Workflow voor karakterisering van neuropeptiden, van bemonstering tot gegevensonafhankelijke acquisitie massaspectrometrie

Summary

Dit protocol schetst een uitgebreide neuropeptidomics-workflow in hersenweefsel van ratten die data-afhankelijke acquisitie-parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (DDA-PASEF) en data-onafhankelijke acquisitie (DIA) massaspectrometrie combineert.

Abstract

Endogene neuropeptiden zijn belangrijke modulatoren van de hersenfunctie en spelen een cruciale rol bij gedrag, stress, pijn en homeostatische regulatie, maar hun analyse blijft moeilijk. Biologisch gezien zijn ze laag in overvloed, worden ze snel afgebroken en variabel verwerkt uit voorlopereiwitten, waarbij de expressie beperkt is tot kleine, gelokaliseerde celpopulaties. Technisch gezien wordt hun detectie bemoeilijkt door een breed dynamisch bereik, diverse posttranslationele modificaties en schaarse signalen in massaspectrometrie-datasets. Dit protocol schetst een uitgebreide workflow voor neuropeptide-analyse in hersenweefsel van Rattus norvegicus met behulp van zowel data-dependent acquisition (DDA) als data-independent acquisition (DIA) massaspectrometrie (MS) op een timsTOF-platform. Na een geoptimaliseerde voorbereiding van het hersenmonster, inclusief dissectie, peptide-extractie en opruiming, wordt nano-vloeistofchromatografie (LC)-MS uitgevoerd met ionenmobiliteit gasfasefractionering om de detectiegevoeligheid en nauwkeurigheid te verbeteren. De door DDA gegenereerde spectrale bibliotheek ondersteunt kwantificering op basis van DIA in Skyline, waardoor metingen op MS2-niveau met hoge betrouwbaarheid mogelijk zijn. Deze geïntegreerde workflow verhoogt de dekking van neuropeptiden en verbetert de kwantitatieve reproduceerbaarheid, en biedt een robuust platform voor het bestuderen van neuropeptiden in complex hersenweefsel.

Introduction

Neuropeptiden zijn een functioneel diverse klasse van endogene signaalmoleculen die dienen als kritische modulatoren van neuronale communicatie-, zenuw- en neuro-endocriene systeemfuncties. Ze werken als neuromodulatoren, hormonen of co-transmitters en beïnvloeden een breed scala aan fysiologische processen, waaronder pijnmodulatie, stressrespons, circadiane regulatie en eetlustbeheersing. In tegenstelling tot klassieke neurotransmitters, die worden gesynthetiseerd als kleine moleculen, worden neuropeptiden gecodeerd in grote voorlopereiwitten die worden gesynthetiseerd door translatie van mRNA. Voorlopereiwitten, of prohormonen, ondergaan vervolgens een proteolytische verwerking om de actieve peptiden vrij te maken, die worden verpakt in blaasjes met dichte kern (DCV's). Bij stimulatie komen neuropeptiden vrij om modulerende, doorgaans langzamere en langdurigere effecten uit te oefenen door interacties met G-eiwitgekoppelde receptoren. Hun belang voor het behoud van de functie van het centrale en perifere zenuwstelsel heeft ze tot een gebied van intens biologisch en klinisch belang gemaakt 1,2,3,4,5.

Ondanks hun relevantie blijven neuropeptiden analytisch uitdagend om te karakteriseren. Hun zeer heterogene structuren - variërend van korte tot uitgebreide sequenties, vaak met diverse posttranslationele modificaties (PTM's) zoals amidatie, acetylering, fosforylering, aminozuurisomerisatie of truncatie - leiden tot variabiliteit in ionisatie- en fragmentatiegedrag in massaspectrometrie (MS)1,6,7,8 . Bovendien zijn ze meestal aanwezig in lage concentraties ten opzichte van biologische matrixcomponenten, worden ze gemakkelijk afgebroken en zijn ze op een ruimtelijk beperkte manier gelokaliseerd in het complexe weefsel van het zenuwstelsel. Deze kenmerken bemoeilijken zowel identificatie als kwantificering, vooral bij het gebruik van traditionele proteomics-benaderingen die gebaseerd zijn op voorspelbare enzymatische vertering en uniforme peptide-eigenschappen ^9,10,11.

Hier presenteren we een uitgebreide strategie voor de identificatie en kwantificering van endogene peptiden in de hersenen van Rattus norvegicus, met een specifieke nadruk op neuropeptiden. De workflow hier begint met geoptimaliseerde hersenbemonsteringsprocedures, gevolgd door uitgebreide vloeistofchromatografie (LC) scheidingen, en eindigt met MS-analyse met hoge resolutie met behulp van parallelle accumulatie-seriële fragmentatie (PASEF) op een ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie (TIMS) platform 12,13,14,15,16. Door ionenmobiliteit gasfasefractionering (IM-GPF) op te nemen voorafgaand aan de selectie van de precursor, maakt de data-dependent acquisition-PASEF (DDA-PASEF)-benadering een verbeterde scheiding van precursoren en de verbeterde detectie van neuropeptiden met een lage abundantie mogelijk, waarvan er vele anders zouden worden gemist in eendimensionale DDA-workflows¹⁷.

Hoewel DDA de meest gebruikte strategie blijft bij de identificatie van peptiden vanwege de hoogwaardige MS/MS-spectra, wordt het inherent beperkt door de afhankelijkheid van de selectie van voorloperionen op basis van intensiteit, wat vooroordelen heeft tegen soorten met een lage abundantie 18,19,20. Bovendien leidt de semi-stochastische bemonstering tot ontbrekende waarden in replicaten, wat reproduceerbare kwantificering belemmert. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een robuuste spectrale bibliotheek opgebouwd met behulp van onze DDA-PASEF-gegevens, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor data-onafhankelijke acquisitie (DIA)-analyse. In tegenstelling tot DDA bemonstert DIA alle voorloperionen binnen gedefinieerde m/z-vensters, wat zorgt voor een consistente bemonstering van zowel overvloedige als zeldzame peptiden, en in combinatie met de spectrale bibliotheek en gerichte analyse in Skyline, zorgt voor gevoelige en reproduceerbare kwantificering op MS2-niveau 21,22,23,24.

Deze integratieve benadering - die de extractie van hersenpeptiden, chromatografische scheiding, door ionenmobiliteit verbeterde MS-acquisitie en hybride DDA/DIA-gebaseerde kwantificering omvat - is ontwikkeld met de complexiteit van neuropeptiden in gedachten. Het maximaliseert de peptidedekking terwijl het gegevensverlies wordt geminimaliseerd, waardoor de belangrijkste beperkingen van een eenvoudigere DDA-gestuurde peptidomics worden aangepakt. Als zodanig presenteren we een flexibel en krachtig platform voor het verkennen van het neuropeptidelandschap in de hersenen van zoogdieren, dat gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala aan experimentele vragen en weefselmonsters.

Protocol

Alle dierproeven in dit onderzoek werden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol voor diergebruik dat is goedgekeurd door het Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) met strikte naleving van zowel nationale als ARRIVE-normen voor de ethische behandeling en verzorging van dieren.

1. Dissectie van dieren en hersenisolatie

1. Voer perfusie met koude zoutoplossing uit, onmiddellijk gevolgd door weefselinvriezen om de integriteit van neuropeptiden te behouden, degradatieartefacten te minimaliseren en de gegevenskwaliteit te verbeteren voor stroomafwaartse peptidomische analyse.
2. Euthanaseer de rat met behulp van de CO₂ -methode volgens de richtlijnen voor dierenverzorging van de instelling. Bevestig de dood door afwezigheid van hartslag en gebrek aan reflexen.
3. Plaats de rat in rugligging; Maak een incisie om de borstholte bloot te leggen.
4. Maak een kleine incisie in de linker hartkamer.
5. Maak een kleine incisie in het rechter atrium om de uitstroom van bloed en perfusieoplossing mogelijk te maken.
6. Steek een op maat gesneden plastic pipetpunt bevestigd aan een spuit van 60 ml gevuld met 50 ml ijskoude fysiologische oplossing (bijv. 0,9% zoutoplossing of mGBSS) in de linker hartkamer.
7. Doordrenk het dierlijk lichaam met de oplossing. Onthoofd de rat met een scherpe schaar of een guillotine.
8. Verwijder de huid en schedel die de hersenen bedekken met rongeurs of een fijne schaar.
9. Til de hersenen voorzichtig uit de schedelholte en snijd indien nodig de hersenzenuwen door.
10. Bevries de hersenen onmiddellijk op droogijs of vries in isopentaan gekoeld op droogijs.
11. Breng over naar gelabelde cryovials of folie en bewaar vervolgens bij -80 °C.

2. Peptide-extractie uit hersenweefsel van ratten

1. Weeg voor hele hersenmonsters elk bevroren weefsel snel met behulp van een analytische balans. Homogeniseer het weefsel met behulp van een LC-MS-oplossing die 10% ijsazijn en 1% water in methanol bevat, met een oplosmiddel-tot-weefselverhouding van 10:1 (v/w).
2. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 20 minuten op ijs.
3. Centrifugeer de monsters gedurende 20 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C. Verzamel het bovenstaande voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
4. Resuspendeer de pellet in water van LC-MS-kwaliteit, met een oplosmiddel-tot-weefselverhouding van 10:1 (v/w), en herhaal de incubatie op ijs gedurende 20 minuten.
5. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden (16.000 × g, 20 min, 4 °C) en verzamel het tweede supernatant.
6. Combineer beide supernatanten en breng 1/10 van het totale volume over naar een nieuwe buis voor downstream verwerking. Droog dit aliquot met behulp van een vacuümconcentrator tot het volledig droog is. Bewaar het resterende extract bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

3. Vastefase-extractie (SPE) met behulp van C18-spinkolommen

OPMERKING: Alle oplosmiddelen moeten LC-MS-kwaliteit zijn. Tenzij anders vermeld, worden centrifugatiestappen uitgevoerd bij 1.500 × g bij kamertemperatuur met behulp van een tafelcentrifuge.

1. Bereiding van reagens
   1. Bereid activeringsoplossing (A): 50% acetonitril/50% 0,1% mierenzuur in water.
   2. Bereid het evenwicht voor en was de oplossing (B): 0,1% mierenzuur in water.
   3. Bereid elutieoplossing (C): 50% acetonitril/50% 0,1% mierenzuur in water.
2. Voorbereiding van het monster
   1. Reconstitueer het gedroogde peptide-extract in 200 μl oplossing (B).
   2. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 16.000 × g bij 4 °C.
   3. Verzamel zorgvuldig het bovenstaande voor SPE.
3. Kolomconditionering en evenwicht
   1. Voeg 150 μl oplossing (A) toe aan de C18-spinkolom.
   2. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 1.500 × g.
   3. Herhaal stap 3.3.1 en 3.3.2 twee keer om een volledige activering te garanderen.
   4. Voeg 150 μl oplossing (B) toe.
   5. Centrifugeer gedurende 1 min.
   6. Herhaal stap 3.3.4 en 3.3.5 twee keer.
4. Monsters laden en wassen
   1. Laad 200 μl van de bereide monsteroplossing op de kolom.
   2. Centrifugeer gedurende 1 min.
   3. Laad de doorstroom drie keer terug op de kolom om het behoud van peptiden te maximaliseren.
   4. Voeg 150 μl oplossing (B) toe.
   5. Centrifugeer gedurende 1 min.
   6. Herhaal stap 3.4.4 en 3.4.5 drie keer om niet-vastgehouden verontreinigingen te verwijderen.
5. Peptide elutie
   1. Voeg 150 μL elutieoplossing (C) toe aan de kolom.
   2. Centrifugeer gedurende 1 min.
   3. Herhaal de elutiestappen 3.5.1-3.5.2 nog een keer.
   4. Combineer beide eluaten en bewaar op ijs of ga verder met drogen onder vacuüm.

4. LC-MS/MS-analyse

1. Bereid oplossing (A): 0,1% mierenzuur in water, oplossing; (B): 0,1% mierenzuur in acetonitril, oplossing; (C): 25 fmol/μL retentietijd standaard (iRT) 0,1% mierenzuur in water.
2. Resuspendeer de monsters in 20 μL oplossing (C) voorafgaand aan LC-MS injectie.
   OPMERKING: Twee biologische monsters werden geanalyseerd en elk werd vijf keer geïnjecteerd voor zowel DDA- als DIA-runs, wat resulteerde in vijf technische replicaten per methode per monster.
3. Voer de peptidescheiding uit met behulp van een high-performance vloeistofchromatografiesysteem (HPLC), waarbij mobiele fase A bestaat uit oplossing (A) en mobiele fase B bestaande uit oplossing (B).
4. Laad 1 μl monsters op een vijfentwintig C18 analytische kolom (150 μm × 250 mm, 1,9 μm deeltjes, 120 Å poriegrootte) en houd deze gedurende de hele run op 40 °C.
5. Voer de LC-scheiding uit met een debiet van 600 nL/min met behulp van het volgende gradiëntprofiel: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; Gevolgd door een hoge biologische wassing en herbalancering.
   OPMERKING: De LC was direct gekoppeld aan een timsTOF MS via een ionenbron.
6. Gebruik voor DDA-analyse de standaardtoepassingsmethode DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime op timsTOF MS.
   1. Kortom, gebruik de massaspectrometer in de PASEF-modus met dynamische uitsluiting ingeschakeld. Stel elke cyclus in op 10 PASEF MS/MS-scans gedurende een inschakelduur van 1,1 s.
   2. Stel het massabereik in op m/z 100-1700 en het ionenmobiliteitsbereik van 0.60 tot 1.60 V·s/^cm2, met een aanlooptijd van 100.0 ms. Verhoog de botsingsenergie van 20,0 naar 59,0 eV als functie van de ionenmobiliteit.
7. Fractionering van de gasfase van ionenmobiliteit (IM-GPF)
   1. Segmenteer het ionenmobiliteitsbereik van 0,6-1,6 V's/cm² in drie overlappende vensters: 0,6-1,0, 0,9-1,3 en 1,2-1,6 V's/cm².
   2. Wijzig hiervoor de begin- en eindwaarden van de mobiliteit in de TIMS-instelling door op timsControl of de timsControl-editor te tikken in de bijbehorende vensterwaarden.
   3. Verkrijg gegevens voor elk venster. Gebruik voor alle acquisitievensters voor ionenmobiliteit een constante accumulatie- en aanlooptijd van 100 ms.
   4. Verkrijg gegevens in DDA-PASEF-modus met behulp van dezelfde parameters als beschreven in stap 4.6.
8. Gebruik voor DIA-analyse een isolatievensterbreedte van 25 m/z over het massabereik van 400-1200 m/z. Gebruik dezelfde experimentele instellingen voor ionenmobiliteit (IMEX) die worden gebruikt in de DDA-methode.
   1. Extra DIA-instellingen zijn onder meer één MS1-helling gevolgd door 16 MS/MS-hellingen per cyclus, wat een totale cyclustijd van 1,8 s oplevert.
   2. Gebruik de standaard proteomics DIA-PASEF-methode als sjabloon voor de ontwikkeling van de DIA-methode. Nadat u de DIA-methode hebt gemaakt, laadt u deze in het tabblad Methode van Hystar. Er is geen activering van de DIA-modus vereist.
      OPMERKING: De DIA-methode wordt automatisch geregistreerd zodra deze met succes is geladen.

5. Gegevensverwerking

OPMERKING: Na gegevensverzameling moet peptide-identificatie worden uitgevoerd met behulp van bio-informaticatools zoals PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant of vergelijkbare platforms. In dit onderzoek is gebruik gemaakt van Peaks Online, dat in staat is om te werken met ruwe data in .d-formaat.

1. Database zoeken
   1. Gebruik een geschikte referentiedatabase voor het zoeken naar peptiden, zoals een samengestelde database met signaleringspeptiden bij ratten, een proteoom van een rat of het menselijke proteoom, of een samengestelde database met signaalpeptiden op basis van de monsterbron.
      OPMERKING: Deze databases kunnen worden verkregen uit betrouwbare bronnen zoals NCBI of UniProt (https://www.uniprot.org/). Merk op dat alleen eiwitten of peptiden in de database worden geïdentificeerd. Rattensignaalgegevens werden samengesteld door het proteoom van de rat te filteren op de annotatie "Signaalpeptide" in UniProt. In de Uniprot-termen betekent filteren op "signaalpeptide" het beperken van het proteoom tot eiwitten die betrokken zijn bij secretie, membraanlokalisatie of compartimenteel transport. Deze aangepaste database bevat 5630 eiwitten. Het beperken van de omvang van de eiwitdatabase van 50.000 naar 5.000 biedt verschillende voordelen. Ten eerste vergroot het het identificatievertrouwen door de kans op willekeurige peptide-spectrumovereenkomsten te verkleinen, waardoor de nauwkeurigheid van peptidetoewijzingen wordt vergroot. Ten tweede verbetert een kleinere database de rekenefficiëntie, waardoor snellere verwerkingstijden en minder vraag naar rekenkracht mogelijk zijn. Ten derde kan een beknoptere database leiden tot een betere controle van de false discovery rate (FDR), wat resulteert in betrouwbaardere en statistisch robuustere eiwitidentificaties. De database moet echter relatief groot zijn om kunstmatige inflatie van betrouwbaarheidsscores en onnauwkeurige FDR-schattingen te voorkomen.
   2. Configureer de databasezoekfunctie in de GUI van het programma met de volgende aanbevolen parameters: Tolerantie van de voorlopermassafout: 10-25 ppm; tolerantie voor fragmentmassafouten: 0,01-0,05 Da; enzymspecificiteit: geen (niet-specifieke spijsvertering); Peptide Lengtebereik: 4-45 aminozuren.
   3. Definieer de set PTM's die in de zoekopdracht moeten worden opgenomen.
   4. Na het voltooien van het zoeken in de database, exporteert u de pepxml- en mzXML-bestanden (of MGF) die overeenkomen met elk ionenmobiliteitsvenster, inclusief het standaard volledige mobiliteitsbereik (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. De bouw van de horizonbibliotheek
   1. Open Skyline en maak een nieuw document, zorg ervoor dat de Proteomics-interface is geselecteerd en gebruik de standaardinstellingen , tenzij anders aangegeven.
   2. Navigeer naar Bestand > importeren > Peptide zoeken.
   3. Selecteer in de wizard Peptide zoeken de optie Bouwen en voeg de relevante pepxml-bestanden toe (zorg ervoor dat de bijbehorende mzXML- of MGF-bestanden zich in dezelfde map bevinden).
   4. Stel iRT-standaardpeptiden in op Automatisch, kies DIA als werkstroom en klik vervolgens op Volgende.
   5. Kies na de opbouw van de bibliotheek ongeveer 10-15 peptiden als iRT-standaarden voor uitlijning tussen replicaten. Als u wordt gevraagd om iRT opnieuw te kalibreren, klikt u op OK om verder te gaan.
   6. Klik op de pagina Chromatogrammen extraheren op Bladeren om alle DIA-RAW-bestanden te selecteren en te importeren en klik vervolgens op Doorgaan.
   7. Stel in het venster Overgangsinstellingen het bereik van de voorloperladingen in op 1-5, het bereik van de productkosten op 1-3, de ionentypen op ,p,y,b en definieer de productionenselectie van ion 2 tot het laatste ion. Andere aanbevolen instellingen: ionenovereenkomsttolerantie: 0,05 Da, Pieken om uit te kiezen: 5.
   8. Stel in het venster Peptide-instellingen wijzigingen in die overeenkomen met de zoekinstelling Peaks die wordt beschreven in 4.1.3.
   9. Voer op de pagina Isolatieschema een naam in voor de isolatie en het schema en selecteer Vooraf opgegeven isolatievensters. Klik op importeren en laad een van de DIA-bestanden om de configuratie van het isolatievenster van het experiment automatisch te importeren.
   10. Stel de instellingen voor volledige scanacquisitie in met de volgende parameters. Acquisitie methode: DIA; Product massa-analysator: Centroided; Isolatieschema: Gebruik het hierboven gedefinieerde schema; Massa nauwkeurigheid: 10-20 ppm; Mobiliteit oplossend vermogen: 30-50; Schakel Alleen scans gebruiken binnen 5 minuten na voorspelde RT in; U kunt desgewenst MS1-filtering wijzigen als het importeren van MS1-chromatogrammen nodig is. Selecteer een geschikte massa-analysator en resolutie voor een optimale MS1-chromatogramextractie.
   11. Importeer FASTA en genereer lokvogels. Set Lokvogel generatiemethode: Shuffle Sequence.
   12. Selecteer enzym: de spijsvertering is niet specifiek in de endogene peptideanalyse. Bewerk het enzym door toevoegen te selecteren in het vervolgkeuzemenu voor enzymen. Stel de naam van het enzym in, Type op beide, splits c-terminal op KR en splits de N-terminal op KR, sta semi-splitsing toe en klik op OK. Stel gemiste decollages in op 3.
   13. Importeer het doel-FASTA-bestand en klik vervolgens op Voltooien. Bevestig de pagina Bijbehorende eiwitten als daarom wordt gevraagd.
   14. Zorg ervoor dat de spectrale bibliotheek met succes is gemaakt en dat DIA-gegevens zijn geïmporteerd. Inspecteer handmatig de lijst met geïdentificeerde peptiden en ga verder met stroomafwaartse kwantitatieve en kwalitatieve analyse.
3. Kwalitatieve en kwantitatieve metingen
   LET OP: De kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden gedaan in Skyline. Ga voor meer informatie over de analyse van DIA-gegevens in Skyline naar https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Als DDA-gegevens zijn geladen, selecteert u Instellingen > Overgangsinstelling in het menu, kiest u DDA in Acquisitiemethode; kies in Instellingen > Peptide-instelling MS 1-niveau voor kwantificering.
   2. Als DIA-gegevens zijn geladen, kiest u in Instellingen > Overgangsinstelling de optie DIA in Acquisitiemethode; kies in Instellingen > Peptide-instelling de optie MS 2-niveau voor kwantificering.
   3. Selecteer in > documentraster de optie Peptidekwantificering en vervolgens Exporteer het werkblad. Combineer de spreadsheets van DDA-resultaten en DIA-resultaten.
      OPMERKING: De spreadsheet geeft een overzicht van de piekgebieden voor alle peptiden in de bibliotheek voor alle monsters. In dit experiment werden peptidepiekgebieden genormaliseerd naar de retentietijd standaard peptide GISNEGQNASIK, die deel uitmaakt van het Pierce-retentietijdmengsel. Normalisatie werd uitgevoerd door de verhouding van het piekgebied van elk peptide tot dat van de standaard te berekenen.

Results

Een representatief experimenteel schema wordt weergegeven in figuur 1. Analyse van de DDA-PASEF-gegevens (Figuur 2) verkregen met behulp van zowel het standaard ionenmobiliteitsbereik als IM-GPF onthulde een aanzienlijk hogere peptidedekking voor de IM-GPF-benadering (Figuur 2B). Met name de meeste peptiden die met behulp van de standaard DDA-PASEF-methode werden geïdentificeerd, overlapten met de peptiden die in de IM-GPF-dataset werden gevonden. Om de dekking van peptide-identificatie te maximaliseren, werd een uitgebreide spectrale bibliotheek gegenereerd door identificaties van beide benaderingen te integreren.

Verdere database-analyse van gerepliceerde datasets verkregen via DDA- en DIA-PASEF (Figuur 3), met behulp van een samengestelde database met signaleringspeptiden bij ratten, onthulde 217 eiwitten die beide methoden gemeen hebben. Bovendien werden 115 eiwitten uniek geïdentificeerd door DIA-PASEF, terwijl 69 exclusief waren voor DDA-PASEF. Verkennende analyses met behulp van spectrale bibliotheken afgeleid van DDA- en IM-GPF-gegevens toonden aan dat DIA-PASEF de zelfverzekerde detectie van neuropeptiden zoals NPAFLFQPQRF (neuropeptide SF) en YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (afgeleid van proenkefaline) mogelijk maakte. Deze neuropeptiden werden niet betrouwbaar gedetecteerd in de overeenkomstige DDA-PASEF-datasets vanwege een slechte piektoewijzing (Figuur 3B,C).

Vanuit een kwantitatief perspectief onthult het spreidingsdiagram in figuur 4A een matige positieve correlatie tussen de intensiteit van de DDA-precursor en de ionenintensiteit van het DIA-fragment, zoals verwacht gezien het feit dat beide benaderingen dezelfde peptiden kwantificeren, maar verschillende ionentypen vangen. De boxplots voor geselecteerde peptiden in Figuur 4B illustreren verder de reproduceerbaarheid van de kwantitatieve metingen die door beide benaderingen worden verkregen. De boxplots tonen de relatieve piekgebieden voor elk peptide gemeten door DIA en DDA, met foutbalken die de meetvariabiliteit tussen technische replicaten weergeven. De geselecteerde peptiden zijn afgeleid van opioïde prohormonen, waaronder proenkefaline (PENK) en prodynorfine (PDYN), die beide een centrale rol spelen bij het moduleren van pijn en analgesie.

Figuur 1: Overzicht van de peptidomics workflow voor de identificatie en kwantificering van endogene peptiden uit hersenweefsel van ratten. De workflow omvat weefseldissectie, peptide-extractie en -zuivering, LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) data-acquisitie met behulp van gasfasefractionering (IM-GPF) en gegevensverwerking om spectrale bibliotheken te genereren en kwantitatieve analyses uit te voeren. Delen van de figuur zijn gemaakt in BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Database peptide- en eiwitidentificatie. (A) Staafdiagram waarin het totale aantal precursoren, peptide-spectrum matches (PSM's) en unieke peptiden wordt vergeleken die zijn geïdentificeerd in verschillende ionenmobiliteitsvensters. (B) Cirkeldiagram dat het aandeel peptiden illustreert dat gewoonlijk wordt geïdentificeerd in alle mobiliteitsvensters en die uniek worden gedetecteerd in individuele vensters. (C,D) Heatmaps die de verdeling van ionensignalen over de m/z- en ionenmobiliteitsdimensies weergeven voor het volledige mobiliteitsbereik (0,6-1,6 V·s/cm^/cm2) (C) en het beperkte mobiliteitsvenster (0,6-1,0 V·s/^cm2) (D). (E) Verstoorde plot met het aantal eiwitten dat is geïdentificeerd in datasets die zijn verkregen met behulp van DDA- en DIA-methoden, met de nadruk op gedeelde en unieke eiwitidentificaties. (F) Heatmap die peptiden weergeeft die zijn afgeleid van de proenkefaline-precursor die is geïdentificeerd in DIA-verworven replicaten (bovenste paneel) en DDA-verworven replicaten (onderste paneel). Leu-enkefaline werd niet gedetecteerd in twee van de vier DDA-replicaten, wat wijst op mogelijke ontbrekende waarden bij acquisitie op basis van DDA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Vergelijkende en verkennende analyse van DDA-PASEF- en DIA-PASEF-gegevens met behulp van spectrale bibliotheken. (A) Uitlijning van de retentietijd van neuropeptide SF over DIA- en DDA-PASEF-replicaten. (B) EIC van PENK (212-229) fragmenteert ionen uit DIA (boven) en DDA (onder) datasets. (C) Fragmentionchromatogrammen van neuropeptide SF van DIA-replicaten die een hoge co-elutie en spectrale kwaliteit vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van kwantitatieve metingen tussen DIA-PASEF (MS2-niveau) en DDA-PASEF (MS1-niveau). (A) Dit spreidingsdiagram vergelijkt de peptidesignaalintensiteiten verkregen met behulp van DIA- en DDA-modi. Concreet vertegenwoordigt de x-as het log_{10-getransformeerde} voorloperpiekgebied van DDA, terwijl de y-as het log_{10-getransformeerde} fragmentpiekgebied van DIA voor elk peptide weergeeft. (B) Boxplots vertegenwoordigen de relatieve piekgebieden van vier representatieve peptiden, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 en PDYN 235-248. Foutbalken geven de variabiliteit tussen technische replica's weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In peptidomics, met name bij het analyseren van endogene peptiden, is het behoud van het natieve peptideprofiel essentieel voor de integriteit van gegevens en biologische interpretatie. Perfusie met koude zoutoplossing verwijdert niet alleen bloed, maar koelt ook de hersenen, wat de postmortale proteolytische afbraak die snel optreedt als gevolg van de activiteit van endogene proteasen aanzienlijk vermindert. Door de hersentemperatuur te verlagen, wordt de enzymatische activiteit vertraagd en worden circulerende proteasen uit het vaatstelsel gespoeld, terwijl ook postmortale metabole veranderingen worden verminderd^25,26. Perfusie met ijskoude zoutoplossing spoelt ook het bloed uit het vaatstelsel van de hersenen. Deze stap is vooral belangrijk, omdat bloed eiwitten met een hoge overvloed (zoals albumine en globulinen) en circulerende proteasen bevat die de detectie van neuropeptiden kunnen verstoren. Postmortale afbraak van overvloedige bloedeiwitten kan de complexiteit van neuropeptide-extracten vergroten en signalen met een lage abundantie maskeren, waardoor uiteindelijk zowel de identificatie als de kwantificering in gevaar komen 25,26,27. Onmiddellijke bevriezing van het hersenweefsel, hetzij op droogijs of via snap-bevriezing in gekoeld isopentaan, stopt enzymatische processen vrijwel onmiddellijk. Deze conservering is vooral belangrijk voor het detecteren van rijpe neuropeptiden met een lage abundantie en volledige lengte en voor het garanderen van een betrouwbare kwantificering. Zonder deze stappen kan afbraak van peptiden leiden tot verhoogde variabiliteit en artefacten die zowel identificatie als kwantificering in gevaar brengen. Bloedverwijdering, koude perfusie en snelle koeling van de hersenen zijn dus fundamentele technieken die een directe invloed hebben op de kwaliteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van peptidomics-gegevens voorafgaand aan metingen.

Analyse van peptiden geëxtraheerd uit de hersenen van ratten onthulde de aanwezigheid van twee verschillende ionenmobiliteitspluimen (Figuur 2C,D). Dit fenomeen kan worden toegeschreven aan verschillende moleculaire klassen of aan variërende ladingstoestanden van de peptiden. Als de pluimen overeenkomen met verschillende moleculaire klassen, kunnen co-eluterende niet-peptidesoorten concurreren met peptiden voor selectie en fragmentatie. Als de scheiding het gevolg is van verschillen in ladingstoestanden, wordt verwacht dat de pluim met sterk geladen peptiden MS/MS-spectra van hogere kwaliteit oplevert, waardoor een meer betrouwbare peptide-identificatie mogelijk wordt.

Om dit te onderzoeken, hebben we een ionenmobiliteitsfractioneringsstrategie geïmplementeerd, waarbij we gegevens hebben verzameld over drie discrete mobiliteitsvensters: 0,6-1,0, 0,9-1,3 en 1,2-1,6 V·s/cm². Deze vensters bestrijken samen het volledige ionenmobiliteitsbereik dat doorgaans wordt geanalyseerd in standaard DDA-PASEF-experimenten voor peptiden. Zoals geïllustreerd in figuur 2, werd een significant groter aantal peptidespectrumovereenkomsten (PSM's) waargenomen binnen het venster van 0,6-1,0 V/s/cm 2, hoewel het totale aantal gedetecteerde precursoren het hoogst was in het volledige scanbereik (0,6-1,6 V/cm/cm²). Deze bevinding suggereert dat de aanwezigheid van twee pluimen inderdaad te wijten kan zijn aan interferentie van andere moleculen.

Op ionenmobiliteit gebaseerde precursorfractionering resulteerde in een toename van 30% in peptidedekking in vergelijking met de conventionele full-scan-methode. Ongeveer 82% van de peptiden die in de dataset met volledige scan werden geïdentificeerd, overlapten met peptiden die werden geïdentificeerd met behulp van fractionering (Figuur 2B), wat de consistentie en robuustheid van de fractioneringsstrategie benadrukt. Op basis van deze waarnemingen hebben we de ionenmobiliteitsfractionering en de full-scangegevens gebruikt om spectrale bibliotheken te construeren voor de kwantitatieve analyse van neuro-endocriene peptiden met behulp van DIA-PASEF.

Database-analyse van replicate datasets verkregen via DDA en DIA onthulde een hoger aantal peptide- en eiwitidentificaties in de DIA-gegevens, waaronder 115 eiwitten die uniek zijn geïdentificeerd door DIA (Figuur 2E). Deze omvatten neuropeptiden zoals Pro-FMRFamide-gerelateerde peptiden FF en VF. Daarentegen werden 69 eiwitten exclusief geïdentificeerd door DDA, waarvan er vele geassocieerd zijn met celadhesie en neuronale ontwikkeling. Deze bevindingen suggereren dat DDA- en DIA-methodologieën op een complementaire manier kunnen worden toegepast om een bredere peptidedekking te bereiken.

Verdere analyse toonde aan dat DIA-acquisitie een deel van het probleem van ontbrekende waarde effectief aanpakt dat vaak voorkomt bij endogene peptideanalyse met behulp van DDA. Leu-enkefaline werd bijvoorbeeld gedetecteerd in slechts twee van de vier DDA-replicaten (Figuur 2F, onderste paneel), terwijl het consequent werd geïdentificeerd in alle vier de DIA-replicaten (Figuur 3F, bovenste paneel).

Skyline, een platform dat veel wordt gebruikt voor kwantitatieve proteomics, werd gebruikt om zowel DDA- als DIA-PASEF-datasets te analyseren²⁸. De software vergemakkelijkt de identificatie van peptiden door middel van spectrale bibliotheekmatching, co-eliatie van fragmentionen en uitlijning van de retentietijd. Om het vermogen van DIA-PASEF om ontbrekende identificatie te verminderen te evalueren, hebben we een kwalitatieve beoordeling uitgevoerd van peptiden die uitsluitend in de DIA-dataset zijn gedetecteerd.

Zoals te zien is in figuur 3D, werd neuropeptide SF consequent gedetecteerd in alle DIA-replicaten binnen hetzelfde retentietijdvenster. De detectie in de DDA-replicaten vertoonde een aanzienlijke variabiliteit, met retentietijden variërend van 25 minuten tot 45 minuten (Figuur 3A). De waargenomen inconsistenties, waaronder piekmisindelingen met lage betrouwbaarheidsscores, waren waarschijnlijk te wijten aan beperkte of lage kwaliteit fragmentionendekking, zoals weergegeven in figuur 3B. Figuur 3C laat daarentegen zien dat fragmentionen die overeenkomen met neuropeptide SF goed uitgelijnd waren in alle DIA-replicaten, wat een betrouwbare geautomatiseerde identificatie ondersteunt.

Een vergelijking van de spectrale kwaliteit van MS/MS voor het peptide PENK (212-229), afgeleid van proenkefaline, toonde de voordelen van DIA-PASEF verder aan. Spectra verkregen uit DIA vertoonden een hogere intensiteit en verbeterde fragmentionenkwaliteit ten opzichte van DDA (Figuur 3), wat vooral gunstig is voor het detecteren van endogene peptiden met een lage abundantie.

Kwantitatieve analyse bevestigde dat DIA-PASEF consistente en reproduceerbare metingen opleverde over biologische replicaten, met prestaties die vergelijkbaar waren met DDA (Figuur 4). Bovendien maakte DIA kwantificering op MS2-niveau mogelijk, wat specificiteit op fragmentionenniveau bood en een groter vertrouwen in peptide-identificatie in vergelijking met op MS1 gebaseerde DDA. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van DIA-PASEF als een betrouwbare en efficiënte benadering voor gerichte kwantificering van neuropeptiden in complexe biologische matrices, vooral wanneer de volledigheid en reproduceerbaarheid van de gegevens van cruciaal belang zijn.

Dit protocol schetst een uitgebreide strategie voor de analyse en kwantificering van neuropeptiden. De IM-GPF-aanpak vergemakkelijkt de constructie van hoogwaardige spectrale bibliotheken. Hoewel DIA-PASEF een verbeterde reproduceerbaarheid en een grotere peptidedekking biedt in vergelijking met DDA-PASEF, verbetert het ook de kwantificering op basis van MS2. De combinatie van beide acquisitiestrategieën verhoogt de totale peptidedekking, aangezien elke methode op unieke wijze bijdraagt aan de identificatie van verschillende peptiden (Figuur 2E). De beperking van dit protocol is de vereiste van voldoende monstermateriaal om zowel het genereren van spectrale bibliotheken als gegevensverzameling via DDA- en DIA-PASEF-methoden te ondersteunen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Formic Acid Water	Fisher Scientific	LS118-500	LC/MS grade
Azijnzuur	Fisher Scientific	A11350	LC/MS grade
Acetonitrile	Fisher Scientific	AA47138K7	LC/MS grade
Formic Acid	Fisher Scientific	PI28905	LC/MS grade
Methanol	Fisher Scientific	AA47192K7	LC/MS grade
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18 spin columns	Fisher Scientific	AA47192K8
Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture	Thermo Fisher	A11351	LC/MS grade
SpeedVac vacuum concentrator	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Het specifieke model dat in dit onderzoek is gebruikt, is niet langer verkrijgbaar bij de fabrikant. Een link naar het huidige equivalent model wordt ter referentie verstrekt
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	LC/MS grade