Hier presenteren we een protocol voor een geoptimaliseerde bloedafnametechniek bij muizen door middel van venapunctie in het gezicht met behulp van een lancet. We gebruiken deze techniek naast flowcytometrische beoordeling om cellulaire fenotypes van transgene, congenische en reporterstammen te karakteriseren. Het is ook geschikt voor serumcytokine-analyse en diabetesstudies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Venapunctie in het gezicht voor het afnemen van bloed bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het afnemen van muizenbloed via venapunctie in het gezicht met behulp van een lancet, en biedt een snel, minimaal invasief en kosteneffectief alternatief voor andere veelgebruikte technieken zoals staartader en retro-orbitale bemonstering. Deze techniek is vooral voordelig voor onderzoeken die herhaalde bemonstering vereisen, zoals fenotypering bij muizen, serumcytokine-analyse en diabetesonderzoek. Het protocol is efficiënt, vereist minimale gespecialiseerde apparatuur en is zeer geschikt voor cellulaire analyse met hoge doorvoer bij muizen. Onze primaire toepassing is de fenotypering van transgene, congene en reportermuizen met behulp van flowcytometrie, hier gedemonstreerd met antilichaamkleuring en tdTomato reportermuizen. Het document schetst de volledige procedure, van de voorbereiding van de dieren tot de analyse van het monster. Belangrijke stappen zijn onder meer bloedafname met een lancet van 3 mm, cellyse, kleuring en flowcytometrische profilering. Venapunctie in het gezicht verbetert de efficiëntie van de verzameling en ondersteunt tegelijkertijd ethische onderzoekspraktijken. Deze praktische en aanpasbare methode is geschikt voor een breed scala aan experimentele protocollen met betrekking tot bloedafname bij muizen en cellulaire analyse.
Inleiding
Efficiënte, reproduceerbare en minimaal invasieve bloedafname is essentieel voor veel onderzoeken bij muizen, met name voor onderzoeken waarbij herhaalde bemonstering nodig is. Dit protocol biedt een gestroomlijnde methode voor het verzamelen van kleine hoeveelheden bloed met behulp van venapunctie in het gezicht, gevolgd door lysis van rode bloedcellen, antilichaamkleuring en flowcytometrische analyse. Deze workflow is zeer geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer en minimaliseert tegelijkertijd de technische complexiteit.
Veel methoden voor bloedafname, zoals retro-orbitale bloedingen of incisie in de staartader, kunnen procedures vereisen met warmte, anesthesie1 en langere behandelingstijden, wat het dier aanzienlijk leed kan bezorgen2. Venapunctie in de gezichtsader met een lancet daarentegen biedt een eenvoudig en snel alternatief dat een ethisch en reproduceerbaar experimenteel ontwerp ondersteunt. Deze methode is in eerdere studies gevalideerd als een humaan alternatief voor bloedafname in kleine hoeveelheden bij muizen3.
We illustreren deze methode door immuuncellen van transgene en reportermuizen te fenotyperen, waaronder TdTomato-reportermuizen en MD4-IgHEL-muizen. Dit laatste vereist kleuring met antilichamen tegen CD19 en IgMa, een IgM-allotype.
Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor cellulaire profilering van het bloed, kan het gemakkelijk worden aangepast voor ander gebruik, waaronder serumcytokine-analyse, detectie van specifieke antilichamen of glucosemetingen, door de lysisstap van rode bloedcellen weg te laten. Over het algemeen verbetert deze techniek de gegevenskwaliteit en experimentele efficiëntie, terwijl het minimale dierenleed veroorzaakt, waardoor het breed bruikbaar is in diverse onderzoekstoepassingen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije omgeving aan het Dartmouth Hitchcock Medical College, een door de AAALAC geaccrediteerde instelling, en gebruikt in overeenstemming met een goedgekeurd protocol onder het Institutional Animal Care and Utilization Committee.
1. Materialen verzamelen
- Bereid 5 ml kweekbuisjes voor, elk met 1,5 ml 1x rode bloedcellen (RBC) lysisbuffer (10x RBC lysis verdund met steriel water). Gebruik één tube per muis.
- Verzamel een doos met lancetten van 3 mm (één lancet per muis).
- Verzamel een doos gaassponzen (één gaasspons per muis).
- Verzamel transferpipetten en een conische buis van 50 ml met 1x HBSS met 0,5 mM EDTA (voldoende voor maximaal 20 muizen).
OPMERKING: Deze buffer wordt gebruikt om de lysisreactie te stoppen. Als de buffer alleen nodig is voor fenotypering en niet voor verdere downstream-analyse, kunnen de meeste neutrale buffers met een pH van 7,2-7,4 worden gebruikt in plaats van HBSS. - Neem een ijsemmer, extra 1x RBC-lysisbuffer, extra 5 ml buizen en transferpijpen mee.
2. Etikettering van muizen en slangen
- Label elke kooikaart en muis met een fenotype-ID die overeenkomt met labels op elke buis om te helpen onderscheiden welke resultaten correleren met welke muis. Veelgebruikte identificatiemiddelen zijn onder meer verschillende kleuren permanente markeringen (bijv. rood, blauw, groen, zwart) op de staarten van muizen, die overeenkomen met de markeringen op de buis.
OPMERKING: Voeg altijd een controlemuis toe voor fenotypering. Zorg er bij reportermuizen voor dat ze een negatieve reportercontrole hebben. Neem voor transgene muizen een wildtype muis op als controle. - Plaats de gelabelde buisjes in een rek met een ijsemmer in de buurt om de buisjes direct na het afnemen van bloed op te slaan.
- Open alle lancetten die nodig zijn voor de procedure.
- Open alle gaassponzen die nodig zijn voor de procedure.
3. Muisbehandeling en monsterafname
- Gebruik de dominante hand om de muis bij de staart vast te pakken en plaats deze op een draadaanvoerrek of een ander plat oppervlak.
- Gebruik de niet-dominante wijsvinger en duim om de muis te nekvel door van de staart naar het cervicale gebied te manoeuvreren.
- Gebruik de overige vingers om de staart vast te zetten, waardoor muisbewegingen tot een minimum worden beperkt.
- Gebruik de dominante hand om een geopend lancet van 3 mm op te halen.
- Zoek de kleine haarloze plek net voorbij de mond en trek een rechte lijn naar het oor. Stop waar de lijn de buitenste ooghoek snijdt (Figuur 1).
- Plaats het lancet op dit kruispunt om een ruime bloedtoevoer te garanderen.
- Gebruik de platte zijrand van het lancet om een enkele druppel bloed op te vangen.
- Deponeer het hele lancet, met het bloedmonster, in de geëtiketteerde buis met RBC-lysisbuffer.
- Schud de buis voorzichtig om ervoor te zorgen dat het hele monster in de buffer wordt gemengd. Onvolledige menging kan stolling en slechte gegevenskwaliteit veroorzaken.
- Gebruik een gaasspons om gedurende 5-10 s lichte druk uit te oefenen op de prikplaats.
- Breng de muis terug in zijn kooi.
- Zorg voor een bufferverhouding tussen bloed en lysis van meer dan 1:10.
- Herhaal de stappen in dit gedeelte voor elke extra muis.
4. Lysis, voorbereiding en analyse van het monster
- Wacht 7-10 minuten na het begin van de lysis, voeg ongeveer 2 ml 1x HBSS toe met 0,5 mM EDTA (of andere media).
- Centrifugebuisjes bij 400 g gedurende 5 min. Bereid gedurende deze tijd antilichaamcocktails voor.
- Gooi het bovenstaande weg.
- Verwijder de lancetten met een tang uit de buisjes.
- Voeg 30 μL van een antilichaamcocktail toe die is ontworpen om de gewenste cellulaire populaties te identificeren.
OPMERKING: Voor het fenotype MD4 IgHEL-muizen bestond onze cocktail uit 1 ml HBSS, 25 μl IgMa PerCP cy-5.5 en 25 μl CD19 APC. - Resuspendeer de cellen door 2-3 s te vortexen en gedurende 25-30 minuten bij 4 °C te incuberen.
- Zet de flowcytometer aan en configureer de flowplots naar de behoeften van het experiment.
OPMERKING: Het is niet nodig om de cellen na de kleuring te laten draaien als het doel fenotypering is. - Voeg 150-25 μL HBSS of andere media toe aan elk monster met behulp van een transferpipet. Indien nodig kan DAPI worden toegevoegd in een eindconcentratie van 1. μg/ml (gebruik 10 μL DAPI-bevattende media).
- Vortex elk monster gedurende 2-3 s vlak voor de acquisitie.
- Verkrijg gegevens van 8.000-10.000 gebeurtenissen, met als doel 100.000 cellen als lysis effectief was.
- Analyseer de verkregen gegevens, geïllustreerd in Figuur 2 en Figuur 3.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van flowcytometrie toont figuur 2 gelyseerd bloed van wildtype (WT) en PF4-Cre TdTomato reportermuizen, bereid met behulp van het hierboven beschreven protocol. De eerste set stroomdiagrammen geeft side scatter (SSC) weer, die de granulariteit van de cel weerspiegelt, versus forward scatter (FSC), die de celgrootte aangeeft. Cellulair puin en bloedplaatjes worden waargenomen in de buurt van de oorsprong van de asse...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit geoptimaliseerde protocol voor bloedafname in de gezichtsader biedt een efficiënt en eenvoudig alternatief voor andere veelgebruikte methoden, zoals staartader of retro-orbitale bloeding. Hoewel het protocol eenvoudig en duidelijk is, moeten een paar cruciale stappen zorgvuldig worden gevolgd. De belangrijkste stap om goed uit te voeren is de juiste plaatsing van de prikplaats4. Door de juiste locatie op de wang te targeten, zorgt u voor voldoende doorbloeding...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health Grant: R35 HL155458 (CVJ)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| APC anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 152410 | CD19 APC |
| Centrifuge 5810 R, without rotor, 120 V, 50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | Centrifuge |
| Dermacea Gauze sponges 8 ply 2" x 2" | Covidien | 441211 | Guaze Ponges |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-91am | Transfer pipet |
| ErgoOne Single Channel Pipette (200 µL) | USA Scientific | 7100-2200 | Pipette |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (0.5 M Solution/pH 8.0) | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| FACSymphony A3 Cell Analyzer | BD Biosciences | 660937 | Flow Cytometer |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisherbrand | 02-215-414 | Vortex |
| Goldenrod Animal Lancet 3 mm Sterile 5 trays of 200 | Goldenrod | GR 3MM | Lancet 3 mm |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
| Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse IgMa Antibody | Biolegend | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Biolegend | 420301 | RBC Lysis Buffer |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes Without Cap | Fisherbrand | FB1496110 | Culture tubes |
| Sharpie Permanent Markers, Chisel Tip | Sharpie | 38254PP | Sharpies |
| Tested for USP Sterile Water | Corning | 25-055-CI | Cell Culture Grade Water |
| TipOne Pipette Tip Refills (200 µL Natural Beveled) | USA Scientific | 1111-1730 | Pipette tips |
Referenties
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
- Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
- Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
- Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
- Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
- Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
- Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
- Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
