Echocardiografiegeleide injectie voor gerichte en betrouwbare intramyocardiale stamcelafgifte in een rattenmodel van een myocardinfarct

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor echocardiografie-geleide intramyocardiale injecties in rattenmodellen van een myocardinfarct met behulp van een naald van 29 G x 88 mm. Deze techniek zorgt voor een robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare toediening van therapeutische middelen rechtstreeks in de peri-infarctzone.

Samenvatting

Echocardiografie-geleide intramyocardiale injectie (EGI) is een minimaal invasieve techniek voor het toedienen van stamceltherapieën in preklinische myocardinfarcten (MI)-modellen. Vergeleken met traditionele benaderingen met open borstkas, biedt EGI verbeterde klinische vertaalbaarheid, verminderde invasiviteit en minimale fysiologische impact op het dier. Hoewel EGI goed ingeburgerd is in muizenmodellen, blijft de toepassing ervan bij ratten beperkt vanwege anatomische en technische uitdagingen. Met name het dunner worden van de linkerventrikel voorwand (LVAW) in infarct- en peri-infarctgebieden bemoeilijkt een veilige en nauwkeurige myocardtoediening, aangezien de wanddikte onder de naaldafschuining van veelgebruikte naalden van 27 G of 28 G kan vallen, waardoor het risico op ventriculaire perforatie of mislukte bevalling toeneemt. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een protocol geoptimaliseerd voor EGI in MI-modellen van ratten met behulp van 29 G Spinocan-naalden. De naald met een kleinere diameter en langere snelheid maakt het mogelijk om dun myocardweefsel nauwkeurig te richten, waardoor schade wordt geminimaliseerd en de nauwkeurigheid van de injectie wordt verbeterd, onafhankelijk van de LVAW-dikte. Deze techniek is compatibel met standaard transthoracale echocardiografieplatforms en elimineert de noodzaak van thoracotomie, waardoor longitudinale studies bij hetzelfde dier mogelijk zijn. Onze verfijnde methode maakt robuuste, reproduceerbare toediening van therapeutische middelen mogelijk in levensvatbaar myocardium naast de infarctzone, waar regeneratieve therapieën het meest effectief zijn. Door de veiligheid te verbeteren en de precisie van de targeting te vergroten, verhoogt deze aanpak de translationele relevantie van preklinisch cardiaal onderzoek en ondersteunt het de ontwikkeling van gestandaardiseerde protocollen in laboratoria.

Inleiding

Hart- en vaatziekten blijven wereldwijd de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit, waarbij een hartinfarct (MI) een belangrijke bijdrage levert aan zowel acute als chronische hartaandoeningen¹. Ondanks de vooruitgang in farmacologische en interventionele behandeling, is het regeneratieve vermogen van het volwassen menselijk hart beperkt, wat vaak resulteert in nadelige hermodellering en progressie naar hartfalen ^2,3. Bijgevolg hebben op stamcellen gebaseerde therapieën aandacht gekregen als mogelijke strategieën om beschadigd myocardium te herstellen, de hartfunctie te behouden en de klinische resultaten te verbeteren⁴.

Robuuste preklinische modellen zijn essentieel voor het evalueren van de veiligheid, werkzaamheid en toedieningsstrategieën van deze therapieën. Onder de modellen met kleine dieren bieden ratten verschillende voordelen, waaronder een beheersbare hartgrootte, goed gekarakteriseerde infarcttechnieken en translationeel relevante cardiale remodelleringsreacties⁵. Conventioneel wordt intramyocardiale toediening van stamcellen in MI-modellen van ratten bereikt via thoracotomie, waardoor directe visualisatie van de injectieplaats mogelijk is⁶. Deze benadering is echter invasief, introduceert aanzienlijke procedurele risico's en belemmert herhaalde interventies in longitudinale studies. Bovendien is het niet afgestemd op klinische toedieningsmodaliteiten, zoals kathetergebaseerde of percutane injectie⁷.

Echocardiografie-geleide intramyocardiale injectie (EGI) is een minimaal invasief alternatief dat gerichte toediening van therapeutische middelen mogelijk maakt onder real-time beeldvormingsbegeleiding. Hoewel het goed ingeburgerd is in muizenmodellen, is het gebruik van EGI in modellen bij ratten beperkt gebleven. EGI is uitgebreider ontwikkeld bij muizen dan bij ratten, voornamelijk omdat het meeste cardiovasculaire onderzoek zich van oudsher heeft gericht op muizen als het dominante preklinische model⁸. Bovendien zorgden de kleinere omvang en hartanatomie van muizen voor de optimalisatie van echogeleide procedures⁹. Ratten daarentegen hebben een dikkere borstwand en een grotere ademhalingsbeweging, wat een stabiele beeldvorming met hoge resolutie tijdens de procedures bemoeilijkt¹⁰.

Vooruitgang in hoogfrequente ultrasone technologie heeft EGI bij ratten haalbaar gemaakt, waardoor de klinische relevantie van het gebruik ervan is toegenomen. Toch blijft het dunner worden van de linkerventrikel voorwand (LVAW) in infarctgebieden een grote uitdaging voor EGI bij knaagdieren. Bij ratten neemt de wanddikte vaak af tot minder dan 1 mm, terwijl standaard naalden van 27 G of 28 G een afschuinlengte hebben van 1,25-1,5 mm, waardoor het risico op ventriculaire perforatie of slecht gerichte celafgifte toeneemt. Om deze beperking aan te pakken, hebben we de EGI-techniek bij ratten verfijnd door gebruik te maken van Spinocan-naalden van 29 G x 88 mm. Deze naalden hebben een afschuinlengte van 1 mm, waardoor nauwkeurige, atraumatische afgifte van cellen in het verdunde myocardium van het infarct en peri-infarct mogelijk is. De procedure wordt uitgevoerd met behulp van transthoracale echocardiografie met hoge resolutie, waardoor zowel anatomische oriëntatiepunten als het naaldtraject in realtime kunnen worden gevisualiseerd.

Dit verfijnde EGI-protocol biedt een minimaal invasieve, reproduceerbare methode voor gerichte toediening van therapeutische middelen in het peri-infarct myocardium in rattenmodellen van zowel acuut als chronisch MI, onafhankelijk van de LVAW-dikte. Het vergemakkelijkt injectie in levensvatbare grenszones - kritieke plaatsen voor het bereiken van therapeutisch voordeel - terwijl de chirurgische belasting en hersteltijd aanzienlijk worden verminderd in vergelijking met benaderingen met open borstkas. Bovendien ondersteunt het longitudinale studies met herhaalde injecties en follow-up beeldvorming, waardoor het aantal dieren wordt verminderd in overeenstemming met het 3V-principe (vervanging, vermindering, verfijning)¹¹. Het protocol is aanpasbaar voor de toediening van farmacologische middelen, gentherapieën, biomaterialen en verschillende stamceltypen. Door EGI in rattenmodellen te standaardiseren en af te stemmen op klinische toedieningsmodaliteiten, verbetert deze aanpak de reproduceerbaarheid in laboratoria en versterkt het de translationele relevantie van preklinisch hartonderzoek.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie van UHasselt (Ethische Commissie voor Dierproeven, UHasselt, Diepenbeek, België, ID202308 en ID202497) en uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EU.

1. Installatie van apparatuur

1. Schakel het ultrasone beeldvormingsplatform, het geïntegreerde verwarmde platform, de fysiologiebewakingseenheid en de gelverwarmer in.
   OPMERKING: Om een duidelijke en voldoende gedetailleerde visualisatie van de linkerventrikelvoorwand tijdens de EGI-procedure mogelijk te maken, wordt een hoogfrequent ultrasoon systeem aanbevolen dat is uitgerust met een ≥ lineaire array-transducer van 15 MHz met een axiale resolutie van ongeveer 75 μm.
2. Zet het verwarmingskussen aan om de lichaamstemperatuur van de rat op peil te houden tijdens het verwijderen van borsthaar.
3. Selecteer de juiste transducer en initialiseer de 3D-motor om het volledige bewegingsbereik van de transducer te garanderen.
   OPMERKING: Naast het gebruik van de micromanipulator van het platformrelingsysteem van het dier, maakt de 3D-motor zeer nauwkeurige transduceraanpassingen mogelijk, die de uitlijning met de injectienaald kunnen vergemakkelijken wanneer dat nodig is. Indien nodig kan de procedure ook zonder de 3D-motor worden uitgevoerd.
4. Zorg voor een goede uitlijning van het systeem voordat u beeldvorming maakt. Zet de micromanipulator van schroeven die het dierenplatform besturen in een neutrale positie (dwz gecentreerd binnen het volledige bewegingsbereik). Centreer het dierenplatform zelf in het midden van het relingsysteem. Plaats het montagesysteem van de transducer zo dat de transducer direct boven het midden van het dierenplatform is uitgelijnd.

2. Voorbereiding en anesthesie van dieren

1. Weeg de rat en bereken de benodigde hoeveelheid buprenorfine (0,04 mg/kg) die moet worden toegediend voor pijnverlichting.
2. Plaats de rat in een inductiekamer die is aangesloten op een anesthesieapparaat. Induceer anesthesie met 2,5% isofluraan aangevuld met zuurstof met een debiet van 2 l/min.
3. Zodra de anesthesie is geïnduceerd, brengt u de rat over op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op 37 0,5 °C te houden. Zorg voor voldoende anesthesie door de snuit van de rat in een neuskegel te plaatsen die is aangesloten op het anesthesiesysteem, waarbij een constante stroom van 1-3% isofluraan wordt afgegeven, aangevuld met 1-1,5 l/min zuurstof, indien nodig aangepast om voldoende sedatie te garanderen.
4. Scheer de borst van de rat en verwijder achtergebleven haren met ontharingscrème. Desinfecteer na het ontharen de injectieplaats door een geschikt chirurgisch scrubmiddel (bijv. povidon-jodium) af te wisselen met 70% ethanol, 3x herhaald. Breng oogheelkundige gel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
5. Dien de vooraf berekende dosis buprenorfine intramusculair toe in het achterbeen om het ongemak in verband met de EGI te minimaliseren.
6. Breng de rat over van het verwarmingskussen naar het dierplatform van het ultrasone beeldvormingssysteem. Zorg voor een consistente anesthesietoediening via de geïntegreerde neuskegel van het platform, waarbij een constante stroom van 1-3% isofluraan in 1-1,5 l/min zuurstof wordt gehandhaafd. Bevestig de poten van de rat op de platformelektroden en breng een kleine hoeveelheid elektrodegel aan om een optimale signaalkwaliteit te garanderen. Plaats de rectale temperatuursonde voor continue bewaking van de lichaamstemperatuur.
   OPMERKING: Continue monitoring van fysiologische parameters is essentieel tijdens beeldvormings- en injectieprocedures. Hartslag (HR), ademhalingsfrequentie (RR) en lichaamstemperatuur van de rat moeten binnen acceptabele marges blijven om anesthesiegerelateerde complicaties te voorkomen. Als algemene richtlijn geldt dat de HR in het bereik van 250-400 bpm moet liggen, terwijl de RR ten minste 30 ademhalingen per minuut moet zijn. Als HR of RR onder deze drempels daalt, verlaag dan onmiddellijk de isofluraanconcentratie (bijv. van 2-3% naar 1-2%) en controleer of het dier goed gepositioneerd blijft en niet onderkoeld raakt. Aanpassingen moeten geleidelijk worden doorgevoerd, waarbij nauwlettend moet worden toegezien totdat de parameters terugkeren naar de doelniveaus.
7. Verkrijg in dit stadium de gewenste basislijn- of pre-injectiebeelden. Over het algemeen worden beelden van de parasternale lange as (PSLAX) en de korte as (SAX) in zowel de B-modus als de M-modus, samen met beelden met vier kamers, aanbevolen voor functionele en anatomische beoordeling bij baseline.
   OPMERKING: Algemene beeldvorming kan worden uitgevoerd met het systeem dat is ingesteld zoals weergegeven in afbeelding 1A. Voor de injectieprocedure moet het dierenplatform worden verplaatst en moet de transducer dienovereenkomstig worden afgesteld. Hoewel PSLAX B-mode beeldvorming wordt gebruikt voor begeleiding tijdens injectie, zijn deze beelden mogelijk niet optimaal voor post-hoc functionele analyses vanwege de noodzaak van nauwkeurige naalduitlijning.

3. Echocardiografie-geleide intramyocardiale injectieprocedure

OPMERKING: Vanaf dit punt zijn twee operators nodig om de injectie met succes uit te voeren. Operator A is verantwoordelijk voor het manipuleren van het dierplatform en het bewaken van het live echocardiografiebeeld, terwijl operator B zich achter de injectiehouder moet positioneren om de naald en transducer nauwkeurig uit te lijnen.

1. Bereid het injectiesysteem voor door een voernaald van 22 G op een spuit van 1 ml te bevestigen. Plaats de spuit met de geleidingsnaald op de injectiesteun en zet de injectieklem vast.
   OPMERKING: De naald van 29 G x 88 mm is te flexibel om huid- en spierlagen direct te doorboren; De voernaald is nodig om de injectie te vergemakkelijken.
2. Lijn de transducer uit met de injectiehouder om ervoor te zorgen dat de naald kan worden gevisualiseerd. Pas de positie van de transducer aan met behulp van de transducerbevestiging en de houder clamp en, indien nodig, draai de injectiesteun langs de rail om de juiste uitlijning te bereiken.
3. Draai zonder de rat te bewegen het dierenplatform zodat de inkeping van de transducer naar de rechterschouder van de rat wijst (Figuur 1B-D). Deze opstelling maakt het mogelijk om een duidelijk PSLAX B-mode beeld van de linker hartkamer te verkrijgen. Controleer of de geleidingsnaald binnen het bewegingsveld van de transducer blijft. Als de transducer niet goed is uitgelijnd, past u de positie van de transducer aan via het 3D-motorsysteem in plaats van de injectiesteun te wijzigen.
4. Zodra de juiste uitlijning van de naald-transducer is bereikt, verfijnt u de beeldvorming met behulp van de micromanipulatorschroeven van de platformrail voor dieren. Houd de transducer in de positie om de uitlijning met de naald te behouden. Extra rotatie of translatie van het dierplatform kan nodig zijn om de beeldkwaliteit te optimaliseren.
5. Visualiseer het infarctgebied. Evalueer de omvang van het infarct, de regionale wandbeweging en het dunner worden van de wand, met behulp van zowel PSLAX B-modus als M-modus beeldvorming om de haalbaarheid van de injectieplaats te beoordelen. Pas een 16-segments wandbewegingsscorebenadering toe om akinetische of ernstig hypokinetische gebieden te identificeren, die de infarctkern vertegenwoordigen.
6. Identificeer de peri-infarctzone en selecteer de beoogde injectieplaats. Kies een hypokinetisch gebied naast de infarctkern met een einddiastolische wanddikte van meer dan 1 mm, waardoor de 29 G-naaldafschuining in een ondiepe hoek volledig kan worden ingebracht.
7. Schuif met behulp van het railsysteem de injectiesteun naar het dierenplatform. Lijn de naald precies uit met het midden van de transducer met behulp van de micromanipulatorschroeven op de injectiesteun.
   OPMERKING: Nauwkeurige uitlijning is van cruciaal belang. Als de naald niet gecentreerd is ten opzichte van de transducer, is deze niet zichtbaar tijdens de injectie.
8. Beweeg de geleidingsnaald met behulp van de injectiemicromanipulatorschroef op de injectiesteun totdat de huid is doorboord. Controleer of de naaldpunt zichtbaar is op het echobeeld. Als de naald niet zichtbaar is, trekt u de naald voorzichtig terug met behulp van de 'inject'-micromanipulatorschroef en herhaalt u stap 3.7 om opnieuw uit te lijnen.
9. Activeer de naaldgeleiderfunctie in de ultrasone software om het naaldtraject te bevestigen. Beweeg de geleidenaald naar het vooraf bepaalde doelgebied en plaats de afgeschuinde naald op ongeveer 1-2 mm van de linkerventrikelvoorwand (LVAW) (Figuur 2A).
   NOTITIE: Vermijd het doorboren van het myocardium met de geleidenaald om overmatig bloeden of hartletsel te voorkomen.
10. Zodra de naald is geplaatst, laat operator A de geleidenaald stevig stabiliseren aan de basis, zodat de naald constant zichtbaar is op het ultrasone scherm. Vraag tegelijkertijd operator B om de klem los te maken waarmee de spuit is bevestigd, de spuit te verwijderen en de injectiespuit voor te bereiden. Instrueer operator A om de geleidingsnaald stil te houden.
11. Bevestig de naald van 29 G x 88 mm op de spuit met het injectaat (operator B) en bevestig de spuit op de injectiehouder. Leid de naald van 29 G x 88 mm handmatig door de stationaire geleidingsnaald en voer indien nodig kleine aanpassingen uit met de micromanipulatorschroeven in het x-asvlak (links of rechts van de sonde). Ga handmatig vooruit totdat de afgeschuinde naald zichtbaar wordt in de borstholte op echografie.
    OPMERKING: Door de flexibiliteit van de naald van 29 G kan deze buigen tijdens het inbrengen in de borstholte. Om dit te minimaliseren, kan operator A het externe deel van de naaldas stabiliseren terwijl operator B de naald in de borstholte brengt.
12. Zodra de naald van 29 G x 88 mm door de geleidingsnaald gaat en zichtbaar wordt op echografie, plaatst u deze in het myocardium van de LVAW met behulp van de micromanipulatorschroeven voor extra precisie en veiligheid. Controleer of de afgeschuinde naald zich volledig in het myocardium bevindt (Figuur 2B).
    OPMERKING: Vanwege de relatief lange afschuining van de naald van 29 G in vergelijking met de myocardwanddikte, is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de gehele afschuining in het myocardium is ingebed. Gebruik indien nodig de functie 'Afbeelding bevriezen' om de plaatsing te controleren. Hoewel ultrasone dieptekalibratie kan helpen bij de precisie, hebben we in dit protocol de diepte geverifieerd door injectieplaatsen te selecteren met een einddiastolische wanddikte >1 mm en visueel te bevestigen dat de naaldpunt de endocardiale grens nadert - maar niet overschrijdt - (Figuur 2B).
13. Injecteer de injectie langzaam in het myocardium (operator B). Succesvolle intramyocardiale injectie wordt visueel bevestigd door een heldere/dichte echogene plek op de injectieplaats, die synchroon met de LVAW moet bewegen (Figuur 2C). Om het terugstromen van het injectaat tot een minimum te beperken, wacht u ongeveer 10 s na voltooiing van de injectie voordat u de naald terugtrekt.
14. Haal eerst de spuit met de naalden uit de injectiehouder om het risico op prikaccidenten te minimaliseren. Verwijder vervolgens de rat voorzichtig van het dierenplatform en laat hem herstellen op een verwarmingskussen. Bewaak de vitale parameters continu totdat u volledig hersteld bent van de anesthesie.

Resultaten

Validatie van de nauwkeurigheid van de injectie door in- en ex vivo bioluminescentiebeeldvorming (BLI)
Om het succes en de efficiëntie van de EGI te evalueren, werden stamcellen eerst getransduceerd om vuurvliegluciferase (Fluc) tot expressie te brengen via een lentivirale vector, waardoor in vivo tracking door bioluminescentiebeeldvorming (B...

Discussie

Naarmate het preklinisch onderzoek naar regeneratieve therapieën om het hart te herstellen na een hartinfarct vordert, blijven er hindernissen met betrekking tot een optimale toediening van therapeutische middelen¹². Minimaal invasieve EGI-technieken hebben steeds meer de voorkeur boven open-thoraxbenaderingen omdat ze klinische percutane toediening beter nabootsen, het dierenwelzijn verbeteren en herhaalde toediening in longitudinale studies mogelijk maken

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
21?MHz MX250 transducer	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Hoge frequentie echografie transducer compatibel met het Vevo 3100 systeem
3M Transpore Surgical Tape	3M	1527	Om de poten van het dier op het dierplatform te bevestigen
Aquasonic  100 Ultrasound Transmission Gel	Parker Laboratories BV	01-08	Zorgt voor een goede akoestische koppeling tussen transducer en dierenhuid voor optimale beeldkwaliteit
Bupaq 0.3 mg/mL Oplossing voor Injectie voor Honden en Katten	Richter Pharma AG	57446/4008	Opioïde analgeticum (buprenorfine) toegediend voor pijnbestrijding
ISOFLUTEK 1000	Alivira	/	Isofluraan-gebaseerd inhalatieanestheticum
Multi-bottle gel warmer 230 V	Parker Laboratories BV	83-03-20 CE (LCD)	Verwarmt echografiegel tot lichaamstemperatuur om hypothermie of ongemak van het dier te voorkomen
Signagel Electrode Gel	Parker Laboratories BV	15-25	Toegepast op ECG-elektroden om de signaalgeleiding voor fysiologisch bewaking te verbeteren
SPINOCAN 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	Fijne naald voor nauwkeurige intramyocardial injectie
Terumo 3-delige spuit met vooraf aangesloten hypodermische naald	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	Wordt gebruikt om de 22 G geleidnaald en de 29 G injectienaald te monteren en te bevestigen voor gecontroleerde toediening in het myocardium.
THM150 Fysiologische Bewakingseenheid	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Bewaakt vitale functies zoals hartslag, ademhalingssnelheid en lichaamstemperatuur van het dier tijdens de procedure
Veet Minima Pure	Reckitt Benckiser	/	Depilatie crème
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	Hoge resolutie echografie systeem
Vidisic carbomerum 980 2mg/g ooggel	Bausch + Lomb	/	Toegepast op de ogen van een geanesthetiseerd dier om hoornvliesdroging te voorkomen