Monitoring van de opname en lokalisatie van organische verbindingen in plantenweefsels met behulp van een hydrocultuur 14C-radiolabelingtest en fosforbeeldvorming

Samenvatting

Dit artikel schetst een methode voor het bestuderen van plant-gemedieerde sanering met behulp van ¹⁴C-gelabelde organische contaminanten. Het beschrijft de bereiding van hydrocultuurplanten, de opname van radioactieve labels en beeldvorming van fosfor om de absorptie, translocatie en het metabolisme van verontreinigende stoffen te volgen. De techniek biedt een waardevol hulpmiddel voor het evalueren van het fytoremediatiepotentieel van verschillende plantensoorten en milieuverontreinigende stoffen.

Samenvatting

Fytoremediatie, het gebruik van planten om milieuverontreinigende stoffen te verminderen, biedt een duurzame en kosteneffectieve aanpak voor het reinigen van verontreinigde locaties. Het ontwikkelen van methoden die helpen bij het ophelderen van de mechanismen achter de opname door planten en het metabolisme van verontreinigende stoffen is cruciaal voor het verbeteren van fytoremediatiepraktijken. Dit artikel beschrijft een methode om de opname en transformatie van organische verontreinigingen door planten te beoordelen met behulp van radioactief gelabelde verbindingen. ¹⁴C-gelabelde organische verbindingen, zoals model ¹⁴C-nafteenzuren, worden gebruikt om hun absorptie, translocatie, lokalisatie en metabolisme in plantenweefsels te traceren. We hebben deze methode eerder toegepast bij meerdere plantensoorten, waaronder Elymus trachycaulus en Salix interior. Deze waarnemingen worden hier bevestigd met de modelplant, Arabidopsis thaliana, die hydroponisch wordt gekweekt in gemodificeerde Hoagland-oplossingen. De opname van radioactief etiketten werd gemonitord via het tellen van vloeistofscintillatie en fosforbeeldvorming, wat visualisatie en kwantificering van radioactief gelabelde verbindingen in plantenweefsels mogelijk maakt. Deze methode beschrijft de bereiding van plantaardig materiaal, het gebruik van radioactief gelabelde verbindingen en het proces van het analyseren van de distributie en het lot van verontreinigingen in planten. De methode omvat ook strategieën voor het beoordelen van de exsudatie van verbindingen en maakt het mogelijk om zowel de opname door de plant als de translocatie van milieuverontreinigende stoffen te evalueren. Deze benadering geeft inzicht in plantgemedieerde saneringsprocessen en kan worden toegepast op de studie van een breed scala aan milieuverontreinigende stoffen en plantensoorten.

Inleiding

Bioremediatie is een saneringstechnologie die wordt gemedieerd door biologische entiteiten, zoals planten en micro-organismen. Fytoremediatie, waarbij planten of plantaardige producten worden gebruikt om verontreinigingen uit het milieu te verwijderen, kan een aanvulling zijn op of dienen als een alternatief voor microbiële sanering, waarbij enkele van de beperkingen van het gebruik van alleen micro-organismen worden overwonnen 1,2,3,4. Fytoremediatie is kosteneffectief vanwege de door zonne-energie aangedreven processen van planten, waarbij verontreinigingen worden geabsorbeerd via hun wortels of scheuten en worden getransporteerd tussen cellen en weefsels waar ze kunnen worden gemetaboliseerd, afgezonderd of vervluchtigd⁵. De meest effectieve planten voor fytoremediatie zijn doorgaans veerkrachtige, stresstolerante soorten met hoge transpiratiesnelheden, snelle biomassaproductie en diepe wortelstelsels, zoals die worden aangetroffen in de geslachten Populus en Salix ⁶. Als sessiele organismen hebben planten verschillende metabole routes ontwikkeld om giftige stoffen in hun omgeving te verwerken¹. Dit geeft hen een breed scala aan genen en biochemische processen die hun vermogen om verontreinigingen te beheersen verbeteren.

Het fytodegradatiekader, voor het eerst voorgesteld door Sandermann et al. (1977)⁷, schetst een driefasenproces voor plant-gemedieerde ontgifting van contaminanten: transformatie, conjugatie en compartimentalisatie. In elke fase ondergaan verontreinigingen enzymatische modificaties die hun hydrofiliciteit verhogen, hun toxiciteit verminderen en ze vatbaarder maken voor sekwestratie of verdere mineralisatie⁴. Omdat planten echter voornamelijk afhankelijk zijn van koolstofdioxide uit de atmosfeer voor koolstoffixatie, is hun vermogen om organische verontreinigingen volledig te mineraliseren mogelijk beperkt. Contaminanten kunnen in plaats daarvan worden afgezonderd in vacuolen of celwanden (fytosequestratie) of vervluchtigen in de atmosfeer (fytoverlooptijdigheid)¹.

Een belangrijke uitdaging in fytoremediatieonderzoek is het detecteren of planten organische verontreinigingen uit hun omgeving kunnen opnemen en transformeren¹. Traditionele detectiemethoden slagen er vaak niet in om de routes van opname en translocatie van verontreinigende stoffen nauwkeurig te traceren, waardoor het moeilijk is om het vermogen van een installatie om specifieke verontreinigende stoffen te saneren^{te beoordelen 1,5}. Radioactief gelabelde koolstof-14 (¹⁴C) organische verbindingen bieden een krachtige oplossing voor dit probleem. Door planten bloot te stellen aan ¹⁴C-gelabelde verontreinigingen, kunnen onderzoekers de opname van radioactief gelabelde koolstof in plantenweefsels volgen, waardoor een nauwkeurig inzicht wordt verkregen in de opname, translocatie en transformatie van de verontreiniging. Deze techniek maakt het mogelijk om plantensoorten te identificeren die in staat zijn om specifieke organische verontreinigende stoffen te saneren en biedt een betrouwbare manier om de betrokken fysiologische routes te beoordelen. Uiteindelijk bevordert het gebruik van ¹⁴C-gelabelde verbindingen ons begrip van het fytoremediatiepotentieel en ondersteunt het de ontwikkeling van effectievere, gerichtere strategieën voor milieusanering.

Dit artikel beschrijft een methode waarbij ¹⁴C-radioactief gelabelde organische verontreinigingen worden gebruikt om de opname, translocatie en het lot van deze verontreinigingen uit een hydrocultuuroplossing door planten te monitoren. In een recente publicatie is een vergelijkbare methode beschreven voor het traceren van het lot van ¹⁴C-gelabelde herbiciden bij bladtoepassing⁸. De hier beschreven methode schetst echter hoe de verwijdering en translocatie van radioactief gelabelde verontreinigingen uit een hydrocultuuroplossing moet worden beoordeeld, met opmerkingen over hoe deze methode kan worden aangepast aan het gebruik van aarde.

Protocol

OPMERKING: Voordat u verder gaat met dit protocol, is het belangrijk om de relevante institutionele en nationale veiligheidsrichtlijnen en -voorschriften voor radio-isotopen te raadplegen. Kortom, behandel al het radioactieve materiaal, of alles wat in contact is gekomen met radio-isotopen, terwijl u dubbele handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril draagt. De procedure werd uitgevoerd in een speciale ruimte in het laboratorium met tape om secties te markeren die radio-isotopen bevatten. Reinig na alle ingrepen ook onmiddellijk het glaswerk en de instrumenten, veeg ze vervolgens af en test ze op de aanwezigheid van besmette radio-isotopen via scintillatietellingen. Alle materialen en vloeistoffen die in deze tests werden gebruikt, werden ook weggegooid in speciale containers voor radioactief afval en op de juiste manier afgevoerd volgens de richtlijnen van de Universiteit van Calgary en de Canadian Nuclear Safety Commission.

1. Bereiding van Hoagland-oplossing

1. Bereid een 0,5x (halfsterkte) Hoagland-oplossing uit een commercieel mengsel of maak de media helemaal opnieuw, bestaande uit 0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 23 μM H₃BO₃, 5 μM MnCl₂•4H₂O, 400 nM ZnSO₄•7H₂O, 200 nM CuSO₄•5H₂O, 70 nM H₂MnO₄•1H₂O, 45 μM FeSO₄•7H₂O.
2. Voeg MES of een andere geschikte buffer toe om een uiteindelijke concentratie van 10 mM te bereiken.
3. Pas de pH aan op de gewenste waarde (hier was de pH 5,0).

2. Bereiding van radioactieve labeloplossing

1. Breng het vereiste volume van 0,5x Hoagland-oplossing (50 ml per replicaat) over in een schone kolf.
2. Voeg 0,1-0,26 kBq/ml van de radioactief gelabelde verbinding toe aan de Hoagland-oplossing.
   OPMERKING: In deze studie werd ¹⁴C-AdCA (adamantaan-1-carbonzuur) opgelost in methanol gebruikt.
3. Meng grondig door de kolf 2-3 minuten rond te draaien.
4. Verdeel 50 ml van de radioactieve merkoplossing in erlenmeyers van 125 ml voor elk duplicaat.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Voorbereiding van de installatie

OPMERKING: Het protocol voor het hydroponisch kweken van Arabidopsis thaliana wordt gedetailleerd beschreven in Conn et al. (2013)⁹.

1. Verwijder voor elke plant met een schaar een dop van een standaard microfuge-buis van 1,7 ml en prik met een leren perforator een gat met een diameter van 3 mm in het midden van de dop.
2. Sluit de bovenkant van de doppen tijdelijk af met tape en vul de doppen met gesmolten 0,5x Hoagland-media die 0,8% agar bevatten en plaats ze vervolgens in het deksel van een aangepaste tipdoos (de kiemtank) (Figuur 1A).
3. Oppervlak steriliseren Arabidopsis-zaden door opeenvolgende wasbeurten in 70% ethanol gedurende 10 minuten, vervolgens 5 minuten en droog ze in de afzuigkap op steriel filtreerpapier.
4. Zaai de zaden in het agarmedium door het gat dat in de bovenkant van de microcentrifugekap is geponst.
5. Stratificeer de zaden in het tiprek bij 4 °C gedurende 2-4 dagen.
6. Verplaats de kiemtank naar een groeikamer onder langdurige omstandigheden (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m²s licht en 22 °C).
7. Vul de tiprekken met 0,5x Hoagland-oplossing.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de oplossing de agar raakt om uitdroging te voorkomen.
8. Kweek planten gedurende 2-3 weken en vul de oplossing indien nodig bij (elke 3-4 dagen) zodat de agar in contact blijft met de hydrocultuuroplossing.
9. Verplant de doppen en zaailingen in een opening met een diameter van 10 mm die door het midden van een Falcon-buisdeksel van 50 ml wordt gesneden met een boor en een boorzaag (Figuur 1B).
10. Boor 12 gaten in het plastic deksel van 10 l met een boorzaag met een diameter van 30 mm (de rijpingstank).
11. Plaats de Falcon-buisdeksels over de openingen in de bovenkant van de draagtas, zodat de wortels in de onderliggende bak terechtkomen.
12. Bevestig luchtstenen aan de bodem van de rijpingstank en vul met Hoagland-oplossing totdat de wortels grotendeels onder water staan.
13. Zet de planten terug in de groeikamer en groei nog 6-8 weken (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m²s licht en 22 °C), tot de rozetten ongeveer 10 cm in diameter zijn.

Figuur 1: Arabidopsis kiem- en rijpingstanks en het ¹⁴C-AdCA behandelingsvat. (A) De kiemtank die wordt gebruikt om Arabidopsis-zaden te ontkiemen voor hydrocultuur. (B) Arabidopsis-planten in de rijpingstank, klaar om te experimenteren. (C) Een Arabidopsis-plant waarvan de wortels tijdens experimenten zijn ondergedompeld in de ¹⁴C-AdCA-oplossing. De kolven van 50 ml (het ¹⁴C behandelingsvat) worden normaal gesproken tijdens blootstelling afgedekt met aluminiumfolie (niet afgebeeld) om algengroei te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Baltische bies (Juncus balticus Willd. ) voorbereiding van de installatie

1. Stratificeer de zaden tussen twee vochtige stukken filtreerpapier in een petrischaaltje bij 4 °C gedurende 1-2 weken.
2. Verwijder het bovenste filterpapier en plaats de schaal gedurende 1 week in een groeikamer onder langdurige omstandigheden (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m²s licht en 22 °C).
3. Verplant zaailingen in aangepaste tiprekken zoals beschreven voor Arabidopsis (stap 3.1-3.4).
4. Kweek planten gedurende 2-3 weken (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m²s licht en 22 °C), of totdat de wortels 3-4 cm lang zijn.
5. Verplant de planten in een aangepaste bak van 10 liter met luchtstenen, vul ze met Hoagland-oplossing tot de wortels grotendeels onder water staan en groei nog 6-8 weken (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m²s licht en 22 °C).

5. Voorbereiding van zandbankwilgen ( Salix interior Rowlee)

OPMERKING: Protocol voor het kweken van zandbankwilgenplantjes wordt beschreven in Alberts et al. (2021)¹⁰.

1. Snijd de stengelstekken van 10 cm (diameter 5 mm) af en dompel ze een nacht onder bij kamertemperatuur in diH₂O om te hydrateren en de beworteling te stimuleren.
2. Breng de gehydrateerde stekken over naar beluchte hydrocultuurtanks met 10 L 0,5x Hoagland-oplossing en kweek gedurende 1 maand (16 uur licht, 8 uur donker bij ~150 μmol/m,²s licht en 22 °C) om wortel- en scheutgroei te bewerkstelligen.
   OPMERKING: Ververs de Hoagland-oplossing elke 2 weken om een tekort aan voedingsstoffen tijdens de ontwikkeling van de plant te voorkomen.

6. Etikettering van radio-isotopen

1. Verzamel na het maken van de radioactieve labeloplossing een aliquoot van 100 μl uit de oplossing voor het tellen van vloeistofscintillatie om de initiële isotoopconcentratie te bepalen.
2. Dep de plantenwortels voorzichtig droog en breng de Falcon-buisdop over naar Erlenmeyers van 125 ml (het ¹⁴C-behandelingsvat) met 0.5x Hoagland-oplossing met de ¹⁴C-gelabelde organische verbindingen uit stap 2.4.
3. Markeer het oplossingsniveau op de kolf om ervoor te zorgen dat deze tijdens het experiment kan worden bijgevuld tot het startvolume, rekening houdend met verdamping.
4. Wikkel kolven in aluminiumfolie en schud bij 40-60 tpm onder kweeklampen voor de duur van de test of totdat de gelabelde planten gedurende een achtervolgingsperiode zijn overgebracht naar 0,5x Hoagland-oplossing zonder radiolabel.
5. Vul het volume in de kolf elke 1-2 uur bij tot de lijn die in stap 6.3 is gemaakt met Hoagland-oplossing zonder het radiolabel voordat u 100 μL aliquots verzamelt. Zorg ervoor dat u het volume Hoagland's meet dat aan elke kolf wordt toegevoegd om de verdampingssnelheid van elke oplossing te vergelijken. Na de eerste 6-8 uur kunnen de bemonsteringstijden toenemen tot elke 12-24 uur.
   OPMERKING: Deze stap kan indien nodig dagen duren, maar zorg ervoor dat u de radioactiviteit in de aliquots dagelijks controleert naarmate het experiment vordert.
6. Optioneel: Voor het bewaken van de exsudatie tijdens de achtervolgingsperiode, brengt u de plant en de Falcon-buisdop over naar een kolf met 50 ml verse Hoagland-oplossing (die geen ¹⁴C-gelabelde verbinding bevat) en verwijdert u elke 2 uur gedurende de eerste 6-8 uur een aliquoot van 100 μl, daarna met tussenpozen van 24 uur vanaf het begin van het experiment.
   OPMERKING: Om onderscheid te maken tussen passieve diffuse en actieve exsudatie van de verbinding uit de plantenwortels, kan een actieve transportremmer zoals ciclosporine A worden toegevoegd in een concentratie van 20 μM.
7. Meet het radioactieve aantal van elk aliquot dat tussen de stappen 6.1-6.6 is verzameld met behulp van een vloeistofscintillatieteller.

7. Fosforbeeldvorming van planten

1. Spoel de wortels gedurende 15 minuten af in 0,5x Hoagland-oplossing zonder het radiolabel om losjes gebonden radio-isotoop te verwijderen.
2. Vang 100 μL van de spoeloplossing op voor het aantal vloeibare scintillaties.
3. Weeg de planten of het niet-houtachtige plantmateriaal om de verse massa te bepalen.
4. Droog het plantmateriaal met een geldroger op een stuk geëtiketteerd filterpapier bij 50 °C onder vacuüm gedurende 2 uur en laat het vervolgens een nacht bij kamertemperatuur drogen.
   OPMERKING: Eenmaal gedroogd, kunnen de planten voor langere tijd (4-6 maanden) worden bewaard en kan beeldvorming op een later tijdstip plaatsvinden met een minimale daling van het radioactieve signaal.
5. Maak de fosforzeef schoon door deze gedurende 15 minuten bloot te stellen aan veel licht op een fosforwisser.
6. Doseer 2-10 μl radioactieve labeloplossing met bekende radioactiviteit op een stuk filtreerpapier en laat dit een nacht bij kamertemperatuur drogen.
   OPMERKING: Hier worden de standaarden met de radioactiviteiten: 67, 33, 17, 8, 4 en 2 Bq gebruikt, maar dit kan worden gewijzigd om tegemoet te komen aan de signaalintensiteiten van de plantmonsters.
7. Plaats de fosforzeef op de gedroogde plantenmonsters en de radioactieve standaarden in het donker of in een gesloten ondoorzichtige container en stel ze ten minste 24 uur bloot.
   OPMERKING: Als het beeld onder- of overbelicht is, pas dan de belichtingstijd dienovereenkomstig aan.
8. Bebeeld de schermen met een laserscanning fosforbeeldvormingssysteem met een resolutie van 50 μm.
9. Analyseer de signaalintensiteiten en -verdelingen van het fosforbeeld met behulp van de ImageJ-software¹¹.
   1. ImageJ-stappen: Open de afbeelding door Bestand te selecteren > Analyseer > Stel metingen in... Selecteer Gebied en gemiddelde grijswaarde > OK. Kies de vormselectietool die het beste bij het weefsel past. Klik en sleep op de afbeelding om het interessegebied te markeren. Druk op Ctrl + M. Kopieer de waarde voor gebied en gemiddelde grijs naar een werkblad.
10. Converteer de gemiddelde grijswaarden naar Bq met behulp van de radioactieve standaarden in een standaardcurve.
11. Bereken de totale activiteit in plantenweefsel (geïntegreerde dichtheden) met de volgende vergelijking:
    Geïntegreerde dichtheid (Bq) = (gemiddelde Bq van weefsel (Bq/cm²) - achtergrond (Bq/cm²)) * gebied (cm²)
    1. Optioneel: Converteer de afbeelding in grijstinten naar een kleurintensiteitsschaal met behulp van de ImageJ-software¹¹.

Resultaten

De opnameprocedure van ^{het 14}C-label is van toepassing op een verscheidenheid aan plantensoorten buiten Arabidopsis, waaronder Salix interior, Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners, en wetlandsoorten zoals Juncus balticus^10,12. Voor representatieve doeleinden presenteren we echter de resultaten van Arabidopsis ecotype Columbia-7 (Col-7). Eerder hebben w...

Discussie

Fytoremediatie heeft de afgelopen decennia aan aandacht gewonnen als een passieve, economische en milieuvriendelijke methode voor het reinigen van industrieel afval en verontreinigde locaties¹. Het identificeren van plantensoorten met een verhoogde opname van verontreinigende stoffen en het begrijpen van de moleculaire processen die de absorptie van organische moleculen bepalen, zou fytoremediatiestrategieën kunnen verbeteren. In tegenstelling tot andere indirecte...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Hoagland Modified Basal Salt Mixture	Phyto Technology Laboratories	H353	Bevat Ferrous Sulfate
Agar	BioShop	AGR001
MES (2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid)	BioShop	MES555
pH Meter	Mettler Toledo	FiveEasy
Methanol	BioShop	MET302
12C-Adamantane carboxylic acid	Sigma Aldrich	106399
14C-Adamantane carboxylic acid	ViTrax		Custom synthese
125 mL Erlenmeyer kolven	VWR	30623-174
50 mL Falcon tubes	VWR	CA21008-940
Microcentrifuge buisjes	VWR	87003-294
Plant Growth Chambers	Conviron
Tip Boxes	DiaMed	DIATEC530-8376
Rubbermaid Roughneck 3 Gal Tote	Amazon	B0B3345MYH
Filterpapier	VWR	CA28320-020
Petrischaal	VWR	11019-566
Schudler met kolvenhouders	Forma Scientific	Model 4516
Scintillatie cocktail	Research Products International	111195
Scintillatiebuisjes	VWR	10014-296
Scintillatieteller	Beckman Coulter	LS 6000IC	De gebruikte buisjes zullen afhangen van uw scintillatieteller
Geldroger	Bio-Rad	Model 583
Laser scanning fosfor imager	Bio-Rad	Molecular Imager FX