Muizen-ischiaszenuwtranssectie/resuturprocedure voor het bestuderen van zenuwherstel en functioneel herstel

Summary

Dit protocol beschrijft een heupdoorsnijding en een resuturmodel bij muizen om perifere zenuwregeneratie te bestuderen met behulp van volwassen dorsale wortelganglionneuronen. Het maakt in vivo analyse mogelijk van axonhergroei, spierrenervatie en functioneel herstel na zenuwbeschadiging.

Abstract

Zenuwherstel is cruciaal voor het herstellen van de functie na een axonaal letsel. Echter, volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS) hebben een beperkt vermogen om hun axonen na een verwonding te regenereren vanwege verminderde intrinsieke groeicapaciteit en een vijandige omgeving. Daarentegen vertonen neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS) robuust regeneratief potentieel. Onder hen staan volwassen dorsale wortelganglion (DRG) neuronen vooral bekend om hun vermogen om effectief te regenereren na perifere zenuwletsels, waardoor ze een ideaal model zijn voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen achter zenuwherstel. Hier wordt een aangepaste microsuturtechniek, genaamd "lus-voor-doorsnijding", beschreven voor het genereren van een heupdoorsnijdings- en resuturmodel bij muizen, gevolgd door analyse van axonregeneratie. Gedragsbeoordelingen en spierrenervatie worden ook aangetoond om functioneel herstel te evalueren. Na het doorsnijden en opnieuw hechten vertonen dieren aanvankelijk gedragsproblemen, maar volledig herstel wordt doorgaans 30 dagen na het letsel waargenomen. Het toepassen van medicijnen die axonale fusie bevorderen op de plaats van de verwonding versnelt het functionele herstel aanzienlijk. Dit modelsysteem biedt een krachtig hulpmiddel om de mechanismen te onderzoeken die zenuwherstel van zoogdieren in vivo regelen.

Introduction

Axonaal letsel is een veelvoorkomend en ernstig gevolg van hersen- en ruggenmergschade, vaak veroorzaakt door traumatische verwondingen, neurotoxines of neurologische aandoeningen die de neurale connectiviteit verstoren en axonale regeneratie ^1,2 belemmeren. Niet alle neuronen bezitten een intrinsieke regeneratiecapaciteit, wat cruciaal is voor het herstel van doorgesneden axonen. De snelheid van axonale regeneratie wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder het intrinsieke groeipotentieel van de neuron, de efficiëntie van de eiwitsynthese, cytoskeletdynamiek, het verwijderen van myelineresten en de beschikbaarheid van groeifactoren ^3,4.

In het centrale zenuwstelsel (CNS) van volwassen zoogdieren leidt axonale schade tot een verminderd regeneratief vermogen, voornamelijk door een gebrek aan intrinsieke groeibevorderende factoren en de aanwezigheid van remmende extrinsieke signalen ^1,5. Daarentegen bezitten axonen in het perifere zenuwstelsel (PNS) een robuust vermogen om te regenereren na een blessure, dankzij de intrinsieke zelfherstelmechanismen van perifere neuronen en de snelle reactivatie van pro-regeneratieve groeiprogramma's. Bij letsel raakt het distale segment van het axon los van de neuronale soma en ondergaat Wallerische degeneratie, gekenmerkt door axonale desintegratie en fragmentatie ^6,7. Efficiënte verwijdering van axonale en myelineresten door gliacellen is essentieel voor succesvolle regeneratie, omdat dit littekenvorming voorkomt die de axonale groei kan belemmeren ^3,8. Dit proces, samen met cytoskeletremodellering van beschadigde axonen, ondersteunt de hergroei van de proximale stomp en faciliteert de renervatie van het doel. Deze gebeurtenissen vinden plaats in gedeeltelijk overlappende fasen, waarin door blessures veroorzaakte activatie van transcriptiefactoren zoals ATF3 en c-Jun pro-regeneratieve genexpressieprogramma's^{bevordert 4,9,10}.

Regeneratieve axonale fusie vertegenwoordigt een efficiënt mechanisme om neuronale connectiviteit te herstellen na axonale schade¹¹. Dit proces werd voor het eerst beschreven bij de rivierkreeft Procambarus clarkii in 1967¹² en is sindsdien gedocumenteerd bij meerdere soorten^{13, 14, 15, 16}, waaronder Caenorhabditis elegans¹⁷. Hoewel direct bewijs voor axonale fusie bij zoogdieren beperkt blijft, zijn fusie-inducerende strategieën met succes toegepast om zenuwherstel^te verbeteren. Opmerkelijk is dat de chemische stof fusogeen polyethyleenglycol (PEG) het membraanafsluiten bevordert en is aangetoond dat het functioneel herstel bevordert na zowel perifere zenuw- als ruggenmergletsels in zoogdiermodellen 18,19,20,21,22,23,24. Recente bevindingen geven aan dat de uitputting van glutathionperoxidase (GPX) voldoende is om axonfusie bij C. elegans²⁵ te bevorderen. Evenzo vertoonden Gpx4 conditionele knockoutmuizen of die behandeld werden met de GPX-remmer ML162 versneld functioneel herstel na een doorsnijding van de ischiaszenuw, mogelijk via versterkte axonale fusie²⁵.

De ischiaszenuw is een gemengde zenuw die bestaat uit sensorische, somatisch-motorische en autonome motorische axonen²⁶. Het ontspringt uit de L4- en L5-spinale segmenten bij ratten²⁷, en uit de L3- en L4-segmenten bij muizen²⁸. Vanwege de toegankelijkheid en anatomische consistentie is ischiaszenuwbeschadiging een van de meest gebruikte modellen geworden voor het bestuderen van perifere zenuwregeneratie^29,30. Deze modellen maken het mogelijk om zowel intrinsieke neuronale mechanismen als extrinsieke omgevingsfactoren te onderzoeken die axonale groei en functioneel herstel beïnvloeden ^3,4,9. Het gebruik van ischiaszenuwvernauwing als experimenteel paradigma in de neurowetenschap dateert uit de late 19e eeuw²⁹. Naast zenuwvernauwingsmodellen wordt zenuwdoorsnijding veel gebruikt om axonregeneratie en functioneel herstel te bestuderen. De klassieke doorsnijding van de ischiaszenuw gevolgd door hechting bij muizen is echter vaak minder reproduceerbaar en betrouwbaar dan bij ratten, vanwege de kleine omvang en kwetsbare textuur van de zenuw³¹.

Met behulp van een aangepast chiasdoorsnijdings- en resuturmodel, genaamd "lus-voor-doorsnijding", werden reproduceerbare doorsnijding van ischiaszenuwen en resuturen succesvol^{gegenereerd 25}. Deze aanpak elimineert de noodzaak om na de doorsnijding van de zenuw te behandelen door de hechting vooraf in te brengen vóór het snijden, waardoor mechanische stress wordt verminderd en variabiliteit door chirurgische techniek wordt geminimaliseerd. Matige niveaus van GPX-modulatie werden gevonden als bijdragen aan functioneel herstel na volledige doorsnijding van de muis ischiaszenuw²⁵. Co-behandeling van de lage concentraties ML162 (0,25 μM)³², GPX-remmer en polyethyleenglycol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 op de heupzenuwtranssectie (SNT) / resuturlaesie verbeterde succesvol de gedragsscore die werd beoordeeld door pinprick, voetfoutasymmetrie en toe spreidingstest ^25,33.34. Geamputeerde distale axonfragmenten van zoogdier-dorsale wortelganglion (DRG) neuronen degenereren binnen 3 dagen, wat leidt tot verstoring van neuromusculaire verbindingen (NMJ)^6,35, en regeneratieve DRG-neuronen zullen spieren renerveren om hun functies te herstellen. SNT/resuture-ML162/PEG co-behandeling groep toonde geïnnerveerde NMJ's en verbeterde gedragsscores in het vroege tijdstip (3 dagen na de operatie), wat wijst op een vroeg herstel van de neuromusculaire functie²⁵.

Hier worden de "lus-voor-doorsnijding" microsuturmethode en medicijntoediening beschreven die bovenstaande waarnemingen bij muizen mogelijk maakten. Een eerder vastgesteld PEG-fusieprotocol, dat snelle reparatie van doorgesneden ratzenuwen mogelijk maakt, werd aangepast¹⁸. Polyethyleenglycol (PEG) werd aanvankelijk gerapporteerd als bevorderaar van exogene reconnectie van gesneden rivierkreeft-mediale reusachtige axonen (MGA) in vitro³⁶. PEG-fusieprotocollen verbeterden gedragsuitkomsten in 25%-30% van de onderzoeken met crush-severance letsels aan de ratten-ischiaszenuw, hoewel functioneel herstel niet werd waargenomen op vroege tijdstippen³⁴. Latere verfijningen namen het concept van endogene membraanafdichting^{over 37}. Na zenuwletsel is snelle plasmalemmale reparatie neuroprotectief en voorkomt neurodegeneratie. Ca²⁺-geïnduceerde ophoping van membraangebonden blaasjes faciliteert dit afsluitingsproces³⁸. Volledige zenuwdoorsnijding verstoort het axolema evenals de endoneuriale, perineuriale en epineuriale scheden op de plek van de laesie. Microsuturering van de epineuriale schede brengt de proximale en distale zenuwstomps uit. Tijdens de hechtingsstap vermindert het gebruik van Ca^2+-vrije hypotone zoutoplossing de vorming van membraangebonden blaasjes, waardoor de endoneuriële en perineuriële scheden open blijven en ze nauw kunnen worden benaderd door de epineuriële hechtingen. Hierna induceert de toepassing van zoutoplossing met Ca²⁺ vesikelophoping om de resterende plasmalemmale verstoornis¹⁸ te verzegelen.

In dit protocol werden volwassen FVB-muizen (8-10 weken oud) en C57BL/6 muizen gebruikt, en er werd geen stamspecifiek verschil waargenomen. De ischiaszenuw bij muizen bevindt zich ongeveer 1-2 mm onder de bilspier halverwege het dijbeen en is aanzienlijk dunner en fragieler dan bij ratten, wat grotere chirurgische precisie bij dissectie en hechting vereist. Er moet voorzichtig worden geworden om zenuwoverstrekking of overmatige manipulatie te voorkomen, wat het functionele herstel kan belemmeren. Deze aanpak houdt in dat de zenuw volledig wordt doorgesneden, wat resulteert in een fysieke opening tussen de proximale en distale stumps. Omdat deze kloof directe axonale regeneratie remt, vereist succesvol herstel doorgaans microchirurgische ingrepen of zenuwtransplantatie.

Aangezien de muisischiaszenuw dunner en delicater is dan die van de rat, is grotere chirurgische precisie vereist. Hoewel microhechting vaak wordt gebruikt, kan het onbedoeld extra trauma veroorzaken door overmatige manipulatie of herhaalde naaldpassages³⁹. Deze beperkingen kunnen variabiliteit introduceren en mogelijk de evaluatie van nieuwe behandelstrategieën verstoren. Daarom is het behalen van consistente chirurgische resultaten terwijl het minimaliseren van door hechtingen veroorzaakte zenuwschade essentieel is om functioneel herstel in zenuwdoorsnijdingsmodellen betrouwbaar te kunnen beoordelen. Met deze "lus-voor-doorsnijding"-methode werden reproduceerbare cciaticszenuwtranssectie- en resuturmodellen gegenereerd, en werden de effecten van dubbele behandeling met PEG en ML162 op functioneel herstel geëvalueerd. Over het algemeen, ondanks het wijdverbreide gebruik, brengt het model van de muis ischiaszenuwdoorsnijding technische uitdagingen met zich mee vanwege de kleine omvang en kwetsbaarheid van de zenuw. Deze hier beschreven aangepaste herhechtingsmethode behandelt een dringende behoefte aan een reproduceerbaar, gestandaardiseerd microchirurgisch protocol dat mechanische schade minimaliseert.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Texas Health Science Center in San Antonio (Protocolnummer: 20200082AR). Volwassen mannelijke en vrouwelijke FVB-muizen (8-10 weken oud, 20-25 g) werden gebruikt voor de hier beschreven JoVE-experimentele procedures. C57BL/6 muizen (8-10 weken oud, 20-25 g) werden alleen gebruikt bij voorlopige oefenoperaties voorafgaand aan de formele experimenten om de precisie van het hanteren en hechten te optimaliseren. Deze oefensessies bevestigden dat de "lus-voor-doorsnijding"-procedure vergelijkbare resultaten opleverde in beide stammen; daarom zijn alle formele gegevens die in dit manuscript worden gepresenteerd verkregen van FVB-muizen. In totaal werden aanvankelijk tien FVB-muizen (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) opgenomen voor een doorsnijding van ischiaszenuw, gevolgd door ML162 + PEG-behandeling. Een dier vertoonde een aangeboren anatomische variatie waarbij de ischiaszenuw zich vóór de doorsnijdingsplaats in twee hoofdtakken splitste, wat resulteerde in onvolledige chirurgie en uitsluiting van de analyse. Daarom werden gedrags- en histologische analyses uitgevoerd bij negen dieren (n = 9). Beide geslachten vertoonden vergelijkbaar regeneratief en gedragsmatig herstel, en er werden geen geslachtsspecifieke verschillen waargenomen. Een extra muis onderging dubbele hechtingpenetratie zonder zenuwdoorsnijding (schijncontrole) om de mogelijke impact van de hechtingsprocedure zelf op gedragsuitkomsten te beoordelen. Er werden geen merkbare verschillen in regeneratieve respons tussen de geslachten waargenomen. De dieren werden gehuisvest onder standaardomstandigheden met een licht/donker-cyclus van 12 uur, bij 75 °F en 40%-60% relatieve luchtvochtigheid, met ad libitum toegang tot voedsel en water. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt, en er werd geen merkbaar verschil waargenomen tussen mannelijke en vrouwelijke dieren. Chirurgische ingrepen werden uitgevoerd onder isoflurane anesthesie van het SomnoSuite low-flow anesthesiesysteem. Gedragstests werden uitgevoerd vanaf de postoperatieve dag 2 en herhaald op dag 4, 7, 10, 14, 18, 22 en 27, zoals aangegeven in de bijbehorende cijfers. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Doorsnijding/herhechting van ischiaszenuw en medicatiebehandeling

1. Plaats het dier op een verwarmd kussen waar de ischiaszenuw onder een stereo dissectiemicroscoop kan worden waargenomen (Figuur 1A).
2. Doof de muis met het SomnoSuite low-flow anesthesiesysteem.
   OPMERKING: Bevestig de diepte van de anesthesie door het ontbreken van reflexreacties, zoals een reactie op een knijp in de teen, voordat de operatie wordt gestart. Breng veterinaire oogzalf aan op de ogen om droogheid van het hoornvlies te voorkomen.
3. Scheer het haar op het dij en eromheen.
   OPMERKING: Verwijder de afgeschoren en losgelaten haren zo schoon mogelijk. Anders blijven de haren plakken aan de 10-0 nylon hechting en besmetten ze de ischiaszenuw. Achterblijvende haren kunnen voorzichtig worden verwijderd met laboratoriumtape of plakband na het scheren om een schoon chirurgisch veld te garanderen. Desinfecteer de operatieplek door het geschoren gebied achtereenvolgens af te vegen met 70% ethanol, betadine, en een laatste afveegbeurt met 70% ethanol met autoclaveerde wattenbolletjes.
4. Lokaliseer het dijbeen en maak een kleine huidincisie van ongeveer 1,0 cm (bereik 0,8-1,2 cm) op het midden van het dijbeen, ongeveer ~1 mm achterop en parallel aan het dijbeen met behulp van een fijne chirurgische schaar.
   1. Trek voorzichtig de gluteus maximus terug om de onderliggende biceps femoris bloot te leggen. Gebruik vervolgens de punten van de schaar om voorzichtig de voorste en achterste koppen van de biceps femoris te scheiden, zonder te knippen, om de ischiaszenuw onder de ischiasnotch bloot te leggen. Deze stappen worden uitgevoerd onder directe visuele observatie, niet onder de microscoop.
5. Trek de ischiaszenuw uit het lichaam met behulp van een microdissectiepincet om de operatie aan de ischiaszenuw te vergemakkelijken (Figuur 1A).
   OPMERKING: Zet de tang vast met tape om te voorkomen dat ze zich verder verspreiden dan een bepaald niveau en zo schade aan de ischiaszenuw minimaliseert. Plaats de punt van de tang onder de ischiaszenuw en til de ischiaszenuw omhoog met behulp van de muisdij als draaipunt. Zorg ervoor dat je de zenuw alleen zo ver optilt als nodig is om het hechten te vergemakkelijken, en vermijd het uitoefenen van spanning of het naar buiten trekken ervan, omdat overmatige rekking de axonen of omliggende structuren kan beschadigen.
6. Richt de microscoop op de blootgestelde ischiaszenuw. Vanaf deze stap gaat u door met stap 15 met een microscoop (Figuur 1A).
7. Penetreer tweemaal de heupzenuw met een nylon hechting van 10-0 (Figuur 1B,C). Ga naar stap 1-8 voor ongesneden controle. Ga naar stap 1-11 voor de zenuwdoorsnijding.
   OPMERKING: Er werden twee penetraties gemaakt op ongeveer één zenuwbreedte (~0,7 mm), symmetrisch geplaatst aan weerszijden van de beoogde doorsnijdingsplaats. Deze afstand zorgde voor een goede uitlijning van de proximale en distale stompjes terwijl mechanische belasting bij de laesie werd geminimaliseerd. Maak penetratie door het midden van de ischiaszenuw met de hechting, zodat de twee penetraties door de hechting precies parallel zijn. 10-0 hechtingen zijn klein en moeten met een superfijne pincet worden gecontroleerd. Niet-absorberbaar 10-0 nylon werd gebruikt omdat het uitstekende trekstabiliteit en minimale weefselreactiviteit biedt tijdens de 30-daagse observatieperiode. Dit materiaal wordt veel gebruikt in microchirurgische zenuwreparatiemodellen bij muizen en ratten^18,31. Oplosbare hechtingen werden niet gebruikt omdat geleidelijke degradatie de uitlijning van de doorgesneden zenuwstompjes kon verstoren voordat functioneel herstel voltooid is. Om de operator-afhankelijke variabiliteit te minimaliseren, werden alle chirurgische ingrepen uitgevoerd door één getrainde chirurg na uitgebreide microchirurgische praktijk onder een stereomicroscoop. De "lus-voor-doorsnijding"-methode vermindert de variabiliteit verder door de noodzaak van post-transsectie zenuwmanipulatie te elimineren, waardoor consistente uitlijning en spanning tussen dieren worden gegarandeerd. Dit vereist veel oefening en een hoog niveau van controle. Voordat ze dieroperaties uitvoeren, kunnen beginners het nuttig vinden om de hechtingsbeweging te oefenen met fijne synthetische draden zoals tandzijde om behendigheid en controle onder een stereomicroscoop te ontwikkelen.
8. Maak voorzichtig een knoop met de nylon hechting.
9. Plaats de blootgestelde ischiaszenuw onder de spierlaag en sluit de huid met 4-0 nylon hechtingen.
10. Bepaal dat dubbele penetratie van de ischiaszenuw met een 10-0 nylon hechting geen invloed heeft op het gedrag van de muis.
    OPMERKING: Ter bevestiging hiervan werden muizen die dubbele hechting doordrongen zonder doorsnijding onderworpen aan dezelfde gedragstests als in de experimentele groepen, waaronder speldenprik, voetfoutasymmetrie en teenspreiding. Deze muizen behaalden consequent volledige scores gelijk aan niet-geopereerde wildtypecontroles, wat aangeeft dat de hechtingprocedure alleen de functie van ischiaszenuw niet aantastte.
11. Knip de ischiaszenuw halverwege tussen de twee 10-0 nylon hechtingen met een scalpel (Figuur 1D).
    OPMERKING: Om variabiliteit te minimaliseren werden alle operaties uitgevoerd door dezelfde getrainde onderzoeker met een gestandaardiseerde procedure. Daarnaast minimaliseert het "lus-voor-doorsnijding"-ontwerp inherent de variabiliteit door het vermijden van post-doorsnijding zenuwbehandeling, waardoor consistente hechtingsplaatsing en spanning bij alle dieren worden gegarandeerd. De positie van de hechtingen werd gecontroleerd onder een dissectiemicroscoop om uniformiteit tussen dieren te waarborgen.
12. Leg de pincet weg.
13. Was de gesneden zenuw met Ca^2+-vrije fosfaatgeborde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7,4), bereid zonder calciumchloride.
    OPMERKING: Spoel de doorgesneden zenuwstomp ongeveer 10-20 seconden met calciumvrije PBS om bloed te verwijderen en voortijdige afsluiting te voorkomen. Het opnieuw hechten moet snel binnen 1-2 minuten worden afgerond om de uitlijning en de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden.
14. Verwijder de Ca^2+-vrije PBS door deze op te nemen met een zakdoek.
15. Maak voorzichtig een knoop met de nylon hechting (Figuur 1E). Ga door naar Stap 20 als drugsbehandeling niet gepland of vereist is.
    OPMERKING: Voor microsuturering werd een standaard vierkante knoop gebruikt, bestaande uit twee tegenovergestelde slagen die zachtjes werden aangespannen met fijne pincetten onder een stereomicroscoop. De twee doorgesneden axonen die door de hechting verbonden zijn, keren terug naar een vorm die dicht bij hun oorspronkelijke vorm ligt. Het opnieuw verbinden van een doorgesneden bloedvat kan een visuele aanwijzing zijn dat de proximale en distale zenuwstomps goed uitgelijnd zijn. Tijdens de procedure moet het weefsel vers en vochtig lijken, zonder bleekheid of compressie. Vermijd het te strak vastbinden van de hechting, omdat dit bloedvaten kan doen instorten of de zenuw kan vervormen. Zorg ervoor dat de zenuwuiteinden zonder spanning worden benaderd voordat je de laatste knoop legt. Indien nodig, verplaats je het ledemaat voorzichtig om de natuurlijke uitlijning te bevorderen in plaats van aan de zenuw te trekken, omdat overmatige spanning het risico op neuroom of fibrose kan vergroten.
16. Plaats 0,25 μM ML162 in DMSO, verdund in PBS, op de gehechte ischiaszenuw met een spuit. Laat de gehechte ischiaszenuw 1 minuut in het medicijn worden ondergedompeld.
17. Verwijder de ML162 door deze op te nemen met een steriel wattenstaafje.
18. Breng 500 mM PEG in gedestilleerd water, voorverwarmd tot 37 °C, op de gehechte ischiaszenuw met een spuit. Laat de gehechte ischiaszenuw 1 minuut in het medicijn worden ondergedompeld.
    OPMERKING: 500 mM PEG is een dichte oplossing die bij werkkamertemperatuur vast kan worden. Plaats de spuit tijdens de werking op een verwarmde pad om ervoor te zorgen dat de PEG vloeibaar blijft. Men denkt dat PEG membraanfusie bevordert door watermoleculen te verwijderen tussen aangrenzende lipidedubbellagen, waardoor nauw membraancontact en spontane fusie mogelijk worden. Hoewel het precieze moleculaire mechanisme nog onderzocht wordt, is aangetoond dat deze aanpak de axonale continuïteit bevordert en het functionele herstel in modellen van perifere zenuwletsel verbetert.
19. Verwijder de PEG door het op te nemen met een zakdoekje.
20. Was de gehechte zenuw met PBS dat Ca²⁺ bevat (PBS aangevuld met 1 mM CaCl₂; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfaatbuffer, pH7,4).
21. Verwijder het PBS met Ca²⁺ door het op te nemen met een tissue en een zakdoek.
22. Plaats de blootgestelde ischiaszenuw onder de spierlaag en sluit de huid met 4-0 nylon hechtingen.
23. Zodra het dier is hersteld van de narcose, zet het terug in de kooi.
    OPMERKING: Na het sluiten van de huid werd de operatieplek behandeld met een plaatselijke antibioticazalf met pijnstiller. Elk dier werd op een verwarmingskussen gecontroleerd totdat het voldoende bewustzijn had teruggekregen om de sternale ligpositie te behouden. Dieren werden vervolgens individueel gehuisvest en pas na volledig herstel van de motoriek weer in hun groep teruggebracht. Hoewel de chirurgische omgeving niet onder een laminaire stroomkap werd gehandhaafd, werden alle chirurgische instrumenten gesteriliseerd en werden de procedures uitgevoerd met aseptische techniek met handschoenen en steriele instrumenten.

2. Gedragstest - Pinprik.

OPMERKING: Om de mechanische gevoeligheid met hoge drempels na letsel³³ te beoordelen.

1. Plaats de muis in een draadgaasraster en laat hem 30 minuten vrij rondlopen om te wennen aan de nieuwe omgeving.
2. Het meest laterale deel van het plantaire oppervlak van de achterpoot was verdeeld in 5 gebieden (A tot E). Breng de Austerlitz (maat 000) voorzichtig aan op het plantaire oppervlak van de ipsilaterale poot. De speldenprik werd twee keer aangebracht van de meest laterale teen (gebied A) tot aan de hiel (gebied E).
   OPMERKING: Dring niet door de huid.
   OPMERKING: Een reactie werd als positief beschouwd toen het dier snel zijn poot van de twee speldenprikkels verwijderde. De muis kreeg een beoordeling van 1 voor dit gebied en werd daarna getest voor het volgende (maximaal 5). Als geen van de aanmeldingen een positieve reactie opleverde, was het totaalcijfer 0. Gebruik het saphenus-territorium van dezelfde ipsilaterale zijde als positieve controle. Het zal altijd een positieve reactie oproepen.

3. Gedragstest - Voetfout (FF) asymmetrie

OPMERKING: Om te meten hoe goed ischiasaxonen meer proximale spieren innerveren:³⁴.

1. Laat de dieren vrij rondlopen op een gaasrooster dat op de kooi is verhoogd om de omgeving te laten wennen. Eén proef bestaat uit in totaal 50 stappen per achterpoot.
2. Score als de dieren een fout maken. De beoordelingscriteria zijn als volgt.
   Score 1: Gedeeltelijke schuld. Teruggetrokken voordat het been helemaal naar de dij viel.
   Score 2: Volledige schuld. Viel helemaal af tot in het kruis.
3. Bereken de composietvoetfoutscore van alle gewonde en niet-gewonde achterpoten van alle dieren bij elke postoperatieve periode.
   Samengestelde voetfoutscore = (# gedeeltelijke breuken x 1) + (# volledige breuken x 2)
4. Deel de composietvoetfoutscore door 50 (totale stappen/ledemaat) om het percentage fout voor elk achterbeen te verkrijgen.
   % voetfout = Samengestelde voetfoutscore/50 (totale stappen) x 100%
5. Trek de voetfouten in het gewonde achterpoot af van het aandeel voetfouten in het intacte achterpoot om een asymmetriescore voor elk dier op een bepaald postoperatief moment te verkrijgen.
   Voetfout (FF) asymmetriescore = %FF (intact ledemaat) - %FF (gewond ledemaat)

4. Gedragstest - Toe-spreiding

OPMERKING: Om het motorische herstel na zenuwletsel te beoordelen. Volgens een eerdere studie is de test voor de teenspreiding gevoeliger dan de ganganalyse om het herstel van de motorische functie na ischiaszenuwletsel³⁰ te detecteren.

1. Bedek het dier voorzichtig met een stuk doek en til de staart op voor een goed zicht op de achterpoten.
   OPMERKING: Alternatief: Pak voorzichtig de nek van de muis, fix de staart, draai hem om en laat de muis kronkelen om de beweging van de teen te observeren.
2. Ken de toe spreidingsscore als volgt toe:
   Score 2: Volledige spreiding. Definieer als een volledige, brede en aanhoudende spreiding van alle tenen gedurende minstens 2 seconden.
   Score 1: Middelmatige spreiding. Elke beweging die geen volledige spreidingsscore bereikt. Licht trillen, of gedeeltelijke beweging.
   Score 0: Geen spreading. Helemaal geen beweging.
   OPMERKING: Alle gedragsbeoordelingen (speldenprik, voetfout en teenspreiding) zijn dubbel gecontroleerd door een onderzoeker die blind was voor behandelgroepen. Dieren werden op het moment van de operatie willekeurig toegewezen aan behandelgroepen volgens het ontwerp dat in onze eerdere studie werd gebruikt (Ko et ^al.25), die vier experimentele aandoeningen omvatte (alleen herhechting, PEG, ML162, ML162 + PEG). Het huidige artikel presenteert gegevens van de ML162 + PEG-groep, onafhankelijk geanalyseerd terwijl de oorspronkelijke experimentele nauwkeurigheid behouden blijft.

5. Weefselperfusie en verwerking voor histologie

1. Diep verdoof het dier en voer transcardiale perfusie uit met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) via de linker ventrikel.
2. Incère het rechter atrium om volledige bloedafvoer mogelijk te maken.
3. Dompel de verzamelde weefsels onder in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C 's nachts voor fixatie.
4. Was de vaste weefsels drie keer met PBS en breng ze dan 's nachts in PBS op 4 °C.
5. Cryoprotectie de weefsels door ze 's nachts in 30% sucrose bij 4 °C te dompelen.
6. Leg de weefsels in OCT-verbinding, vries ze in en snijd ze in op een dikte van 12 μm met een cryostaat.
7. Bewaar weefselblokken bij -80 °C en cryosecties bij -20 °C tot gebruik.
8. Voor alleen het verzamelen van ischiaszenuwen moet perfusie worden weggelaten, omdat het bloedgehalte de immunokleuringskwaliteit in deze perifere weefsels niet significant beïnvloedt.

Results

Het vorige PEG-fusieprotocol¹⁸ werd aangepast om consistente chirurgische resultaten te behouden en zenuwschade veroorzaakt door hechting²⁵ te minimaliseren. Door de hechting door de zenuw te plaatsen vóór de doorsnijding, werd schade veroorzaakt door knijpen met een pincet of prikken met een naald na de doorsnijding tot een minimum beperkt. Om het effect te testen van het vastbinden van een hechting die een zenuw binnendringt op de functie...

Discussion

Zenuwregeneratiestudies met zenuwdoorsnijdingsmodellen worden veel uitgevoerd op de zenuwischiaszenuw^{van de muis 31,39}. Door zijn kleine formaat en zachte textuur is de muizenischiaszenuw echter moeilijk voorzichtig te hanteren met chirurgische instrumenten, en het weefsel is gevoelig voor scheuren tijdens het hechten. Het microsuturproces, dat vaak overmatige manipulatie inhoudt, kan leiden tot zenuwvervorming en trauma. Zelfs w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumostar-Biology	11295-51	Een in elke hand. Je hebt er twee nodig om een 10-0 nylon naad vast te klemmen.
10-0 nylon naad	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0 nylon naad	Matrix Wizard	0197
Anti-beta-tubulin	R&D Systems	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz maat 000			Voor Pinprick test
CF488 geconjugeerd-alpha-bungarotoxine	Biotium	00005
Dissectie schaar	Kent Scientific
Fijne naai schaar	Kent Scientific
Iris forceps	Kent Scientific
K&H Small Animal Heated Pad	K&H pet products
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Muis chirurgisch kit	Kent Scientific
Naaldhouder	Kent Scientific
Polyethyleenglycol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific		Voor isofluraan anesthesie
Splitter forcep			Gebaten om de nervus ischiadicus bloot te leggen.