen methoden om de spin-dope-toestand uitgebreid te evalueren, aangezien succesvol vezelspinnen kan worden bereikt door iteratieve evaluatie van verschillende spin-dopes en spinconfiguraties. Gedetailleerd moleculair en supramoleculair inzicht in de spin-dope-toestand kan worden bereikt door middel van technieken zoals viscometrie, lichtverstrooiing, ver-UV circulaire dichroïsmespectroscopie, nucleaire magnetische resonantiespectroscopie en/of elektronenmicroscopie²⁶. Er moet ook worden opgemerkt dat het recombinante eiwit zelf kan worden gemodificeerd om het gedrag voor het spinnen te verbeteren, waarbij de bolvormige niet-repetitieve N- en C-terminale domeinen een voorbeeld zijn van een methode om de oplosbaarheid van spidroïne te vergroten³². Kortom, zonder de juiste identificatie van spin-dope is het niet haalbaar om over te gaan tot vergelijkende tests van spinomstandigheden.

Zodra een of meer spin-dope-aandoeningen zijn geïdentificeerd, biedt handtekenen een snelle route om de eigenschappen van zijdevezels te evalueren. Aangezien er aanzienlijk lagere hoeveelheden dope nodig zijn voor productief met de hand tekenen, zijn er veel lagere massa's puur eiwit nodig, waardoor dit een uitstekende voorloper is van geautomatiseerde natspinbenaderingen. Dit biedt ook een zeer hanteerbare en eenvoudige methode om de vezeleigenschappen van verschillende spidroins direct te vergelijken³³, opnieuw met het voordeel dat de vezelproductie relatief eenvoudig is met kleine hoeveelheden eiwit. Dit zou betekenen dat de optimalisatie van eiwitexpressie en zuiveringsprotocollen om de hogere opbrengsten te verkrijgen die nodig zijn voor natspinnen, kan worden gericht op de meest veelbelovende spidroins. Het nadeel is natuurlijk dat met de hand tekenen niet geschikt is voor de productie van lange ononderbroken vezels of van substantiële hoeveelheden vezels op een gestroomlijnde manier.

Bij voldoende eiwit biedt nat spinnen dan voordelen voor een gestroomlijnde productie van lange, continue vezels³². Niet alleen dit, maar vezeleigenschappen kunnen gemakkelijk worden gemoduleerd door het spinproces. De keuze voor draaiende dope-omstandigheden biedt bijvoorbeeld een duidelijke route om de vezelmechanica te verbeteren. In het geval van een ~60 kDa recombinant aciniform zijde-eiwit, bijvoorbeeld, leidde het overschakelen van de ene spindope naar de andere, waarbij alle andere spinparameters constant bleven, tot dramatische veranderingen in de rekbaarheid van de vezels²⁶. Dit was op zijn beurt terug te voeren op de manier waarop de aciniforme spidroin zich voorafgaand aan het spinnen in de spindope assembleerde, waarbij verbeterde homogeniteit van zelfgeassembleerde nanodeeltjes in de spindope werd gecorreleerd met verbeterde vezelmechanica. Opname van een trekking na het draaien, waarbij wordt opgemerkt dat de trekverhouding moet worden geoptimaliseerd voor een bepaald vezeltype, verbetert doorgaans ook de mechanica van zijdevezels door een combinatie van verbeterde moleculaire uitlijning en verbeterde conversie naar bijvoorbeeld kristallieten van β vellen die vezels versterken³². Ten slotte biedt het gebruik van verschillende omstandigheden tijdens de trekkingsfase na het centrifugeren een middel om vezeleigenschappen te moduleren. Blootstelling aan oplosmiddelen, onmiddellijk voorafgaand aan of tijdens de trekking, kan de mechanische en structurele eigenschappen van de vezel aanzienlijk veranderen^17,38, waarbij wordt opgemerkt dat verschillende spidroins verschillende oplosmiddelvoorkeuren en -toleranties zullen hebben (bijv. waarbij recombinante aciniforme vezels zeer watercompatibel zijn^26,31 versus recombinante pyriforme vezels die samentrekking ondergaan in water³⁸ versus vezels van chimeer pyriform-aciniform spidroin die de watercompatibiliteit van aciniform spidroin vertonen, ondanks dat dit minder dan de helft van het eiwit in massa is¹⁷).

Het beschreven protocol biedt een zeer aanpasbare en veelzijdige benadering om de spinbaarheid en vezeleigenschappen van recombinant spinnenzijde te evalueren en te optimaliseren. In alle gevallen moeten de resulterende vezeleigenschappen consequent en robuust worden geanalyseerd en vergeleken. Hier stellen we het gebruik van optische microscopie voor, inclusief gepolariseerde lichtmicroscopie, trekproeven en FTIR-spectromicroscopie als een "standaard toolkit" van technieken voor dit doel. Aanvullende biofysische en materiaalkarakteriseringstechnieken kunnen worden toegepast om het begrip van de resulterende vezels uit te breiden, maar deze reeks technieken biedt een uitstekende dekking van de belangrijkste eigenschappen van morfologie, intrafibrillaire uitlijning/anisotropie, mechanische prestaties en secundaire structurering van eiwitten. In het bijzonder, hoewel FTIR-spectromicroscopie een relatief eenvoudige manier biedt om de secundaire structurering van zijdevezels te evalueren en gepolariseerde lichtmicroscopie conclusies mogelijk maakt over de mate van verbeterde moleculaire uitlijning die is bereikt, zijn andere methodologieën zoals vastestof-NMR-spectroscopie^63,64, röntgendiffractie⁶⁴, gepolariseerde Raman-spectromicroscopie⁶⁵ en/of niet-lineaire optische microscopie⁵⁴ moet worden overwogen om de kristalliniteit, uitlijning en structurering binnen zijdevezels uitgebreider te evalueren voor volledige opheldering van de structuur-mechanica-relatie. Gezien de geschiktheid van natspinnen voor andere soorten eiwitten⁶⁶, verwachten we dat dit protocol algemeen toepasbaar zal zijn buiten recombinante zijde.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan K. Rainey meldt een relatie met 3DBioFibR Inc. die aandelen of aandelen en financieringssubsidies omvat. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit werk werd verstrekt door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants (RGPIN-2020-06083 tot X-QL en RGPIN-2023-05912 tot JKR), een Department of National Defence/NSERC Supplement (DGDND-2023-05912 tot JKR), een NSERC Alliance Grant (ALLRP-578541-22 tot JKR) in samenwerking met 3DBioFibR Inc, en NSERC Research Tools and Instruments Grants. AG is de ontvanger van een Nova Scotia Graduate Scholarship (NSGS-D) op doctoraal niveau en een Dalhousie Faculty of Medicine 2024 Graduate Studentship, gefinancierd met steun van de Molly Appeal Donors; HB is de ontvanger van een Vanier Canada Graduate Scholarship gefinancierd door NSERC, een Killam Predoctoral Scholarship (niveau 2) en een NSGS-D; en SE is de ontvanger van een NSERC Doctoral Postgraduate Scholarship (PGS-D), een NSERC/Department of National Defence Supplemental Funding Award en een Walter C. Sumner Memorial Fellowship. De auteurs zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Sophie Haverstock en Emily Smith.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,1,1,3,3,3-hexafluroropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Gebruikt voor dope bereiding
1725LTSN spuit met Luer tip gelaste naald	Hamilton	81100	Gebruikt voor wet-spinning
2,2,2-trifluoroethanol (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Gebruikt voor dope bereiding
Absolute ethanol	Fisher Scientific	BP28184	Gebruikt voor coagulatiebad
Azijnzuur	Fisher Scientific	A38-212	Gebruikt voor dope bereiding
Analytische balans	Mettler Toledo	XS105 Dual Range	Trektestapparaat
Calciumchloride (CaCl₂)	Sigma-Aldrich	C-3881	Gebruikt voor dope bereiding
Citroenzuur	Millipore Sigma	77-92-9	Gebruikt voor dope bereiding
Computer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Model B	Wet-spinning apparaat - biedt de mogelijkheid om een grafische gebruikersinterface te gebruiken om steppermotoren te besturen
Dinatriumwaterstoffosfaat (Na₂HPO₄)	Millipore Sigma	7558-79-4	Gebruikt voor dope bereiding
Mierenzuur	Fisher Scientific	A118-500	Gebruikt voor dope bereiding
Glazen plaatjes	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Gebruikt voor vezelmontage
Zoutzuur (HCl)	EM Science	HX0603-53	Gebruikt voor dope bereiding
MCT-A Gekoelde Detector	Thermo Fisher Scientific	840-199300	FTIR evaluatie van vezel secundaire structuur
Montageplaat	Fabrikant in-house		Wet-spinning apparaat
NEMA 17 Biopolaire Stepper Motor	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Wet-spinning apparaat - let op: meerdere motoren vereist om post-spin streching uit te voeren
Nicolet iN10 FTIR spectromicroscoop	Thermo Fisher Scientific	912A0604	FTIR evaluatie van vezel secundaire structuur
Nicolet iN10 Mapping Stage	Thermo Fisher Scientific	840-198800	FTIR evaluatie van vezel secundaire structuur
Nicolet iN10 Motorized Stage Joystick	Thermo Fisher Scientific	840-199800	FTIR evaluatie van vezel secundaire structuur
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	FTIR evaluatie van vezel secundaire structuur
OMNIC Picta ver. 1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	FTIR instrumentbesturingssoftware
OMNIC ver. 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	FTIR instrumentspecifieke dataverwerkings- en analysesoftware
Optische/Gepolariseerd licht microscoop	Zeiss Canada	Axio Observer A1	Omgekeerde optische microscoop
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Externe FTIR dataverwerkings- en analysesoftware
Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	P285-10	Gebruikt voor dope bereiding
Kaliumfosfaat dibasisch (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500	Gebruikt voor dope bereiding
Voeding	ALITOVE	ALT-1205	Wet-spinning apparaat - 12V 5A voedingsadapter converter AC 100-240V ingang met 5.5x2.5mm DC uitgangsconnector - let op: voor optimale prestaties kan een aparte voeding voor elke motor vereist zijn
Natriumacetaat	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Gebruikt voor dope bereiding
Natriumhydroxide (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Gebruikt voor dope bereiding
Spinrols	Fabrikant in-house		Gebruikt voor wet-spinning
Stepper Motor Kabels	XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Wet-spinning apparaat - biedt verbinding van stepper motor controllers naar stepper motoren
Stepper Motor Controller (Pi HAT)	Adafruit	DC & Stepper Motor HAT voor Raspberry Pi	Wet-spinning apparaat motor controller permutatie 1 - let op beperkte motorrotatiesnelheid van ~46 rpm
Stepper Motor Controller (USB)	Polulu	Tic T249	Wet-spinning apparaat motor controller permutatie 2 - gebruik wanneer rotatie hoger dan 46 rpm nodig kan zijn
Spuitpomp	KD Scientific	Model 100	Trektestapparaat en wet-spinning apparaat
Trifluorazijnzuur (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Gebruikt voor dope bereiding
Tris-hydrochloride	EMD Millipore	9310-500GM	Gebruikt voor dope bereiding
USB Hub	Acasis	B07Q3TYF15	Wet-spinning apparaat - 48W aangedreven USB Hub - ACASIS 10 poorten USB 3.0 Data Hub - met individuele aan/uit schakelaars en 12V/4A voedingsadapter USB splitter - interface tussen Raspberry Pi en Tic T249 stepper motor controllers

```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gosline, J. M., Demont, M. E., Denny, M. W. The structure and properties of spider silk. Endeavour. 10 (1), 37-43 (1986).
Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol. 202 (23), 3295-3303 (1999).
Lewis, R. V. Spider silk: Ancient ideas for new biomaterials. Chem Rev. 106 (9), 3762-3774 (2006).
Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New opportunities for an ancient material. Science. 329 (5991), 528-531 (2010).
Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int J Biol Macromol. 24 (2-3), 271-275 (1999).
Römer, L., Scheibel, T. The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion. 2 (4), 154-161 (2008).
Altman, G. H., et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24 (3), 401-416 (2003).
Fahnestock, S. R., Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 23-32 (1997).
Xia, X. -X., et al. Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (32), 14059-14063 (2010).
Fahnestock, S. R., Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 33-39 (1997).
Bogush, V. G., et al. Recombinant analogue of spidroin 2 for biomedical materials. Dokl Biochem Biophys. 441, 276-279 (2011).
Huemmerich, D., et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr Biol. 14 (22), 2070-2074 (2004).
Menassa, R., et al. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: Accumulation and field production. Plant Biotechnol J. 2 (5), 431-438 (2004).
Hauptmann, V., et al. Native-sized spider silk proteins synthesized in planta via intein-based multimerization. Transgenic Res. 22, 369-377 (2013).
Lazaris, A., et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295 (5554), 472-476 (2002).
Xu, H. T., et al. Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim Biotechnol. 18, 1-12 (2007).
Ghimire, A., Xu, L., Liu, X. Q., Rainey, J. K. A recombinant chimeric spider pyriform-aciniform silk with highly tunable mechanical performance. Mater Today Bio. 26, 101073(2024).
Wohlrab, S., et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 33 (28), 6650-6659 (2012).
Baker, L. A., et al. Nerve growth factor-binding engineered silk films promote neuronal attachment and neurite outgrowth. Adv Funct Mater. 32 (45), 2205178(2022).
Kluge, J. A., Rabotyagova, O., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol. 26 (5), 244-251 (2008).
Bakhshandeh, B., Nateghi, S. S., Gazani, M. M., Dehghani, Z., Mohammadzadeh, F. A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues. Int J Biol Macromol. 192, 258-271 (2021).
Hijirida, D. H., et al. 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys J. 71 (6), 3442-3447 (1996).
Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid Crystalline Spinning of Spider Silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
Doblhofer, E., Heidebrecht, A., Scheibel, T. To spin or not to spin: spider silk fibers and more. Appl Microbiol Biotechnol. 99, 9361-9380 (2015).
Koeppel, A., Holland, C. Progress and trends in artificial silk spinning: A systematic review. ACS Biomater Sci Eng. 3 (3), 226-237 (2017).
Xu, L., Weatherbee-Martin, N., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Recombinant silk fiber properties correlate to prefibrillar self-assembly. Small. 15 (12), 1805294(2019).
Teulé, F., et al. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat Protoc. 4 (3), 341-355 (2009).
Yang, M., Kawamura, J., Zhu, Z., Yamauchi, K., Asakura, T. Development of silk-like materials based on Bombyx mori and Nephila clavipes dragline silk fibroins. Polymer. 50 (1), 117-124 (2009).
Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., Fournier, M. J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Express Purif. 7 (4), 400-406 (1996).
Arcidiacono, S., et al. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
Weatherbee-Martin, N., et al. Identification of wet-spinning and post-spin stretching methods amenable to recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 17 (8), 2737-2746 (2016).
Schmuck, B., et al. Strategies for making high-performance artificial spider silk fibers. Adv Funct Mater. 34 (35), 2305040(2024).
Xu, L., et al. Structural and mechanical roles for the C-terminal nonrepetitive domain become apparent in recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 18, 3678-3686 (2017).
Xu, L., Rainey, J. K., Meng, Q., Liu, X. Q. Recombinant minimalist spider wrapping silk proteins capable of native-like fiber formation. PLoS One. 7 (11), e50227(2012).
Exler, J. H., Hümmerich, D., Scheibel, T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. Angew. Chem, Int Ed. 46 (19), 3559-3562 (2007).
Teulé, F., Furin, W. A., Cooper, A. R., Duncan, J. R., Lewis, R. V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers. J Mater Sci. 42, 8974-8985 (2007).
Khan, A. Q., et al. Innovations in spider silk-inspired artificial gel fibers: methods, properties, strengthening, functionality, and challenges. SusMat. 4 (3), e205(2024).
Simmons, J. R., Xu, L., Rainey, J. K. Recombinant pyriform silk fiber mechanics are modulated by wet-spinning conditions. ACS Biomater Sci Eng. 5 (10), 4985-4993 (2019).
Seidel, A., Liivak, O., Jelinski, L. W. Artificial spinning of spider silk. Macromolecules. 31 (19), 6733-6736 (1998).
Venkatesan, H., et al. Artificial spider silk is smart like natural one: Having humidity-sensitive shape memory with superior recovery stress. Mater Chem Front. 3 (11), 2472-2482 (2019).
Sommer, C., Scheibel, T. Suitable electrospinning approaches for recombinant spider silk proteins. Open Ceramics. 15, 100420(2023).
Wang, M. Y., et al. Dry-spinning of artificial spider silk ribbons from regenerated natural spidroin in an organic medium. Macromol Rapid Commun. 44 (12), 2300024(2023).
Chang, M., Zhang, X., Yang, Z. Artificial metal-ion doped spider silk fibers with excellent mechanical property and humidity-driven actuator property. Macromol Chem Phys. 226 (10), 2400502(2025).
Kang, E., et al. Digitally tunable physicochemical coding of material composition and topography in continuous microfibres. Nat Mater. 10 (11), 877-883 (2011).
Lin, B., et al. Overexpressed artificial spidroin based microneedle spinneret for 3D air spinning of hybrid spider silk. ACS Nano. 18 (37), 25778-25794 (2024).
Gonska, N., et al. Structure-function relationship of artificial spider silk fibers produced by straining flow spinning. Biomacromolecules. 21 (6), 2116-2124 (2020).
Blackledge, T. A., Cardullo, R. A., Hayashi, C. Y. Polarized light microscopy, variability in spider silk diameters, and the mechanical characterization of spider silk. Invert Biol. 124 (2), 165-173 (2005).
Greco, G., et al. Properties of biomimetic artificial spider silk fibers tuned by postspin bath incubation. Molecules. 25 (14), 3244(2020).
Andersson, M., et al. Biomimetic spinning of artificial spider silk from a chimeric minispidroin. Nat Chem Biol. 13 (3), 262-264 (2017).
Tremblay, M. L., et al. Spider wrapping silk fibre architecture arising from its modular soluble protein precursor. Sci Rep. 5 (1), 11502(2015).
Schmuck, B., et al. Impact of physio-chemical spinning conditions on the mechanical properties of biomimetic spider silk fibers. Commun Mater. 3 (1), 83(2022).
Yue, X., et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution. Mater Lett. 128, 175-178 (2014).
Sulekha, A., et al. An engineered recombinant spider silk protein providing disulfide-locked control over self-assembly and fiber formation. Adv Funct Mater. 35 (15), 2420254(2025).
Harvey, M., Ghimire, A., Cisek, R., Kreplak, L., Rainey, J. K., Tokarz, D. Polarization-resolved second harmonic generation microscopy of silk fibers is sensitive to β-sheet orientation and molecular structure. ACS Appl Bio Mater. 8 (6), 5229-5238 (2025).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Huan, Y., et al. Experimental study of the mechanical properties of a novel supramolecular polymer filament using a microtensile tester based on electronic balance. Exp Tech. 40, 737-742 (2014).
Hu, X., Kaplan, D., Cebe, P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy. Macromolecules. 39 (18), 6161-6170 (2006).
Breslauer, D. N. Current progress on scale-up and commercialization of microbially-produced silk. Adv Funct Mater. 35 (15), 2408386(2025).
Branković, M., et al. Review of spider silk applications in biomedical and tissue engineering. Biomimetics. 9 (3), 169(2024).
Pan, L., et al. A supertough electro-tendon based on spider silk composites. Nat Commun. 11 (1), 1332(2020).
Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
Malay, A. D., et al. Spider silk self-assembly via modular liquid-liquid phase separation and nanofibrillation. Sci Adv. 6 (45), eabb6030(2020).
Asakura, T., Naito, A. Structure of spider silk studied with solid-state NMR. Adv Funct Mater. 35 (15), 2407544(2024).
Yarger, J. L., Cherry, B. R., Van Der Vaart, A. Uncovering the structure-function relationship in spider silk. Nat Rev Mater. 3 (3), 1-11 (2018).
Lefèvre, T., Paquet-Mercier, F., Rioux-Dubé, J. F., Pézolet, M. Structure of silk by Raman spectromicroscopy: from the spinning glands to the fibers. Biopolymers. 97 (6), 322-336 (2012).
Schiller, T., Scheibel, T. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications. Commun Mater. 5 (1), 56(2024).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

Trefwoorden

Productie van spinnenzijde handmatig trekken van zijde natspinnen van zijde optimalisatie van zijdevezels bereiding van spindoop nabehandeling door trekken optische microscopie trekproeven FTIR spectromicroscopie

Optimaliseren en evalueren van handtekenen en nat spinnen voor de productie van recombinante spinragvezels

In dit artikel

Erratum-melding

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Erratum

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen