Methodenartikel

Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68739

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de in vivo herprogrammering van muizenkankercellen tot type 1 dendritische-achtige cellen binnen de tumormicro-omgeving door middel van geforceerde expressie van de transcriptiefactoren PU.1, IRF8 en BATF3.

Samenvatting

De werkzaamheid van kankerimmunotherapie is afhankelijk van de rekrutering en activering van cytotoxische T-celresponsen tegen solide tumoren door type 1 conventionele dendritische cellen (cDC1's). De generatie van cDC1's voor kankerimmunotherapie heeft echter te maken met aanzienlijke beperkingen, waaronder een slechte celopbrengst, functionele heterogeniteit en gevoeligheid voor immunosuppressie in de tumormicro-omgeving (TME). We hebben onlangs een immunotherapiemodaliteit ontwikkeld op basis van in vivo herprogrammering van kankercellen tot immunogene cDC1-achtige cellen, waardoor kankercellen tumorantigenen als cDC1's konden presenteren en polyklonale cytotoxische T-celresponsen en duurzame systemische antitumorimmuniteit opriepen. Hier beschrijven we een hanteerbaar protocol om cDC1-achtige cellen binnen de TME te genereren door het minimale cDC1-specifieke genregulerende netwerk - PU.1, IRF8 en BATF3 (gezamenlijk aangeduid als PIB) - tot overexpressie te brengen in kankercellen, gevolgd door subcutane implantatie van een mengsel van getransduceerde en oudercellen. PIB-overexpressie stimuleert de geleidelijke verwerving van de hematopoëtische marker CD45 en het professionele antigeenpresentatiecomplex MHC klasse II op tumorcellen, die dienen als uitlezingen van het celoppervlak voor in vivo cDC1-herprogrammering. In vergelijking met het herprogrammeringsproces in vitro, toonde herprogrammering van het YUMM1.7-muismelanoommodel in vivo een snellere kinetiek en een hogere efficiëntie. cDC1-achtige cellen induceerden een snelle remodellering van de TME door gastheerimmuuncellen binnen de eerste 3 dagen te rekruteren en te leiden tot de vorming van een tertiaire lymfoïde structuur op dag 9. Geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen bleven ten minste 9 dagen in tumoren aanwezig, maar werden op dag 15 niet gedetecteerd. Het in vivo cDC1-herprogrammeringsprotocol dat hier wordt beschreven, biedt een hanteerbare en robuuste methode om "immuunkoude" tumoren effectief om te zetten in "immuun-warm". Over het algemeen biedt het een krachtig platform om de mechanismen die ten grondslag liggen aan cDC1-gemedieerde antitumorimmuniteit te bestuderen en synergetische combinaties met andere modaliteiten voor kankerimmunotherapie te ontdekken.

Inleiding

Recente ontwikkelingen op het gebied van immunotherapie bij kanker, waaronder blokkade van het immuuncheckpoint (ICB), adoptieve celtherapie (ACT) en vaccins, hebben het landschap van de behandeling van kanker veranderd1. Bij melanoom kunnen de responspercentages op geprogrammeerde celdood-eiwit 1 (PD-1) en cytotoxische T-lymfocyt-geassocieerde proteïne 4 (CTLA-4)-remming oplopen tot 60%2. Desalniettemin reageert meer dan 40% van de melanoompatiënten niet op ICB, en de responspercentages bij minder immunogene kankers, zoals borstkanker, microsatellietstabiele colorectale kanker en glioblastoom, blijven onder de 5%, wat de klinische hiaten benadrukt 3,4,5. Een belangrijke barrière voor breed klinisch succes is de slechte activering van cytotoxische T-celresponsen, die afhankelijk zijn van efficiënte antigeenpresentatie in de tumormicro-omgeving (TME)6.

Conventionele type 1 dendritische cellen (cDC1's) zijn zeldzaam, maar onmisbaar voor het initiëren van tumorspecifieke immuniteit en bieden drie belangrijke signalen om T-celresponsen te stimuleren: (1) professionele verwerking en presentatie van antigenen op belangrijke histocompatibiliteitscomplexen (MHC) klasse I en II, (2) co-stimulatie via CD80 en CD86, en (3) pro-inflammatoire cytokinesignalering inclusief IL-12 7,8. Van de subsets van dendritische cellen (DC) blinken cDC1's uit in het kruisen van tumorcel-geassocieerde antigenen om naïeve CD8+ T-cellen in het geheugen te primen of opnieuw te activeren of CD4+ T-celdifferentiatie naar type 1 T-helpercellen (TH1) te sturen9. Bovendien zijn cDC1's de belangrijkste producenten van chemokines, C-X-C motief chemokine liganden 9 en 10 (CXCL9/10), die de rekrutering van T-cellen naar het tumorweefsel 10,11,12,13 mediëren. In de afgelopen jaren hebben talrijke onderzoeken aangetoond dat tumorafstoting en effectieve respons op ICB of ACT sterk correleren met de aanwezigheid van intratumorale cDC1's12,13. Daarom hebben cDC1's zich ontwikkeld als een aantrekkelijk doelwit voor kankerimmunotherapie en kan het succesvol benutten van hun unieke eigenschappen een aanzienlijk translationeel potentieel hebben.

De huidige methoden om cDC1's te genereren zijn gebaseerd op bloedisolatie of differentiatie van CD34+-voorlopers of pluripotente stamcellen 14,15,16. De overheersende klinische strategieën zijn gebaseerd op het isoleren van een mengsel van autologe DC-subgroepen uit het bloed en het ex vivo stimuleren ervan met toll-like receptoragonisten of pro-inflammatoire cytokines om een volwassen, immunogeen programma te induceren vóór reïnfusie16. Deze strategieën worden echter beperkt door slechte celrijping, immunosuppressieve barrières in de TME en subsetheterogeniteit in het geïnfuseerde DC-mengsel, waar slechts een klein deel van de cDC1's aanwezig is7. Bovendien is het isoleren van alleen cDC1's voor immunotherapie of vaccinatie bij kanker een uitdaging vanwege hun extreem lage abundantie in perifeer bloed (<0,3%)16. Bovendien kunnen cDC1's worden geproduceerd uit CD34+-voorlopercellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van cytokines en NOTCH-signalering. Deze methoden vereisen echter complexe en lange protocollen en leveren lage aantallen en heterogene populaties van DC-subgroepenop 17,18,19.

Om deze beperkingen aan te pakken, biedt in vivo herprogrammering een geschikte strategie voor kankerimmunotherapie om cDC1-achtige cellen te genereren, die lijken op de fenotypische, transcriptionele en functionele eigenschappen van cDC1's20. Door de overexpressie van het cDC1-specifieke minimale genregulerende netwerk - PU.1, IRF8 en BATF3 (gezamenlijk aangeduid als PIB) - zijn fibroblasten, stromale cellen en kankercellen geleidelijk geherprogrammeerd tot cDC1-achtige cellen, waardoor tumorantigeenverwerking en presentatie op MHC klasse I en II, co-stimulerende signalering via CD80 en CD86 en cytokine/chemokinesecretie, waaronder CXCL9/10 en IL-1220, mogelijk wordt. 21,22,23. De herprogrammering van cDC1 vorderde sneller en efficiënter bij menselijke xenotransplantaten in vivo en onafhankelijk van immunosuppressie, waardoor cDC1-achtige cellen werden gegenereerd met een volwassen immunogene signatuur20. Bij syngene melanoomtumoren zagen we dat cDC1-achtige cellen hun TME hermodelleerden, de vorming van tertiaire lymfoïde structuur (TLS) induceerden en polyklonale TH1- en cytotoxische geheugen-T-cellen rekruteerden en expandeerden, wat leidde tot systemische immuniteit op lange termijn20. Ten slotte ontwikkelden we een nieuwe kankerimmunotherapiemodaliteit op basis van in situ herprogrammering van kankercellen in cDC1-achtige cellen door intratumorale injectie van adenovirale vectoren20. Deze bevindingen maken de weg vrij voor klinische vertaling van cDC1-herprogrammering als een nieuwe kankerimmunotherapiemodaliteit die de functionele eigenschappen van cDC1's kan benutten.

Hier presenteren we een hanteerbaar protocol om cDC1-achtige cellen te genereren binnen de TME op basis van in vivo cDC1-herprogrammering. Lentivirale toediening van PIB aan kankercellen en daaropvolgende implantatie als een gedefinieerde mix van getransduceerde kankercellen met niet-getransduceerde ouderlijke kankercellen maakt in vivo herprogrammering van een gecontroleerde fractie van kankercellen binnen de TME mogelijk. Bovendien wordt deze methode niet beperkt door de in situ afgifte-efficiëntie van virale vectoren20. We schetsen de stappen voor efficiënte productie van lentivirale vectoren, functionele titratie en in vivo cDC1-herprogrammering met behulp van het syngene melanoommodel, YUMM1.7, als voorbeeld. We beschrijven de experimentele opzet en de gating-strategie voor het analyseren in vivo geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen door middel van flowcytometrie na tumordissociatie. We bieden ook de stappen om veranderingen in de TME te evalueren door cryopreservatie, secties en immunofluorescentiekleuring van tumorsecties uit te voeren, gevolgd door confocale microscopie. Ten slotte gaan we in op het monitoren van cDC1-geïnduceerde immuniteit door tumorgroei en -overleving te meten. Deze hanteerbare en schaalbare aanpak biedt onderzoekers een waardevol hulpmiddel om combinatorische behandelingsstrategieën te beoordelen met in vivo cDC1-herprogrammering, om veranderingen in de TME- en TLS-neogenese in kankermodellen te karakteriseren of om grote schermen uit te voeren die de expressie van verschillende immuunroutes wijzigen, bijvoorbeeld antigeenpresentatie of cytokine/chemokinesecretie, en hun impact op antitumorimmuniteit te ontrafelen.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Zweedse regelgeving na goedkeuring van de Zweedse Landbouwraad.

1. Bereiding van reagens

  1. Om Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) compleet medium te bereiden, voegt u 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 1 mM natriumpyruvaat, 100 E/ml penicilline (Pen), 2 mM glutaminevervanger en 100 mg/ml streptomycine (Strepto) toe.
  2. Om RPMI 1640 complete media te bereiden, voegt u 10% (v/v) FBS, 2 mM glutaminevervanger, 1 mM natriumpyruvaat, 50 mM 2-mercaptoethanol, 100 E/ml Pen en 100 mg/ml Streptokokken toe.
  3. Om DMEM/F12 complete media te bereiden, voegt u 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 100 E/ml pen en 100 mg/ml Streptokokken toe.
  4. Om 1 mg/ml polyethylenimine (PEI) te bereiden, lost u 100 mg PEI-poeder op in 100 ml steriel gedeïoniseerd water in een glazen bekerglas of conische buis. Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en roer bij kamertemperatuur (RT) om een draaikolk te creëren totdat deze volledig is opgelost. Stel de pH in op 6,9-7,1, voeg druppelsgewijs zoutzuur (HCl)/natriumhydroxide (NaOH) toe en filtreer de oplossing door een PES-membraanfilter van 0,22 μm.
  5. Om 1 mM natriumbutyraat te bereiden, lost u 1,10 mg op in 10 ml steriel gedeïoniseerd water.
  6. Om 8 mg/ml Polybrene te bereiden, lost u 80 mg Polybrene-poeder op in 10 ml steriel gedeïoniseerd water.
  7. Om de FACS-buffer voor te bereiden, voegt u 2% FBS en 1 mM EDTA toe aan fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

2. Productie van lentivirussen

  1. Ontdooi HEK 293T-cellen door 1 ml cellen toe te voegen aan 9 ml voorverwarmd DMEM compleet medium en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 350 × g . Resuspendeer de celpellet in 20 ml DMEM volledig medium en kweek de cellen in een plaat van 150 mm bij 37 °C met 5 % CO2.
  2. Breid HEK 293T-cellen uit en splits ze wanneer ze een samenvloeiing van 80-90% bereiken. Om cellen te splitsen, wast u ze eenmaal met PBS, voegt u 5 ml trypsine toe om ze van de plaat te dissociëren en incubeert u 5-10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Verzamel cellen met 5 ml DMEM volledig medium, centrifugeer ze bij 350 × g gedurende 5 minuten en splits ze 1:6 in nieuwe platen van 150 mm, 48 uur vóór transfectie.
    OPMERKING: De kwaliteit van de lentivirus-producerende cellijn is cruciaal voor het produceren van hoge titers. Laat cellen niet meer dan 95% samenvloeien en vermijd het zaaien van cellen met een samenvloeiing van <30%.
  4. Na 48 uur, of wanneer de cellen 70-80% samenvloeiing bereiken, bereidt u de transfectiemix in een conische buis van 50 ml voor. Gebruik het volgende transferplasmide: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-een polycistronische lentivirale vector die de transcriptiefactoren PU.1, IRF8, BATF3, een interne ribosomale ingangsplaats (IRES) en een verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) bevat als de fluorescerende transductiereporter; of 2) SFFV-eGFP, een controle-lentivirale vector met een meervoudige kloonplaats en eGFP; of 3) SFFV-mCherry, een lentivirale vector die mCherry tot expressie brengt. Voeg 10 μg transferplasmide, 7,5 μg verpakkingsplasmide psPAX2 en 2,5 μg envelopplasmide pMD2.G toe. Vul de tube bij met Opti-MEM om een totaal volume van 2 ml te bereiken. Tenslotte, voeg 60 μL van het transfectiereagens PEI (van de 1 mg/ml-voorraad) aan de transfectiemengeling toe.
    OPMERKING: De lentivirale vector SFFV-eGFP wordt gebruikt als transductiecontrole voor het herprogrammeren van experimenten om rekening te houden met lentiviraal-gemedieerde immunogeniciteit, terwijl SFFV-mCherry wordt gebruikt om fluorescerend gelabelde kankercellijnen te genereren.
  5. Vortex de transfectie mengt zich grondig gedurende 1 minuut en incubeert gedurende 15 minuten bij RT om de vorming van DNA-lipidecomplexen mogelijk te maken.
    OPMERKING: Confluentie heeft een aanzienlijke invloed op virale titers. Het transfecteren van cellen met een samenvloeiing van minder dan 70% zal resulteren in lagere virale titers omdat minder cellen de plasmiden ontvangen.
  6. Zuig het medium van de HEK 293T-cellen op en voeg 10 ml DMEM toe zonder Pen/Step en met 10% steriel gefilterd FBS.
  7. Voeg het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de platen van 150 mm en incubeer gedurende 16 uur bij 37 °C met 5% CO2.
  8. Vervang na transfectie het medium door 20 ml DMEM volledig medium aangevuld met 1 mM natriumbutyraat, en incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: Natriumbutyraat is een klasse 1 histondeacetylase (HDAC)-remmer en kan de genexpressie in HEK 293T-cellen verbeteren door histonhyperacetylering te induceren, die de chromatinestructuur opent en de transcriptie van virale verpakkingen en overdrachtsplasmiden vergemakkelijkt. De doeltreffendheid van de transfectie kan worden beoordeeld door de uitdrukking van eGFP te controleren gebruikend een fluorescentiemicroscoop.
  9. Verzamel het lentivirus-bevattende supernatans 48 uur en 60 uur na transfectie in conische buisjes van 50 ml. Voeg na de eerste afname 12 ml voorverwarmd DMEM compleet medium toe per 150 mm plaat voor de tweede verzameling. Bewaar de collecties bij 4 °C, filtreer ze door een 0,45 μm eiwitarm bindend PES-filter en combineer ze.
  10. Om het virus te concentreren, pipetteert u 37 g lentivirusbevattend medium in open-top dunwandige polypropyleen buisjes van 38,5 ml. Meet het gewicht van de buizen met behulp van een tafelweegschaal.
    OPMERKING: Meet het gewicht van het lentivirusbevattende medium in plaats van het volume, aangezien het gewicht een grotere precisie biedt bij het balanceren. Het gewicht van de buizen moet goed uitgebalanceerd zijn om beschadiging van de ultracentrifuge te voorkomen.
  11. Plaats de buizen in de ultracentrifugatieemmers, sluit de deksels en plaats de emmers in een rotor met zwaaiende emmers. Centrifugeer bij 25.000 × g gedurende 90 minuten bij 4 °C.
  12. Haal na het centrifugeren de buisjes uit de emmers en zuig het supernatant op.
    OPMERKING: Dezelfde buisjes kunnen herhaaldelijk worden gevuld en gebruikt voor een totaal aantal van drie centrifugatierondes om een grotere lentiviruspellet per buis te produceren.
  13. Plaats de open-top dunwandige polypropyleen buizen ondersteboven gedurende 5 minuten op een laboratoriumdoekje of soortgelijk absorberend materiaal om overtollige vloeistof te laten weglopen en de pellet te drogen.
  14. Voeg aan elke pellet 200 μL ijskoude DMEM aangevuld met HEPES of PBS toe. Plaats de microcentrifugebuisjes in conische buisjes van 50 ml en sluit het deksel om de steriliteit te behouden.
  15. Incubeer de pellet een nacht bij 4 °C om resuspentie mogelijk te maken.
  16. Combineer de geresuspendeerde pellets, aliquot, en bewaar ze maximaal een jaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Om titerverlies door herhaalde vries-ontdooirondes te voorkomen, gebruikt u kleinere hoeveelheden (bijv. 50-200 μL).

3. Functionele virustitratie

OPMERKING: Deze stap moet voor elke batch lentivirus worden herhaald om de optimale virale dosis te bepalen die nodig is om een verhouding van 1:1 van getransduceerde (eGFP+) tot niet-getransduceerde (eGFP-) cellen te bereiken.

  1. Ontdooi en breid kankercellen uit in geschikte kweekmedia (bijv. de YUMM1.7 muizenmelanoomcellijn in DMEM/F12 compleet medium).
    OPMERKING: Cellen moeten ten minste één delingsronde ondergaan voordat een herprogrammeringsexperiment wordt uitgevoerd. Passages van cellen moeten vergelijkbaar zijn tussen experimenten.
  2. Kweek een dag voor het ontstaan van de tumor kankercellen op door hun kweekmedia op te zuigen, één keer te wassen met PBS en 2 ml of 5 ml trypsine toe te voegen per plaat van 100 mm of plaat van 150 mm. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C met 5% CO2 en verzamel de cellen door 8 ml of 5 ml volledige media per plaat van respectievelijk 100 mm of 150 mm toe te voegen aan conische buizen van 50 ml.
  3. Centrifugeer de cellen bij 350 × g gedurende 5 minuten om trypsine te verwijderen en opnieuw te suspenderen in volledig medium.
  4. Neem een hoeveelheid cellen van 10 μL, voeg 10 μL Trypan Blue toe en tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.
  5. Breng 6 × 105 cellen over in een nieuwe conische buis van 50 ml met 12 ml volledig medium en voeg 12 μl 8 mg/ml polybreen toe aan de celsuspensie om een werkconcentratie van 8 μg/ml te bereiken.
  6. Pipetteer 2 ml van de celsuspensie in elk putje op een weefselkweekplaat met 6 putjes.
    OPMERKING: Verhoog indien nodig het celaantal tot 1,2-1,8 x 106 per plaat met 6 putjes.
  7. Voeg toenemende hoeveelheden lentivirus toe aan elk putje om het optimale volume te bepalen dat nodig is om een verhouding van 1:1 van getransduceerde (eGFP+) tot niet-getransduceerde (eGFP-) cellen te bereiken.
    OPMERKING: Voeg de aanbevolen lentivirusvolumes van lentivirus van 1, 2, 4, 8, 16 en 32 μL in drievoud toe. Voer de functionele titratie uit voor de lege-controle-lentivirale vector SFFV-eGFP en SFFV-mCherry.
  8. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
  9. Verwijder op dag 0 de lentivirusbevattende media, vervang ze door verse media en incubeer gedurende 72 uur bij 37 °C met 5% CO2.
  10. Controleer op dag 3 de cellen op eGFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop.
    OPMERKING: Deze stap biedt een snelle verificatie van celtransductie, maar vervangt niet de analyse die wordt uitgevoerd door flowcytometrie in stap 3.14 om de exacte verhouding van eGFP+ tot eGFP-cellen te bepalen.
    In sommige kankercellen (bijv. B16-melanoomcellen van muizen) kan het eGFP-signaal laag zijn en moeilijk te detecteren met een fluorescentiemicroscoop. Het wordt aanbevolen om direct over te gaan tot flowcytometrie.
  11. Zuig het medium op, was de cellen één keer met PBS en voeg 500 μL trypsine per putje toe. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  12. Til de cellen in elk putje op met 1,5 ml FACS-buffer en pipetteer de celsuspensie in polystyreenbuisjes van 5 ml. Neem een aliquot en tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauwe kleuring.
  13. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 × g gedurende 5 minuten, suspendeer de pellet in 100 μL FACS-buffer en ga verder met flowcytometrie-analyse.
  14. Kwantificeer de precieze verhouding van getransduceerde (eGFP+) tot niet-getransduceerde (eGFP-) cellen door middel van flowcytometrie. Gebruik voor in vivo testen het lentivirusvolume dat het dichtst bij de verhouding 1:1 ligt.
    OPMERKING: Om de verhouding tussen eGFP+ en eGFP-cellen nauwkeurig te bepalen, moet niet-getransduceerde kankercellen worden opgenomen als negatieve controles voor gating.

4. Subcutane tumorvestiging voor in vivo herprogrammering

  1. Ontdooi en breid kankercellen uit in hun geschikte kweekmedium voor het genereren van cellen die mCherry tot expressie brengen.
    OPMERKING: mCherry-expressie vergemakkelijkt het onderscheid tussen kankercellen tijdens flowcytometrieanalyse en andere populaties in de tumor, bijvoorbeeld endogene stromale en immuuncellen.
  2. Voer de stappen 3.2-3.4 uit en resusteer de cellen in volledige media in een concentratie van10-5 cellen per ml.
  3. Voeg 8 μg/ml polybreen en het bepaalde volume SFFV-mCherry lentivirus toe aan de celsuspensie om een transductie-efficiëntie van >90% te bereiken.
    OPMERKING: Als alternatief, als het bereiken van >90% transductie de levensvatbaarheid van de cellen in gevaar brengt, sorteer dan mCherry+ -cellen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) 72 uur na transductie en breid gesorteerde cellen uit in kweek.
  4. Plaat 5 ml van de celsuspensie (met 5 × 105 cellen) per 100 mm plaat en incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  5. Vervang na 24 uur het medium door 10 ml volledig medium en breid de cellen uit door ze gedurende ten minste 7 dagen bij 37 °C met 5% CO2 te kweken voordat u met de herprogrammeringsexperimenten begint.
  6. Volg na de expansie de stappen 3.2-3.4 om de celsuspensies voor te bereiden op daaropvolgende transductie met het eerder bepaalde volume SFFV-PIB-IRES-eGFP, wat resulteert in de dichtstbijzijnde verhouding van 1:1 van getransduceerde (eGFP+) tot niet-getransduceerde (eGFP-) cellen op dag 3.
  7. Voeg 8 μg/ml polybreen toe aan de celsuspensie, samen met het eerder bepaalde volume lentivirus aan de celsuspensie in conische buisjes van 50 ml. Meng goed zonder bubbels te creëren.
  8. Pipetteer 2 ml van de celsuspensie (met 105 cellen) per putje in een weefselkweekplaat met 6 putjes en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: U kunt de cellen ook plateren in 5 ml transductiemedia in weefselkweekplaten van 100 mm. Houd er echter rekening mee dat de transductie-efficiëntie bij grotere volumes kan afnemen en empirisch moet worden bepaald zoals beschreven in de stappen 3.1-3.13.
    Het wordt aanbevolen om ten minste 10% meer cellen te transduceren om mogelijk celverlies tijdens het transductieproces te compenseren en om te zorgen voor voldoende volume voor pipetteren of injectie tijdens het opzetten van de tumor.
  9. Verwijder na 24 uur het lentivirusbevattende medium, was tweemaal met PBS, voeg 500 μL trypsine toe aan elk putje en incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
  10. Controleer onder een lichtmicroscoop of de cellen volledig van de platen zijn gedissocieerd en verzamel ze vervolgens met volledige media in conische buisjes van 50 ml.
  11. Pellet de cellen door ze 5 minuten te centrifugeren op 350 × g, was de pellet met PBS en centrifugeer opnieuw gedurende 5 minuten op 350 × g. Neem een aliquot en tel levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauwe kleuring.
  12. Resuspendeer de pellet in ijskoude PBS om een concentratie van 2-4 × 107 cellen per ml te bereiken, wat overeenkomt met 1-2 × 106 cellen in 50 μL injectievolume per tumor.
    OPMERKING: Belangrijk is dat deze cijfers zijn gevalideerd voor YUMM1.7-melanoomtumoren om in vivo geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen te isoleren voor flowcytometrie-analyse. Voor andere cellijnen en voor andere experimentele uitlezingen, zoals tumorgroei- en overlevingsexperimenten, moeten de cijfers empirisch worden getest. Voor experimenten met tumorgroei en overleving worden lagere celaantallen aanbevolen, variërend van 100.000 tot 250.000 cellen per tumor.
  13. Verplaats naar het werkgebied waar dierproeven worden uitgevoerd en houd de cellen op ijs.
    OPMERKING: Voer na de celbereiding zo snel mogelijk celinjecties uit, aangezien de levensvatbaarheid van de cellen na verloop van tijd afneemt.
  14. Bereid de anesthesieoplossing voor die 3 μl xylazine (20 mg/ml), 27 μl ketamine (100 mg/ml) en 30 μl PBS per muis bevat.
  15. Verdoof CD45.1-muizen door 60 μL verdovingsmiddel intraperitoneaal te injecteren. Willekeurig de muizen en houd ze op een warmhoudkussen om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen. Breng oogcrème aan op hun ogen om ooguitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om CD45.1-muizen te gebruiken om onderscheid te kunnen maken tussen in vivo geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen die het wildtype CD45.2-allel tot expressie brengen en endogene immuuncellen. Als de cellijn CD45.1 is, kunnen C57BL/6-muizen (CD45.2) als ontvangers worden gebruikt. Muizen moeten op geslacht en leeftijd worden afgestemd tussen experimentele groepen en gerandomiseerd worden voordat de tumor zich ontwikkelt.
  16. Wacht 5-10 minuten totdat alle muizen volledig verdoofd zijn.
  17. Scheer de rechterflank van de muizen met een scheermes; Markeer ze eventueel met een oorclipper. Desinfecteer het gebied en veeg het resterende haar weg met 70% ethanol.
  18. Resuspendeer kankercellen door op en neer te pipetteren met een P1000-pipet. Laad de celsuspensie in een spuit van 30 G van 0,5 ml.
  19. Til de huid van de geschoren flank van de muis voorzichtig op met twee vingers en steek de punt van de naald in waar de huid een vouw vormt.
    OPMERKING: Wees voorzichtig om te voorkomen dat u uw vingers met de naald doorboort.
  20. Maak de huid los, houd de spuit met één hand op zijn plaats en gebruik twee vingers van de andere hand om de huid van de muis uit te rekken.
  21. Injecteer langzaam 50 μL van de kankercelsuspensie om een ovale uitstulping (onderhuidse zwelling) op de injectieplaats te creëren.
    OPMERKING: Als er geen uitstulping ontstaat, kan de suspensie in het omliggende onderhuidse weefsel zijn gelekt, wat kan leiden tot inconsistente of mislukte tumorvorming.
  22. Controleer na de procedure alle muizen die wakker worden om ervoor te zorgen dat ze na de anesthesie overleven.
  23. Houd de muizen in een omgeving met gecontroleerde temperatuur met 23 ± 2 °C en een vaste licht/donkercyclus van 12 uur en vrije toegang tot voedsel en water.
    OPMERKING: Als u de tumorgroei wilt controleren, gaat u verder met de stappen 4.24-4.26. Sla anders deze stappen over en ga direct door naar de volgende secties.
  24. Om de tumorgroei te volgen, houdt u de muis voorzichtig met één hand in bedwang, zodat de tumor duidelijk zichtbaar is.
  25. Meet met een elektronische schuifmaat de lengte (l), breedte (b) en hoogte (h) van de tumor. Bereken het tumorvolume (V) met behulp van de formule: V = (l x b x h) / 2.
  26. Meet de afmetingen van de tumor elke twee tot drie dagen. Wanneer de tumor een volume bereikt dat voldoet aan het humane eindpuntcriterium (bijv. 1.500 mm³), euthanaseer het dier dan in overeenstemming met ethische en institutionele richtlijnen.

5. Tumorisolatie voor flowcytometrie-analyse

  1. Bereid een schaar, tang, FACS-buffer en niet-weefselkweekplaten met 12 putjes voor met ijskoud RPMI compleet medium voor het verzamelen van tumormonsters.
  2. Bereid de oplossing voor de tumorvertering door 30 μl 100 mg/ml collagenase D en 3 μl 10 mg/ml DNAse I te mengen in 3 ml RPMI volledig medium per tumor (om een werkconcentratie van 1 mg/ml collagenase D en van 10 μg/ml DNAse I te bereiken).
    OPMERKING: Als de spijsverteringsefficiëntie niet optimaal is, voeg dan 2-5 mM CaCl2 toe om de collagenase-activiteit te ondersteunen.
  3. Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie of CO2 -verstikking op de dag van isolatie.
  4. Snijd onderhuidse tumoren weg met een schaar en een tang en plaats elke tumor in een putje van de niet-weefselkweekplaat met 12 putjes met ijskoude RPMI. Probeer de excisie van niet-tumorweefsel tot een minimum te beperken.
  5. Snijd tumormonsters in 1-2 mm3 stukken met een schaar, verzamel de stukjes in conische buizen van 50 ml met 3 ml digestieoplossing en incubeer bij 37 °C terwijl u schudt bij 200-250 tpm gedurende 30-45 minuten.
    OPMERKING: Vortex of pipet om de 15 minuten om het verteringsproces te vergemakkelijken.
  6. Na de spijsvertering pipetteer het mengsel krachtig gedurende 1 minuut met behulp van een serologische pipet van 5 ml. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml.
  7. Gebruik de zuiger van een spuit van 10 ml om niet-verteerde stukjes tegen de celzeef van 70 μm te slaan en spoel de zeef af met 10 ml RPMI compleet medium.
  8. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, resuspendeer in 1 ml FACS-buffer en tel de levensvatbare cellen.
  9. Breng de celsuspensie over in polystyreenbuisjes van 5 ml, pelletcellen bij 350 × g gedurende 5 minuten en suspendeer 106 levensvatbare cellen per 100 μl FACS-buffer.
  10. Afzonderlijke cellen voor enkelvoudige kleur (SC) en FMO-regelaars in afzonderlijke polystyreenbuizen.
  11. Bereid een antilichaamkleuringsmastermix voor met rattenserum (1:100) om niet-specifieke binding te blokkeren; een fixeerbare kleurstof voor de levensvatbaarheid (1:100) om dode cellen in de analyse uit te sluiten; en fluorescerend gelabelde antilichamen anti-CD45.1, anti-CD45.2 en anti-MHC-II in hun optimale concentratie. Voeg aan elk monster 100 μl van het basismengsel toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C in het donker.
  12. Was de monsters 2x met 2 ml FACS-buffer en ga verder met flowcytometrie-analyse.
  13. Kwantificeer de percentages cDC1-achtige cellen die CD45.2 en/of MHC-II tot expressie brengen, door getransduceerde (eGFP+) kankercellen (CD45.1-mCherry+) in te sluiten.
    OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt om immunofenotypering van tumoren uit te voeren na in vivo cDC1-herprogrammering door het kleuringspaneel aan te vullen met antilichamen tegen endogene lymfoïde en/of myeloïde immuuncelpopulaties.

6. Bevriezing en doorsnede van tumoren voor confocale microscopieanalyse

  1. Bereid je voor op tumorisolatie door stappen 5.1 en 5.3 te volgen. Snijd onderhuidse tumoren weg met een schaar en een tang.
  2. Fixeer tumoren in vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij 4 °C met voorzichtig schudden. Pas de fixatietijd aan op basis van de grootte van de tumor, met 1 uur per mm³ weefsel als richtlijn.
  3. Breng tumoren over in 15% sucrose in PBS en incubeer bij 4 °C terwijl u de weefsels voorzichtig schudt totdat ze naar de bodem van de buis zinken. Verplaats ze vervolgens naar 20% sucrose in PBS onder dezelfde omstandigheden.
  4. Zodra de tumoren zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, incubeer ze in een 1:1 mengsel van 20% sucrose in PBS en OCT-verbinding gedurende 30 minuten bij 4 °C met schudden.
  5. Verwijder het mengsel, sluit de weefsels in een cryomold met 100% OCT en vries ze in met vloeibare stikstof.
    NOTITIE: Draag altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (cryohandschoenen, gelaatsscherm en laboratoriumjas) om koude brandwonden of letsel door snelle dampexpansie te voorkomen. Werk in een goed geventileerde ruimte om verstikkingsgevaar te voorkomen.
    1. Bewaar blokken bij -80 °C in gesloten containers om uitdroging te voorkomen.

7. Immunofluorescentie kleuring van tumorsecties

  1. Snijd de tumoren met behulp van een cryostaat in ongeveer 8 μm dikke secties en monteer ze op microscoopglasplaatjes. Bewaar de glaasjes indien nodig bij -80 °C.
    OPMERKING: Om de integriteit van het weefsel te behouden, moeten de blokken en dia's met gemonteerde tumorsneden op droogijs liggen tijdens het transport van en naar de cryostaat. Zorg ervoor dat de cryostaat tijdens het snijden op -20 °C wordt gehouden.
  2. Ontdooi de objectglaasjes 5 minuten in PBS en fixeer ze 10 minuten in een 4% PFA-oplossing bij RT.
  3. Was de objectglaasjes na fixatie 5 minuten in PBS.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de tissues gehydrateerd blijven; Bewaar ze altijd in vloeistof tijdens alle volgende kleuringsstappen. Als het experiment moet worden gepauzeerd, kunnen dia's maximaal 3 uur worden opgeslagen in PBS op RT. Bewaar de dia's niet 's nachts in PBS.
  4. Vul voor het ophalen van antigeen een stomer met water en zet hem aan. Plaats een pot met gedeïoniseerd water en een pot met 10 mM natriumcitraat (pH 6) in de stomer en dek de opening af met aluminiumfolie. Steek zonder het deksel te verwijderen een thermometer door de ventilatieopeningen van het stoomdeksel, prik in de aluminiumfolie en controleer de temperatuur en zorg ervoor dat de oplossingen ~99 °C bereiken.
  5. Wanneer de buffers ~99 °C bereiken, dompelt u de dia's 10 s onder in gedeïoniseerd water en brengt u ze vervolgens snel over naar de antigeenoplossing.
  6. Incubeer de glaasjes gedurende 15 minuten bij ~99 °C.
  7. Was de dia's in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  8. Gebruik een hydrofobe barrière-pappen om elk weefselgedeelte af te bakenen en een hydrofobe omtrek te vormen die voorkomt dat vloeistof die aan de weefsels wordt toegevoegd, lekt.
    OPMERKING: Daaropvolgende PBS-wasbeurten kunnen de hydrofobe perimeter rond de weefsels verstoren en moeten worden vernieuwd. Teken het opnieuw als dat nodig is.
  9. Blokkeer en permeabiliseer weefsels met 150 μL blokkeerbuffer (5% serum en 0,5% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 60 minuten bij RT. Gebruik voor alle kleuringsstappen serum van dezelfde soort als de gastheer van het secundaire antilichaam.
  10. Was de dia's in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  11. Incubeer weefsels met 20 μg/ml van het primaire anti-CD45-antilichaam in blokkeerbuffer (5% serum en 0,5% Triton X-100 in 1X PBS) 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: Om andere antilichamen te gebruiken, moet u de antilichaamconcentratie empirisch valideren.
  12. Was de dia's in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  13. Incubeer de weefselcoupes met het secundaire anti-rat antilichaam van de geit, geconjugeerd met AlexaFluor-647 in een verdunning van 1:250 in een blokkerende buffer (5% serum) gedurende 2 uur in het donker bij RT.
    OPMERKING Voer na het toevoegen van het secundaire antilichaam alle volgende stappen in het donker uit om fotobleken van de fluoroforen te voorkomen.
  14. Was de dia's in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  15. Incubeer weefsels met 1 μg/ml DAPI en 20 μg/ml AlexaFluor-594 geconjugeerde antilichamen in blokkerende buffer (5% serum) gedurende 1 uur in het donker bij RT.
  16. Was de dia's in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  17. Voeg een druppel montageoplossing toe op elk tumorgedeelte en breng vervolgens een paar druppels montagemedium aan op het dekglaasje. Keer het dekglaasje snel om op het glaasje om om het te monteren en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de buurt van de tumoren zijn.
  18. Laat de objectglaasjes een nacht drogen en maak ze met confocale microscopie in beeld.

Resultaten

Een schematisch overzicht van het traceerbare in vivo herprogrammeringsprotocol wordt weergegeven in Figuur 1. Eerst produceerden we de polycistronische lentivirale vector SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), die codeert voor de cDC1-instruerende herprogrammeringsfactoren PU.1, IRF8, BATF3, gevolgd door een interne ribosomale ingangsplaats (IRES) en verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) in de HEK 293T-verpakkingscellijn. Om te controleren op lentivirus-gemedieerde immunogeniciteit, produceerden we een lege SFFV-MCS-eGFP (eGFP) vector, die een meervoudige kloneringsplaats (MCS) en IRES-eGFP bevat, maar zonder de herprogrammeringsfactoren. Na de virale productie hebben we het lentivirus-bevattende supernatans geoogst en geconcentreerd door middel van ultracentrifugatie. We hebben het virus functioneel getitreerd om de hoeveelheid te bepalen die nodig is om een verhouding van 1:1 van getransduceerde (eGFP+) tot niet-getransduceerde (eGFP-) cellen te bereiken, die we op dag 3 na transductie hebben geëvalueerd. Vervolgens gebruikten we de resulterende hoeveelheid virus om de geselecteerde kankercellijn op dag -1 te transduceren. Na 24 uur verzamelden we de cellen en implanteerden we ze subcutaan om tumoren te ontwikkelen. Deze strategie zorgde ervoor dat getransduceerde cellen in vivo werden geherprogrammeerd tot cDC1-achtige cellen, binnen de TME. Op aangegeven tijdstippen na de implantatie hebben we tumoren weggesneden en verwerkt voor stroomafwaartse analyses, waaronder flowcytometrie van gedissocieerde tumorcellen, om in vivo herprogrammeringsefficiëntie te kwantificeren, of immunofluorescentiekleuring van gecryopreserveerde tumorsecties om veranderingen in de TME te karakteriseren.

Ten eerste, om de productie van hoge lentivirale titers te verzekeren, hebben we HEK 293T-cellen gemonitord vóór transfectie, gericht op het bereiken van 70-80% confluentie en 24 uur later hebben we de transfectie-efficiëntie beoordeeld door middel van eGFP-expressie door fluorescentiemicroscopie (Figuur 2A). Vervolgens verzamelden we 48 uur en 60 uur na de transfectie virusbevattend medium, ultracentrifugeerden het en bewaarden het in aliquots bij -80 °C (Figuur 2B). Vervolgens bepaalden we de optimale virale hoeveelheid die nodig was om een verhouding van 1:1 van eGFP+ tot eGFP-cellen in YUMM1.7 melanoomcellen te bereiken. We zaaiden 105 YUMM1.7-cellen per putje in een plaat met 6 putjes, transduceerden de cellen met toenemende hoeveelheden lentivirus en vervingen het virusbevattende supernatans na 24 uur door verse DMEM/F12 complete media (Figuur 2C). Op dag 3 beoordeelden we de eGFP-expressie door middel van fluorescentiemicroscopie, voordat we verder gingen met het kwantificeren van de precieze percentages eGFP+-cellen door middel van flowcytometrie (Figuur 2C). Om de verhouding tussen eGFP+ en eGFP-cellen te kwantificeren, hebben we levende, enkele cellen omheind om dode cellen en doubletten uit te sluiten (Figuur 2D). Het optimale volume van de geproduceerde lentivirusbatch werd bepaald voor zowel PIB-eGFP als het controle-eGFP-virus als 2 μL per 105 YUMM1.7-cellen, resulterend in respectievelijk 50.0 ± 0.3% en 63.0 ± 0.9% eGFP+-cellen (Figuur 2E).

Om de efficiëntie van in vivo herprogrammering te evalueren, hebben we vervolgens een fluorescerend gelabelde (mCherry+) kankercellijn (YUMM1.7-mCherry) gegenereerd. Dit zorgde ervoor dat we onderscheid konden maken tussen kankercellen en stromale of immuuncellen door levende mCherry+-cellen in te sluiten in de flowcytometrie-analyse (Figuur 3A,B). Vervolgens transduceerden we YUMM1.7-mCherry-cellen met 2 μL PIB-eGFP of controle-eGFP-virus per 105 cellen om een 1:1 eGFP+ tot eGFP-verhouding te bereiken. We hebben subcutaan 1,6 × 106 cellen per tumor geïmplanteerd in CD45.1-muizen en een aliquot cellen in vitro gekweekt ter vergelijking. We evalueerden de herprogrammeringsefficiëntie door middel van flowcytometrie, waarbij levende mCherry+ eGFP+ en CD45.1-cellen werden afgeschermd om gastheer-immuuncellen uit te sluiten die eGFP of mCherry hebben opgeslokt (Figuur 3B). Van dag 1 tot 9 zagen we de geleidelijke verwerving van CD45.2- en/of MHC-II-expressie, waarbij gedeeltelijk geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen (CD45.2+ MHC-II- of CD45.2- MHC-II+) en volledig geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen (CD45+ MHC-II+) werden gemarkeerd (Figuur 3C). We valideerden dat herprogrammering van muizenkankercellen in vivo resulteerde in hogere percentages cDC1-achtige cellen op dag 9 in vergelijking met in vitro omstandigheden (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+in vivo vs. 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+in vitro, P = 0,018). De kinetiek van herprogrammering werd ook versneld toen we al op dag 4 een hoger percentage cDC1-achtige cellen waarnamen (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+in vitro, P = 0,05), wat aangeeft dat de aanwezigheid van omgevingsfactoren een snellere en efficiëntere herprogrammering naar cDC1-achtige cellen19 bevordert. Terwijl in vitro geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen aanwezig waren tot dag 15, bleven in vivo cDC1-achtige cellen 9 dagen bestaan, maar waren ze niet gedetecteerd op dag 15, wat wijst op depletie van de TME door het immuunsysteem van de gastheer (Figuur 3C). 

Ten slotte wilden we vroege veranderingen van de TME karakteriseren als gevolg van in vivo cDC1-herprogrammering in de eerste 9 dagen. We voerden immunofluorescentiekleuring uit van gecryopreserveerde en doorgesneden tumorweefsels van zowel eGFP- als PIB-eGFP-tumoren na 3 en 9 dagen in vivo herprogrammering, met de nadruk op de infiltratie van immuuncellen gemarkeerd door de pan-hematopoëtische marker CD45. Met name cDC1-achtige cellen rekruteerden significant meer CD45-cellen naar de TME op dag 3, vergeleken met eGFP-tumoren (49,6 ± 17,0 vs. 8,0 ± 5,8 eGFP gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CD45-kleuring per tumorgebied; Figuur 4A,B). Interessant is dat we TLS detecteerden in de TME van tumoren na 9 dagen van in vivo herprogrammering. Dit suggereert dat cDC1-achtige cellen de TME binnen 3 dagen snel kunnen hermodelleren van een "immuunkoude" naar een "immuun-warme" omgeving, wat vervolgens leidt tot TLS-vorming op dag 9.

figure-results-1
Figuur 1: Protocoloverzicht om cDC1-achtige cellen te genereren door in vivo herprogrammering van kankercellen. Lentivirale vectoren SFFV-PIB-IRES-eGFP-codering PU.1, IRF8 en BATF3 in een polycistronische cassette onder controle van de miltfocusvormende viruspromotor (SFFV) en eGFP na een interne ribosoomingangsplaats (IRES) om getransduceerde cellen te volgen door middel van flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie - worden geproduceerd in de HEK 293T-verpakkingscellijn. Vervolgens worden lentivirale vectoren ultragecentrifugeerd en functioneel getitreerd om de hoeveelheid virus te bepalen die nodig is voor het transduceren van kankercellen in een verhouding van 1:1 getransduceerde eGFP+ tot niet-getransduceerde eGFP-cellen. Voor in vivo herprogrammeringsexperimenten worden kankercellen op dag -1 geplateerd met de optimale hoeveelheid lentivirus. De volgende dag wordt deze 1:1 mix van getransduceerde GFP+ en niet-getransduceerde GFP-cellen gewassen en verzameld voor subcutane tumorvorming bij muizen. Parallelle in vitro culturen worden gehandhaafd om transductie op dag 3 te valideren door middel van flowcytometrie. Dieren worden elke 2-3 dagen gecontroleerd op tumorgroei en overleving. Tumoren worden verzameld op gedefinieerde tijdstippen, gedissocieerd en gekleurd voor expressie van oppervlaktemarkers voor flowcytometrie-analyse. Als alternatief worden hele weefsels gefixeerd, gecryopreserveerd en doorgesneden voor immunofluorescentiekleuring en confocale microscopie-analyse. In vivo herprogrammeringsefficiëntie wordt geëvalueerd door middel van flowcytometrie-analyse, terwijl veranderingen in de micro-omgeving van de tumor worden gekenmerkt door confocale beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Productie en functionele titratie van lentivirus voor in vivo cDC1 herprogrammering. (A) Wanneer HEK 293T-cellen ~70-80% samenvloeiing bereiken, worden ze getransfecteerd met een mengsel dat 10 μg transferplasmide bevat, ofwel SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) of lege lentivirale vectorcontrole SFFV-eGFP (eGFP), samen met 7,5 μg psPAX2 en 2,5 μg mPD2.G en 60 μL 1 mg/ml PEI. Helderveld- en fluorescentiemicroscopiebeelden van HEK 293T-cellen die eGFP-expressie 24 uur na transfectie tonen, wat wijst op succesvolle plasmideafgifte. Schaalbalken = 200 μm. (B) Schematische weergave van de ultracentrifugatieworkflow om lentivirus te concentreren. Het lentivirus-bevattende supernatans van HEK 293T-cellen wordt 48 uur en 60 uur na transfectie verzameld, gefilterd door een 0,45 μm eiwitarm bindend PES-filter en 37 g wordt gewogen in open-top dunwandige polypropyleen buizen met behulp van een tafelweegschaal. Buizen worden ultragecentrifugeerd in een Swinging-Bucket Rotor, het bovenstaande wordt aangezogen en de pellet wordt gedurende 5 minuten gedroogd. Pellets worden vervolgens geresuspendeerd in ijskoude DMEM die HEPES bevat en een nacht geïncubeerd voordat ze worden gealucht en opgeslagen bij -80 °C. (C) Experimentele strategie van de functionele titratie om de optimale virale dosis te bepalen voor het bereiken van een 1:1 verhouding van GFP+ tot GFP-cellen. Helderveld- en fluorescentiemicroscopiebeelden die eGFP-expressie tonen in YUMM1.7-melanoomcellen, 72 uur na transductie, wat wijst op succesvolle levering van de herprogrammeringsfactoren en eGFP. Schaalbalken = 100 μm. (D) Representatieve flowcytometriegrafieken die de poortstrategie tonen om de verhouding van eGFP+ -cellen te kwantificeren. Levende cellen werden afgeschermd voor levensvatbaarheid kleurstofnegatieve populatie (DAPI), gevolgd door doubletuitsluiting. (E) Kwantificering van de transductie-efficiëntie van flowcytometrie met toenemende virale doses om het optimale volume te bepalen voor het bereiken van 1:1 GFP+/GFP-cellen . Voor zowel PIB-eGFP als eGFP lentivirus bereikte 2 μL volume per 105 cellen de gewenste verhouding. Afkortingen: cDC1s = type 1 conventionele dendritische cellen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; PIB = PU.1, IRF8 en BATF3; PEI = polyethyleenimine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Beoordeling van de efficiëntie van de in vivo cDC1-herprogrammering. (A) Schematische weergave van de experimentele workflow voor het evalueren van de efficiëntie van in vivo cDC1-herprogrammering. Kankercellen worden in eerste instantie getransduceerd met een lentivirus dat mCherry tot expressie brengt om een fluorescerend gelabelde cellijn (YUMM1.7-mCherry) te genereren, gevolgd door transductie met de geoptimaliseerde dosis PIB-eGFP lentivirus op dag -1. Cellen worden vervolgens subcutaan geïnjecteerd met een verhouding van 1:1 van eGFP+/eGFP-cellen op dag 0 om tumoren te vestigen in CD45.1-muizen en PIB-getransduceerde cellen te laten herprogrammeren in cDC1-achtige cellen binnen de TME. Tumoren worden vervolgens geïsoleerd op aangegeven tijdstippen, gedissocieerd en gekleurd voor CD45.1, CD45.2 en MHC-II met behulp van flowcytometrie. Dit maakt het mogelijk om CD45.1-gastheerimmuuncellen uit te sluiten om in vivo cDC1-herprogrammeringsefficiëntie te kwantificeren door expressie van CD45.2 en MHC-II. Parallelle in vitro culturen worden gedurende de tijdspunten aangehouden in vergelijking met in vivo herprogrammering. (B) Representatieve flowcytometriegrafieken die de gatingstrategie op dag 9 illustreren. Cellen werden afgeschermd op mCherry+ en GFP+ om succesvol getransduceerde kankercellen te identificeren. Immuuncellen van de gastheer werden uitgesloten door CD45.1+-cellen uit te sluiten. (C) Kwantificering van in vivo herprogrammeringsefficiëntie (links) van YUMM1.7-mCherry-cellen door middel van flowcytometrie als het percentage CD45+ MHC-II+ cellen (volledig geherprogrammeerd) en CD45.2+ HLA-DR- of CD45.2-HLA-DR+ cDC1-achtige cellen (gedeeltelijk geherprogrammeerd) afgeschermd binnen eGFP+ mCherry+ Cellen. Representatieve flowcytometriegrafieken (rechts) die de geleidelijke verwerving van CD45.2- en MHC-II-expressie in PIB-eGFP-getransduceerde YUMM1.7-mCherry-cellen op de aangegeven tijdstippen laten zien. eGFP-getransduceerde YUMM1.7-mCherry-cellen werden gebruikt als controle en in vitro geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen werden gebruikt ter vergelijking. Gegevens in (C) geven een gemiddelde ± SD aan van 3-5 biologische replicatie-experimenten. Statistische analyse in (C) werd uitgevoerd voor CD45+ MHC-II+ cellen met behulp van de Mann-Whitney-test. *P < 0,05. Afkortingen: cDC1s = type 1 conventionele dendritische cellen; PIB = PU.1, IRF8 en BATF3; TME = micro-omgeving van de tumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Analyse van immuuninfiltratie in de micro-omgeving van de tumor na in vivo cDC1-herprogrammering. (A) Representatieve confocale beelden van CD45+ -cellen in YUMM1.7-tumoren na subcutane implantatie van PIB-eGFP- of controle-eGFP-getransduceerde cellen (1:1 verhouding van getransduceerde naar oudercellen) op dag 3 en 9. Schaalbalken = 500 μm. (B) Kwantificering van de MFI voor CD45-kleuring bij met PIB behandelde en controle-eGFP-getransduceerde YUMM1.7-tumoren op dag 3 en 9. Gegevens in (B) geven het gemiddelde ± SD van 3-6 biologische replicatie-experimenten aan. Statistische analyse in (B) werd uitgevoerd met behulp van de Mann-Whitney-test. *P < 0,05 en ***P < 0,001. Afkortingen: cDC1s = type 1 conventionele dendritische cellen; PIB = PU.1, IRF8 en BATF3; MFI = gemiddelde fluorescentie-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In dit protocol beschrijven we een hanteerbare methode om cDC1-achtige cellen te genereren op basis van in vivo herprogrammering van kankercellen uit solide tumoren. Onze resultaten tonen aan dat de overexpressie van PU.1, IRF8 en BATF3 de geleidelijke verwerving van een cDC1-fenotype in de TME stimuleert tot dag 9, waarna cDC1-achtige cellen uit tumoren worden gedegenereerd. Uiteindelijk leidt dit tot een toename van de infiltratie van CD45-cellen in de TME op dag 3, waardoor de hermodellering van een "immuunkoude" TME "immuun-warm" wordt.

Huidige protocollen om cDC1 te genereren omvatten verrijking van autologe DC's uit perifeer bloed, differentiatie van CD34+ hematopoëtische voorlopercellen of differentiatie van pluripotente stamcellen 14,15,16,17,18,19. Deze methoden vertonen echter beperkende factoren: onvoldoende rijping, verminderde antigeenpresentatie en cytokine/chemokine-productiecapaciteit in vivo, gevoeligheid voor immunosuppressie, hoge DC-heterogeniteit en lage aantallen gegenereerde cellen7. Hier bieden we een protocol dat het mogelijk maakt om in vivo schaalbare cDC1-achtige cellen te genereren voor functionele en mechanistische studies.

Met deze methode hebben we getest of de expressie van de transcriptiefactorcombinatie PU.1, IRF8 en BATF3 voldoende was om in vivo herprogrammering aan te sturen. Dit protocol maakt een nauwkeurige controle van de toedieningsefficiëntie mogelijk, aangezien het variëren van de dosis geïmplanteerde genetisch gemodificeerde cellen rechtstreeks van invloed is op de werkzaamheid van de behandeling. We hebben eerder aangetoond dat 2% getransduceerde cellen, die overeenkomen met 0,15% CD45+ en MHC-II+ cDC1-achtige cellen, voldoende zijn om antitumorimmuniteit op te wekken20. Bovendien suggereert de snelle immuuninfiltratie die op dag 3 werd waargenomen dat gedeeltelijk geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen functioneel actief zijn in vivo, aangezien er op dit tijdstip geen substantiële toename is van volledig geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen. In de toekomst zal het interessant zijn om de functionele rol van gedeeltelijk versus volledig geherprogrammeerde cDC1-achtige cellen in de antitumorwerkzaamheid te ontrafelen met behulp van gemodificeerde vectoren die een zelfmoordgen bevatten om celdood te induceren in geselecteerde celpopulaties op gedefinieerde tijdstippen24. Dit protocol kan verder worden gebruikt om de combinatie met epigenetische adjuvantia te onderzoeken, wat de herprogrammeringsefficiëntie kan verhogen25. Ten slotte kan deze methode ook worden aangepast om andere DC-subtypes in vivo te genereren, waarbij verschillende soorten immuunresponsen worden gelanceerd, bijvoorbeeld antivirale of tolerogene responsen14. Bovendien kunnen we in vivo herprogrammering gebruiken als een platform om barcodes uit te voeren voor transcriptiefactorcombinaties om diverse immuunceltypen te genereren. Deze mogelijkheid zou de flexibiliteit van behandelingen kunnen vergroten door gebruik te maken van diverse functionele eigenschappen van specifieke immuunsubsets.

In onze vorige studie hebben we aangetoond dat de immunosuppressieve in vivo omgeving de herprogrammering van menselijke kankercellen tot immunogene cDC1's20 niet belemmert. In dit artikel laten we zien dat bij muizen herprogrammering in vivo sneller en efficiënter is dan in vitro, wat suggereert dat de verbeterde herprogrammering die in vivo wordt waargenomen een geconserveerd fenomeen is bij beide soorten. Een van de beperkingen van deze methode is echter het ontbreken van de in vivo omgeving tijdens de eerste vectorafgifte; Het kan dus niet onderscheiden of omgevingsfactoren van invloed zijn op de efficiëntie van de in vivo levering. Dit moet ter plaatse worden bepaald door verschillende delen te vergelijken. Adenovirale vectoren, waarvan we hebben vastgesteld dat ze efficiënter zijn dan lentivirale vectoren voor in-situ toediening20 , kunnen worden vergeleken met niet-virale delen zoals lineaire, circulaire en zelfversterkende RNA's of cocktails van kleine moleculen2 6,27.

We hebben eerder aangetoond dat cDC1-herprogrammering kankercellen begiftigt met pro-inflammatoire cytokine- en lymfocytenrekruterende chemokinesecretie en professionele antigeenverwerking en presentatie op MHC-I en MHC-II in melanoommodellen23,28. Dit resulteert in hermodellering van de TME van een "immuun-koude" naar een "immuun-hete" toestand door TLS-vorming te induceren, die de infiltratie van cytotoxische effector-T-cellen, NK-cellen en B-cellen verhoogt en immunosuppressieve populaties zoals regulerende en uitgeputte T-cellen vermindert20. Bij patiënten zijn positieve reacties op immunotherapie in verband gebracht met de aanwezigheid van TLS in tumoren, waarbij aanhoudende T- en B-celpriming tegen tumorantigenen tumorspecifieke antilichaamresponsen genereert29,30. In de toekomst stellen we ons voor om dit traceerbare in vivo cDC1-herprogrammeringsprotocol te gebruiken om de mechanismen van geïnduceerde TLS-neogenese, TME-remodellering en antitumorimmuniteit bij verschillende kankertypes te ontrafelen en te karakteriseren of de productie van tumorspecifieke antilichamen wordt gestimuleerd.

We hebben eerder synergie waargenomen tussen in vivo cDC1-herprogrammering en ICB met anti-PD-1 of anti-CTLA-420. Dit suggereert dat de "immuun-hete" TME die wordt gecreëerd door cDC1-herprogrammering een gunstige omgeving zou kunnen bieden voor mogelijke combinaties met andere immunotherapieën zoals ACT, waaronder T-celreceptor (TCR)-T-cellen, chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen of tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's). Een ander voordeel van deze methode is de mogelijkheid om grote onbevooroordeelde combinatorische of CRISPR-schermen uit te voeren, waarbij immunologische receptoren, cytokines, chemokines of lymfotoxinen tot overexpressie of verarming kunnen worden gebracht in cDC1-achtige cellen in resistente tumortypes, waardoor de rol van verschillende routes bij het versterken van cDC1-gemedieerde immuniteit wordt ontrafeld. Concluderend biedt het huidige protocol een waardevolle bron voor een brede wetenschappelijke gemeenschap, aangezien in vivo cDC1-herprogrammering een flexibel en krachtig platform is voor mechanistische studies en therapeutische innovatie in kankerimmunotherapie.

Openbaarmakingen

C.-F.P. heeft een aandelenbelang en bekleedt managementfuncties bij Asgard Therapeutics AB, dat kankerimmunotherapieën ontwikkelt op basis van in vivo DC-herprogrammeringstechnologieën. C.-F.P is een uitvinder van verleende octrooien US 11,345,891, JP 7303743 en CN ZL201880005047.3 en octrooiaanvragen WO 2018/185709 en WO 2022/243448 (samen met EA) in het bezit van Asgard Therapeutics, die betrekking hebben op de hier beschreven benadering van celherprogrammering.

Dankbetuigingen

We danken Mariana Lopes en Camille Chatelain, leden van het Cell Reprogramming in Hematopoiesis and Immunity Laboratory, voor het redigeren en proeflezen van het manuscript.

Deze studie werd uitgevoerd in de context van de Nationale ATMP Onderzoeksschool, gefinancierd door de Zweedse Onderzoeksraad. De hier besproken projecten werden medegefinancierd door de Europese Onderzoeksraad in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (866448-TrojanDC en 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), Europese Innovatieraad (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), de Zweedse Onderzoeksraad (2020-00615), Zweeds Innovatieagentschap (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) en Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). De Knut en Alice Wallenberg Foundation, de medische faculteit van de Universiteit van Lund en Region Skåne worden erkend voor hun genereuze financiële steun.

Materialen Beschikbaarheid:

Constructies en vectoren die worden gebruikt voor herprogrammering zijn verkrijgbaar bij Asgard Therapeutics onder een overeenkomst voor materiaaloverdracht met het bedrijf. Alle andere gegevens die nodig zijn om de conclusies in de paper te evalueren, zijn aanwezig in de hoofdtekst of het aanvullende materiaal.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum FilterFisher scientific15983297
2-Mercaptoethanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Anti-mouse CD45 Monoclonal Antibody (clone: 30-F11), Rat IgG2b, κThermoFisher Scientific14-0451-82
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)The Jackson Laboratory002014
BD Micro-Fine U-100 Insulin Syringes (0.5 mL)Fisher Scientific11395751
C57BL/6J miceThe Jackson Laboratory000664
Collagenase DSigma Aldrich11088882001
Corning Falcon Cell Strainer For Use With 50ml Conical TubesSigma AldrichCLS352340
Corning cover glasses 24 x 50 mm Sigma AldrichCLS2975245
DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)ThermoFisher ScientificD1306
DNase ISigma Aldrich10104159001
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 450Invitrogen65-0863-14
eBioscience IHC Antigen Retrieval Solution - Low pH (10x)ThermoFisher Scientific00-4955-58
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher ScientificA5256701
Fluoromount-G Mounting MediumThermoFisher Scientific00-4958-02
GFP Antibody [Alexa Fluor 594]Novus BiologicalsNB600-308AF594
Gibco DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific31331028
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumThermoFisher Scientific52400025
Gibco Sodium Pyruvate (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific35050061
Goat anti-rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Polyclonal, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11006
HEK 293T cellsATTCCRL-11268
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma AldrichH9268
HyClone Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseCytivaSH30243.01
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep)CytivaSV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS)CytivaSH30028.02
Ketaminol vet. Solution for injection 100 mg/mLMSD Animal Health SwedenQN01AX03
Microtome Blade - C35pfm medical207500005
Mouse anti-CD45.2 (104), Surface, APC, MonoclonalBiolegend109814
Mouse anti-MHCII (M5/114.15.2), Surface, PE-Cy7, MonoclonalBiolegend107630
Normal Goat SerumAbcamab7481
Normal Rat Serum (sterile)Abcamab7488
Open-Top Thinwall Polypropylene TubesBeckman Coulter Life Sciences326823
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeThermoFisher Scientific043368.9M
pFUW-tetO-Batf3, a monocistronic cassette encoding mouse Batf3Addgene139837
pFUW-tetO-Irf8, a monocistronic cassette encoding mouse Irf8Addgene139838
pFUW-tetO-Pu.1, a monocistronic cassette encoding mouse Pu.1Addgene139839
Plasmid pMD2.GAddgene12259
Plasmid psPAX2Addgene12260
Plasmid SFFV-eGFP (eGFP)In house cloning-
Plasmid SFFV-mCherry (mCherry)In house cloning-
Plasmid SFFV-PIB-eGFP,  a polycistronic cassette encoding mouse PU.1, IRF8, and BATF3 (PIB) In house cloning-Constructs and vectors used for reprogramming are available from Asgard Therapeutics under a material transfer agreement with the company
Polyethylenimine (PEI), Linear, MW 25000, Transfection GradePolysciences23966
ReadyProbes Hydrophobic Barrier Pap PenThermoFisher ScientificR3777
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
SucroseSigma-AldrichS7903
SuperFrost Plus Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek4583
TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol redThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold Intermediate, square (15 x 15 x 5 mm)Sakura Finetek4566
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Xysol vet. Solution for injection 20 mg/mLVM PharmaQN05CM92
YUMM1.7 cellsAntineo

Referenties

  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Herprogrammering van tumorcellencDC1 achtige cellenkankerimmunotherapietumormicro omgevingcytotoxische T cellenantigeenpresentatielentivirale transductietertiaire lymfo de structurenCD45 marker

Gerelateerde artikelen