Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Door geneesmiddelen geïnduceerde senescentie in levercellen bevordert polarisatie van M2-macrofagen: implicaties voor tyrosinekinaseremmer-geassocieerde hepatotoxiciteit

899 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier bestuderen we hepatotoxiciteit veroorzaakt door lapatinib en neratinib door middel van SASP-gestuurde macrofaagpolarisatie, die een dieper mechanistisch begrip biedt dat verder gaat dan traditionele toxiciteitstests. Deze benadering laat zien hoe senescente hepatocyten de immuunrespons beïnvloeden. Dit is met name waardevol voor het beoordelen van geneesmiddeleffecten op de lange termijn en het ontdekken van nieuwe therapeutische doelen voor het beheersen van door geneesmiddelen geïnduceerde hepatotoxiciteit.

Samenvatting

Lapatinib en neratinib zijn tyrosinekinaseremmers (TKI's) die zijn goedgekeurd voor de behandeling van HER2-positieve gemetastaseerde borstkanker, maar hun klinisch gebruik wordt beperkt door hepatotoxiciteit. In hepatocyten produceren cytochroom P450-enzymen reactieve metabolieten van deze geneesmiddelen, wat DNA-schade, mitochondriale disfunctie en oxidatieve stress veroorzaakt, wat leidt tot beschadiging van de hepatocyten. Deze cellulaire stress veroorzaakt senescentie van hepatocyten, een toestand van groeistilstand die gepaard gaat met de secretie van pro-inflammatoire en weefselremodellerende factoren die het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP) worden genoemd. SASP wijzigt de micro-omgeving van de lever aanzienlijk, beïnvloedt het gedrag van immuuncellen en verergert weefselbeschadiging. We tonen aan dat lapatinib en neratinib senescentie en SASP induceren in de HepG2-levercellijn. Bovendien bevordert SASP van deze senescente cellen M2-achtige polarisatie van RAW264.7-macrofagen. Hoewel M2-macrofagen in verband worden gebracht met ontstekingsremmende reacties en weefselherstel, kan hun overmatige of langdurige activiteit leiden tot weefselbeschadiging en fibrose. Onze bevindingen benadrukken een mechanisme waarmee TKI-geïnduceerde hepatocytensenescentie en SASP de immuunrespons moduleren en kunnen bijdragen aan levertoxiciteit bij borstkankerpatiënten. Dit onderstreept het belang van het richten op senescente cellen of SASP-factoren om levertoxiciteit te verminderen en de behandelingsresultaten te verbeteren, waardoor de identificatie van effectieve senotherapeutica een essentieel onderzoeksaandachtspunt is. Er is geen literatuurrapport dat het effect van TKI-geïnduceerd levercelsecretoom op macrofaagpolarisatie aantoont.

Inleiding

Lapatinib en neratinib, beide tyrosinekinaseremmers met een klein molecuul (TKI), kregen in 2007 en 2017 goedkeuring van de FDA voor de behandeling van uitgezaaide borstkanker1. Van deze geneesmiddelen is bekend dat ze de humane epidermale groeifactorreceptor 2, HER22, remmen, een receptortyrosinekinase die tot overexpressie wordt gebracht bij bepaalde vormen van borstkanker3. Ondanks hun klinische succes worden lapatinib en neratinib ook in verband gebracht met bijwerkingen, met name hepatotoxiciteit 4,5. Acute leverbeschadiging, die zich manifesteert door verhoogde aminotransferasespiegels, komt voor bij ongeveer 14% van de patiënten die een behandeling met lapatinib of neratinibondergaan 6. De hepatotoxiciteit wordt grotendeels toegeschreven aan het levermetabolisme van deze geneesmiddelen, waarbij cytochroom P450 (CYP) enzymen betrokken zijn, voornamelijk CYP3A4/5 7,8. Deze enzymen katalyseren de vorming van chinon-imine-tussenproducten, die elektrofiel en zeer reactief zijn 9,10. Deze reactieve metabolieten, waaronder O-gedealkyleerd lapatinib, N-gedealkyleerd lapatinib en N-hydroxy lapatinib, O-gedealkyleerd neratinib en N-gedemethyleerd neratinib, kunnen covalente adducten vormen met cellulaire macromoleculen, waardoor de normale cellulaire functies worden verstoord en uiteindelijk resulterend in leverbeschadiging11.

Reactieve metabolieten van lapatinib en neratinib kunnen ook oxidatieve stress veroorzaken, een belangrijke trigger van cellulaire veroudering12. Cellulaire senescentie is een door groei gestopte maar metabolisch actieve toestand, gekenmerkt door de afscheiding van verschillende pro-inflammatoire cytokines, groeifactoren en proteasen. Dit secretoire fenotype staat bekend als het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)13,14,15. De SASP kan de omringende micro-omgeving diepgaand beïnvloeden, waardoor vaak ontstekingen en weefselremodellering worden bevorderd. In de context van kankertherapie kan de SASP de kankerstamcelpopulatie verrijken en de immuunrespons wijzigen om de overleving van de tumor te bevorderen16. Bovendien kunnen de inflammatoire cytokinen weefselbeschadiging verergeren. We speculeerden dat bij patiënten die werden behandeld met lapatinib en neratinib, de leverbeschadiging gedeeltelijk wordt bijgedragen door TKI-geïnduceerde senescentie en pro-inflammatoire SASP-productie.

Onze experimenten toonden aan dat lapatinib en neratinib de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) in levercellen induceren, wat leidt tot DNA-schade en mitochondriale disfunctie, wat op zijn beurt cellulaire veroudering veroorzaakt. Deze veroudering kan bijdragen aan door lapatinib/neratinib geïnduceerde hepatotoxiciteit door SASP-factoren vrij te geven, die de polarisatie van macrofagen kunnen beïnvloeden.

Macrofagen spelen een cruciale rol in de immuunrespons en hun functionele fenotype kan verschuiven als reactie op verschillende stimuli17,18. Het klassieke M1-macrofaagfenotype wordt doorgaans geassocieerd met pro-inflammatoire reacties, waaronder de productie van cytokines zoals TNF-α en IL-1β, en wordt over het algemeen beschouwd als een marker van acute ontsteking19,20. Daarentegen wordt het fenotype van de M2-macrofaag geassocieerd met fibrose, weefselherstel21, immunosuppressie en een reactie op chronische ontsteking22,23. De inflammatoire cytokinen in de SASP kunnen de polarisatie van macrofagen beïnvloeden, waardoor de conversie van M1-macrofagen naar een M2-achtig fenotype23 wordt bevorderd. Deze verschuiving in polarisatie kan aanzienlijke implicaties hebben voor de immuunmicro-omgeving, wat mogelijk kan leiden tot immunosuppressie, tumorprogressie en hermodellering van weefselarchitectuur.

Om de macrofaagpolarisatie geïnduceerd door lapatinib en neratinib te onderzoeken, gebruikten we de RAW264.7-cellijn, een muizenmacrofaagachtige cellijn die vaak wordt gebruikt in immunologisch onderzoek 24,25. RAW264.7-cellen zijn afgeleid van BALB/c-muizen en worden veel gebruikt om ontstekingen, fagocytose en immuunresponsen te bestuderen25. Ze reageren op verschillende stimuli, waaronder lipopolysacchariden (LPS), en zijn bijzonder waardevol voor het bestuderen van de macrofaagfunctie, de productie van cytokines en de biologie van kanker26. In deze studie werd HepG2, een menselijke hepatoomcellijn, behandeld met lapatinib en neratinib om de hepatotoxische effecten na te bootsen die bij patiënten werden waargenomen. De HepG2-cellijn wordt vaak gebruikt als onderzoeksmodel voor geneesmiddelmetabolisme en hepatotoxiciteit vanwege de menselijke oorsprong en de hepatocellulaire carcinoomlijn27. Na behandeling van de HepG2-cellen met de TKI's werden de geconditioneerde media verzameld en toegevoegd aan RAW264.7-cellen. De daaropvolgende fenotypische veranderingen van macrofagen werden gevolgd, met de nadruk op de vraag of de behandeling een verschuiving induceert van het pro-inflammatoire M1-fenotype naar het immunosuppressieve M2-fenotype.

Geneesmiddelgeïnduceerde hepatotoxiciteit wordt over het algemeen bestudeerd door middel van cytotoxiciteitstesten, beoordeling van ontstekingsmarkers en het gebruik van diermodellen. In vergelijking hiermee heeft onze methode voor het onderzoeken van TKI-lapatinib en neratinib-geïnduceerde hepatotoxiciteit door middel van senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)-factoren en hun invloed op macrofaagpolarisatie verschillende voordelen. Ten eerste legt onze methode een verband tussen SASP-factoren geproduceerd door door geneesmiddelen geïnduceerde senescente levercellen en aangeboren immuniteit, die verder kan worden gekoppeld aan weefselremodellering, chronische ontsteking en carcinogenese 28,29,30,31. Conventionele toxiciteitsschermen kunnen ons niet helpen de kortetermijninteracties tussen de lever en immuuncellen vast te leggen, noch kunnen ze de langetermijnimpact van TKI's op leverontsteking en fibrose onthullen, met name in de context van chronische blootstelling aan geneesmiddelen. In combinatie met een geschikte proteomics-benadering om SASP-bestanddelen te identificeren, kan deze techniek helpen bij het identificeren van voorspellende biomarkers van TKI-geïnduceerde hepatotoxiciteit en bij het ontwerpen van therapeutische interventies om deze te verminderen 29,30,31.

Voor implementatie moeten onderzoekers co-cultuur of geconditioneerde mediasystemen gebruiken met lever- en immuuncellijnen, zoals beschreven, en biomarkers van veroudering evalueren, evenals M1- en M2-macrofagen. Deze methode is het meest effectief voor de beoordeling van door geneesmiddelen geïnduceerde acute of chronische leverbeschadiging, of voor het verkennen van strategieën om off-target effecten van kankertherapieën te minimaliseren 29,30,31.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celcultuur

  1. Kweek HepG2-cellen in Modified Eagle Medium (MEM) hoge glucose met 10% foetaal runderserum (FBS) en RAW264.7-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose met 10% FBS bij 37 °C met 5% CO 2 en ververs elke 3 dagen.
    OPMERKING: Het gebruik van antibiotica wordt niet aanbevolen, tenzij er sprake is van schimmel- of bacteriële besmetting. RAW264.7-cellen groeien zeer snel en moeten na 2 dagen worden gepasseerd.

2. MTT-test

  1. Celtelling en celbeplating
    1. Kweek HepG2-cellen in een kweekschaaltje van 60 mm in een celcultuurincubator in volledige groeimedia (MEM + 10% FBS).
    2. Toen de cellen ongeveer 80% samenvloeiden, verwijder dan de groeimedia, spoel ze snel met 1 ml 1x PBS en voeg 600 μl 0,5x trypsine toe. Incubeer gedurende 5-6 minuten.
      OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een BSL 2-celkweekkast.
    3. Neutraliseer trypsine door 1,2 ml volledige groeimedia toe te voegen aan de BSL 2.
      OPMERKING: Om overmatige trypsinisatie te voorkomen, moeten volledige media worden toegevoegd, tweemaal het volume toegevoegde trypsine.
    4. Neem de celsuspensie in een microcentrifugebuis van 5 ml (MCT) en pellet deze naar beneden door te centrifugeren bij 180 g (1000 tpm) gedurende 3-4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    5. Gooi het supernatant weg, suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml media, pipetteer om te mengen als een enkele celsuspensie en tel met behulp van een hemocytometer onder een microscoop.
    6. Plaats vervolgens HepG2-cellen in een plaat met 96 putjes met 5000-7000 cellen per putje, in volledige groeimedia, in drievoud voor elke medicijndosis, en bewaar deze 12-16 uur in de incubator.
      OPMERKING: De celsamenvloeiing moet 50-60% zijn voor medicamenteuze behandeling en deze stap moet in de kap worden uitgevoerd.
  2. Medicamenteuze behandeling
    1. Bereid geleidelijk toenemende werkconcentraties van lapatinib en neratinib in dimethylsulfoxide (DMSO) voor uit de voorraadconcentratie (respectievelijk 30 mM en 3,5 mM) in de kap. De uiteindelijke concentraties zijn 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM voor lapatinib en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM voor neratinib in groeimedia (MEM + 5% FBS). Houd één controle zonder behandeling voor beide geneesmiddelen.
    2. Gooi de vorige media weg van de plaat met 96 putjes die cellen bevat, voeg 100 μL media toe met het medicijn en incubeer gedurende 48 uur in de incubator.
  3. Kleuring en kwantificering
    1. Voeg na 48 uur 10 μL 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromidekleurstof (MTT; 5 mg/ml) toe, los op in 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) in elk putje en incubeer gedurende ten minste 2 uur in de incubator totdat er paars gekleurde kristallen verschijnen.
      OPMERKING: Voeg de kleurstof rechtstreeks toe aan medicijnbevattende media en incubeer cellen niet langer dan 4 uur met kleurstof.
    2. Verwijder na incubatie de kleurstof, los de kristallen op in 100 μL DMSO in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten, gevolgd door het meten van de optische dichtheid (OD) bij 595 nm.
      OPMERKING: Deze stap kan buiten de afzuigkap worden uitgevoerd.

3. SA-β galactosidase-test

  1. Medicamenteuze behandeling
    1. Plaat HepG2-cellen in schaaltjes van 35 mm met een dichtheid van 40 x 104 cellen per plaat in drie sets, één voor lapatinib, één voor neratinib en één onbehandelde controle.
      OPMERKING: De stappen voor het tellen en plateren van cellen zijn zoals beschreven in stap 2.1.
    2. Voeg 1 μL lapatinib toe uit 5 mM werkvoorraad en 1,43 μL neratinib uit 3,5 mM hoofdvoorraad in 2 ml media om een uiteindelijke concentratie van 2,5 μM (subletale dosis) van lapatinib en neratinib te maken.
      OPMERKING: De subletale geneesmiddeldosis wordt geselecteerd volgens de celoverlevingsgrafiek in de MTT-test.
    3. Verwijder de vorige media uit de vaat en was ze eenmaal met 500 μL 1x PBS, voeg medicijnhoudende media toe (in de kap) en bewaar deze 48 uur in de broedmachine.
  2. Fixeren en beitsen
    1. Verwijder na 48 uur het medicijn, spoel het eenmaal snel met 500 μL 1x PBS en fixeer met 1,5 ml 2% formaldehyde en 0,2% glutaaraldehyde in 1x PBS gedurende 10 minuten bij RT.
    2. Was de platen na fixatie twee keer met 1 ml 1x PBS en zorg ervoor dat de fixeeroplossing correct wordt verwijderd. Voeg 1,5 ml kleuroplossing toe (40 mM citroenzuur/Na-fosfaatbuffer, 5 mM K4[Fe(CN)6], 5 mM K3[Fe(CN)6], 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 mg/ml X-gal in geautoclaveerd water) en incubeer gedurende 8 uur bij 37 °C zonder CO2.
      OPMERKING: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype; voor HepG2 mag de incubatietijd niet langer zijn dan 8 uur.
    3. Was na het kleuren de platen snel twee keer in 1 ml 1x PBS en maak helderveldbeelden met een vergroting van 20x en 40x met een epifluorescentiemicroscoop. Leg minimaal vier tot vijf velden vast voor elke behandelingsgroep.
      OPMERKING: Het volume van de fixeer- en kleuroplossing is afhankelijk van de plaatgrootte en alle stappen kunnen buiten de kap worden uitgevoerd.
  3. Kwantificering van afbeeldingen
    1. Maak een foto van een veld, tel het totale aantal cellen en de cellen met een blauw signaal. Bereken handmatig het percentage cellen met een blauw signaal. Bereken ten minste vier afbeeldingen, neem het gemiddelde, plot in een spreadsheetgrafiek en voer een t-toets uit.

4. ROS-detectie

  1. Celbeplating en medicamenteuze behandeling
    1. Plaat HepG2-cellen in schalen met glazen bodem van 35 mm met een dichtheid van 40 x 104 cellen per plaat in drie sets: één voor lapatinib, één voor neratinib en één onbehandelde controle.
      OPMERKING: De stappen voor het tellen en plateren van cellen zijn zoals beschreven in stap 2.1.
    2. Volg dezelfde behandelstrategie als beschreven in stap 3.1.
  2. Kleuring en beeldvorming
    1. Voeg na 48 uur behandeling 2 μM cel ROX dieprood reagens (5 mM voorraad), 1 μM Mito Tracker Green (1 mM voorraad) gedurende 30 minuten toe en ga de kleuring tegen met 500 nM nucleaire kleurstof Hoechst (500 μM voorraad).
      OPMERKING: Kleurstof moet in de kap worden toegevoegd en directe blootstelling aan licht moet worden vermeden. Tegenkleuring wordt gedaan door nucleaire kleurstof Hoechst toe te voegen tijdens de toediening van andere kleurstoffen.
    2. Verwijder na 30 minuten de kleurstof en was met 1x PBS om overtollige kleurstof en afbeelding te verwijderen met een confocale microscoop met een vergroting van 100x (olie-emersie, respectievelijk 640 nm, 488 nm en 405 nm excitatiegolflengte).
  3. Kwantificering van afbeeldingen
    1. Kwantificeer het signaal van cel ROX rood met behulp van Fiji ImageJ-software en vergelijk het met het signaal van de onbehandelde controle. Gebruik MitoTracker groen om aan te geven dat het signaal afkomstig is van mitochondriën. Voer na het uitzetten van de staafdiagrammen met gemiddelde waarden een t-toets uit.

5. Geconditioneerde media (CM) collectie

  1. Behandel HepG2-cellen met 2,5 μM lapatinib of neratinib gedurende 48 uur (behandelingsstrategie vergelijkbaar met stap 3.1, behalve voor dit experiment, plaat 70 x104 cellen in een schaaltje van 60 mm).
  2. Verwijder na 48 uur het medicijn en was het eenmaal met 500 μL 1x PBS.
  3. Voeg op de maximale dag van senescentie (na 48 uur medicamenteuze behandeling) 4 ml serumvrije MEM-media (zonder FBS of andere supplementen) toe aan de met het geneesmiddel behandelde cellen, evenals de onbehandelde controle gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Het volume van serumvrije media is afhankelijk van de plaatgrootte.
  4. Verzamel vervolgens de serumvrije media die al het secretoom bevatten, ook wel geconditioneerde media genoemd, en bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
    OPMERKING: Nadat de CM is verzameld, moet deze gedurende 5 minuten worden gecentrifugeerd bij 2800 g (4000 tpm) om dode cellen en ander cellulair vuil te verwijderen. RAW264.7-cellen worden meestal gekweekt in DMEM, maar CM wordt verzameld in MEM volgens de HepG2-kweekomstandigheden. Om de compatibiliteit te behouden, moeten geconditioneerde media worden gemengd met serumvrije DMEM in een verhouding van 1:1 voorafgaand aan RAW264.7-incubatie.

6. M1/M2-polarisatie in RAW264.7

  1. Cel plateren
    1. Volg de celtelling en de celbeplating zoals beschreven in stap 2.1, met uitzondering van de stap trypsinisatie. Voeg tijdens het trypsiniseren van RAW264.7-cellen 600-700 μL 0,5x trypsine toe, incubeer gedurende 15-20 minuten in de incubator en voor het neutraliseren van trypsine, voeg 2 ml groeimedia (DMEM + 10% FBS) toe en plaat 70 x104 cellen in een schaaltje van 60 mm in drie sets: lapatinib, neratinib en één onbehandelde controle.
  2. RAW264.7 inductie
    1. Verwijder de gewone groeimedia, was eenmaal met 1 ml 1x PBS en voeg de bijbehorende CM toe gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Voordat u de CM toevoegt, moet u deze conditioneren met serumvrije DMEM in een verhouding van 1:1, aangezien RAW264.7-cellen in DMEM groeien, dus het houden van de cellen in MEM zal stress veroorzaken, wat het resultaat kan belemmeren. Het kweken van RAW264.7 in CM (serumvrije media) gedurende 48 uur kan ook stress veroorzaken; In dat geval kan een incubatie van 24-30 uur worden uitgevoerd voordat de gegevens worden verzameld.
    2. Gooi na de incubatie de CM weg, was met 1 ml 1x PBS, voeg 600 μL trypsine toe aan elke plaat, incubeer gedurende 10 minuten en pellet vervolgens gedurende 3 minuten bij 180 g (1000 rpm) bij RT. Gebruik de pellet voor eiwitzuivering of bewaar deze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: De trypsinisatietijd is afhankelijk van het celtype en centrifugeren wordt niet aanbevolen boven 180 g.
  3. Eiwitisolatie en western blotting
    1. Bereid de lysisbuffer voor door radioimmunoprecipitatietest (RIPA), lysisbuffer en proteaseremmercocktail te mengen in een verhouding van 100:1. Voeg de lysisbuffer toe aan de celpellet, suspendeer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
      OPMERKING: Het volume van de lysisbuffer is afhankelijk van de grootte van het cellenpalet en lysis kan buiten de kap worden gedaan. Als de pellet bij -80 °C wordt bewaard, ontdooi de pellet dan eerst op ijs, centrifugeer hem kort en verwijder eventuele restmedia.
    2. Centrifugeer het cellysaat na de incubatie gedurende 30 minuten bij 20.000 g bij 4 °C. Verzamel het bovenstaande en ga verder voor western blot, of bewaar bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
    3. Bereid het eiwitmonster voor door 35-40 μg eiwit te nemen, voeg 1x laadkleurstof toe, verwarm gedurende 5-6 minuten op 95 °C, laat SDS-PAGE (10% en 12% acrylamidegel) op 90 V draaien en breng over naar nitrocellulosemembraan.
    4. OPMERKING: Voor meer gedetailleerde informatie over de westelijke vlek, zie Joubert et al.32.
    5. Controleer de expressie van M1- en M2-polarisatiemarkers door de vlek te ontwikkelen met behulp van een mierikswortelperoxidase (HRP) ontwikkelaar, iNOS (M1) en arginase1 (M2), respectievelijk met behulp van anti-NOS2- en anti-ARG1-antilichamen.
      OPMERKING: De concentratie voor zowel primaire antilichamen, anti-NOS2 en anti-ARG1 is 1:1000, en secundair anti-konijnenantilichaam is 1:10.000.
  4. Polarisatie van macrofagen met behulp van LPS en IFN-γ
    1. Plaat 70 x 104 RAW264.7 cellen in twee schotels van 60 mm.
      OPMERKING: De platingprocedure is vergelijkbaar met stap 6.1.
    2. Meng na 12-16 uur 4 μL 1 μg/ml lipopolysaccharide (LPS, voorraadconcentratie is 1 mg/ml) en 1,33 μL 33 ng/ml interferon-γ (IFN-γ, voorraadconcentratie is 100 μg/ml) in 4 ml groeimedia (DMEM + 10% FBS) en voeg toe aan de voorgeplateerde RAW264.7, waarbij één niet-geïnduceerde controle behouden blijft.
    3. Verzamel na 48 uur de celpellet via trypsinisatie, isoleer het eiwit, voer een western blot uit en controleer de expressie van respectievelijk iNOS (M1) en ARG1 (M2) met behulp van anti-iNOS- en anti-ARG1-antilichamen.
      OPMERKING: Al het celcultuurafval en biochemisch afval moet worden weggegooid in een bak voor biologisch gevaar, op de juiste manier worden geautoclaveerd en vervolgens worden weggegooid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd een reeks tests uitgevoerd om de impact van TKI-lapatinib en neratinib op hepatocellulair carcinoom (HepG2)-cellen en hun stroomafwaartse paracriene effecten op macrofagen te evalueren. HepG2-cellen werden behandeld met verschillende concentraties lapatinib of neratinib en de levensvatbaarheid van de cellen werd na 48 uur gemeten met behulp van de MTT-test (figuren 1A,B). Op basis van de overlevingscurves werd gek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige studie onderzoekt de indirecte effecten van behandeling met lapatinib of neratinib op de polarisatie van macrofagen door middel van geconditioneerde media die zijn verzameld uit met TKI behandelde HepG2-levercellen. Door gebruik te maken van RAW264.7-macrofagen zien we een M2-fenotype bij blootstelling aan de geconditioneerde media, zoals aangegeven door de opregulatie van ARG1. Morfologisch gezien vertoonden de behandelde macrofagen een karakteristieke vergrote en langwerpige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de Shiv Nadar Institution of Eminence voor de ondersteuning van de infrastructuur. Deze studie wordt gefinancierd door de subsidie van het Departement Wetenschap en Technologie CRG/2022/003242.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HepG2 cell lineNCCSAdherent cell line
RAW264.7 cell lineNCCSAdherent cell line
DMEM (Dulbacco's Modified Eagle Medium)HimediaAT066Hoge glucose, Poeder
MEM (Modified Eagle MediumGibco611100-053Poeder
PBS (Phosphate Buffer Saline)HimediaTS1101Poeder
Trypsin-EDTA SolutionHimediaTCL007Oplossing
FBS (Fetal Bovine Serum)HimediaRM1112Vloeistof
MTT DyeHimediaTC191Poeder
LapatinibSelleckchemS2111Poeder
NeratinibCayman Chemical Company18404Poeder
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) HimediaTC185Oplossing
Formaldehyde RankemF0080Oplossing
GlutaraldehydeSigma-aldrich340855Oplossing
Citric Acid monohydrate, PureHimediaGRM229Poeder
Sodium phosphate dibasic anhydrous HimediaMB024Poeder
Potassium ferrocyanide, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
Potassium ferricyanide, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721Poeder
MgCl2 hexahydrateHimediaGRM-1068Poeder
X-GalSRL45904Poeder
LipopolysaccharideSigma-aldrichL6529
Human Recombinant Interferon-γHimediaCF040-20MCG
Cell ROX deep red reagentThermo fisher scientificC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Poeder
MitoTRACKER GreenInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Poeder
Anti-ARG1 antibodyAffinityDF6657Oplossing, Berekend MW- 35kDa, Waarneembaar MW - 65kDa
Anti-NOS2 antibodyCloudo Clone Corp.PAA837Hu01Oplossing, Berekend MW- 130kDa, Waarneembaar MW - 65kDa
Anti-iNOS antibodyAffinityOplossing, Berekend MW- 130kDa, Waarneembaar MW - 120kDa
Anti-GAPDH antibodyBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Oplossing
Anti-Rabbit AntibodyCayman Chemical Company10004301Oplossing
Nitrocellulose membrane Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Productnummer)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
60mm DishesNUCK150462
96well plate, NUCK165306
Cell Culture Incubator Thermo Fisher Scientific371
Microscope 1. LEICA Inverted Microscope   2. Nikon Confocal Microscope 1. DMIL LED      2. Ti2E, A1R Beiden zijn modelnummer
iBright Imaging SystemInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (modelnummer)
Plate-readerBio-RADiMark Microplate Reader
Centrifuge Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (modelnummer)

Referenties

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Senescentie van levercellenTyrosinekinaseremmersMechanismen van hepatotoxiciteitSenescentie-geassocieerd secretorisch fenotypeHepG2-cellenGeconditioneerd mediumReactieve zuurstofspeciesWestern blotting
Door geneesmiddelen geïnduceerde senescentie in levercellen bevordert polarisatie van M2-macrofagen: implicaties voor tyrosinekinaseremmer-geassocieerde hepatotoxiciteit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.