Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

18 juli 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

In dit artikel

Samenvatting

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Samenvatting

Drie kritische en onderling afhankelijke processen definiëren meiotische profase I: homologe chromosomen moeten aan elkaar koppelen, een eiwitachtige structuur die het synaptonemale complex wordt genoemd, vormt zich om homologen aan elkaar te binden (synapsis), en homologen ondergaan recombinatie, waarbij wederzijds genetisch materiaal wordt uitgewisseld om crossovers (CO's) te vormen. Fouten in deze processen kunnen leiden tot voortijdige ovariële insufficiëntie, aneuploïdie en uiteindelijk zwangerschapsverlies en onvruchtbaarheid. Meiotische recombinatie is bijzonder foutgevoelig in eicellen, waarbij meer dan 7% van de menselijke eicellen ten minste één chromosoompaar bevat zonder cross-over, en tussen 20%-80% van de eieren versus 2,5%-7% van het sperma aneuploïde is. Het blijft echter onduidelijk waarom chromosomale afwijkingen zulke opvallende sekseverschillen vertonen. Het huidige protocol beschrijft methoden voor de bereiding en analyse van eicelprofase I- en metafase I-chromosoomspreads van respectievelijk foetale en juveniele muizen. Om kritische chromosoomdynamiek tijdens meiotische profase I te traceren, maakt dit protocol gebruik van immunofluorescentiekleuring van gemeenschappelijke markers voor meiotische recombinatie (RAD51 voor dubbelstrengsbreuken, MSH4 voor CO-tussenproducten en MLH1/MLH3 om de meeste CO's te identificeren) en synapsis (SYCP3 voor chromosoomassen, SYCP1 voor gesynapseerde regio's en HORMAD1 voor geasynapseerde regio's). Verder maakt dit protocol gebruik van in vitro rijping van eicellen die zijn verzameld om het aantal gepaarde chromosomen (bivalente fenten) en het totale aantal cross-overs (chiasmata) in metafase I te beoordelen. Samen bieden deze technieken een uitgebreid en kwantitatief kader om mechanismen te onderzoeken die de vroege chromosoomdynamiek bij vrouwelijke meiose reguleren.

Inleiding

Meiose is een gespecialiseerde celdeling die essentieel is voor de productie van haploïde gameten. Tijdens profase I moeten homologe chromosomen (elk bestaande uit zusterchromatiden die bij elkaar worden gehouden door cohesin) drie kritieke taken uitvoeren: 1) elkaar herkennen en met elkaar koppelen, 2) aan elkaar vastritsen door het synaptonemale complex (SC) tussen hun laterale assen te vormen, en 3) DNA uitwisselen via homologe recombinatie, resulterend in crossovers (CO's) tussen niet-zusterchromatiden 1,2. De fysieke verbinding als gevolg van crossover-vorming, onderhouden door cohesin, zorgt voor een goede chromosoombioriëntatie en segregatie tijdens metafase I 3,4,5.

Meiotische profase I bestaat uit vijf fasen, elk gedefinieerd door de status van synapsis6. Bij leptonema (Grieks voor dunne draad) condenseren chromosomen terwijl het axiale element (gemarkeerd door SYCP3) zich langs chromosoomassen vormt. Tijdens zygonema (samengevoegde draden) beginnen homologen te synapsen als het transversale element van de SC (SYCP1) zich vormt tussen assen7. Bij pachynema (dikke draad) zijn chromosomen over de gehele lengte gesynapseerd. De SC valt vervolgens uiteen tijdens diplonema (twee draden), waardoor homologen alleen op crossover-plaatsen (chiasmata) verbonden blijven. Chiasmata zijn het product van homologe recombinatie, een proces dat wordt geïnitieerd met de geprogrammeerde inductie van dubbelstrengsbreuken van DNA (DSB's). Van honderden DSB's wordt slechts ~10% CO's. Bij muizen vormen de meeste (90%-95%) zich via de klasse I CO-route die wordt gefaciliteerd door MutLγ (MLH1-MLH3), terwijl de resterende CO's worden gemaakt door MUS81-EME1 via de klasse II CO-route 8,9,10,11.

Koppeling, synapsis en recombinatie zijn sterk gereguleerde en onderling afhankelijke processen. Fouten activeren meestal controlepuntmechanismen, wat leidt tot celdood. Bij vrouwen kan kiemcelverlies door vroege profase I-fouten voortijdige ovariële insufficiëntie veroorzaken 12,13, terwijl late fouten (bijv. homologen die er niet in slagen CO's te vormen, verkeerde plaatsing van CO's of voortijdig verlies van cohesine) kunnen leiden tot chromosoommissegregatie en aneuploïdie. Bij mensen zijn meiotische fouten een belangrijke oorzaak van zwangerschapsverlies en onvruchtbaarheid. Vrouwelijke meiose is bijzonder foutgevoelig. Ongeveer 20%-80% van de menselijke eieren (versus 2,5%-7% van het sperma) dragen abnormale chromosoomnummers, de meeste als gevolg van fouten in de eerste meiotische divisie 14,15,16,17. Hoewel leeftijd is geïdentificeerd als de belangrijkste oorzaak van maternale aneuploïdie, blijft de reden waarom eicellen zo vatbaar zijn voor fouten onduidelijk.

Ondanks het belang van het begrijpen van de factoren die ten grondslag liggen aan hoge foutenpercentages in eicellen, komt het grootste deel van onze kennis over de regulatie van profase I-gebeurtenissen uit studies naar mannelijke meiose. Omdat een klein fragment van volwassen testikelmateriaal voldoende materiaal biedt om alle stadia van meiotische en postmeiotische kiemcellen te beoordelen, is mannelijke meiose al lang gemakkelijker toegankelijk voor onderzoekers. Vrouwelijke meiose daarentegen vindt op een discontinue manier plaats. Bij muizen vordert profase I semi-synchroon in de foetale eierstok, beginnend ongeveer 14 dagen na coïtum (dpc; Figuur 1A), kort na geslachtsbepaling 18,19,20. Rond de tijd van de geboorte komen eicellen in dictyaatstilstand tot de eisprongmaanden (bij muizen) of decennia (bij mensen) later 21,22,23. Bijgevolg zijn specifieke profase I-stadia alleen toegankelijk tijdens beperkte ontwikkelingsvensters (Figuur 1A), waarbij post-profase I-gebeurtenissen slechts in enkele eicellen tegelijk voorkomen bij de juveniele en adulte eeuw. Hoewel technische vooruitgang de onderzoeken naar eicellen bij zoogdieren heeft verbeterd, blijven deze methoden uitdagend en tijdrovend in vergelijking met vergelijkbare technieken die in mannelijke onderzoeken worden gebruikt.

Vrouwelijke meiotische analyse wordt verder bemoeilijkt door beperking in substadiëring van pachyteen-eicellen - cruciaal voor het bestuderen van crossover-aanduiding en rijping. Mannelijke studies profiteren van een goed gekarakteriseerde dynamiek van het paren van geslachtschromosomen en de aanwezigheid van de histonvariant, H1t, die dienen als markers voor vroege, middelste en late pachynema 24,25,26. Er is echter geen betrouwbare methode geformaliseerd voor het substadiëren van pachyteen-eicellen.

De hier gepresenteerde protocollen vergemakkelijken een uitgebreide analyse van synapsis en recombinatie in eicellen van muizen van vroege profase I tot metafase I. Dit werk bouwt voort op klassieke chromosoomverspreidingstechnieken ontwikkeld door Peters et al.27 en Tarkowski28 en eerdere verfijningen van die methoden door Hunt29 en Sun en Cohen30. Dit protocol is ontwikkeld om de nadruk te leggen op: 1) Verrijking en identificatie van specifieke profase I-substadia, 2) het maximaliseren van het aantal uitgevoerde toepassingen per paar foetale eierstokken, en 3) grondige, toegankelijke metrieken voor evaluatie van synapsisdefecten en recombinatie van foci naar chiasmata.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle behandeling en procedures van dieren werden uitgevoerd na goedkeuring door het Cornell Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) onder protocol 2004-0063.

1. Bereiding van eicel profase I chromosoomverspreidingsdia

  1. Zet in de late namiddag getimede paringen op van C57BL/6J vrouwelijke muizen (2 - 6 maanden oud) met mannetjes (2 - 12 maanden oud). Controleer vanaf de volgende dag elke ochtend (vóór 9 uur) de vrouwtjes op een copulatieplug. Middag op de dag van de stekker wordt gedefinieerd als 0,5 dpc.
  2. Bereid het volgende voor voordat u drachtige muizen offert.
    1. Zet een bevochtigde kamer op met kamertemperatuur H2O.
    2. Bereid 10 ml hypotone extractiebuffer (HEB; zie tabel 1) bestaande uit 30 mM Tris-HCl, 50 mM sucrose, 17 mM natriumcitraat, 5 mM EDTA, 2,5 mM DTT en 0,5 mM PMSF in Milli-Q water. Voordat u DTT en PMSF toevoegt, stelt u de pH in op 8,2 - 8,4 met behulp van 50 mM boorzuur. Maak HEB vers en gebruik binnen 2 uur na het toevoegen van DTT.
    3. Bereid 100 mM sucrose door 342 mg sucrose toe te voegen aan 10 ml ultrazuivere H2O. Bewaren bij 4 °C wanneer niet in gebruik.
    4. Verwarm ultrazuivere H2O in een standaard magnetron gedurende 1 min voor (tot 90 - 95 °C). Voeg onder een zuurkast de verwarmde ultrazuivere H2O toe aan 0,5 g paraformaldehyde (PFA). Voeg twee druppels 1 N NaOH, vortex toe om te mengen en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Stel de pH in op 9,2 - 9,3 met 50 mM boorzuur en voeg Triton X-100 toe aan 0,15 % (v/v). Voeg ultrazuivere H2O toe aan een eindvolume van 50 ml (1% PFA-fixatieoplossing) en giet fixatief in een glazen Coplin-kleurpotje van 50 ml.
      OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van bijna-kokend water om PFA te bereiden; het verhitten van PFA in oplossing boven 65 °C kan echter degradatie en het vrijkomen van giftige dampen veroorzaken. U kunt ook ultrazuivere H2Ø in een waterbad voorverwarmen tot 60 °C.
    5. Reinig glazen microscoopglaasjes met 70% ethanol. Gebruik een hydrofobe barrière-PAP-pen om maximaal drie vierkanten te tekenen (ongeveer 20 x 20 mm; zie afbeelding 1E). Een enkel paar eierstokken levert voldoende materiaal voor zes vierkanten (of twee dia's van elk 3 vierkanten).
  3. Offer zwangere muizen 14,5 - 18,5 dpc op door CO2 -verstikking en cervicale dislocatie volgens de IACUC-richtlijnen.
    1. Tijdstippen voor verrijking van specifieke stadia van profase I in C57BL/6J-muizen worden beschreven in figuur 1A. Voor de gegeven ontwikkelingstijdstippen is het geschatte percentage eicellen in elk stadium van profase I verstrekt met behulp van gegevens van Evans et al. (1982)31. Voor zygotene eicellen, verzamel op 16,5 dpc; vroeg pachyteen op 17,5 dpc; en mid-pachyteen - diploteen bij 18,5 dpc.
  4. Gebruik een dissectieschaar om de buikholte te openen en de baarmoederhoorns te verwijderen.
  5. Ontleed de foetale muizen van de baarmoederhoorn, het deciduale weefsel en de dooierzak. Plaats foetale muizen in een petrischaaltje van 100 mm met 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS).
  6. Ontleed eierstokken van één vrouwelijke foetus tegelijk terwijl u de rest in 1x PBS onderhoudt. Offer foetale muizen door onthoofding volgens de IACUC-richtlijnen. Gebruik roestvrijstalen monsterpennen om het ventrale oppervlak van de romp vast te zetten op een siliconen pad in een dissectieschaal.
  7. Gebruik een microdissectieschaar om een incisie in de buik te maken net onder de navel en zorg ervoor dat er geen snijwonden in de slagaders komen. Gebruik een fijne tang om de darm te verplaatsen totdat de foetale baarmoederhoorns zichtbaar zijn.
  8. Om de eierstokken te lokaliseren, volgt u elke baarmoederhoorn naar buiten vanaf de blaas in de richting van de nier. De eierstok en de eileider verschijnen als kleine bolletjesstructuren aan de uiteinden van de baarmoederhoorns, net onder de nier en nabij de achterkant van de peritoneale holte (Figuur 1B).
  9. Gebruik een fijne tang om de eierstokken af te knijpen en verzamel ze in een klein horlogeglas gevuld met 750 μL 1x PBS.
  10. Ontleed de eierstok van de omliggende weefsels en plaats beide eierstokken in een horlogeglas met 750 μL HEB, zorg ervoor dat de eierstokken volledig ondergedompeld zijn (zie figuur 1C en 1D). Incubeer de eierstokken gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Pipetteer 35 μL van 100 mM sacharose op een holtedia. Gebruik een fijne tang om beide eierstokken over te brengen van HEB naar sucrose.
  12. Gebruik een naald van 25 G om een eierstok aan het objectglaasje te bevestigen, terwijl u een tweede naald gebruikt, afgeschuind naar beneden, om de eicellen uit de eierstok te drukken.
    1. Wanneer de eierstok transparant en geleiachtig wordt, verwijdert u de eierstok uit de HEB en herhaalt u het proces met de tweede eierstok. Piket de oplossing voorzichtig om de cellen te verspreiden.
  13. Dompel het glaasje in het Coplin kleurpotje PFA en dep de rand van het glaasje kort tegen een papieren handdoek. Zodra de PFA is verzameld in kleine druppels langs de hydrofobe grens van elk vierkant (Figuur 1E), pipetteer je 5 μL van de eicel-sucrose-oplossing in elke druppel PFA.
  14. Verdeel de eicellen over de vierkante secties door de dia's voorzichtig heen en weer te kantelen. Zorg ervoor dat de oplossing van een vierkant niet overloopt naar aangrenzende vierkanten.
  15. Plaats het glaasje in een vochtige kamer en ga door met het maken van glaasjes totdat de eicel-sucrose-oplossing is uitgeput.
  16. Herhaal stap 1.6 - 1.15 totdat alle vrouwelijke foetussen zijn gebruikt. Incubeer dia's in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  17. Open na de incubatie de vochtige kamer. Aangezien de meeste (zo niet alle) vloeistof/fixeermiddel nog steeds op het oppervlak van de objectglaasjes aanwezig moet zijn (ongeveer 10 μL in elke vierkante sectie), brengt u de objectglaasjes voorzichtig over op een papieren handdoek en laat u de objectglaasjes volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur op een laboratoriumbank (dit proces duurt meestal 30 - 60 minuten, afhankelijk van de lokale vochtigheid).
    NOTITIE: Dia's kunnen ook aan de lucht worden gedroogd onder een zuurkast om mogelijke blootstelling aan resterende PFA-dampen te verminderen. Dit verkort ook het drogen tot ongeveer 20 - 30 minuten.
  18. Was de dia's in 0,4% bevochtigingsmiddel in ultrazuivere H2O gedurende 2 min. Laat de dia's volledig drogen.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de objectglaasjes worden bewaard bij -80 °C; bepaalde epitopen zijn echter onstabiel (bijv. in onze ervaring kleurt MLH1 slecht en SYCP3-kleuring heeft significante artefacten na bevriezing). Het wordt sterk aangeraden om objectglaasjes onmiddellijk met immunokleuring te krijgen.

2. Immunofluorescentiekleuring van profase I-chromosoomverspreidingen

  1. Bereid 10x antilichaamverdunningsbuffer (ADB; zie tabel 2) met 10% (v/v) normaal geitenserum, 3% (g/v) runderserumalbumine (BSA) en 0,05% Triton X-100 in 1x PBS. Filter, steriliseer met een filter van 0,45 μm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
  2. Was de dia's in een Coplin kleurpot met 0,4% bevochtigingsmiddel in 1x PBS gedurende 10 minuten. Was de dia's in een Coplin kleurpot van 0,1% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 10 min. Blok dia's in een Coplin kleurpotje van 1x ADB gedurende 10 min.
  3. Verdun geselecteerde primaire antilichamen in 10x ADB (zie materiaaltabel voor de lijst van antilichamen en hun respectievelijke verdunningen).
    1. Bereid vier combinaties van antilichamen voor multiplex-immunokleuring: (1) SYCP332,33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; en (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Verwijder de objectglaasjes van ADB, tik overtollige vloeistof af en plaats de objectglaasjes in een bevochtigde kamer met water op kamertemperatuur. Breng 30 μL verdunde antilichamen aan per vierkante sectie van elk objectglaasje en zorg ervoor dat antilichamen van het ene vierkant niet overlopen naar aangrenzende vierkanten.
  5. Sluit de bevochtigde kamer en laat de glaasjes een nacht bij kamertemperatuur incuberen.
  6. Open de volgende ochtend de vochtige kamer en tik de verdunde antilichamen van de objectglaasjes. Herhaal stap 2.2.
  7. Verdun geselecteerde secundaire antilichamen in 10x ADB (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Vanaf dit punt zijn objectglaasjes en antilichamen lichtgevoelig. Voltooi alle volgende incubaties in het donker.
  8. Verwijder objectglaasjes uit ADB, tik overtollige vloeistof af en plaats objectglaasjes in een bevochtigde kamer met water op kamertemperatuur. Breng 30 μL geselecteerde verdunde antilichamen aan per vierkant gedeelte van elk objectglaasje en zorg ervoor dat antilichamen van het ene vierkant niet overlopen naar aangrenzende vierkanten.
  9. Sluit de bevochtigde kamer en laat de glaasjes 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  10. Was de dia's 3x gedurende 5 minuten elk in Coplin kleurpotjes van 0,4% bevochtigingsmiddel in 1x PBS. Was de dia's gedurende 5 minuten in een Coplin kleurpot van 0,4% bevochtigingsmiddel in ultrazuivere H2O.
  11. Breng een kleine druppel (ongeveer 10 μl) antifade-montagemedia aan met 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) of gelijkwaardige nucleïnezuurkleuring. Plaats op elke dia een 60 mm x 24 mm nr. 1.5 glazen dekglaasje en dep voorzichtig overtollige vloeistof op.
    OPMERKING: Dia's kunnen worden verzegeld met doorzichtige nagellak of rubbercement. Bij gebruik van een uithardingssteunmiddel is het afdichten van de objectglaasjes niet nodig. Dia's moeten worden bewaard in een diadoos of map bij 4 °C. Hoewel het het beste is om objectglaasjes kort na het kleuren af te beelden, is onze ervaring dat objectglaasjes die in het donker bij 4 °C worden bewaard, hun signaalintensiteit enkele maanden tot een jaar kunnen behouden. Voor langere opslag kunnen bewaarobjectglaasjes meerdere jaren bij -20 °C worden bewaard zonder noemenswaardig verlies van signaalkwaliteit.
  12. Beeld cellen af op 63x met behulp van epifluorescentiemicroscopie (zie Materiaaltabel). Gebruik beeldanalysesoftware (bijv. Zen van ImageJ, zie Materiaaltabel) om de SC-lengte en fluorescentie-intensiteit van alle kanalen langs de as te meten. Volg de lengte van elke chromosoomas (SYCP3), beginnend bij het centromeer (CREST of DAPI dense regio).
    1. Noteer voor de analyse van HORMAD1 en SYCP1 de lengtes van de fluorescentiesignaalpieken. Bereken de totale lengte van HORMAD1- of SYCP1-pieken en deel deze door de lengte van de chromosoomas.
    2. Kwantificeer voor de analyse van MSH4 het aantal fluorescentiesignaalpieken voor elke meting van SYCP3. Noteer zowel het totale aantal MSH4-pieken per kern als het aantal MSH4-pieken dat de MLH3-pieken overlapt. Bevestig het aantal MSH4 door pieken te vergelijken met het overeenkomstige aantal brandpunten.

3. Diakinese/prometafase preparaten voor observatie van chiasmata

  1. Om de opbrengst van meiotisch competente eicellen te maximaliseren, gebruikt u jonge vrouwelijke muizen (25 - 28 dagen oud).
    OPMERKING: Stimulatie door intraperitoneaal injecteren van vrouwelijke muizen met 5 IE drachtige merrieserumgonadotrofine (PMSG) 48 uur voorafgaand aan het verzamelen van eicellen kan worden uitgevoerd om de opbrengst te verbeteren. Voor chiasmata-analyses kunnen echter voldoende kiemblaasjes (GV) eicellen worden verzameld van niet-gestimuleerde vrouwtjes.
  2. Voordat u muizen offert, moet u de volgende reagentia en oplossingen bereiden.
    1. Laat M2 (3 ml per muis) en KSOM (1 ml per muis) gedurende ten minste 1 uur in evenwicht komen in een celkweekincubator (37 °C, 5 % CO2).
      OPMERKING: Buisjes met bevroren media-aliquots kunnen de avond voorafgaand aan het verzamelen van de eicellen in de couveuse worden geplaatst met hun deksel los, zodat ze ongeveer 14 uur klaar zijn.
    2. Bereid M2-media voor met 2,5 μM milrinon (een fosfodiësterase-isoenzymremmer die meiotische hervatting voorkomt)36. Pipetteer vijf druppels van 20 μl M2 + milrinon in een petrischaaltje van 35 mm en bedek met lichte minerale olie (Figuur 2C).
    3. Pipetteer vijf KSOM van 20 μL in een petrischaaltje van 35 mm en bedek met lichte minerale olie (Figuur 2C).
      LET OP: Controle van temperatuur en pH is van cruciaal belang voor de in-vitrorijping van eicellen. Het verzamelen van eicellen moet worden uitgevoerd op een verwarmd werkblad (37 °C). Alle media moeten in de broedmachine worden bewaard totdat ze worden gebruikt, en de schalen met media moeten één voor één worden verwijderd om verstoring door blootstelling aan omgevingslucht te beperken.
    4. Reinig glazen objectglaasjes met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen. Snijd op de achterkant van glazen microscoopglaasjes lichtjes (met een pen met diamantpunt) of teken (met een waterbestendige inkt) een raster van 5 x 5 van ~ 4 mm x 4 mm vierkanten (een voorbeeld wordt getoond in Figuur 2B en kan worden gebruikt om het raster te tekenen).
  3. Verzamel eicellen van één muis tegelijk. Offer een vrouwelijke muis door CO2 -verstikking en cervicale dislocatie volgens de IACUC-richtlijnen.
  4. Gebruik een dissectieschaar om de buikholte te openen. Gebruik een fijne tang om de darmen te verplaatsen.
  5. Volg elke baarmoederhoorn van de blaas naar de nier. Eierstokken en eileiders worden geassocieerd met een klein vetkussentje in de buurt van de nier.
  6. Gebruik een microdissectieschaar om de eierstokken te verwijderen en plaats ze in vergaste M2-media met milrinon.
  7. Gebruik een microdissectieschaar om al het vet en andere weefsels (inclusief de slijmbeurs) uit de eierstokken te verwijderen. Gebruik naalden van 25 G om antrale follikels te scheuren.
  8. Gebruik een transferpipet om de eicellen in M2 + milrinon in een dunne laag in een petrischaaltje van 100 mm te verspreiden en zorg ervoor dat de media de zijkanten van de schaal niet raken (Figuur 2C).
  9. Gebruik een dissectiemicroscoop (vergroting 25x - 50x) om GV-eicellen zichtbaar te maken (Figuur 2F). GV-eicellen kunnen geassocieerd zijn met cumuluscellen in een cumulus-eicelcomplex (COC). Verwijder cumuluscellen door herhaaldelijk te pipetteren.
  10. Verzamel GV-eicellen met behulp van een mondbediende glazen pipet (100 - 150 μm diameter; Figuur 2A). Breng GV-eicellen over in een druppel van 20 μl M2 + milrinon bedekt met lichte minerale olie (figuur 2C). Doe niet meer dan 30 eicellen in een enkele druppel.
  11. Wanneer alle GV-eicellen zijn verzameld, passeert u ze door twee of drie druppels van 20 μl M2 + milrinon bedekt met lichte minerale olie om eventuele somatische cellen te verwijderen.
  12. Breng GV-eicellen (met zo min mogelijk media) over in een druppel van 30 μl KSOM. Spoel het milrinon uit door de eicellen door vijf KSOM-druppels te halen (Figuur 2C).
  13. Breng alle GV-eicellen over in 20 μL druppels KSOM bedekt met lichte minerale olie, maximaal 30 eicellen per KSOM-druppel (Figuur 2C). Plaats de eicellen in een celkweekincubator (37 °C, 5 % CO2).
  14. Incubeer de eicellen gedurende ongeveer 5 uur.
    OPMERKING: GV-uitsplitsing (markering van het verdwijnen van de nucleaire enveloppe en meiotische herneming; Figuur 2G) Treedt meestal op na 2 uur in de kweek, maar de snelheid van de rijping van de eicel kan variëren, afhankelijk van de soort van de muis of hormoonstimulatie. Onze ervaring is dat een totaal van 5 uur in cultuur het beste optimaliseert voor chiasmata-spreads in de meeste muizenstammen. Als het te lang wordt laten rijpen, kan de eerste meiotische deling en extrusie van het poollichaam optreden (Figuur 2H).
  15. Breng 5 - 10 eicellen (met zo min mogelijk KSOM) over in een druppel van 30 μl hypotone oplossing (0,9 % natriumcitraat in ultrazuiver H2O). Incubeer de eicellen in de hypotone oplossing gedurende 5 - 10 minuten.
  16. Pipetteer een kleine druppel (~ 1 μL) aangezuurd water (8 druppels ijsazijn in 50 ml ultrazuiver H2O) op een van de vierkanten op de voorbereide dia's (Figuur 2B).
  17. Gebruik een mondbediende glazen pipet met een diameter van 100 - 150 μm om snel één eicel van de naar de aangezuurde waterdruppel over te brengen. Breng zo min mogelijk hypotone oplossing over met de eicel. Gebruik dezelfde pipet om een deel van de vloeistof te verwijderen totdat de eicel aan het glaasje blijft plakken.
    OPMERKING: Het vloeistofvolume rond de eicel is van cruciaal belang. Er moet voldoende vloeistof zijn zodat de eicel niet uitdroogt voordat hij wordt gefixeerd, maar niet zo veel dat de eicel zich niet aan het objectglaasje kan hechten.
  18. Schakel snel over op een glazen pipetpunt met een diameter van 150 μm. Voeg een druppel vers fixeermiddel van Carnoy (drie delen absolute methanol op één deel ijsazijn) toe aan de eicel. Laat het fixatief zich over het objectglaasje verspreiden. De eicel moet minder duidelijk lijken te worden en smelten als het zuur uit het fixeermiddel de zona pellucida oplost en de cellen barsten.
  19. Als de voorkant van het fixatief begint samen te trekken, voeg dan snel nog 2 - 3 druppels fixatief toe. Blaas zachtjes op de schuif om het drogen te versnellen.
  20. Herhaal stap 3.16 - 3.19 met extra eicellen uit de hypotone oplossing.
  21. Herhaal stap 3.15 - 3.20 totdat alle eicellen zijn gefixeerd. Controleer de spreiding van chromosomen met behulp van een fasecontrastmicroscoop.
  22. Wanneer het objectglaasje volledig aan de lucht is gedroogd, plaatst u het objectglaasje in een Coplin kleurpot met 50 ml 4% Giemsa (v/v) in ddH2O. Kleurglaasjes in Giemsa gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur.
  23. Was de dia's 3x gedurende 3 minuten elk in ddH2O op kamertemperatuur. Laat de dia's volledig drogen.
  24. Breng een dunne laag (~60 μL) Permount aan op een 60 mm x 24 mm nr. 1.5 glazen afdekplaat. Monteer dia's door ze om te keren op de dekglaasjes en voorzichtig overtollige vloeistof uit te deppen. Laat de dia's een nacht drogen voordat u de foto maakt met 63x op brightfield.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Evaluatie van synapsisdefecten in pachyteenachtige cellen
Dit experiment evalueert synapsisdefecten in pachyteen-eicellen en bewaakt de progressie van profase I (Figuur 3A). Immunokleuring voor SYCP3 (axiale/laterale SC-elementen), SYCP1 (centraal SC-element) en HORMAD1 (niet-gesynapseerde/gedesynapseerde chromosoomassen) maakt stadiëring en synapsisbeoordeling mogelijk. HORMAD1 colokaliseert met SYCP3 tij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eicellen van zoogdieren zijn bijzonder foutgevoelig in vergelijking met spermatocyten. Hoewel het minder efficiënte controlepunt (SAC) van de eicel bijdraagt aan deze kwetsbaarheid 14,52,53, stellen Hassold en Hunt voor dat meerdere treffers leiden tot aneuploïdie, waarbij defecte recombinatie een primaire factor is54. Studies bij mensen koppelen aneuploïdie aan onvoldoen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit project werd verstrekt door een K99-prijs van het Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development (HD112986 tot TH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm Syringe FilterMillipore SigmaSLHAR33SBvoor het maken van mondeling bediende pipetten
0.5 M EDTA, pH 8.0Corning46-034-CI voor HEB
1 mL steriele spuit met 25-gauge, 16 mm naaldFisher Scientific14-817-125 voor het scheuren van eierstokken
100 x 15 mm petrischaalVWR25384-302 
14,6 cm wegwerpbare borosilicaat glas Pasteur pipettenFisher Scientific13-678-20B voor het maken van mondeling bediende pipetten
35 x 10 mm petrischaalCorning351008
40 mm x 0.45 mm #3 roestvrijstalen pennen voor entomologieAmazonB0CSSPW5S7voor het vastpinnen van foetale muizen voor dissectie
Azijnzuur, glazuurFisher ScientificA38-212voor Carnoy's fixatief
Aspiratorbuisassemblages voor gecalibreerde microcapillaire pipettenMillipore SigmaA5177-5EAvoor het maken van mondeling bediende pipetten
B.P.I. kijkglasNDS Technologies 1580-00Gebruik alternatief een embryo-schaal met een diameter van 30 mm x 12 mm diep (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
BoorzuurFisher ScientificBP168-1voor het aanpassen van de pH van HEB, PFA
RundserumalbumineMillipore SigmaA7906-100Gvoor ADB
CO2 Tankvoor incubator
Corning MicroscoopglazenMillipore SigmaCLS294875X25L x B 75 mm x 25 mm, aan één kant gefrost
Corning microscoopglazen, aan één kant gefrost, één uiteindeVWR294875X25
Dekglas rechthoekig. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
DissectiebakElectron Microscopy Sciences70540
DissectiemicroscoopElk standaardmodel
Dissectiescharen, scherpe punt, 4,5"VWR82027-578
Extra fijne, scherpe punt tangVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500voor het kleuren van chiasmata-verspreidingen
ImmEdge Hydrofobe Barrière PAP PenVector LaboratoriesH-4000
IncubatorElk standaardmodel met CO2 en watermanteltechnologie
IVF WorkstationK-SystemsElk model met een verwarmde werkblad
Kodak Photo-Flo 200 SolutionBH Photo & Video1464510voor diawassingen
MethanolFisher ScientificA412-4voor Carnoy's fixatief
MP Biomedicals Coplin KleurvatFisher ScientificICN17006201
Normaal GeitenserumGibco16210-072voor ADB
Paraformaldehyde, EM Grade, Gezuiverde PrillElectron Microscopy Sciences19200
PermountFisher ScientificSP15-100voor het monteren van dia's voor chiasmata-verspreidingen
ProLong Glass Antifade Mountant met NucBlue StainThermo ScientificP36985voor het monteren van geïmmunokleuring dia's
Silicoonbuis, binnendiameter: 0,125", buitendiameter: 0,25"VWR89068-474voor het maken van mondeling bediende pipetten
NatriumcitraatdihydraatFisher ScientificS279-500voor HEB, hypotone oplossing
StainTray Slide Staining SystemElectron Microscopy Sciences71396-BTe gebruiken als een bevochtigde kamer. Gebruik de zwarte deksel voor immunofluorescentiekleuring. U kunt alternatief de bodem van een ondoorzichtige diadoos of tupperware bekleden met vochtige papieren handdoeken voor gebruik als een bevochtigde kamer 
Stripper Tips - 100Cooper SurgicalMXL3-100voor mondeling bediende pipetten
Stripper Tips - 150Cooper SurgicalMXL3-150voor mondeling bediende pipetten
SucroseMillipore SigmaS-8501voor HEB, sucrose hypotone oplossing
Tris BaseFisher ScientificBP152-5voor HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 voor PFA, ADB en Triton-PBS
United Scientific Coplin KleurvatFisher ScientificS17495Aopaak wit plastic voor wassen en blokkeren van dia's na toevoeging van fotogevoelige secundaire antilichamen
United Scientific Glazen ConcaviteitsschuivenFisher ScientificS1395331,3 mm dik, 2 wel tellen
Vannas Microdissectie Scheren 5 mm rechtVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 SoftwareCarl ZeissBeeldverzameling en analyse software
Antilichamen
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071gebruikt 1:1.000 verdunning
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Rabbit IgG, Fc fragment specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046gebruikt 1:1.000 verdunning
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specifiekJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170

Referenties

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Synaptonemaal complexmeiotische recombinatieimmunofluorescentiekleuringchromosomale synapsiscrossover vormingoocytenrijpinganeuplo diebeoordelingchromosoomdynamiek
Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.