Methodenartikel

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 augustus 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Effectieve modellering van ziekten in realistische omgevingen is cruciaal om ons begrip van diverse pathologieën te verbeteren. In dit opzicht bieden organoïden een meer getrouwe omgeving dan hun klassieke tweedimensionale tegenhangers in vitro. Evenzo stellen syngene muizenmodellen onderzoekers ook in staat om completere tumor-gastheerinteracties, zoals met het immuunsysteem, in vivo te onderzoeken. Hier presenteren we een compleet protocol voor het extraheren van eileiderepitheelcellen, de cel van oorsprong van hooggradige sereuze eierstokcarcinomen (HGSOC), van een muis en leiden we ze af als primaire organoïde culturen, evenals hun in vitro kweek en onderhoud. Vervolgens beschrijven we hoe genetische manipulatietechnieken, zoals lentivirale of retrovirale genoverexpressie, evenals CRISPR-Cas9-gendeletie, kunnen worden gebruikt om deze lijnen te wijzigen en om te zetten in precancereuze tumoroïden. We rapporteren ook hoe ze kunnen worden gebruikt voor in vitro validatie, via de extractie van genetisch materiaal en immunofluorescentiekleuring. Ten slotte geven we aan hoe deze tumoroïden effectief kunnen worden geïnjecteerd in de ovariële slijmbeurs, de autochtone plaats van HGSOC, voor tumorinitiatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) blijft een slecht begrepen en zeer dodelijke ziekte. Historisch gezien is het gebrek aan getrouwe in vitro en in vivo modellen die de HGSOC-biologie en therapierespons vertegenwoordigen, een belangrijke barrière voor vooruitgang geweest. Bijvoorbeeld, meerdere (zo niet de meeste) studies hebben cellijnen gebruikt die er niet in slagen om belangrijke genomische/genetische kenmerken van HGSOC te delen, waardoor de relevantie van hun bevindingen twijfelachtig wordt 1,2,3,4. Het gemeenschappelijke ID8 syngene muismodel is bijvoorbeeld afgeleid van ovarieel oppervlakte-epitheel (OSE) en is Trp53-wild type5. Daarentegen ontstaat de meeste, zo niet alle, HGSOC in het eileiderepitheel (FTE)6, en HGSOC is bijna universeel TP53-mutant of gedempt7. Onderzoekers hebben sindsdien geprobeerd deze lijn te corrigeren door Trp53-mutaties erin te integreren5, maar aangezien Trp53-mutatie een vroege gebeurtenis is in de pathogenese van HGSOC, komt deze wijziging mogelijk te laat in de transformatie van deze cellijn en vertegenwoordigt deze waarschijnlijk geen normale HGSOC-ontwikkeling.

In het afgelopen decennium zijn pogingen ondernomen om deze stand van zaken recht te zetten door meer realistische modellen van HGSOC te genereren. Genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMM's) die relevante mutaties herbergen op cellen van de Mülleriaanse afstamming, vaak onder een Cre-recombinasesysteem om de pathogenese te beheersen, stellen onderzoekers bijvoorbeeld in staat om de ziekte in vivo beter na te bootsen 8,9,10. Helaas zijn deze modellen vaak ingewikkeld om te genereren en kunnen ze andere problemen hebben, zoals Cre-lekkend, Cre-effect of "veldeffecten"11,12,13. In dit opzicht lijken syngene organoïdemodellen een robuust compromis te zijn voor onderzoekers die de ziekte zowel in vitro als in vivo beter willen nabootsen 14,15,16,17,18,19. Hoewel de meeste HGSOC-modellen die momenteel beschikbaar zijn en worden gebruikt, tweedimensionale modellen zijn, kunnen ze helaas de complexiteit van de extracellulaire matrix (ECM), een cruciaal element dat de celbiologie beïnvloedt, niet goed simuleren. Organoïden zijn zelfgeorganiseerde 3D-weefsels, vaak gegenereerd uit stamcellen, die de vroege structurele en functionele complexiteit van een orgaan in de petrischaal kunnen nabootsen20. Hun generatie werkt meestal door afzonderlijke cellen, die pluripotent zijn, op te schorten in een basaalmembraanmatrix (BMM), zoals Matrigel21. In vitro zijn deze modellen relatief nauwkeuriger in het recapituleren van in vivo omstandigheden dan 2D-modellen. Evenzo kunnen deze modellen, vanwege hun syngene aard, worden getransplanteerd in een muis met een volledig functionerend immuunsysteem, waardoor een meer getrouwe reconstructie van pathogenese en ontwikkeling mogelijk is14,15. Dit is een duidelijk voordeel ten opzichte van van de patiënt afgeleide xenotransplantaten, die, hoewel ze de meest realistische tumorgenetica hebben, implantatie vereisen in immuungecompromitteerde muismodellen.

In dit protocol beschrijven we hoe syngene HGSOC-organoïdemodellen kunnen worden ontwikkeld. Van het genereren van de originele wild-type FTE-organoïdecultuur geëxtraheerd uit een muis, hun genetische manipulatie om ziekte-geïnformeerde genotypen te genereren, tot uiteindelijk hun transplantatie terug in de eierstokslijmbeurs om volledig ontwikkelde tumoren te genereren. We hebben ook een paar aanvullende protocollen toegevoegd om te helpen bij veelvoorkomende experimenten, zoals immunofluorescentie (IF) kleuring van in vitro organoïden en 2D-conversie van cellijnen voor grootschalige productie van cellen, zoals voor injecties. Dit protocol is bedoeld voor onderzoekers die organoïde syngene modellen van HGSOC willen ontwikkelen met controle over hun genetische samenstelling, met de specifieke bedoeling om HGSOC-biologie te bestuderen in meer realistische in vitro omstandigheden, evenals de interacties die aanwezig zijn in de micro-omgeving van de tumor in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle verzameling en procedures van dierlijk weefsel werden ethisch uitgevoerd onder de goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Alexandria Center for Life Sciences en het Perlmutter Cancer Center van NYU Langone Health, New York, New York.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Bereiding van organoïde media (MOM) bij muizen
    1. Bereid het basale medium voor door de items in tabel 1 te combineren.
      OPMERKING: Media zijn tot een maand stabiel bij 4 °C.
  2. Voorbereiding van 2D-media
    1. Combineer recombinant muizen EGF 50 ng/ml, insuline-transferrine-selenium (eindconcentraties 10 mg/l insuline, 5,5 mg/l transferine, 6,7 μg/l), 3% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine (100 E/ml), in DMEM (met pyruvaat en hoge glucose).
  3. Bereiding van de spijsverteringsmix
    1. Combineer collagenase/hyaluronidase (3000 E/ml collagenase, 1000 e/ml hyaluronidase) met DMEM (met pyruvaat en hoge glucose) in een verhouding van 1:10. Bereid 1 ml aliquots in microbuisjes van 1,5 ml. Bewaar de aliquots bij -20 °C en ontdooi op ijs.
    2. Bereid aliquots voor eenmalig gebruik van DNAse I (10.000 E/ml) en Dispase (5 E/ml).
    3. Zodra een aliquot collagenase/hyaluronidase in DMEM is ontdooid, voegt u DNAseI (10 μL, 100 eenheden) en Dispase (25 μL, 0,1 eenheden) toe.
      OPMERKING: Deze spijsverteringsoplossing is ook nuttig voor het verteren van maximaal 0,5 g tumor.
  4. BMM-afhandeling
    1. Bewaar BMM langdurig bij -80 °C. Om vries-ontdooiende BMM te voorkomen, bereidt u 1 ml aliquots in tubes van 1,5 ml. Ontdooi een hoeveelheid door deze gedurende 2 uur of een nacht bij 4 °C op ijs te leggen.
      OPMERKING: BMM stolt bij kamertemperatuur (RT). Daarom is het aan te raden om de tube BMM altijd op ijs of op een cold tube rack te bewaren. Gebruik pipetpunten die minimaal 2 uur zijn voorgekoeld in een vriezer van -20 °C.

2. Isolatie van cellen van FTE bij muizen

  1. Ontdooi een hoeveelheid BMM, voorverwarmd TrypLE Express Enzyme en een plaat met 24 putjes bij 37 °C (bewaar de plaat 24 uur in de incubator voor het beste resultaat). Bereid vervolgens het operatiegebied voor: gereedschap voor dissectie en het reinigen van weefsel op de ontleedmicroscoop, plaat met koude PBS + P/S en warme digestiemix.
  2. Euthanaseer vrouwelijke C57BL/6J-muizen door verstikking door kooldioxide. Voer een secundaire euthanasiemethode (cervicale dislocatie) uit zoals vereist door IACUC.
  3. Ontleed en verwijder de eierstok en eileider en breng ze over in een steriel petrischaaltje met DMEM + P-S bij 4 °C. Met behulp van een ontleedmicroscoop verwijdert een fijne tang en schaar de resterende hoeveelheid vet uit de eierstok en isoleert de eileider (infundibulum en een deel van de distale ampulla) van de eierstok en de baarmoeder.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u de huid of het haar van de muis niet aanraakt met het gereedschap om microbiële besmetting te voorkomen.
  4. Breng het weefsel over in de buis met de volledige spijsverteringsmix en hak de eileider met een fijne schaar in kleine stukjes (<0,5 mm). Incubeer gedurende 40-50 minuten bij 37 °C.
  5. Na dissociatie centrifugeren de cellen gedurende 5 minuten bij 350 x g en gooien we het supernatant weg. Voeg 500 μL voorverwarmde TrypLE Express toe. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
  6. Quen trypsinisatie met 500 μL 3% FBS in DMEM (2D media). Zeef het mengsel door een celzeef van 70 μm in een nieuw microbuisje. Draai gedurende 5 minuten op 350 g en gooi de supernatant weg.
  7. Resuspendeer de celpellet (nauwelijks zichtbaar afhankelijk van het aantal gebruikte FT's) in 12,5 μL organoïde muizenmedia en incubeer kort op ijs. Meng met 37,5 μL ijskoude BMM en zaai het hele volume (50 μL) in de bodem van een kuiltje van een voorverwarmde plaat met 24 putjes.
  8. Plaats de plaat gedurende ten minste 20 minuten, maar niet langer dan 48 uur, op 37 °C om de BMM in te stellen. Zorg ervoor dat u de koepels niet verstoort wanneer u de plaat naar de broedmachine overbrengt.
  9. Voeg 500 μL voorverwarmde MOM toe aan elk putje door het medium voorzichtig langs de zijkant van het putje te pipetteren. Voeg media nooit rechtstreeks toe aan de dome, omdat dit schade of onthechting kan veroorzaken. Plaats het deksel op de kweekplaat en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 .

3. Onderhoud van muizen FTE-afgeleide organoïden

  1. Veranderende media
    1. Zuig met een ongefilterde, steriele tip van 10 μL de media van de bodem van de put op terwijl de plaat op een helling van 45° wordt gehouden. Als de koepel loskomt van de plaat, zuigt u de media voorzichtig op vanaf de bovenkant van de put terwijl de vrijstaande koepel zich op de bodem bevindt.
    2. Voeg langzaam 750 μL MOM toe, voorverwarmd bij 37 °C, met de punt tegen de zijwand van de put.
    3. Vervang de media elke 2 tot 3 dagen of totdat de media van kleur veranderen van roze naar geel. Als het medium minder dan 24 uur na het vervangen geel wordt, zijn de organoïden klaar om te worden gepasseerd.
  2. Organoïden passeren
    1. Verwijder het medium en was elk goed met 500 μL koude (4 °C) PBS. Zuig PBS aan en voeg 500 μL koude (4 °C) Cell Recovery Solution rechtstreeks toe aan de BMM-koepel om deze op te lossen. Ga door met pipetteren totdat de BMM volledig is opgelost en breng deze over in een buis van 1,5 ml.
    2. Plaats de tube 30 minuten op ijs en plaats de plaat terug in de broedmachine zodat deze warm blijft. Als u een nieuwe plaat gebruikt, zorg er dan voor dat deze gedurende 24 uur is voorverwarmd op 37 °C.
      OPMERKING: Als er meer dan 2x 50 μL koepels worden doorgelaten, zoals tijdens de hieronder beschreven uitbreidingen, kan het nodig zijn de incubatie op ijs langer dan 30 minuten te verlengen voor het beste resultaat.
    3. Centrifugeer 5 minuten bij 350 g bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande voorzichtig zonder de pellet op te zuigen en was met 500 μL koude PBS. Herhaal deze stap drie keer.
      NOTITIE: Als er geen koude centrifuge beschikbaar is, laat de buis dan tussen de wasbeurten afkoelen door deze op ijs of een koud rek te plaatsen.
    4. Centrifugeer na de laatste wasbeurt 5 minuten bij 350 g , verwijder het supernatant en voeg 500 μL voorverwarmd (37 °C) TrypLE Express Enzyme toe. Om te voorkomen dat cellen verloren gaan door pipetteren, sleept u de slang tegen het ventilatierooster in de weefselkweekkap om de cellen te homogeniseren.
    5. Incubeer de buis bij 37 °C gedurende 30 tot 60 minuten.
      OPMERKING: De tijd kan worden aangepast afhankelijk van het genotype van de organoïde en de passagetijd, aangezien sommige mogelijk langere trypsinisatie nodig hebben om eencellige suspensies te verkrijgen.
    6. Stop het celdissociatieproces door 500 μL DMEM + 3% HI FBS toe te voegen en meng door op en neer te pipetteren totdat de oplossing gehomogeniseerd is.
    7. Centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 minuten en zuig het bovenstaande op tot er ~20 μL volume over is. Verwijder het resterende bovenstaande middel handmatig met een P20-pipet in plaats van met een vacuümaspirator, aangezien het gebruikelijk is om de pellet in deze stap op te zuigen.
    8. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude (4 °C) MOM en meet de celconcentratie. Bereid de celverdunningen naar wens voor en bewaar ze op ijs. Meng vervolgens met ijskoude BMM met behulp van pipetpunten die vooraf bij -20 °C zijn bewaard.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om twee koepels van 50 μL voor te bereiden op 2 × 105 cellen/ml, waarbij de verhouding tussen MOM en BMM 1:4 is. Daarom zou je moeten hebben; 25 μL cellen in MOM bij 8 × 105 cellen/ml, en 75 μL BMM voor een totaal van 100 μL, verdeeld in 2 koepels. Op deze manier zal men effectief 1 × 104 cellen per koepel zaaien.
    9. Zaai elke koepel van 50 μL in het midden van het putje van een voorverwarmde plaat met 24 putjes. Plaats de plaat in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minstens 30 minuten om de BMM te laten stollen. Voeg 500 μl MOM bij 37 °C toe, zoals eerder aangegeven in stap 3.1.2 en plaats de plaat terug in de broedmachine.
  3. Expansie
    1. Om de organoïde celcultuur uit te breiden tot een (voorverwarmde) plaat met 6 putjes, bereidt u vijf koepels van 50 μL voor op 8 × 105 cellen/ml. Resuspendeer de cellen in een totaal van 62,5 μL MOM en meng met 187,5 μL ijskoude BMM en zaai de 5 domes in hetzelfde putje.
    2. Verplaats de plaat 30 minuten naar de broedmachine om de BMM te laten stollen. Voeg 2 ml MOM bij 37 °C toe, zoals eerder aangegeven in stap 3.1.2 en plaats de plaat terug in de broedmachine. Verander de media zo nodig totdat de cellen samenvloeien.
      OPMERKING: Om cellen te verzamelen voor passaging, gebruikt u 1 ml celhersteloplossing in plaats van 500 μl en incubeert u 45 minuten op ijs in plaats van 30 minuten.
  4. Cryopreservatie
    1. Voor langdurige bewaring van organoïden, doorgang zoals beschreven in stap 3.2.1-3.2.7. Resuspendeer vervolgens in 250 μL organoïde vriesmedia (80% MOM, 10% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO)) en breng over naar een cryobuis. Vries 1 × 105 cellen per cryovial in.
    2. Bewaar de tube in een cryogene injectieflacon vriescontainer (bijv. Mr. Frosty) en laat deze afkoelen in een vriezer van -80 °C. Bewaar de cellen voor langdurige opslag in vloeibare stikstof of in een vriezer van -150 °C.

4. Genetische modificatie van muizen FTE-afgeleide organoïden om nieuwe cellijnen te ontwikkelen

  1. Transductie door spinoculatie (lentiviraal of retroviraal)
    1. Bereid een mengsel van 25 μL MOM en 75 μL BMM en voeg dit toe aan een putje van een koude (4 °C, zorgt ervoor dat BMM de put volledig kan "bevochtigen") plaat met 48 putjes. Incubeer 30 tot 60 minuten bij 37 °C om BMM de kans te geven stollen voordat de cellen worden uitgezaaid.
    2. Verkrijg enkele cellen afgeleid van organoïden (stap 3.2.5) en zaai ongeveer 2 × 104 bovenop de BMM. Voeg 200 μL warme (37 °C) MOM toe en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
    3. Voeg het virus in de gewenste concentratie toe. Bepaal het MOI experimenteel; een MOI van minder dan 30% wordt gesuggereerd.
      OPMERKING: Organoïden zijn bijzonder moeilijk te infecteren in vergelijking met 2D-cellijnen en verwachten lage MOI's, zelfs bij hoge virustiters. Centrifugeer de cellen gedurende 600 minuten bij 600 × g bij 32 °C. Plaats de plaat terug in de couveuse nadat de spinoculatie is voltooid.
    4. Verwijder na 8 uur de media en voeg een mengsel van 25 μL MOM en 75 μL BMM toe aan de cellen om ze in BMM te "sandwichen", zodat organoïden op natuurlijke wijze in 3 dimensies kunnen groeien. Laat de BMM stollen door de plaat 30-60 minuten in de broedmachine te plaatsen. Voeg vervolgens 250 μL warme (37 °C) MOM toe.
    5. Zodra de cellen samenvloeien, gaat u verder met het passeren ervan zoals beschreven in stap 3.2, waarbij u het volledige volume cellen uitbreidt tot 2 koepels in een plaat met 24 putjes.
      OPMERKING: Als u een antibioticaselectie gebruikt, wordt aanbevolen de selectie rechtstreeks in de 48-well uit te voeren, beginnend 48 uur na de eerste spinoculatie. Bij het uitvoeren van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), wordt aanbevolen om verder uit te breiden op een plaat met 6 putjes zoals hierboven beschreven om voldoende cellen te verkrijgen. Langere trypsinisatietijden (1 uur) worden ook aanbevolen om ervoor te zorgen dat er enkele cellen zijn voordat de monsters op stroom worden gefilterd.
  2. Transformatie door op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9
    OPMERKING: Voor concentraties en bereiding van het ribonucleoproteïne (RNP)-complex verwijzen naar de IDT Homology-Directed Repair Guide (pp. 9-11)22. Laat de HDR Enhancer V2 echter weg voor knock-outs, omdat deze alleen wordt aanbevolen voor genoombewerking die homologe recombinatie vereist.
    1. Bereid een eencellige suspensie afgeleid van organoïden (stap 3.2.7). Wassen met PBS en meet de celconcentratie. Breng een celsuspensie met een hoeveelheid in de orde van grootte van 104 (1 × 104 tot 9 × 104 cellen) over in een buisje van 1,5 ml.
    2. Centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer opnieuw in 10 μL genoombewerkingsbuffer. Als >1 × 104 cellen nodig zijn voor elektroporatie, bereid dan een voldoende volume voor voor seriële elektroporaties en zorg ervoor dat elke 10 μl 1 × 104 tot 9 × 104 cellen bevat.
    3. Verzamel met behulp van een elektroporatiepipetsysteem 10 μl van de celsuspensie en zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd. Elektroporeren onder de volgende omstandigheden: 1200 V spanning, pulsduur 20 ms, 4 pulsen in totaal. Plaats cellen in een buisje met koude MOM.
    4. Nadat de cellen zijn geëlektroporeerd, centrifugeert u de gehele suspensie gedurende 5 minuten bij 350 × g . Resuspendeer de pellet in ijskoude MOM en BMM (verhouding 1:4) en bereid voldoende voor om één koepel per elektroporatieronde te zaaien (1 koepel per 1 104 cellen).
    5. Plaats de plaat in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minstens 30 minuten om de BMM te laten stollen. Voeg 500 μl MOM bij 37 °C toe, zoals eerder aangegeven in stap 3.1.2 en plaats de plaat terug in de broedmachine.
  3. Afzonderlijke klonen selecteren
    1. Om een kloon te verkrijgen die afkomstig is van een enkele cel, moeten cellen worden gepasseerd zoals hierboven beschreven, maar 50 tot 100 cellen per koepel zaaien (4 × 103 tot 8 × 103 cellen/ml in celsuspensie voordat ze worden gemengd met BMM).
    2. Verander de MOM elke 3 dagen. Controleer of organoïden op de juiste manier groeien en noteer welke goed gescheiden zijn van de andere.
    3. Wanneer organoïden een waarneembare grootte hebben (ongeveer 500 μm), gebruik dan een lichtmicroscoop om 4-5 grote organoïden te identificeren die voldoende gescheiden zijn.
      OPMERKING: Ze moeten met het blote oog zichtbaar zijn, maar het is handig om de onderkant van de plaat te markeren met een markering met een fijne punt door een cirkel te tekenen rond het gebied van de plaat waar de organoïde zich bevindt.
    4. Gebruik een pipet van 20 μl in de steriele kap om de punt voorzichtig in de BMM te steken en zuig de enkele organoïde op (zuig een volume van ongeveer 12,5 μl op). Plaats de organoïde in een opvangbuisje van 1,5 ml met 500 μL MOM.
    5. Centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer opnieuw in 500 μl TrypLE Express Enzyme. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
    6. Blus de celdissociatiereactie af met 500 μL 3% FBS in DMEM (2D-media) en centrifugeer bij 350 × g gedurende 5 minuten. Verwijder heel voorzichtig het supernatant, resusinfecteer in 12,5 μL koude MOM, meng met 37,5 μL ijskoude BMM en zaai de hele suspensie als een enkele koepel van 50 μL in een plaat met 24 putjes, zoals hierboven beschreven.
    7. Plaats de plaat in de broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 gedurende minstens 30 minuten om de BMM te laten stollen. Voeg 500 μl MOM bij 37 °C toe, zoals eerder aangegeven in stap 3.1.2 en plaats de plaat terug in de broedmachine.
    8. Vervang de media elke 3-4 dagen en voer deze door wanneer de koepel samenvloeit.

5. 2D cellijn afleiding van organoïden

  1. Overgang celcultuur
    1. Begin met een eencellige suspensie, zoals na het passeren van organoïden.
    2. Ga te werk zoals u zou doen met het zaaien van een plaat met 6 putjes (stap 3.3), maar gebruik in plaats daarvan een voorgekoelde plaat (4 °C gedurende 24 uur). Zaai de koepels op een plaat met 6 putjes die een nacht bij 4 °C wordt bewaard en laat de plaat 5-10 minuten in de steriele kap rusten voordat u deze in de broedmachine brengt.
      OPMERKING: Met deze stap kunnen de cellen zich voorzichtig naar de bodem van de plaat nestelen om plaats te bieden aan een 2D-groeiconditie, terwijl ze nog steeds toegang hebben tot de ECM-componenten van BMM.
    3. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 en voeg vervolgens 2 ml MOM bij 37 °C toe. Wijzig de media indien nodig.
    4. Wanneer organoïden samenvloeien, passage zoals beschreven in de stappen 3.2.1-3.2.7. Na de laatste PBS-wasbeurt van de put om overgebleven BMM te verwijderen, voegt u 2 ml voorverwarmde 2D-media toe aan de put.
      OPMERKING: De BMM-verwijdering verwijdert geen cellen die aan de put zijn bevestigd, en deze kunnen nu vrijelijk de rest van de put binnendringen terwijl ze zich aanpassen aan 2D-omstandigheden/media.
    5. Zodra een suspensie met één cel is bereikt met de cellen die in de BMM zijn achtergebleven, zaait u de helft van het celvolume en herhaalt u stap 5.1.2. Voeg de andere helft van het origineel goed toe, zodat meer cellen kunnen zaaien, wat de samenvloeiing zal versnellen.
    6. Wijzig 2D-media na 24 uur om niet-aangesloten cellen te verwijderen.
      OPMERKING: Er moeten veel niet-aangehechte cellen zijn, omdat cellen die in BMM worden gekweekt niet gewend zijn aan plastic substraten en zich niet gemakkelijk zullen hechten.
    7. Herhaal stap 5.1.4. Resuspendeer vervolgens het volledige volume cellen in 4 ml 2D-media en zaai 2 ml in elk van de eerder gebruikte putjes. Verander 2D-media elke 3-4 dagen.
  2. 2D-celcultuur voor uitbreiding
    1. Zodra cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, gaat u verder met de eerste passaging.
    2. Zuig media op, was eenmaal met 1 ml PBS en voeg 1 ml 0,25% trypsine toe. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 tot 10 minuten.
      OPMERKING: Verschillende cellijnen kunnen verschillende adherente eigenschappen hebben, waardoor de trypsinisatieduur varieert. Controleer onder de microscoop of de cellen zijn losgekomen voordat u doorgaat naar de volgende stap. Door met de hand zachtjes op de celkweekplaat te tikken, kunnen cellen worden losgemaakt.
    3. Zodra alle cellen zijn losgekomen, dooft u de dissociatie met DMEM + 10% FBS en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 350 × g .
    4. Voor de eerste uitbreiding (wanneer 80-100% confluent), opnieuw zaaien met een 1:1 splitsingsverhouding. Herhaal stap 5.1.6 en vervang de 2D-media elke 2-3 dagen.
    5. Bij de tweede expansie (80-100% confluentie) zaai je alle cellen in een schaaltje van 100 mm door de cellen opnieuw te suspenderen in 10 ml 2D-media bij 37 °C. Herhaal stap 5.1.6 en vervang de media elke 2-3 dagen.
      OPMERKING: Dit proces is tijdrovend en kan tot een volledige maand duren. Als u werkt met cellijnen met viraal geïntegreerde genen voor overexpressie van eiwitten, wordt aanbevolen om selectieantibiotica overal in de groeimedia aanwezig te houden. Als de marker een fluorescerend eiwit is, voer dan zo snel mogelijk een fluorescentie-geactiveerde celsortering uit (d.w.z. einde van de schotelexpansie van 100 mm).
  3. Cryopreservatie
    1. Voor het bewaren van deze cellen, doorgang zoals beschreven in de stappen 5.2.1-5.2.3. Resuspendeer vervolgens ~1 × 106 cellen in 1 ml 2D-vriesmedia, die is samengesteld uit 80% 2D-media, 10% FBS en 10% DMSO, en breng over naar een cryobuis. Sla de cellen op volgens stap 3.5.2.

6. Valideren van organoïde lijnen

  1. Genetisch materiaal isoleren uit organoïden
    1. Beginnend met een enkele celsuspensie, zaai twee koepels met het dubbele van de gebruikelijke celdichtheid (1 × 106 cellen/ml). Verander MOM op dag 3.
    2. Verwijder op dag 5 media, was eenmaal met PBS en voeg 350 μL voorkeurslysisbuffer rechtstreeks op de koepels toe. Breng het lysaat na 5 minuten incubatie bij RT - of totdat de BMM is opgelost - over in een buis van 1,5 ml.
    3. Bewaar het lysaat voor langdurig gebruik bij -80 °C. Ga anders verder met het protocol voor DNA- en/of RNA-extractie met behulp van de gewenste extractietechniek of een in de handel verkrijgbare kit.
  2. Immunofluorescentie (IF) kleuring
    1. Om cellen voor te bereiden, passage zoals beschreven in de stappen 3.2.1-3.2.5. Resuspendeer in een mix van 37,5 μL MOM en 112,5 μL ijskoude BMM (genoeg voor drie 50 μL domes die als biologische replicaten zullen fungeren). Volg stap 3.2.6 en wijzig media op dag 3 en dag 5.
    2. Zuig op dag 7 MOM op en was de cellen met 500 μL PBS. Bevestig elke koepel afzonderlijk door 500 μL voorverwarmde (37 °C) 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in PBS rechtstreeks op de koepel toe te voegen. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C tot BMM is opgelost.
    3. Gebruik een P1000-pipetpunt met brede boring (indien niet beschikbaar, snijd dan gewoon een gewone P1000-punt op ongeveer 0,5 cm van het fijne uiteinde), verzamel de organoïden in 4% PFA en breng het volume over in een buis van 1,5 ml.
      LET OP: Het gebruik van een standaard pipetpunt zorgt ervoor dat organoïden breken.
    4. Wacht 2 tot 3 minuten totdat de organoïden naar de bodem van de buis zijn gezakt. Aspireer 4% PFA (terwijl er een veilige hoeveelheid volume overblijft om geen organoïden aan te zuigen) en voeg 500 μL PBS toe om de organoïden te wassen. Herhaal deze stap nog twee keer, voor een totaal van 3 wasbeurten.
      OPMERKING: Wachten tot de organoïden naar de bodem zinken, heeft de voorkeur boven centrifugeren om de organoïde vorm te behouden.
    5. Voor langdurige bewaring (4-6 weken) organoïden in PBS bewaren bij 4 °C. Om door te gaan met kleuren, permeabiliseren met PBS + 1% Triton-X gedurende 30 minuten bij RT. Eenmaal wassen met PBS.
    6. Blokkeer met PBS + 0,2 % Triton-X + 4% FBS + 1% muizenserum gedurende 60 minuten bij RT. Was eenmaal met PBS en laat 100 μL volume in de tube.
    7. Bereid de werkbuffer voor op antilichaamkleuring: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% rattenserum. Deze buffer werkt voor zowel primaire als secundaire antilichamen.
    8. Om de primaire antilichaamkleuring te bereiden, berekent u de verdunning die twee keer zo geconcentreerd is als de werkelijke verdunning die nodig is. Bereid voldoende oplossing voor om 100 μl antilichaam toe te voegen aan de 100 μl PBS die in elke buis achterblijft. Bijvoorbeeld, voor een oorspronkelijke verdunning van 1:1000, bereid 100 μL 1:500 oplossing.
    9. Incubeer een nacht bij 4 °C. Was daarna drie keer met 500 μL PBS.
    10. Bereid de secundaire antilichaamkleuring voor zoals uitgelegd in stap 6.2.8. Incubeer gedurende 1 uur bij RT.
      OPMERKING: Zorg er vanaf deze stap voor dat u het werkgebied afdekt met aluminiumfolie/voorkeursdonkere doos om fotobleken van de fluorescerende antilichamen te voorkomen.
    11. Nadat de secundaire kleuring is afgelopen, wordt driemaal gewassen met 500 μL PBS. Verwijder na de laatste wasbeurt zoveel mogelijk vloeistof uit de tube om het monster klaar te maken voor montage. Gebruik een pipet van 20 μl om te voorkomen dat de organoïden worden opgezogen.
    12. Voeg met behulp van een brede of gesneden pipetpunt 20 μL montagemedia naar keuze toe en homogeniseer de oplossing goed, terwijl u luchtbellen vermijdt.
    13. Plaats een druppel organoïden in montageoplossing op een rechthoekig dekglaasje. Plaats met een tang een cirkelvormig dekglaasje op de druppel, vermijd luchtbellen, en laat het een nacht in het donker drogen bij RT. Herhaal deze stap op hetzelfde glaasje als er meer dan één monster per objectglaasje moet worden geplaatst.
    14. Voeg nog eens 20 μL montagemedia toe direct bovenop de ronde afdekplaat. Maak nu een montage-"sandwich" door het rechthoekige dekglaasje 180° om te draaien en op het microscoopglaasje te plaatsen. Laat minstens 8 uur in het donker drogen bij RT.
      OPMERKING: Het objectglaasje moet van onder naar boven in de volgende volgorde staan: microscoopglaasje, cirkelvormig afdekglaasje, organoïden, rechthoekig afdekplaatje. Dit zorgt voor optimale beeldvormingsomstandigheden.

7. Ontwikkeling van tumormodellen bij muizen

  1. Cellen voorbereiden
    1. Ontdooi een flesje met 2D-cellen naar keuze in 2D-media. Laat deze cellen groeien en uitzetten tot een plaat van 150 mm. Als de cellen antibioticaselectiemarkers hebben, selecteer dan vóór de injectie op cellen om een zuivere populatie van de gewenste cellen te garanderen.
    2. Voor 5 muizeninjecties worden de cellen uitgebreid tot twee platen van 150 mm. Wanneer de platen voor 80% samenvloeien, oogst u de cellen door de stappen 5.2.2-5.2.3 te volgen. Resuspendeer cellen in 1 ml Opti-MEM I Reduced Serum medium en meet de celconcentratie.
      OPMERKING: Elke injectie bevat 4 × 106 cellen; Het wordt echter aanbevolen om u voor te bereiden op een extra injectie om rekening te houden met het dode volume van de spuiten. Bereid in dit geval 24 × 106 cellen voor in plaats van 20 × 106 cellen.
    3. Plaats het volledige celvolume voor alle injecties in een tube van 1,5 ml. Bereid in totaal 44 μL per injectie, bestaande uit 1 deel cellen in niet-gesupplementeerde Opti-MEM I en 1 deel ijskoude BMM. Bijvoorbeeld, voor 24 × 106 cellen (6 injecties), resuspenderen in 132 μl Opti-MEM I en 132 μl BMM.
    4. Meng de cellen grondig en blijf op ijs liggen totdat de injectie wordt uitgevoerd.
  2. Voorbereiding op de procedure
    1. Verwijder luchtbellen uit het dode volume van de spuit (U-100 insuline 28 G) met koude PBS.
    2. Gebruik de cellen in de buis van 1,5 ml om vijf injecties van 40 μl te bereiden door de spuit langzaam te laden om te voorkomen dat de cellen lyseren als gevolg van schuifkrachten in de naald. Blijf op ijs liggen totdat de muizen verdoofd zijn.
    3. Zodra alles is voorbereid op injecties, plaatst u de spuiten naast de verwarmingslamp zodat de BMM kan opwarmen en stroperig kan worden, waardoor injectie en implantatie worden vergemakkelijkt. Plaats ze niet direct onder de verwarmingslamp, omdat te gestold BMM niet op de juiste manier door de spuit gaat. Werk over het algemeen snel om dit te voorkomen.
  3. Intrabursale injectie (IBI) in de eierstok
    1. Verdoof een C57BL/6J-muis met ketamine (100 mg/ml). Dien 0,1 ml per 10 g lichaamsgewicht toe via intraperitoneale injectie.
      OPMERKING: Jonge vrouwelijke muizen hebben vaak slechts 0,2 ml injecties nodig, maar kunnen meer nodig hebben als ze ouder zijn. Dit zorgt voor anesthesie voor een duur van 20-40 minuten, maar biedt geen analgesie.
    2. Plaats de muis in een kooi die is opgewarmd door de verwarmingslamp.
      OPMERKING: Plaats muizen niet direct onder de verwarmingslamp, omdat dit staartnecrose en hyperthermie kan veroorzaken, wat dodelijk kan zijn.
    3. Zodra de eerste muis volledig is verdoofd, snijdt u met behulp van een aseptische techniek een incisie van <1 cm langs de flank van een C57BL/6J-muis in de buikstreek en boven de dij. Zorg ervoor dat u door de epidermis en hypodermis gaat voordat u de bursa-regio bereikt.
    4. Trek de eierstok voorzichtig naar buiten (gemakkelijk te vinden door het vetkussentje dat eraan is bevestigd). Neem een van de voorbereide spuiten en injecteer de cellen langzaam door het vetkussentje direct achter de eierstok, door de eierstok zelf, in de eileiderzak.
      OPMERKING: Bij een succesvolle injectie wordt de ballon van de eileiderzak met BMM gezien. Het mengsel zal waarschijnlijk ook over het hele vetkussen lekken, wat normaal is.
    5. Plaats de eierstok voorzichtig terug in de slijmbeurs en sluit de incisie met chirurgische nietjes of door te naaien.
    6. Plaats de muis terug in de kooi. Gebruik een verwarmingslamp om muizen warm te houden terwijl ze na de operatie herstellen tot ze half bewusteloos zijn (>15 min). Controleer de volgende dag de muis om te controleren of er 's nachts geen sepsis is opgetreden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schema dat de workflow voor het genereren en valideren van HGSOC-eierstokkanker samenvat, wordt weergegeven in figuur 1. Dit proces begint met de extractie van eileiderweefsel van een vrouwelijke C57BL/6J wildtype muis (Figuur 2A). Het wordt aanbevolen om te beginnen met een royaal stuk weefsel om een goede verzameling te garanderen. Het gebruik van een dissectiemicroscoop maakt het mogelijk om de distale eileider nauwkeurig...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in oncologisch onderzoek, blijft HGSOC de meest agressieve vorm van gynaecologische maligniteit en de belangrijkste doodsoorzaak onder alle eierstokkankers23,24. Naarmate het gynaecologische oncologische onderzoek is geëvolueerd, moeten ook de modellen die erin worden gebruikt evolueren. Er is inderdaad ontdekt dat veel historische modelcellijnen voor eierstokkanker om verschillende redenen subopt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R01(CA257507). De schema's voor de figuren zijn gemaakt met behulp van BioRender. We willen Dr. Benjamin Neel bedanken voor zijn steun tijdens dit project, Dr. Shuang Zhang voor de ontwikkeling van het originele protocol en Dr. Kiyomi Araki voor haar hulp bij het optimaliseren ervan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS zonder Calcium, Magnesium en Natrium BicarbonaatCorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
Advanced DMEM/F12Gibco12-634-028
Aged C57BL/6J (vrouwelijk)The Jackson Laboratory000664
AllPrep DNA/RNA Mini KitQIAGEN80204Voor DNA/RNA extractie
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Integrated DNA Technologies10008100
Anti-Ki67 antilichaamAbcamab15580
AutoClip SystemFine Science Tools12020-00Voor wondsluiting post-IBI
B-27 Supplement (50x), serumvrijGibco17-504-001
Blasticidin HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenant-bl-05
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393Om cellen te lyzeren voor DNA/RNA extractie
Cell Recovery SolutionCorning354253
Collagenase/HyaluronidaseSTEMCELL Technologies07912
CoraLite 594-Phalloidin (rood)ProteintechPF00003
Dekselglas 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Dekselglas 24 mm ´ 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
CTS (Cell Therapy Systems) N-2 SupplementGibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Deoxyribonuclease I (DNAse I) uit runderspeekselSigma AldrichD5025
Difco Skim MilkBecton Dickinson232100
DispaseSTEMCELL Technologies07913
DMEM met L-Glutamine, 4,5 g/L Glucose en Sodium PyruvaatCorning10013CV
DNase I recombinant, RNase-vrijRoche04716728001
Dulbecco's Phosphate-Buffered SolutionSigma AldrichD8537
Dumont #5 - Keramisch Gecoate PincettenFine Science Tools11252-50Voor dissectie van de eileider
Foetaal RunderserumCorning35-010-CVVerhit inactief op 56 °C gedurende 60 min.
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09Voor verzameling eileider en IBI-snede
Geneticin Selectief Antibioticum (G418 Sulfaat) (50 mg/mL)Gibco10131027
GlutaMAX Supplement (100x)Gibco35-050-061
Geit anti-Konijn IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Cyanine3InvitrogenA10520
Graefe PincettenFine Science Tools11053-10Voor weefselbehandeling
HEPES bufferCorning25060CI
Humaan R-Spondin 1 Recombinant EiwitPeproTech120-38
Insulinenaald, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")BDBD329461
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matrigel GFR Basal Membraan MatrixCorning356231BMM
Muis EGF Recombinant EiwitPeproTech315-09
Muis FGF-basic Recombinant EiwitPeproTech450-33
Muis Noggin Recombinant EiwitPeproTech250-38
Muis Wnt-3a Recombinant EiwitPeproTech315-20
N2 SupplementGibco17502048
N-acetylcysteïne amideSigma AldrichA0737
Neon NxT ElectroporatiesysteemInvitrogenNEON1SVoor CRISPR-Cas9 electroporatie
Neon NxT Electroporatiesysteem 10-μL Kit met 1-kanaalsbuizenInvitrogenN1025Consumables voor electroporatie, inclusief genoombewerkingsbuffer
NicotinamideSigma AldrichN3376
Normaal Muis SerumInvitrogen10410
Normaal Rat SerumSTEMCELL Technologies13551
Opti-MEM I Reduced Serum MediumGibco31985070
PAX8 Polyklonaal antilichaamProteintech10336-1-AP
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromycinSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm ´ 75 mm ´ 1,0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Fisher BioreagentsBP151
TrypLE Express Enzym (1x), zonder fenol roodGibco12-604-013
Vannas Spring Scissors - 4 mm SnijrandFine Science Tools15019-10Voor dissectie van de eileider
Y27632STEMCELL Technologies72304Rho-kinase (ROCK) Remmer 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Eileider organo denmuistumormodelorgano dekweekgenetische modificatieCRISPR Cas9 deletielentivirale overexpressieinteractie met het immuunsysteeminjectie in de bursaovaria

Gerelateerde artikelen