Methodenartikel

Op maat gemaakte 3D-geprinte mallen voor beeldvorming van zebravissen en hartontwikkeling

775 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

15 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode met behulp van een goedkope stereolithografische 3D-printer om mallen te maken om de reproduceerbare montage van zebravisembryo's voor beeldvormend onderzoek te vergemakkelijken. Met behulp van deze methode hebben we mallen gemaakt voor het in beeld brengen van cardiale morfogenese in zebravisembryo's.

Samenvatting

Het monteren van embryo's is een van de technische uitdagingen die onderzoekers tegenkomen bij het uitvoeren van een beeldvormingsproject. Embryo's moeten op een reproduceerbare manier worden georiënteerd, zodat het weefsel van belang gedurende de gehele beeldvormingsperiode toegankelijk is voor een microscoopobjectief. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, kunnen onderzoekers embryo's inbedden in viskeuze media of gespecialiseerde schalen en afgietsels maken om embryo's tijdens beeldvorming in een gewenste oriëntatie te houden. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van een goedkope stereolithografische (SLA) 3D-printer om herbruikbare mallen te vervaardigen die agaroseputjes maken waarin embryo's kunnen worden gemonteerd voor beeldvorming. Deze agaroseputjes bieden een betrouwbaar middel om meerdere embryo's te oriënteren voor beeldvorming. Deze methode omvat een ontwerpkader dat eenvoudig kan worden aangepast voor een verscheidenheid aan weefsels, organismen en beeldvormingsuitdagingen. Met behulp van deze methode hebben we mallen gemaakt voor het in beeld brengen van de hartontwikkeling in zebravissen voor zowel rechtopstaande als omgekeerde microscopen. Door gebruik te maken van materialen en apparatuur die toegankelijk zijn, kunnen onderzoekers met deze methode eenvoudig mallen maken die specifiek zijn voor hun montagebehoeften.

Inleiding

Het visualiseren van cellulaire dynamiek in een intact dier is essentieel voor het begrijpen van de pathologieën van aangeboren ziekten en de fundamentele processen van ontwikkeling en homeostase. Deze visualisatie omvat beeldvorming op meerdere ruimtelijke schalen om de fysiologische dynamiek in een heel organisme en op weefsel-, cellulair en subcellulair niveau te identificeren. De beeldvormingsmodaliteiten die worden gebruikt voor het visualiseren van cellulaire dynamica variëren van immunofluorescentiestudies van vaste monsters tot time-lapse-beeldvorming van levende exemplaren. Deze beeldvormingsmodaliteiten vereisen het intact houden van preparaten in specifieke richtingen, zodat een interessegebied toegankelijk is voor het microscoopobjectief.

Zebravisembryo's zijn een ideaal modelorganisme voor beeldvormend onderzoek vanwege hun optische transparantie, genetische traceerbaarheid, externe bevruchting en oorsprong van gewervelde dieren. Het monteren van zebravisembryo's in een specifieke oriëntatie op een consistente en reproduceerbare manier is echter een voortdurende uitdaging geweest. Montage is vooral een uitdaging voor de visualisatie van de hartontwikkeling in zebravisembryo's, omdat cardiale morfogenese in verschillende vlakken plaatsvindt1.

Er zijn meerdere benaderingen ontwikkeld om de uitdagingen van het monteren van embryo's voor beeldvorming aan te pakken. Een van de eenvoudigste methoden is het monteren van zebravisembryo's tussen twee dekglaasjes met lagen tape tussen de dekglaasjes om verplettering te voorkomen. Deze methode maakt beeldvorming mogelijk op zowel omgekeerde als rechtopstaande microscopen2. Zebravisembryo's kunnen ook worden gemonteerd in een zeer viskeus medium of gel, zoals methylcellulose of agarose met een laag smeltpunt van 0,1-0,8%, om embryo's in specifiekeoriëntaties 2,3,4 te houden. Deze low-throughput-benaderingen werken goed voor veel beeldvormingsprojecten; Het kan echter lastig zijn om de integriteit van het embryo te waarborgen en reproduceerbaar specifieke oriëntaties te verkrijgen. Om de beeldverwerkingscapaciteit te verhogen en de montage te vergemakkelijken, kunnen putten op regelmatige afstand van elkaar worden gemaakt van gestold agarose in een beeldvormingsschaal 5,6,7,8. Om het maken van deze agaroseputten te vergemakkelijken, zijn er plastic mallen gemaakt 9,10,11. Hoewel deze mallen kunnen worden toegepast op beeldvorming langs de standaard dorsale-ventrale-laterale assen10,12, zijn ze vaak gemaakt voor specifieke beeldvormingsuitdagingen, zoals voor gebruik in platen met 96 putjes13 of voor de detectie van de eerste hartslag14. In gespecialiseerde gevallen zijn volledige beeldvormingsschotels gemaakt 5,15,16. Een microfluïdische kamer (ZEBRA genaamd) gemaakt van PDMS vergemakkelijkt bijvoorbeeld zowel de beeldvorming als de blootstelling van embryo's aan chemicaliën17. Deze mallen zijn vaak gemaakt van siliconen of machinaal bewerkt uit lucite 10,18,19. De komst van relatief goedkope driedimensionale (3D) printers heeft echter de creatie van op maat gemaakte mallen gedemocratiseerd die worden gebruikt om agarose-beeldvormingsputten te maken.

3D-printen, ook wel additieve of gelaagde productie genoemd, omvat het produceren van een 3D-object op basis van een digitaal ontwerp door de opeenvolgende toevoeging en samenvoeging van afzonderlijke lagen20,21. Stereolithografie (SLA) maakt gebruik van ultraviolet (UV) licht om een lichtgevoelige vloeibare hars in opeenvolgende lagen uit te harden22. SLA-printers zijn kosteneffectief, snel en zeer nauwkeurig en kunnen worden gebruikt met een verscheidenheid aan harsen, waaronder harsen die een glad oppervlak leveren16. Het proces begint met CAD-software (Computer-Aided Design), waarbij digitale modellen van het object de novo kunnen worden ontworpen of kunnen worden aangepast op basis van reeds bestaande ontwerpen. Het digitale model wordt vervolgens virtueel in afdrukbare lagen gesneden. Met behulp van deze digitale lagen bouwt een 3D-printer het object op, laag voor laag. Hier presenteren we een methode en raamwerk voor het op maat ontwerpen en maken van beeldvormingsmatrijzen met behulp van een goedkope, in de handel verkrijgbare SLA 3D-printer. Daarnaast gebruiken we dit raamwerk om mallen te maken voor het in beeld brengen van verschillende stadia van de hartontwikkeling van zebravissen op omgekeerde of rechtopstaande microscopen en voor het afbeelden van zebravisembryo's langs hun laterale, dorsale of ventrale assen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De protocollen, experimenten en bevindingen die hier worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen voor dierenwelzijn en de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Mississippi (protocol #24-008).

Om agaroseputten in verschillende vormen te maken waarin embryo's kunnen worden georiënteerd voor beeldvorming, hebben we een ontwerp ontwikkeld dat gebruik maakt van een basis die aan pinnen is bevestigd (Figuur 1A). De vorm van deze pinnen (zie pijl die naar pinnen in paars wijst in figuur 1A) kan worden aangepast om embryo's van verschillende ontwikkelingsstadia te oriënteren en om zich op verschillende weefsels te concentreren. Hieronder beschrijven we een protocol voor het aanpassen van deze pinnen en voor het gebruik van dit systeem om agaroseputten te maken.

1. Een op maat ontworpen beeldvormende mal maken

  1. Maak een voorlopige schets van het preparaat of embryo dat in de gewenste richting is geplaatst. Houd rekening met de gewenste embryo-oriëntatie en of de te gebruiken microscoop rechtopstaande of omgekeerde objectieven bevat. Houd ook rekening met de grootte van de schaal, het aantal embryo's dat moet worden gemonteerd en de afstand ertussen.
  2. Meet de afmetingen van embryo's (bijv. lengte, breedte en hoogte) met behulp van een microscoop in combinatie met een softwaretool zoals FIJI23. Gebruik deze afmetingen om ervoor te zorgen dat de embryo's in de putjes passen die door de pinnen zijn gemaakt.
  3. Identificeer een vorm die overeenkomt met de geometrie van het embryo. Gebruik de metingen uit stap 1.2 in combinatie met een computer-aided design (CAD) software om een pin te maken die de vorm en grootte van het monster benadert.
    OPMERKING: Deze vorm kan worden gemaakt in een eenvoudig CAD-softwareprogramma door verschillende vooraf ontworpen vormen te combineren en te overlappen, of de vorm kan de novo worden gemaakt met behulp van een geavanceerd CAD-softwareprogramma. Bovendien kan men een van onze vooraf ontworpen pinnen aanpassen (zie aanvullend bestand 1). Het taps toelopen van de pin, zoals in figuur 1A, kan helpen bij het oriënteren van embryo's om ervoor te zorgen dat het weefsel van belang het dichtst bij het doel ligt.
  4. Combineer het ontwerp van de pin met het basisontwerp:
    1. Voeg in een CAD-softwareprogramma een op maat ontworpen pin toe aan een van de vooraf ontworpen basissen (aanvullend bestand 1). Dupliceer en plaats vervolgens de pinnen gelijkmatig over de basis voor beeldvorming met hoge doorvoer met behulp van de tools in een geavanceerd CAD-programma. Controleer nogmaals of alle haringen dezelfde hoogte bereiken, weg van de basis.
  5. Bereid het ontwerp voor op 3D-printen:
    1. Breng het aangepaste matrijsontwerp of een van de vooraf ontworpen matrijzen (aanvullend bestand 2) over naar een slicersoftware, die het ontwerp omzet in opdrachten voor de 3D-printer.
    2. Zorg ervoor dat u in de slicersoftware het ontwerp roteert, zodat kritieke componenten zoals de pinnen uit de buurt van de printertrap worden geplaatst. Voor de deksliphouder, die is afgedrukt op een fused deposition modeling (FDM)-printer, plaatst u de afdruk horizontaal.
      OPMERKING: Rotatie van het ontwerp voorkomt kromtrekken, wat kan gebeuren wanneer delicate onderdelen dicht bij de afdrukfase worden geplaatst.
    3. Voeg steunen toe aan de slicersoftware om ervoor te zorgen dat delicate aspecten van de mal niet breken tijdens het printen. De medium automatische plaatsing van de ondersteuning in de software, samen met handmatige curatie, zorgt voor een goede spreiding van de steunen zonder grote openingen. Een 100% infill-strategie wordt gebruikt om een solide mal te creëren.
    4. Print meerdere stukken tegelijk door ofwel een enkel STL-bestand te gebruiken dat alle mallen bevat, of door afzonderlijke STL-bestanden samen te voegen met behulp van de slicer-software.
  6. Drukkerij
    OPMERKING: SLA-printers zijn ons favoriete 3D-printertype voor de beeldvormende mallen vanwege hun haalbaarheid, precisie en het creëren van gladde oppervlakken. Een FDM-printer wordt gebruikt om de dekglaasjeshouder te maken, omdat deze lichtgewicht, stijvere afdrukken maakt dan SLA-printers.
    1. Begin met de volgende printinstellingen en optimaliseer van daaruit: 0,05 mm laaghoogte; 5 aantal onderste lagen; 2,5 s belichtingstijd; 35 s bodembelichtingstijd; 5 mm bodemlift en hefafstand; 60 mm/min snelheid van de bodemlift; 80 mm/min hefsnelheid; en 210 mm/min intreksnelheid.
      OPMERKING: De afdrukinstellingen moeten waarschijnlijk door de gebruiker worden geoptimaliseerd, aangezien deze afhankelijk zijn van het type hars, de kamertemperatuur en het printermodel.
  7. Was de mallen na het printen in water, verwijder de steunen en plaats de mallen onder UV-licht in een weefselkweekkap om ervoor te zorgen dat de hars stolt.
    OPMERKING: Het grondig wassen en uitharden van de mallen is belangrijk om te voorkomen dat de hars afbladdert en om te voorkomen dat de mal misvormd raakt.
    Handschoenen en een laboratoriumjas moeten worden gedragen bij het hanteren van niet-uitgeharde hars en het reinigen van de mallen, aangezien niet-uitgeharde hars irriterend kan zijn voor de huid. SLA-printers gebruiken UV-licht om de hars uit te harden, wat schadelijk kan zijn voor de ogen en de huid. Zorg ervoor dat de printkamer goed is omsloten en kijk niet rechtstreeks in de UV-lichtbron.

2. Een procedure voor het gebruik van 3D-geprinte mallen om agaroseputten te maken

  1. Agaroseputjes maken
    1. Maak agaroseputjes door 2% (g/ml) agarose op te lossen in E3-media (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2*2H2O, 0,161 mM MgSO4*7H2O). Plaats een vorm in het midden van een dekglaasje met de pijl naar beneden gericht naar de put (zie afbeelding 2A,B). Pipetteer 750 μL 2% gesmolten agarose/E3 langs de helft van de omtrek van de beeldvormende matrijs (zie figuur 2C).
      OPMERKING: Gesmolten agarose moet niet-stroperig zijn, maar koel genoeg om te pipetten zonder luchtbellen te creëren. We gebruiken 60 mm schotels met een 30 mm dekglaasje bodemput, terwijl voor mallen die zijn ontworpen voor rechtopstaande microscopen, een standaard 60 mm schaal kan worden gebruikt. Voor de zeefmal wordt een iets ander protocol gebruikt (zie hieronder).
    2. Pipetteer nog eens 750 μL 2% gesmolten agarose/E3 langs de andere helft van de omtrek van de beeldvormende matrijs (zie figuur 2D).
    3. Wacht 5-7 minuten totdat de agarose is gestold en observeer de overgang van een heldere vloeistof naar een ondoorzichtige blauwe gel (zie figuur 2E).
    4. Voeg een dun laagje gesmolten agarose toe rond de omtrek van de gestolde centrale agarose.
      OPMERKING: Hoewel het niet strikt vereist is, helpt deze stap om de gestolde agarose aan de schaal te verankeren en door media veroorzaakte loslating te voorkomen.
    5. Plaats de buitenste ring (aanvullende afbeelding S1B) over de agarosevorm met de pijl naar de agarose gericht (zie afbeelding 2F).
    6. Terwijl u de buitenste ring voorzichtig ingedrukt houdt, trekt u de binnenste vorm voorzichtig recht omhoog om deze los te maken van de agarose (zie afbeelding 2G).
      NOTITIE: Om te voorkomen dat de agaroseputjes breken of beschadigen, mag u de buitenring niet te hard naar beneden duwen en de binnenste vorm niet draaien of verschuiven wanneer u deze naar boven trekt.
    7. Verwijder de buitenste ring, waardoor de agaroseputjes in de bodemschaal van het dekglaasje zichtbaar worden (Figuur 2H).
    8. Inspecteer de agaroseputjes onder een microscoop om de juiste maat en productie te bevestigen.
      OPMERKING: Voor beeldvorming op een omgekeerde microscoop moet vaak een dun laagje agarose van de bodem van de put worden getild. Dit kan met een tang.
  2. Aangepast protocol voor het gebruik van de zeefmal
    1. Giet gesmolten 2% agarose/E3 in het petrischaaltje tot het ongeveer voor de helft gevuld is.
    2. Houd de vorm met de pinnen naar boven en piponeer gesmolten 2% agarose/E3 op de pinnen, totdat ze bedekt zijn (~3 ml).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd door slechts 90% van de gesmolten agarose die in de pipet is gezogen vrij te geven.
    3. Plaats met een kantelende beweging het ene uiteinde en vervolgens de hele vorm met de pinnen naar beneden in de petrischaal met gesmolten agarose (aanvullende afbeelding S2).
    4. Laat de agarose 5-7 minuten stollen.
    5. Verwijder de vorm voorzichtig door het handvat te gebruiken om het ene uiteinde en vervolgens het andere uiteinde omhoog te wrikken.

3. Montage van embryo's in agaroseputten met en zonder agarose met een lage smelttemperatuur

  1. Dechorionaat en verdovende embryo's in een tricaïneoplossing van 200 μg/ml voorafgaand aan de montage.
    OPMERKING: Een ~400 μg/ml tricaïne-oplossing is nodig om het kloppen van het hart te stoppen.
    1. Zonder agarose met een lage smelttemperatuur te gebruiken: vul de beeldvormingsschaal met 1x E3 en tricaine (200 μg/ml), voeg gedechorioneerde verdoofde embryo's toe aan de beeldvormingsschaal, gebruik een tang om embryo's in de agaroseputjes te plaatsen en te oriënteren, en vervolgens afbeelding (zie figuur 2I, J).
      OPMERKING: Omdat een tang een embryo gemakkelijk kan beschadigen, kan in plaats daarvan een embryopook worden gebruikt waarin een vislijn met een diameter van 0,41 mm in een capillaire buis of pipetpunt wordt ingebracht en met superlijm wordt vastgezet24.
    2. Met een lage smelttemperatuur agarose:
      OPMERKING: Hoewel de mallen zijn ontworpen om embryo's in specifieke richtingen te plaatsen, kan het gebruik van agarose met een lage smelttemperatuur om embryo's op hun plaats te houden ervoor zorgen dat embryo's niet drijven tijdens beeldvorming of tijdens het transporteren van de beeldvormende schotel met de gemonteerde embryo's naar de microscoop. Onderstaande stappen zijn afgeleid van ons vorige protocol6.
      1. Maak tubes agarose met een lage smelttemperatuur door 0,1-0,8% agarose met een lage smelttemperatuur op te lossen in 5 ml E3-media en in een waterbad te verwarmen tot 65-70 °C. Keer af en toe de buis om totdat de agarose met een lage smelttemperatuur is opgelost. Doe de agaroseoplossing met lage smelttemperatuur in microfugebuisjes en plaats ze op een warmteblok dat is ingesteld op 42 °C. Laat de oplossing gedurende ten minste 1 uur in evenwicht komen tot 42 °C.
        OPMERKING: Het is over het algemeen raadzaam om een vers gemaakte agarose-oplossing met een lage smelttemperatuur te gebruiken.
      2. Breng met behulp van een glazen pasteurpipet met brede diameter een enkel embryo over in een buisje met de agaroseoplossing met een lage smelttemperatuur. Om te voorkomen dat overtollige vloeistof wordt toegevoegd aan de agarose-oplossing met een lage smelttemperatuur, brengt u alleen het embryo en de vloeistof eromheen over. Breng het embryo, dat nu in laagsmeltende agarose is, onmiddellijk over naar een van de agaroseputjes. Breng de agarose-oplossing met een lage smelttemperatuur terug naar het warmteblok voor hergebruik.
      3. Plaats het embryo met een tang of een embryopook (zie stap 3.1.1) in het putje voor beeldvorming.
      4. Herhaal stap 3.1.2.2-3.1.2.3 voor de andere putjes. Als de vorige putjes beginnen uit te drogen, gebruik dan een p200-pipet om een kleine hoeveelheid E3 (~50-100 μL) bovenop de put toe te voegen.
  2. Zodra de embryo's in alle putjes zijn gemonteerd en de agarose met een laag smeltpunt is gestold, voegt u met behulp van een pipet langzaam de tricaïne/E3-oplossing toe aan de beeldvormingsschaal.
  3. Haal de embryo's na beeldvorming voorzichtig uit de putjes met behulp van een tang en laat ze zich verder ontwikkelen om ervoor te zorgen dat beeldvorming geen ontwikkelingsstoornissen veroorzaakte.
    OPMERKING: De agaroseputjes kunnen uit de beeldschaal worden verwijderd, die kan worden afgespoeld en hergebruikt. Spoelen met in de handel verkrijgbare glasreiniger en vervolgens meerdere keren met ddH2O helpt om zoutafzettingen op de dekglaasjes te verwijderen. Hoewel we geen toxiciteit hebben ervaren als gevolg van resterende sporen van glasreiniger, wordt de onderzoeker geadviseerd om deze resultaten te bevestigen met behulp van hun eigen laboratoriumomstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het bovenstaande protocol werd gebruikt om mallen te ontwerpen voor het in beeld brengen van verschillende stadia van cardiale ontwikkeling bij zebravissen, waaronder hartfusie, hartbuisvorming, cardiale looping en kamervorming. Aangezien de ontwikkeling van het hart niet plaatsvindt langs de belangrijkste anatomische assen van het embryo, werd de vorm van de pinnen aangepast aan verschillende ontwikkelingsstadia om de embryo's goed te positioneren. Bijvoorbeeld, de voorste inwendige pla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol schetsen we een methode voor het ontwerpen van 3D-geprinte mallen die agaroseputten maken die het monteren van embryo's of weefsels voor beeldvormend onderzoek kunnen vergemakkelijken. Deze mallen kunnen worden gemaakt voor beeldvorming met rechtopstaande of omgekeerde microscopen en de agaroseputjes die met behulp van deze op maat gemaakte mallen zijn gemaakt, kunnen worden gebruikt voor beeldvormingstoepassingen die variëren van immunofluorescentiestudies van gefixeerde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We willen de leden van het Bloomekatz-laboratorium bedanken, in het bijzonder Sasmitha Singh en Allison Holmes, evenals de GlyCORE-beeldvormingskern (ondersteund door P20GM130460), het IDEA-lab van de Universiteit van Mississippi, Dr. Yiwei Han en het Han-laboratorium, en leden van de Glycoscience and Developmental Biology-gemeenschappen van de Universiteit van Mississippi. Dit werk wordt ondersteund door financiering van de NIH (R15HD108782, P20GM130460).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SLA 3D PrinterElegooMARS 2 PRO
AgaroseApex Bioresearch; Genesee Scientific20-102QDElk merk kan worden vervangen
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/Computer aided design (CAD) Software - geavanceerder
Axio-Zoom rechtopstaande microscoopZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Slicer software
Dekglasbodemschaal (60 mm schaal met 30 mm bodemput)CellvisD60-30-1.5N
F59 Myosine zware keten (alle snelle isoformen)DHSBF591:50 verdunning
FDM-filamentenBambuPLA-filamenten
FDM-printerBambuBambu X1 Carbon FDM0,4 mm extrusie-uitloop
PincetFisher16-100-121Andere merken zijn waarschijnlijk geschikt
Geit anti-muis Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 verdunning
ImarisAndor10.2Software
Omgekeerde confocale microscoopLeicaLeica SP8 X
Agarose met lage smelttemperatuurGold BiotechnologyCatalogusnr: A-204-25Andere merken zijn waarschijnlijk geschikt
PipetpompeBel-ArtF37898
Hars voor SLA-printerElegooElegoo P05BB028Waterwasbare fotopolymeerhars V2.0
Ricinus communis agglutinine (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (lectinekit)1:300 verdunning
TinkerCADAutodesk Inc.https://www.tinkercad.com/Computer aided design (CAD) Software - basis
Tricaine SWestern Chemical, Inc.ANADA #200-226
Tarwekiem agglutinine (WGA)Vector labs#RLK-2200 (lectinekit)1:300 verdunning
Glas Pasteur-pipet met brede boringDuran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
```

Referenties

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D geprinte mallenembryo montageagarose putjesstereolithografisch printenrechtopstaande microscopenomgekeerde microscopenweefselori ntatieherbruikbare mallen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen