Een geverifieerde workflow voor MiRNA-Seq-gegevensverwerking en bio-informatica-analyse met behulp van R

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om miRNA-Seq-gegevens te analyseren met behulp van R. De workflow stelt onderzoekers in staat om miRNA-gereguleerde netwerken en hun betekenis in diverse biologische en klinische vragen te verkennen. Dit werk is bedoeld als een praktische gids voor zowel beginnende als ervaren onderzoekers op het gebied van miRNA-bio-informatica.

Samenvatting

MicroRNA's (miRNA's) zijn kritische post-transcriptionele regulatoren die een breed scala aan fysiologische en pathologische processen beïnvloeden. Met de vooruitgang van high-throughput sequencing-technologieën is miRNA-Seq naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het profileren van miRNA-expressiepatronen. Een betrouwbare interpretatie van dergelijke gegevens vereist echter een gestandaardiseerde en reproduceerbare analysepijplijn. Hier presenteren we een geverifieerde workflow voor miRNA-Seq-gegevensverwerking en bio-informatica-analyse met behulp van R. Dit protocol omvat alle essentiële stappen, waaronder voorverwerking van onbewerkte gegevens, kwaliteitscontrole, uitlijning, kwantificering, normalisatie, differentiële expressieanalyse, doelvoorspelling, functionele verrijking en regelgevende netwerkconstructie. De workflow is ontworpen voor flexibiliteit en transparantie, integreert algemeen aanvaarde R-pakketten en ondersteunt soortspecifieke annotatie en modulaire aanpassing. Bovendien worden gebruikers begeleid bij het uitvoeren van stroomafwaartse biologische interpretatie door gebruik te maken van samengestelde databases en visualisatietools zoals Cytoscape. Dit protocol ondersteunt niet alleen robuuste statistische analyse, maar biedt ook zinvolle inzichten in miRNA-mRNA-interacties en hun rol in ziektemechanismen. Het is bijzonder geschikt voor zowel beginnende als ervaren onderzoekers die miRNA-biomarkerontdekking, ziektemodellering of integratieve multi-omics-studies uitvoeren.

Inleiding

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende RNA-moleculen die de genexpressie aanzienlijk beïnvloeden door in te werken in de post-transcriptionele fase¹. Ze functioneren doorgaans door te binden aan complementaire sequenties in de 3' niet-getransleerde regio's (UTR's) van doelboodschapper-RNA's (mRNA's), wat leidt tot mRNA-degradatie of translationele onderdrukking¹. In de afgelopen twee decennia zijn miRNA's steeds meer erkend als centrale regulatoren van verschillende biologische processen, waaronder celproliferatie, differentiatie, apoptose, immuunresponsen en orgaanontwikkeling². Bovendien is ontregeling van miRNA-expressie betrokken bij de pathogenese van tal van ziekten, zoals kanker, hart- en vaatziekten, neurologische aandoeningen en nieraandoeningen³. Deze bevindingen benadrukken het potentieel van miRNA's, niet alleen als therapeutische doelen, maar ook als minimaal invasieve biomarkers in klinische diagnostiek.

Met de komst van next-generation sequencing (NGS) -technologieën is de studie van miRNA's een nieuw tijdperk ingegaan. In tegenstelling tot op microarray gebaseerde methoden die beperkt zijn tot bekende miRNA's, maakt miRNA-sequencing (miRNA-Seq) uitgebreide, high-throughput en onbevooroordeelde profilering mogelijk van zowel bekende als nieuwe miRNA's in verschillende monstertypes en omstandigheden⁴. miRNA-Seq biedt superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en dynamisch bereik, waardoor het een voorkeursmethode is voor het onderzoeken van miRNA-expressiepatronen en het ontdekken van regulerende mechanismen in fysiologische en pathologische omgevingen⁵. De analyse van miRNA-Seq-gegevens brengt echter specifieke computationele uitdagingen met zich mee, waaronder het omgaan met korte leeslengtes, het verwijderen van adaptersequenties, het maken van onderscheid tussen nauw verwante miRNA-familieleden en het beheren van hoge redundantie in het aantal gelezen^{lezen 6}. Deze kenmerken vereisen een zorgvuldig ontworpen en gestandaardiseerde analytische workflow.

Hoewel er verschillende pijplijnen en softwaretools zijn ontwikkeld voor miRNA-Seq-gegevensanalyse, vertrouwen veel daarvan op grafische gebruikersinterfaces of vaste workflows die de flexibiliteit en reproduceerbaarheid beperken⁷. De R-programmeeromgeving biedt daarentegen een krachtig en aanpasbaar platform voor bio-informaticaanalyse⁸. R biedt een rijk ecosysteem van pakketten voor statistische modellering, datavisualisatie en integratie met biologische databases. Dit stelt gebruikers in staat om uitgebreide en reproduceerbare analyses uit te voeren op een transparante en op scripts gebaseerde manier. Bovendien stelt het modulaire karakter van R-workflows onderzoekers in staat om elke stap aan te passen aan specifieke experimentele vereisten, van voorverwerking van onbewerkte gegevens tot functionele interpretatie.

In dit protocol presenteren we een geverifieerde en volledige miRNA-Seq-analyseworkflow die volledig in R is geïmplementeerd, met als doel een reproduceerbare en door de gebruiker aanpasbare oplossing te bieden voor onderzoekers die werken met miRNA-expressiegegevens. De workflow begint met kwaliteitscontrole en het bijsnijden van adapters van onbewerkte sequencing-lezingen, gevolgd door uitlijning met een referentiegenoom of bekende miRNA-sequenties. Daaropvolgende stappen omvatten kwantificering van het aantal gelezen bestanden, normalisatie, differentiële expressieanalyse, voorspelling van doelgenen, functionele verrijking en netwerkvisualisatie. De workflow omvat verschillende veelgebruikte en goed onderhouden R-pakketten, waardoor zowel de betrouwbaarheid als de compatibiliteit met toekomstige updates en uitbreidingen worden gegarandeerd.

Een van de belangrijkste sterke punten van dit protocol ligt in het vermogen om verder te gaan dan differentiële expressieresultaten en een zinvolle biologische interpretatie te bieden. Door samengestelde databases van gevalideerde en voorspelde miRNA-mRNA-interacties te integreren, stelt de workflow gebruikers in staat om biologisch relevante doelgenen te identificeren. Deze doelen kunnen vervolgens worden onderworpen aan genontologie en routeverrijkingsanalyses om aangetaste biologische processen en moleculaire routes aan het licht te brengen. In de laatste stap kunnen miRNA-mRNA-interactienetwerken worden gevisualiseerd met behulp van externe tools zoals Cytoscape⁹, waardoor inzicht wordt verkregen in het regelgevingslandschap en belangrijke hub-miRNA's met potentieel functioneel belang worden geïdentificeerd.

Deze methode is met succes toegepast in klinische onderzoekscontexten, waaronder studies naar nierziekte, waarbij circulerende miRNA's dienen als veelbelovende biomarkers voor diagnose en prognose¹⁰. Het modulaire en flexibele ontwerp van de workflow maakt het echter geschikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder ziektemodellering, onderzoek naar geneesmiddelrespons, ontwikkelingsbiologie en vergelijkende genomica. Onderzoekers kunnen de workflow eenvoudig aanpassen aan soortspecifieke annotaties, experimentele omstandigheden of extra lagen omics-gegevens.

Door een open-source, op scripts gebaseerde oplossing aan te bieden, pakt deze R-gecentreerde pijplijn een aantal van de belangrijkste beperkingen aan die verband houden met bestaande miRNA-Seq-tools, waaronder beperkte aanpassing, afhankelijkheid van niet-transparante grafische interfaces, gebrek aan ondersteuning voor niet-modelorganismen, slechte reproduceerbaarheid door de afwezigheid van versiebeheer en moeilijkheid bij integratie met downstream statistische en functionele analysekaders. Het maakt volledige controle over de parameters van de gegevensverwerking mogelijk, stimuleert de reproduceerbaarheid door middel van versiegecontroleerde code en bevordert de transparantie in bio-informaticaonderzoek. Naarmate het belang van miRNA's blijft groeien in de context van systeembiologie en translationele geneeskunde, wordt toegang tot een betrouwbaar en aanpasbaar analysekader steeds belangrijker.

Protocol

OPMERKING: Materialen met softwarekoppelingen worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereid RNA-monsters en sequentiebibliotheken voor

OPMERKING: Voer RNA-extractie en -sequencing uit buiten deze computationele workflow. Er is meer dan één manier om miRNA-sequencinggegevens te analyseren. Dit gedeelte biedt de context van een practicum.

1. Extraheer totaal RNA: Extraheer totaal RNA uit de biologische monsters met behulp van een kit die is geoptimaliseerd voor kleine RNA-isolatie (bijv. miRNA-isolatiekit). Volg het protocol van de fabrikant zorgvuldig. Zorg ervoor dat u RNase-vrije verbruiksartikelen gebruikt en bewaar monsters op ijs om degradatie te minimaliseren.
2. Beoordeel de integriteit en kwantiteit van het RNA: Voer 1-2 μL van het geëxtraheerde RNA uit op een bioanalyzer of gelijkwaardig apparaat. Controleer het RNA-integriteitsnummer (RIN) en zorg ervoor dat het ≥ 7.0 is voor betrouwbare sequencing. Registreer de concentratie met behulp van een spectrofotometer of fluorometer.
3. Bouw kleine RNA-bibliotheken: Bereid sequencingbibliotheken voor van 1 μg totaal RNA met behulp van een commerciële kleine RNA-seq-bibliotheekvoorbereidingskit. Volg het kitprotocol om adapters te ligateren, reverse te transcriberen en het cDNA te amplificeren. Zuiver de PCR-producten met grootteselectie (bijv. 18-30 nt insert) om te verrijken voor miRNA-fragmenten.
4. Sequentiebibliotheken: Laad de bibliotheken op een sequencingplatform met hoge doorvoer. Stel de run-configuratie in voor single-end sequencing met een leeslengte van ~50 bp. Zorg ervoor dat elk monster ongeveer 10 miljoen onbewerkte lezingen genereert om voldoende diepte te bereiken.
5. Exporteer sequencing-uitvoer: Exporteer na de sequencing de onbewerkte gegevens als FASTQ-bestanden met behulp van de gegevensuitvoersoftware van het instrument. Controleer of de uitvoermap zowel de leesreeks als de bijbehorende bestanden met kwaliteitsscores bevat. Sla de FASTQ-bestanden op in een gestructureerde map voor downstream-analyse.

2. Verwerk onbewerkte lezingen voor en voer kwaliteitscontrole uit

1. Sequenties van adapters bijsnijden
   1. Installeer en configureer Cutadapt of fastp.
   2. Voer het bijsnijden van de adapter uit op elk FASTQ-bestand met de volgende opdracht:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      OPMERKING: De adaptervolgorde die na '-a' wordt gevolgd, moet van toepassing zijn op de specifieke voorbereidingskit voor de sRNA-bibliotheek. '-o' definieert de bestandsnaam van de uitvoer met het invoerbestand erachter.
2. Beoordeel de leeskwaliteit
   1. Gebruik FastQC om kwaliteitscontrolerapporten te genereren:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Kwaliteitsscores per basis, leeslengteverdeling en adaptervervuiling bekijken: Open het FastQC HTML-rapport dat voor elk FASTQ-bestand is gegenereerd in een webbrowser. Onderzoek stap voor stap de volgende modules:
      1. Kwaliteit van de sequentie per base: Zorg ervoor dat de meeste honken binnen de groene zone vallen (Phred-score ≥30). Zoek naar een kwaliteitsverlies aan het 3-inch uiteinde dat kan duiden op volgordefouten.
      2. Leeslengteverdeling: Controleer of de verdeling overeenkomt met de verwachte insertgrootte (bijv. 18-30 nt voor miRNA's). Controleer of er geen onverwachte pieken zijn.
      3. Inhoud van de adapter: controleer of de adaptersequenties effectief zijn bijgesneden. Controleer of het vervuilingspercentage van de adapter na het bijsnijden bijna nul is.
   3. Sla het FastQC-overzichtsrapport op en markeer alle monsters met statistieken van slechte kwaliteit voor opnieuw bijsnijden of uitsluiting van verdere analyse.

3. Kaart leest en genereer telmatrices

1. Uitlijnen leest naar referentie
   1. Download het FASTA-bestand van het referentiegenoom of rijpe miRNA-sequenties (bijv. van miRBase)¹¹. Voorbeeld:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Indexeer het referentiegenoom met behulp van Bowtie.
      1. Open een terminal en voer de volgende opdracht uit om de index op te bouwen:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. Vervang reference.fa door de werkelijke FASTA-bestandsnaam.
      3. Vervang reference_index door het gewenste voorvoegsel voor de index.
      4. Zorg ervoor dat Bowtie meerdere indexbestanden genereert (bijv. .ebwt). Controleer of deze bestanden aanwezig zijn in de werkmap, aangezien ze nodig zijn voor de uitlijning.
   3. Lijn lezingen uit met behulp van Bowtie met geschikte parameters voor korte lezingen. Voorbeeld:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      OPMERKING: Het invoerbestand is trimmed_reads.fastq en het uitvoerbestand is aligned_reads.sam. '-V 0' betekent dat we geen fouten toestaan in de hele lezing. '-a -best -strata' betekent dat we elke uitlijning weggooien die meer mismatches heeft dan de beste.
2. Kwantificeer miRNA-expressie
   1. Converteer SAM-bestanden naar BAM-formaat met behulp van SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      OPMERKING: Het invoerbestand aligned_reads.sam is het resultaat van de laatste opdracht. Het uitvoerbestand aligned_reads.bam wordt voorbereid voor latere analyse.
      1. Gebruik SAMtools om het uitlijningsbestand te comprimeren en te sorteren:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. Zorg ervoor dat de eerste opdracht het SAM-bestand converteert naar BAM-indeling.
      3. Zorg ervoor dat de tweede opdracht het BAM-bestand sorteert op genomische coördinaten.
      4. Zorg ervoor dat de derde opdracht een indexbestand (.bai) genereert, dat nodig is voor downstream-analyses.
      5. Controleer of zowel het gesorteerde BAM-bestand als de index zijn gemaakt voordat u doorgaat met kwantificeren.
   2. Gebruik featureCounts of HTSeq-count om een telmatrix te genereren met behulp van miRNA-annotatie GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      OPMERKING: featureCounts kwantificeert het lezen in het invoerbestand aligned_reads.bam op basis van miRNA.gtf en voert counts.txt uit.

4. Voer differentiële expressieanalyse uit in R

1. Gegevens over het aantal belastingen
   1. Importeer de telmatrix en voorbeeldmetagegevens in R:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      OPMERKING: Telgegevens (counts.csv) en groep monsters (metadata.csv) moeten aan DESeq2 worden verstrekt. 'Voorwaarde' verduidelijkt hier de groep verstrekte monsters. Voor individuele vereisten, zie de handleiding van DESeq2¹².
2. Gegevens normaliseren en transformeren
   1. Normaliseer telgegevens met behulp van de standaardmethode van DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Variantiestabiliserende transformatie uitvoeren:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. Visualiseer voorbeeldclustering met behulp van PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Identificeer differentieel tot expressie gebrachte miRNA's
   1. Extraheer en sorteer differentiële expressieresultaten:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      OPMERKING: We herschikken het resultatenbestand 'res' op basis van de waarde van pvalue.
      summary(res)
   2. Filter op significant differentieel tot expressie gebrachte miRNA's (p-waarde < 0,05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      OPMERKING: Er zijn meerdere drempels voor het filteren van significant veranderde miRNA's. De eisen 'p-waarde < 0,05, |log2FC| > 1' worden veel toegepast. De drempels kunnen worden aangepast voor individuele gegevens.
4. Veranderingen in expressies visualiseren
   1. Installeer en laad het EnhancedVolcano-pakket.
   2. Maak het vulkaanplot:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. Voorspel doelgenen van miRNA's

1. Databases opvragen
   1. Gebruik online bronnen zoals TargetScan, miRDB en miRTarBase om naar specifiek microRNA te zoeken en doelgenen op te halen.
   2. Richt u op experimenteel gevalideerde doelen voor meer zelfvertrouwen.
2. Automatiseer voorspelling in R
   1. Laad het multiMiR-pakket en voer gevalideerde doelen op:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      OPMERKING: Hier nemen we bijvoorbeeld "has-miR-21-5p" en krijgen we gevalideerde doelen.
   2. Extraheer unieke doelgensymbolen voor verrijkingsanalyse:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. Voer een functionele verrijkingsanalyse uit

1. Voer GO-verrijking uit
   1. Gereedschap voor belastingverrijking:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      OPMERKING: Hier laden we een database met annotaties van het menselijk genoom, die nuttig zijn voor het converteren van gemeenschappelijke genidentificaties.
   2. Voer GO-verrijkingsanalyse uit voor biologische processen:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      OPMERKING: Voor het gebruik van enrichGO geven we een lijst van genen en verduidelijken we dat ze hier als 'SYMBOOL' worden aangeduid. We voerden een biologische procesverrijking uit, die overeenkomt met parameter 'ont ="BP" '. We voeren meervoudige testcorrecties uit, dus we duiden pAdjustMethod = "BH" aan. Voor een significante drempelwaarde kiezen we pvalueCutoff = 0.05.dotplot om een gevisualiseerd resultaat te presenteren. Raadpleeg voor meer individuele opties de handleiding van clusterProfiler¹³.
2. Voer KEGG-routeverrijking uit
   1. Voer KEGG-verrijking uit:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      OPMERKING: Voor het gebruik van enrichKEGG geven we een lijst met genen en verduidelijken we het organisme als menselijk ("heeft"). dotplot presenteert een gevisualiseerd resultaat. Raadpleeg voor meer individuele opties de handleiding van clusterProfiler¹³.

7. Construeren en visualiseren van miRNA - mRNA-interactienetwerk

1. Gegevens exporteren voor netwerkvisualisatie
2. Maak een dataframe van miRNA-target genparen op basis van de targets die zijn gegenereerd uit TargetScan, miRDB of miRTarBase.
3. Schrijf de netwerktabel naar CSV:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Importeren in Cytoscape
   1. Open Cytoscape en importeer de netwerktabel.
   2. Visualiseer het netwerk met behulp van een geforceerde of cirkelvormige lay-out.
   3. Analyseer topologische eigenschappen (bijv. graden centraliteit) om hub-miRNA's te identificeren.

Resultaten

We hebben de microRNA-expressiematrix van GSE133530 gedownload en rechtstreeks differentiële expressieanalyse uitgevoerd. We hebben een voorbeeld van een analytisch R-script gegeven voor de gegevensset in aanvullend bestand 1. De dataset voerde globale miRNA-profilering uit op 16 niercysten van verschillende groottes (minimale cysten: minder dan 1-5 ml, n = 10; middelgrote cysten: tussen 10-25 ml, n = 4; grote cysten: groter dan 50 ml, n ...

Discussie

De analyse van miRNA-Seq-gegevens brengt duidelijke uitdagingen met zich mee vanwege de kleine omvang en redundantie van de lezingen, waardoor strenge kwaliteitscontrole en voorverwerking van cruciaal belang zijn. Een van de belangrijkste stappen in de workflow is het bijsnijden van adapters. Omdat miRNA's ongeveer 22 nucleotiden lang zijn, kunnen adaptersequenties de lezingen gemakkelijk domineren als ze niet op de juiste manier worden verwijderd. Het niet nauwkeurig trimmen kan leiden ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agilent-021827 Human miRNA Microarray	Agilent	/	Een commercieel array voor het profileren van microRNA's van menselijke monsters
Bowtie	Johns Hopkins University	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Een softwaretool voor het uitlijnen van sequencing-reads op lange referentiesequenties
clusterProfiler (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Een R-pakket ontworpen voor functionele verrijkingsanalyse en visualisatie van hoogdoorvoer biologische gegevens.
Cutadapt	Open Source	https://cutadapt.readthedocs.io	Een opdrachtregeltool die adaptersequenties, primers, poly-A-staarten en andere ongewenste fragmenten verwijdert uit hoogdoorvoer sequencing-reads.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/	Een open-source softwareplatform ontworpen voor de visualisatie en analyse van complexe biologische netwerken.
DESeq2 (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Een R-pakket ontworpen voor differentiële genexpressieanalyse van telldata
EnhancedVolcano (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Een R-pakket ontworpen om publicatiekwaliteit vulkaanplots te maken.
FastQC	Babraham Bioinformatics	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Een open-source kwaliteitscontroletool voor hoogdoorvoer sequencinggegevens.
featureCounts	Subread / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Een programma dat wordt gebruikt voor het tellen van reads die op genomische kenmerken zijn toegewezen
HTSeq-count	Python-pakket	https://htseq.readthedocs.io	Een opdrachtregeltool die telt hoeveel gealigneerde hoogdoorvoer sequencing-reads overlappen genomische kenmerken zoals genen of exons. I
Illumina Human v2 MicroRNA expression beadchip	Illumina	/	Een commercieel array voor het profileren van microRNA's van menselijke monsters
multiMiR (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Een R-pakket dat de grootste geïntegreerde verzameling van geïmpliceerde en experimenteel gevalideerde microRNA-target interacties biedt, samen met hun associaties met ziekten en geneesmiddelen.
org.Hs.eg.db (R-pakket)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Een annotatiepakket ontworpen voor menselijke (Homo sapiens) genoomonderzoek.
R Software	R Project	https://www.r-project.org/	Een open-source project voor statistische computing
Rstudio	Posit PBC	/	Een geïntegreerde ontwikkelomgeving helpt om productiever te zijn met R en Python
SAMtools	Open Source	http://www.htslib.org/	Een softwarepakket voor het manipuleren van next-generation sequencing (NGS) data.