Methodenartikel

SCAnED - een open-source huidsegmentatiemacro voor semi-geautomatiseerde detectie van cellen en kernen in epidermale en dermale huidcompartimenten

DOI:

10.3791/68746

⸱

8 augustus 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een semi-geautomatiseerd protocol voor het identificeren en kwantificeren van immuun- en niet-immuuncellen in huidsecties met behulp van SCAnED, een gratis op ImageJ gebaseerde macro voor huidsegmentatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ruimtelijke verdeling van immuun- en niet-immuuncellen in weefsels en de expressie van celspecifieke markers levert essentiële informatie op over de celfunctie in situ. De menselijke huid is een zeer complex orgaan met afgebakende compartimenten die bestaan uit verschillende cellen met verschillende fenotypes. Door gebruik te maken van multi-fluorescentie-etikettering kunnen verschillende huidcelpopulaties worden bepaald en verder worden gekarakteriseerd. Momenteel is de beschikbaarheid van niet-commerciële instrumenten voor beeldanalyse van huidmonsters die in silico-segmentatie van cellen specifiek in de epidermis of de dermis met een resolutie van één cel mogelijk maken, echter beperkt. We bieden hier een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van huidsecties, confocale microscopie en beeldanalyse met behulp van onze gratis beschikbare tool SCAnED (Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis). De SCAnED-macro maakt de nauwkeurige identificatie en classificatie van cellen en kernen in zowel de epidermale als de dermale compartimenten van de menselijke huid mogelijk. We bieden richtlijnen voor het bepalen van gemiddelde intensiteitsniveaus van maker-expressie in verschillende cellen en cellulaire compartimenten, zoals het cytoplasma en de kern, en hoe cellen die verschillende hoeveelheden van deze markers tot expressie brengen, kunnen worden gekwantificeerd met een bijbehorende Python-pijplijn die wordt geleverd als een kant-en-klaar Jupyter-notebook uitgevoerd in Google Colab. Dit protocol stelt onervaren gebruikers in staat om celspecifieke expressieprofielen in huidweefsel te bepalen en inzicht te geven in de ruimtelijke verdeling van cellen in de epidermale en dermale compartimenten, waardoor een beter begrip van de ingewikkelde weefselstructuur en celsamenstelling van de menselijke huid mogelijk wordt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van huidweefsels op cellulair niveau en het onderscheiden van celfenotypes, morfologie en hun lokalisatie binnen zowel de epidermale als de dermale compartimenten zijn cruciaal in dermatologisch onderzoek en histopathologie 1,2. De cellulaire samenstelling in de epidermis, die keratinocyten, melanocyten en Langerhans-cellen onder gezonde omstandigheden omvat, raakt sterk uit balans bij inflammatoire huidziekten en kanker. Bovendien kan het fenotype en de lokalisatie van cellen in de dermis, die zich onder de epidermis bevinden en fibroblasten en de meeste immuuncellen herbergen, aanzienlijk veranderen bij ziekte. Daarom is cel- en kernsegmentatie absoluut noodzakelijk voor het beoordelen van cellulaire kenmerken zoals celaantal, eiwitexpressie, morfologie en ruimtelijke organisatie, en kernkenmerken zoals grootte, vorm en expressie van transcriptiefactoren, waardoor wordt bijgedragen aan het begrip van huidhomeostase en ziekten 3,4,5.

Ondanks de beschikbaarheid van beeldanalyseplatforms voor algemeen gebruik, zoals QuPath6, CellProfiler7 en ilastik8, vereisen deze tools vaak uitgebreide aanpassingen en scripts om zich aan te passen aan de structurele complexiteit en heterogene celmorfologie van huidweefsel. Er zijn maar weinig tools die specifiek zijn afgestemd op geautomatiseerde segmentatie van epidermale en dermale compartimenten, en veel beschikbare oplossingen zijn commercieel en niet vrij toegankelijk. Deze beperkingen maken het een uitdaging voor niet-experts om efficiënte pijplijnen te implementeren voor huidspecifieke analyse.

Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor de analyse van cellen en kernen in huidweefsel en zijn compartimenten, dat alle vitale stappen omvat, van weefselkleuring tot beeldanalyse met behulp van onze semi-geautomatiseerde beeldanalysepijplijn. We beginnen met gedetailleerde informatie over immunofluorescentiekleuring van huidweefsel, inclusief kleuring met E-cadherine voor segmentatie van epidermis/dermis en 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) voor cel-/kerndetectie. Twee interessante markers, Vimentin (VIM) en CD90, werden opgenomen voor validatiedoeleinden. We raden aan om antilichamen in geoptimaliseerde concentraties te gebruiken (zie tabel 1) en beelden vast te leggen met behulp van confocale microscopie met consistente instellingen voor laserintensiteit, belichtingstijd en resolutie om reproduceerbaarheid te garanderen.

Verder introduceren we onze op maat ontworpen ImageJ9 macro SCAnED, wat staat voor Skin Compartment Analysis of Epidermis en Dermis, en we bieden alle noodzakelijke stappen voor in silico-segmentatie en detectie van kernen en cellen in zowel de epidermis als de dermis. Gebruikers kunnen kiezen tussen twee verschillende methoden voor het detecteren van kernen, ofwel met behulp van eenvoudige en snelle drempels of de deep learning-tool StarDist10 en ons getrainde huidmodel, voordat ze verder gaan met het SCAnED-protocol. In tegenstelling tot algemene tools is SCAnED speciaal ontwikkeld voor huidhistologie en presteert het beter door automatische compartimentering van epidermale en dermale regio's mogelijk te maken en geïntegreerde kwantificering van meerdere markers in beide regio's mogelijk te maken. Dit is vooral handig voor onderzoekers die geen expertise hebben op het gebied van programmeren of deep learning, en biedt een kant-en-klare tool die is afgestemd op de analyse van huidbeelden.

We laten verder zien hoe gemiddelde intensiteitsniveaus per cel worden geëxtraheerd uit immunofluorescentiebeelden van maximaal vijf verschillende markers van belang. Ten slotte bieden we een Python-code voor de statistische analyse van de verkregen single-cell data, geschreven en uitgevoerd in Google Colab11 en gedeeld als een Jupyter-notebook. Ons protocol en de SCAnED-macro zijn bedoeld om huidonderzoekers zonder geavanceerde immunofluorescentie- en computerexpertise een praktisch hulpmiddel te bieden om cellen en markerexpressie in de menselijke huid te labelen en semi-automatisch te kwantificeren, met de nadruk op de epidermale en dermale compartimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunofluorescentielabeling van E-cadherine, VIM en CD90 en nucleaire kleuring met DAPI in in paraffine ingebedde huidsecties

OPMERKING: Het protocol toont stappen voor in paraffine ingebedde secties. Voor verse en ingevroren weefselmonsters fixeert u de weefselsecties en gaat u verder met stap 1.3 van het protocol.

  1. Smelt paraffine met behulp van een hetelucht of oven.
  2. Rehydrateer secties door door gesorteerde alcoholen met een toenemend watergehalte te laten gaan (bijv. xyleen → 100% ethanol → 85% ethanol → 70% ethanol → water).
  3. Voer de stappen voor het ophalen van antigen uit zoals geschikt voor de antigenen.
  4. Permeabiliseer weefselcoupes met 0,3% Triton X in PBS (3 x 20 min) (zie Tabel 2).
  5. Dia's wassen met PBS (1 x 5 min).
  6. Omcirkel elk monster met een hydrofobe diamarkeerstift om morsen van vloeistof te voorkomen en het volume van reagentia te minimaliseren en laat drogen.
  7. Breng primaire antilichamen aan (buffer voor Abs: PBS + 2% BSA) (zie Tabel 1 en Tabel 2). Plaats de dia's in een bevochtigde kamerdoos (natte doos) en broed een nacht uit.
  8. Was de dia's met 0,3% Triton X in PBS (3 x 5 min).
  9. Verwijder overtollig wasmiddel door dia's te wassen met PBS (1 x 5 min).
  10. Breng secundaire antilichamen en geitenserum aan (zie tabel 1). Incubeer dia's op een donkere plaats gedurende 1 uur.
  11. Was de dia's met 0,3% Triton X in PBS (3 x 5 min).
  12. Verwijder overtollig wasmiddel door dia's te wassen met PBS (1 x 5 min).
  13. Voeg DAPI toe voor kernkleuring (zie tabel 1). Incubeer dia's op een donkere plaats gedurende 30 minuten.
  14. Was de dia's met 0,3% Triton X in PBS (3 x 5 min).
  15. Dia's wassen met PBS (1 x 5 min).
  16. Breng 1 druppel (~5-15 μL) fluorescentiemontagemedium aan op elk monster en plaats voorzichtig dekglaasjes (verwijder bubbels indien nodig). Laat de dia's in het donker drogen.
Antilichamen & kleurstofConcentratie op het werkVerdunning
anti-Vimentin antilichaam0,8 μg/ml1:50
anti-E-cadherine antilichaam1 μg/ml1:333
anti-CD90 antilichaam1:1000
AF488 anti-muis1:500
AF568 anti-konijn1:500
AF647 anti-muis1:500
DAPI1 μg/ml

Tabel 1: Antilichamen en kleurstof.

1. Buffer voor kleuring
ReagensUiteindelijke concentratieAantal
BSA2%1 gr
PBS1x50 ml
Totaaln.v.t50 ml
2. Permeabilisatie buffer
ReagensUiteindelijke concentratieAantal
Triton X0.30%300 μL
PBS1x100 ml
Totaaln.v.t100 ml

Tabel 2: Recepten voor oplossingen.

2. Confocale beeldvorming

OPMERKING: Voor dit protocol werd een confocale laserscanmicroscoop gebruikt, uitgerust met een 10x objectief (NA 0.4) en 4 laserlijnen (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

  1. Verkrijg afbeeldingen met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie voorbeeldafbeelding in afbeelding 1).
  2. Gebruik de volgende parameter voor de scangrootte om de macro te maken, het StarDist-model te trainen en idealiter voor beeldacquisitie: Afbeeldingsgrootte = 4.096 x 4.096 pixels (of 1.273 x 1.273 micron), bitdiepte = 16-bits, minimale pixelgrootte = 0,3 micron, signaal-ruisverhouding (SNR) = minimaal 3.

figure-protocol-1
Figuur 1: Immunofluorescentiekleuring van de huidsectie. DAPI: labelt kernen, CD90: fibroblastmarker, E-cadherine: gebruikt om epidermis te labelen, VIM: cellen die VIM tot expressie brengen, Samenvoegen: samenvoegen van DAPI (magenta), CD90 (blauw), E-cadherine (geel) en VIM (groen) kleuring. Schaalbalken = 100μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Beeldanalyse met behulp van de SCAnED-macro (Aanvullend bestand 1, Aanvullende video S1 en Aanvullende video S2)

  1. Start de macro (SCAnED.mp4 film).
    1. Open immunofluorescentiebeelden in Fiji/ImageJ met behulp van bio-formaten met standaardinstellingen.
      OPMERKING: Splits geen kanalen bij deze stap.
    2. Download en voer de SCAnED-macro uit door naar Plug-ins | Macro's | Voer het SCAnED-macroscript uit en selecteer het (aanvullend bestand 1).
    3. Volg de stapsgewijze instructies op het scherm in de macro.
  2. In silico segmentatie van epidermis en dermis met behulp van de SCAnED-macro.
    1. Selecteer het E-cadherine-kanaal wanneer daarom wordt gevraagd.
    2. Pas de drempel handmatig aan door naar Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde en klik op OK om het E-cadherinekanaal het epidermale gebied volledig vast te leggen.
    3. Bevestig indien nodig de stap Flood Fill om gaten in het E-cadherine-masker te dichten door het pictogram Flood Fill Tool in ImageJ te selecteren, op het bovenste deel van de epidermis te klikken en op OK te klikken (aanvullende afbeelding S1A-E en tips voor het oplossen van problemen in het discussiegedeelte).
    4. Als het masker is omgekeerd, selecteert u Ja en OK wanneer u wordt gevraagd om de selectie om te keren; selecteer anders Nee en OK (zie Aanvullende afbeelding S1F,G en tips voor het oplossen van problemen in het discussiegedeelte).
    5. Selecteer het DAPI-kanaal wanneer daarom wordt gevraagd. De kernbeelden voor en na epidermale-dermale segmentatie worden weergegeven in figuur 2.
  3. Segmentatie van kernen met behulp van de drempelfunctie
    1. Definieer automatisch intensiteitsniveaus.
  4. Segmentatie van kernen met behulp van StarDist
    1. Open StarDist in ImageJ (Figuur 3).
    2. Laad het kerndetectiemodel (aanvullend bestand 2) in de StarDist-GUI (Afbeelding 4). Het bijbehorende trainingspaar voor het maken van het StarDist-model wordt weergegeven in aanvullende afbeelding S2.
      OPMERKING: Tensor Flow versie 1.15 moet voor dit model worden gebruikt als er een StarDist-fout optreedt (zie aanvullende afbeelding S3).
    3. Klik eerst op het kernkanaal.
    4. Pas de tegelinstellingen dienovereenkomstig aan (zorg ervoor dat het aantal tegels overeenkomt met de verwachte patchgrootte (256 x 256 px) (zie afbeelding 3 en afbeelding 4).
      OPMERKING: StarDist-segmentatie kan enige tijd duren, afhankelijk van het aantal kernen.
  5. Intensiteitsmeting en kwantificering van nucleaire eiwitten
    OPMERKING: Voordat u de SCAnED uitvoert, gaat u naar Analyseren | Stel metingen in en configureer de parameters om nauwkeurige en relevante gegevensuitvoer te garanderen (Afbeelding 5).
    1. Selecteer Ja wanneer daarom wordt gevraagd om de intensiteit van de marker in kernen te meten.
    2. Kies het juiste markeringskanaal (maximaal vijf mogelijk).
    3. Sla de resultaten op als CSV-bestanden volgens de instructies van de macro.
    4. Herhaal dit voor elk kanaal.
    5. Nadat alle kanalen zijn verwerkt, slaat u de resultaten op als CSV-bestanden volgens de instructies van de macro.
      OPMERKING: Voor een betere visualisatie hebben we voor de rest van de analyse een vergrote weergave van een specifiek huidgebied opgenomen (Figuur 6).
  6. Celsegmentatie (cytoplasmatisch gebied)
    OPMERKING: De celsegmentatie is gebaseerd op het uitbreiden van de nucleaire ROI en moet daarom worden gestart na kernsegmentatie.
    1. Wanneer de drempelfunctie is gebruikt voor kernsegmentatie, past u binaire dilatatie toe.
    2. Wanneer StarDist is gebruikt voor kernsegmentatie, gebruik dan vergrotingsuitbreiding, die een langere verwerkingstijd heeft (zie aanvullende figuur S4).
  7. Intensiteitsmeting en kwantificering van cytoplasmatische eiwitten
    1. Selecteer Ja om de markerintensiteit in hele cellen te meten.
    2. Sla de CSV-bestanden van het resultaat op volgens de instructies van de macro.
    3. Herhaal dit voor elk markeringskanaal in volgorde.
    4. Houd dezelfde volgorde van kanalen aan voor zowel kern- als celmetingen om consistentie in de uitvoergegevens te behouden.
    5. Kies Verwijderen wanneer de macro daarom vraagt, om te voorkomen dat kerngegevens tussen epidermis en dermis worden gemengd. Figuur 7 illustreert alle stappen van de segmentatie op basis van drempelwaarden.

figure-protocol-2
Figuur 2: Analyse en scheiding van kanaalspecifieke kernen in epidermale en dermale kernen. Immunofluorescentiekleuring van DAPI toont de morfologie en ruimtelijke verdeling van kernen in de hele huid aan (afbeelding links). Weergave van kernkanalen van epidermale kernen gekleurd met DAPI, wat inzicht geeft in de verdeling van kernen in het epidermale compartiment (middelste afbeelding). Weergave van kernkanalen van dermale kernen gekleurd met DAPI, waardoor visualisatie van de kernverdeling in het dermale compartiment mogelijk is (afbeelding rechts). Schaalbalken = 100μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: Gebruik maken van de "StarDist" optie. Screenshot met de locatie van de optie "StarDist 2D" in het menu/Plugins/StarDist/StarDist 2D. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4: Instructies voor het gebruik van het kerndetectiemodel. Download het bestand "nuclei_detection_model.zip" en geef het bestandspad op in de sectie Bladeren . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-5
Afbeelding 5: Meetinstellingen configureren. (A) Schermafbeelding met de locatie van de optie Metingen instellen in het menu, waardoor de meetparameters kunnen worden aangepast voor latere analyse. (B) Stel het vak Metingen in dat de interface weergeeft voor het aanpassen van meetinstellingen, zodat gebruikers parameters kunnen specificeren voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 6: Vergrote weergave van een specifieke regio. (A) Samenvoeging van DAPI (magenta) en VIM (groen) kleuring. (B) Vergrote weergave van een specifiek gebied vanaf A, voor gedetailleerde visualisatie van VIM-expressie in huidweefsel. Let op de verschillende morfologie van kernen in de epidermis en dermis. Schaalbalken = 100 μm (A), 20 μm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-7
Figuur 7: SCAnED-segmentatie in epidermis en dermis voor kernen en cellen met behulp van drempelwaarde. (A) Hele afbeelding: samenvoeging van DAPI (magenta) en VIM (groen) kleuring. Bovenste deel: (B) Samenvoeging van epidermale kernen gekleurd met DAPI en VIM na scheiding. (C) Masker van epidermale kernen door gebruik te maken van drempelwaarde. (D) Segmentatie van kernen van epidermale kernen over de samensmelting van DAPI en VIM, wat helpt bij de visualisatie van de kerndistributie binnen het epidermale compartiment. (E) Celsegmentatie van epidermale kernen over de samensmelting van DAPI en VIM gelegd, wat helpt bij de visualisatie van de kerndistributie binnen het epidermale compartiment door gebruik te maken van drempel en dilatatie, omdat het aantoont dat het selectiegebied groter is dan kernen. Onderste deel: (F) Samenvoeging van huidkernen gekleurd met DAPI en VIM na scheiding. (G) Masker van huidkernen door gebruik te maken van drempelwaarde. (H) Segmentatie van kernen van dermale kernen over de samensmelting van DAPI en VIM, wat helpt bij de visualisatie van de kerndistributie binnen het dermale compartiment. (I) Celsegmentatie van dermale kernen over de samensmelting van DAPI en VIM gelegd, wat helpt bij de visualisatie van de kerndistributie in het dermale compartiment. Schaalbalken = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Classificatie en visualisatie van geëxtraheerde gegevens van één cel (aanvullende video S3)

OPMERKING: Elke immunofluorescentiemarker genereert twee CSV-bestanden: één voor het epidermale compartiment en één voor het dermale compartiment.

  1. Stel markerspecifieke intensiteitsdrempels vast met behulp van isotypecontrolemonsters.
    1. Importeer de CSV-uitvoerbestanden die door de SCAnED-macro zijn gegenereerd in Google Colab met behulp van de meegeleverde Jupyter Notebook. Download eerst het juiste Jupyter-notitieblok (bijv. Aanvullend bestand 3 of Aanvullend bestand 4), ga naar Google Colab (https://colab.research.google.com/), klik op Bestand, open het notitieblok, selecteer het bestand en voer de codecellen één voor één uit. Wanneer u wordt gevraagd om Bestanden te kiezen, klikt u op de knop en uploadt u het .csv bestand.
    2. Bereken voor elk antilichaam de gemiddelde fluorescentie-intensiteit op basis van de isotypecontroles. Om de grenswaarde voor elk antilichaam te bepalen, opent u het DotPlot-notebook (aanvullend bestand 4), uploadt u het bijbehorende isotypecontrolebestand en voert u de code uit.
    3. Kies op basis van de verdeling van de stippen in de isotypecontrole en specifieke antilichaamplots een geschikte intensiteitsdrempel om de achtergrond (isotypecontrole) te scheiden van het signaal (specifieke kleuring). Gebruik deze waarden als afkappen om afzonderlijke cellen te classificeren als positief of negatief voor markerexpressie.
  2. Vergelijk de markerintensiteiten in experimentele monsters met de berekende drempels.
    1. Classificeer cellen met intensiteit ≥ drempel als positief.
    2. Classificeer cellen met intensiteit < drempel als negatief.
    3. Classificeer subpopulaties op basis van combinaties van markerexpressie, identificeer bijvoorbeeld enkelvoudige, dubbelpositieve of drievoudige positieve celpopulaties.
  3. Visualiseer de verdeling en relaties van markeringsexpressie met behulp van twee typen grafieken:
    1. Maak histogrammen en overlappende histogrammen om de intensiteitsverdeling tussen omstandigheden (bijv. controle versus zieke huid) te vergelijken door de histogramcode uit te voeren (download het aanvullende bestand 3, ga naar Google Colab (https://colab.research.google.com/), klik op Bestand, open notebook, selecteer het bestand, voer de code uit) (Afbeelding 8).
    2. Maak puntplots om spreidingsdiagrammen in flowcytometriestijl te simuleren voor het beoordelen van co-expressiepatronen door de DotPlot-code uit te voeren (download aanvullend bestand 4, ga naar Google Colab (https://colab.research.google.com/), klik op Bestand, open notebook, selecteer het bestand, voer de code uit) (Afbeelding 9).
    3. Exporteer verwerkte gegevens voor aanvullende analyses en evaluatie van significante verschillen met behulp van statistische tests.

figure-protocol-8
Figuur 8: Overlay histogram waarin de gemiddelde intensiteit van VIM-positieve cellen wordt vergeleken. Histogramoverlay waarin de gemiddelde intensiteit van VIM-cellen in gezonde monsters (H) in blauwe en psoriasismonsters (P) in oranje in de dermis wordt vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-9
Figuur 9: Dubbele positieve signalen op een dot plot. Een demonstratie van dubbele kleuring dot plot die kan helpen bij een betere visualisatie van enkelvoudig-positieve, dubbel-positieve en dubbel-negatieve populaties. Dit voorbeeld toont de dubbele kleuring van CD90 en VIM in de dermis van (A) gezonde en (B) psoriasis huid, en in de epidermis van (C) gezonde en (D) psoriasis huidmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een eerdere studie hebben we SCAnED met succes gebruikt om cellen en expressieniveaus van lysyloxidase (LOX), een cytoplasmatisch eiwit, en de transcriptiefactor hypoxie-induceerbare factor 1 (HIF-1) in cellen in de dermis van de menselijke huid te detecteren en te kwantificeren12 , wat de toepasbaarheid van dit hulpmiddel voor huidonderzoek benadrukt.

Om de precisie van onze huidsegmentatiemacro bij het identificeren van cellen en k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het SCAnED-protocol is een semi-geautomatiseerde methode voor compartimentspecifieke analyse van zowel immuun- als niet-immuuncellen in menselijk huidweefsel. De workflow integreert een op E-cadherine gebaseerd kleuringsprotocol om epidermis- en dermissegmentatie, DAPI-gebaseerde kernen en celdetectie mogelijk te maken, gevolgd door de kwantificering van markerexpressie in kernen en cellen met behulp van onze op ImageJ gebaseerde macro. Verder begeleiden we gebruikers bij de analyse van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van deze pijplijn voor beeldanalyse werd gefinancierd door de deelstaat Niederösterreich als onderdeel van het Donau-allergieonderzoekscluster en door de Fellinger Krebsforschung.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.3% Triton X Sigma-AldrichT9284
BSA (Bovine serum albumin)Sigma Aldrich
CD90cell signalingD3V8A
DAPI Roche10236276001
Deionized water
E-cadherin Abcamab1416
Fluorescence mounting medium DakoS3023
Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488  (AF 488 anti-mouse)Thermo Fisher ScientificA-21121
Goat anti-Mouse IgG2a Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-mouse)Thermo Fisher ScientificA-21241
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 ( AF 568 anti-rabbit)Thermo Fisher ScientificA-11011
Goat serum Agilent Technologies Österreich GmbH, DakoX0907
PBS Gibco14190-094
Vimentin DakoM7020
Materialen
Chamber box (natte box)
Dekglasjes Thermo Fisher
Vloeistofdichtende glijmiddelstift voor kleuring (hydrofoob) Daido SangyoZ37782124x50mm
Oplossingen
Permeabilisatiebuffer (0,3% Triton X in PBS) Verwijs naar Tabel 2
Kleuringsbuffer (2% BSA in PBS) Verwijs naar Tabel 2
Software en datasets
Confocale laserscanningmicroscoop OlympusFV3000 gebaseerd op inverted IX83uitgerust met een 10x objectief (NA 0,4), 4 laserlijnen (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, Coherent)
Fiji (ImageJ) V1.54h
Google ColabGoogle
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Prism 10voor verdere statistische analyse
HALOIndica Labs
Python programmaPython 3.11.12
QuPathopen software ( Bankhead, P. et al, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistInstalleer TF1.15.0 CPU-versie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
  2. Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
  3. Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
  4. Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
  5. Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
  6. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  7. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
  8. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
  12. Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
  13. Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
  14. de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
  15. Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
  16. Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
  17. Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
  18. RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celdetectieepidermale compartimentdermale compartimentimmunofluorescentiekleuringconfocale microscopiemarkerintensiteitbeeldanalyseStarDist segmentatie

Gerelateerde artikelen