Een geverifieerde workflow voor MiRNA-Seq-gegevensverwerking en bio-informatica-analyse met behulp van R

Summary

Hier presenteren we een protocol om miRNA-Seq-gegevens te analyseren met behulp van R. De workflow stelt onderzoekers in staat om miRNA-gereguleerde netwerken en hun betekenis in diverse biologische en klinische vragen te verkennen. Dit werk is bedoeld als een praktische gids voor zowel beginnende als ervaren onderzoekers op het gebied van miRNA-bio-informatica.

Abstract

MicroRNA's (miRNA's) zijn kritische post-transcriptionele regulatoren die een breed scala aan fysiologische en pathologische processen beïnvloeden. Met de vooruitgang van high-throughput sequencing-technologieën is miRNA-Seq naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het profileren van miRNA-expressiepatronen. Een betrouwbare interpretatie van dergelijke gegevens vereist echter een gestandaardiseerde en reproduceerbare analysepijplijn. Hier presenteren we een geverifieerde workflow voor miRNA-Seq-gegevensverwerking en bio-informatica-analyse met behulp van R. Dit protocol omvat alle essentiële stappen, waaronder voorverwerking van onbewerkte gegevens, kwaliteitscontrole, uitlijning, kwantificering, normalisatie, differentiële expressieanalyse, doelvoorspelling, functionele verrijking en regelgevende netwerkconstructie. De workflow is ontworpen voor flexibiliteit en transparantie, integreert algemeen aanvaarde R-pakketten en ondersteunt soortspecifieke annotatie en modulaire aanpassing. Bovendien worden gebruikers begeleid bij het uitvoeren van stroomafwaartse biologische interpretatie door gebruik te maken van samengestelde databases en visualisatietools zoals Cytoscape. Dit protocol ondersteunt niet alleen robuuste statistische analyse, maar biedt ook zinvolle inzichten in miRNA-mRNA-interacties en hun rol in ziektemechanismen. Het is bijzonder geschikt voor zowel beginnende als ervaren onderzoekers die miRNA-biomarkerontdekking, ziektemodellering of integratieve multi-omics-studies uitvoeren.

Introduction

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende RNA-moleculen die de genexpressie aanzienlijk beïnvloeden door in te werken in de post-transcriptionele fase¹. Ze functioneren doorgaans door te binden aan complementaire sequenties in de 3' niet-getransleerde regio's (UTR's) van doelboodschapper-RNA's (mRNA's), wat leidt tot mRNA-degradatie of translationele onderdrukking¹. In de afgelopen twee decennia zijn miRNA's steeds meer erkend als centrale regulatoren van verschillende biologische processen, waaronder celproliferatie, differentiatie, apoptose, immuunresponsen en orgaanontwikkeling

Protocol

OPMERKING: Materialen met softwarekoppelingen worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereid RNA-monsters en sequentiebibliotheken voor

OPMERKING: Voer RNA-extractie en -sequencing uit buiten deze computationele workflow. Er is meer dan één manier om miRNA-sequencinggegevens te analyseren. Dit gedeelte biedt de context van een practicum.

1. Extraheer totaal RNA: Extraheer totaal RNA uit de biologische monsters met behulp van een kit die is geoptimaliseerd voor kleine RNA-isolatie (bijv. miRNA-isolatiekit). Volg het protocol van de fabrik....

Results

We hebben de microRNA-expressiematrix van GSE133530 gedownload en rechtstreeks differentiële expressieanalyse uitgevoerd. We hebben een voorbeeld van een analytisch R-script gegeven voor de gegevensset in aanvullend bestand 1. De dataset voerde globale miRNA-profilering uit op 16 niercysten van verschillende groottes (minimale cysten: minder dan 1-5 ml, n = 10; middelgrote cysten: tussen 10-25 ml, n = 4; grote cysten: groter dan 50 ml, n .......

Discussion

De analyse van miRNA-Seq-gegevens brengt duidelijke uitdagingen met zich mee vanwege de kleine omvang en redundantie van de lezingen, waardoor strenge kwaliteitscontrole en voorverwerking van cruciaal belang zijn. Een van de belangrijkste stappen in de workflow is het bijsnijden van adapters. Omdat miRNA's ongeveer 22 nucleotiden lang zijn, kunnen adaptersequenties de lezingen gemakkelijk domineren als ze niet op de juiste manier worden verwijderd. Het niet nauwkeurig trimmen kan leiden .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Human miRNA Microarray	Agilent	/	Een commercieel array voor het profileren van microRNA's van menselijke monsters
Bowtie	Johns Hopkins University	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Een softwaretool voor het uitlijnen van sequencing-reads op lange referentiesequenties
clusterProfiler (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Een R-pakket ontworpen voor functionele verrijkingsanalyse en visualisatie van hoogdoorvoer biologische gegevens.
Cutadapt	Open Source	https://cutadapt.readthedocs.io	Een opdrachtregeltool die adaptersequenties, primers, poly-A-staarten en andere ongewenste fragmenten verwijdert uit hoogdoorvoer sequencing-reads.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Een open-source softwareplatform ontworpen voor de visualisatie en analyse van complexe biologische netwerken.
DESeq2 (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Een R-pakket ontworpen voor differentiële genexpressieanalyse van telldata
EnhancedVolcano (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Een R-pakket ontworpen om publicatiekwaliteit vulkaanplots te maken.
FastQC	Babraham Bioinformatics	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Een open-source kwaliteitscontroletool voor hoogdoorvoer sequencinggegevens.
featureCounts	Subread / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Een programma dat wordt gebruikt voor het tellen van reads die op genomische kenmerken zijn toegewezen
HTSeq-count	Python-pakket	https://htseq.readthedocs.io	Een opdrachtregeltool die telt hoeveel gealigneerde hoogdoorvoer sequencing-reads overlappen genomische kenmerken zoals genen of exons. I
Illumina Human v2 MicroRNA expression beadchip	Illumina	/	Een commercieel array voor het profileren van microRNA's van menselijke monsters
multiMiR (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Een R-pakket dat de grootste geïntegreerde verzameling van geïmpliceerde en experimenteel gevalideerde microRNA-target interacties biedt, samen met hun associaties met ziekten en geneesmiddelen.
org.Hs.eg.db (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Een annotatiepakket ontworpen voor menselijke (Homo sapiens) genoomonderzoek.
R Software	R Project	https://www.r-project.org/	Een open-source project voor statistische computing
Rstudio	Posit PBC	/	Een geïntegreerde ontwikkelomgeving helpt om productiever te zijn met R en Python
SAMtools	Open Source	http://www.htslib.org/	Een softwarepakket voor het manipuleren van next-generation sequencing (NGS) data.