Methodenartikel

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 november 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Induceerbare genexpressietools kunnen nieuwe toepassingen openen in de menselijke gezondheid en biotechnologie, maar de huidige opties zijn vaak duur, moeilijk terug te draaien en hebben ongewenste off-target effecten. Optogenetische systemen gebruiken lichtgevoelige eiwitten om de activiteit van regulatoren te regelen, zodat de expressie wordt geregeld met de "flip of a switch". Deze studie optimaliseert een vereenvoudigd lichtgeactiveerd CRISPR-effectorsysteem (2pLACE), dat afstembare, omkeerbare en nauwkeurige controle van de genexpressie van zoogdieren biedt. De OptoPlate-96 maakt high-throughput screening mogelijk via flowcytometrie voor single-cell analyse en snelle optimalisatie van 2pLACE. Deze studie laat zien hoe het 2pLACE-systeem met de OptoPlate-96 in HEK293T cellen kan worden gebruikt om de optimale componentverhoudingen te identificeren voor het maximaliseren van het dynamisch bereik en om de responscurve voor de intensiteit van blauw licht te vinden. Soortgelijke workflows kunnen worden ontwikkeld voor andere zoogdiercellen en voor andere optogenetische systemen en golflengten van licht. Deze ontwikkelingen verbeteren de precisie, schaalbaarheid en het aanpassingsvermogen van optogenetische hulpmiddelen voor bioproductietoepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synthetische biologie-instrumenten zoals induceerbare genexpressiesystemen hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan biologisch onderzoek. Hun vermogen om genexpressie op een afstembare, omkeerbare en nauwkeurige manier te reguleren, kan de controle van de eiwitproductie verbeteren 1,2,3,4,5,6, celmorfologie 7,8,9,10,11,12, metabole routes 13,14,15 ,16,17,18, en andere doelen voor bioproductie en therapeutische toepassingen. Chemisch induceerbare systemen kunnen resterende19,20 of off-target effecten hebben. Chemische additieven kunnen ook erg duur zijn en moeilijk industrieel op te schalen als gevolg van extra stroomafwaartse zuiveringsprocessen 21,22,23. Licht-induceerbare genexpressiesystemen kunnen een schaalbare en nauwkeurige methode bieden voor bioproductiepraktijken 24,25,26,27.

Er zijn veel licht-induceerbare genexpressiesystemen ontwikkeld als nuttige hulpmiddelen voor synthetische biologie in een verscheidenheid aan toepassingen 28,29,30,31,32,33,34,35,36 en golflengten van blauw 35,37,38, rood / verrood12,39,40, of groen41 licht. In het geval van op CRISPR gebaseerde optogenetische genregulatie kan het wijzigen van de hoeveelheid afgeleverde individuele gids-RNA's (gRNA's) de mRNA-expressie van endogene genen42 beïnvloeden en moet worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Transactiveringseiwitten zoals VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544, of fusies ervan 47 kunnen ook worden gebruikt, waardoor de modulariteit van optogenetische systemen wordt vergroot. Om complexe en met elkaar verweven biologische routes 12,40,48,49,50,51,52,53 te onderzoeken, kunnen verschillende combinaties van deze bekende componenten worden getest. Bovendien kunnen verschillende cellijnen verschillen in inductie vertonen met hetzelfde systeem52. Verschillende inductieniveaus kunnen leiden tot onvoldoende genexpressie of gevoeligheid bij de precieze controle van genexpressie, waardoor rigoureuze tests nodig zijn om een optimaal optogenetisch systeem te vinden in nieuwe of biologisch relevantere cellijnen. Met een groeiend tempo en een toenemende toepasbaarheid van optogenetische genregulatie, is het absoluut noodzakelijk om deze verschillende systemen snel te karakteriseren.

De huidige methoden voor het karakteriseren van optogenetische hulpmiddelen maken gebruik van stabiele of voorbijgaande expressie van genen12,54. Het genereren van stabiel tot expressie gebrachte cellijnen en het optimaliseren van de systeemdynamiek voor maximale expressie kan tijdrovend en daarom kostbaar zijn. Transiënte expressie maakt snelle en waardevolle inzichten mogelijk, vooral bij het testen van optogenetische systemen met meerdere componenten. Hier gebruikten we het door blauw licht geactiveerde CRISPR-dCas9-effector (LACE)37-systeem, samengesteld uit cryptochroom 2 (CRY2) en cryptochroom-interagerende basic-helix-loop-helix N-terminal (CIBN). Het is gebruikt om genexpressie te regelen in zoogdiercellen zoals HEK293T (menselijke embryonale niercellen)37,38, CHO-DG44 (eierstokcellen van Chinese hamster)55 en C2C12 (myoblastcellen van muizen)38. Het modulaire karakter is ideaal voor het snel karakteriseren van systeemprestaties door middel van transiënte expressie en high-throughput-methoden. Systemen met meerdere componenten, zoals LACE, kunnen bijvoorbeeld optimalisatie van massaverhoudingen nodig hebben om de inductie te verbeteren, een stap die doorgaans niet wordt gebruikt bij de karakterisering van optogenetische systemen.

Dit protocol beschrijft de snelle optimalisatie en karakterisering van het systeem met twee plasmide LACE (2pLACE)38. In deze opstelling regelt 2pLACE de expressie van een fluorescerende reporter, eGFP (verbeterd groen fluorescerend eiwit), in HEK293T cellen. Activering wordt uitgevoerd in zwarte platen met 96 putjes met glazen bodem met behulp van een OptoPlate-96, een 3D-geprinte LED-array ontworpen en gebouwd door Lukasz Bugaj en collega's 56,57,58,59. Dit protocol optimaliseert specifiek de maximale expressie met verschillende massaverhoudingen van het twee-plasmidesysteem. Het bevat ook gebruiksvriendelijke code om verschillende lichtintensiteiten te regelen om de afstembaarheid van het systeem en het volledige dynamische bereik te onderzoeken. Flowcytometrie wordt gebruikt voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Protocollen voor het genereren van plasmideconstructies en 3D-printmaterialen voor de LED-array zijn te vinden in eerdere publicaties 54,56. Deze methoden benadrukken een snelle, high-throughput pijplijn voor het karakteriseren van licht-induceerbare genexpressiesystemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Plateren van HEK293T cellen in een formaat met 96 putjes

  1. Verzamel in een bioveiligheidskast een bleekafvalcontainer, serologische pipetten, pipethulpmiddel, Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), Dulbecco-gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en een T-75-celkweekkolf met confluente HEK293T cellen. Verwarm de media voor op 37 °C.
  2. Controleer in een T-75-kolf of de confluentie ongeveer 80%-100% confluent is door een omgekeerde microscoop.
  3. Gebruik in de bioveiligheidskast een serologische pipet om de gebruikte media uit de celkweekkolf op te zuigen. Raak het oppervlak of het plastic van de kolf niet aan. Gooi de gebruikte media en aspirator weg in de afvalcontainer.
  4. Was de cellen voorzichtig met ongeveer 10 ml DPBS door het in een hoek van de kolf op te zuigen en voorzichtig rond het oppervlak te draaien. Zuig de DPBS uit de kolf en gooi de was en de aspirator in de afvalcontainer.
  5. Voeg 1,5 ml 0,05% trypsine-EDTA toe om het oppervlak van de kolf te bedekken en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Tik zachtjes op de kolf om de cellen van het oppervlak los te maken.
  6. Voeg 8,5 ml verse DMEM toe aan de kolf. Resuspendeer en meng de cellen met een serologische pipet totdat alle aggregaten zijn afgebroken door op en neer te zuigen.
  7. Verzamel 9 ml celsuspensie in een conische buis van 15 ml.
    1. Voeg 9 ml verse DMEM toe aan de kolf en plaats deze in een incubator bij 37 °C en 5% CO2
  8. Meng met behulp van een hemocytometer 10 μL gesuspendeerde cellen met 10 μL Trypan blauwe kleurstof in een verhouding van 1:1 om de concentratie van cellen te berekenen. Gebruik deze waarde om voldoende cellen voor te bereiden om op het bord te zaaien.
  9. Zaai ~35.000 cellen in 100 μL voor elk putje van een hoogwaardige #1.5 zwarte glazen bodemplaat met 96 putjes en plaats deze gedurende 24 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 .

2. 2pLACE transfectie optimalisatie

  1. Voor één putje en 10% overmaat, aliquoot 11 μL warme serumvrije DMEM (SFM) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  2. Met behulp van een CRY2-eGFP: CIBN-gRNA-plasmide-massaverhoudingen gelijk aan 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 en 9:1, aliquoot 110 ng voor elk putje van totaal DNA tot de aliquots van SFM (Tabel 1).
  3. Als positieve controle wordt dezelfde massa CMV-eGFP-plasmide aan verschillende aliquots SFM toegevoegd.
  4. Voor elke put, aliquoot 11 μL SFM voor verdunning van het transversiereagens.
  5. Bereid het transfectiereagens voor bij een verhouding van 1:3 massa (μg) aan volume (μL) van DNA en transfectiereagens.
  6. Voeg verdund transfectiereans toe aan het verdunde DNA en incubeer gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur om de transfectiecomplexen tot stand te brengen.
  7. Voeg ~20 μL van het transfectiecomplex toe aan elk putje. Zorg ervoor dat het de wanden van de put niet raakt.
  8. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en plaats deze gedurende 24 uur in een broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .

3. 2pLACE-activering

  1. Wijzig de invoercode van de microcontroller om de gewenste putten te verlichten met behulp van deze instellingen (aanvullend coderingsbestand 1, regels 147 - 158).
    1. LED-intensiteit: 9,27 mW/cm2 (aanvullend coderingsbestand 1, regels 200 - 215).
    2. Pulslengte: 1 s (aanvullend coderingsbestand 1, regels 280 - 290).
    3. Pulsfrequentie: 0,067 Hz (elke 15 s) (aanvullend coderingsbestand 1, regels 264 - 278).
      OPMERKING: De golflengte-instellingen worden bepaald door de soorten geïnstalleerde LED's.
  2. Spuit het 3D-geprinte deksel van de OptoPlate in met 70% ethanol en laat het drogen in een bioveiligheidskast.
  3. Zet een rode lichtlamp in de donkere kamer aan en plaats de plaat met 96 putjes in een bioveiligheidskast en plaats het deksel terug door het gedroogde 3D-geprinte deksel.
    OPMERKING: Men kan optioneel de CMV-eGFP-cellen bekijken met behulp van fluorescentiemicroscopie om de transfectie-efficiëntie te schatten.
  4. Neem de plaat met 96 putjes en plaats deze op de LED-array om het LED-array-apparaat te bouwen. Zorg ervoor dat de plaat op zijn plaats klikt.
  5. Sluit de microcontroller-, LED- en ventilatorpoorten aan op een stroombron.
  6. Spuit de draden voorzichtig af met 70% ethanol en veeg ze droog.
  7. Plaats het LED-array-apparaat gedurende 24 uur in een broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 . Zorg ervoor dat de LED's volgens de regels worden ingeschakeld en dat de draden niet strak staan wanneer de couveuse is afgedicht.

4. Voorbereiding van flowcytometrie

  1. In een omgeving met rood licht verwijdert u de OptoPlate en plaatst u de plaat in een bioveiligheidskast
    OPMERKING: Men kan de cellen optioneel bekijken door middel van fluorescentiemicroscopie om de lichtinductie visueel te bevestigen.
  2. Zuig zorgvuldig alle media uit elke put op.
  3. Maak de cellen los met 30 μl 0,05% trypsine-EDTA en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
  4. Meng elk putje met 100 μL koude FACS-buffer (1% FBS in PBS) tot het eencellig is.
  5. Breng elk monster over in een plaat met 96 putjes met V-bodem.
  6. Centrifugeer de V-bodem 96-wells plaat op 164 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Zuig 80 μL supernatans op zonder de pellet te verstoren.
  8. Voeg 200 μL koude FACS-buffer toe om de pellet opnieuw te suspenderen.
  9. Wikkel de V-bodem 96-well plaat in aluminiumfolie voor lichte isolatie.
  10. Plaats de plaat in een piepschuimen doos met ijs voor transport.

5. Flowcytometrie, gating en gegevensverzameling

  1. Zet de flowcytometer aan met de schakelaar aan de achterkant en open de bijbehorende flowcytometriesoftware op de computer.
  2. Voer het opstartprogramma van het systeem uit en laad 2 ml DI-water in de monsterlader (aanvullende afbeelding 1A).
  3. Voer kwaliteitscontrole (QC) uit met behulp van de meegeleverde QC-kralen (aanvullende afbeelding 1B).
  4. Zorg ervoor dat de flowcytometer in de plaatbemonsteringsmodus staat (aanvullende afbeelding 1C).
  5. Stel monsterputten in en specificeer ze (aanvullende afbeelding 1D).
  6. Maak de volgende spreidingsdiagrammen en tabellen (aanvullende afbeelding 2A).
    1. Zijwaartse verstrooiing (SSC-A) versus voorwaartse verstrooiing (FSC-A).
    2. SSC-H tegen SSC-A.
    3. SSC-A tegen FITC-A.
    4. FITC-A statistische tabel (aanvullende figuur 2B).
  7. Klik de V-bodemplaat in de plaatlader van de cytometer.
  8. Selecteer een niet-getransfecteerde put en klik op Initialiseren en klik vervolgens op Uitvoeren.Zorg ervoor dat de volumebemonsteringsfrequentie 10 μL/min is (aanvullende afbeelding 2C).
  9. Pas SSC- en FITC-spanningen aan om de populatie van belang te centreren op de SSC-A versus FSC-A-plot (aanvullende afbeelding 2C).
    1. Maak een veelhoek om de gezonde celpopulatie van interesse te poorten (aanvullende figuur 2D).
    2. Maak een polygoon om te gaten voor doubletdiscriminatie op de SSC-H versus SSC-A-plot.
    3. Pas de FITC-spanning aan om niet-getransfecteerde cellen links van de SSC-A versus FITC-A-plot te plaatsen (aanvullende afbeelding 2D).
  10. Herhaal dit voor de resterende niet-getransfecteerde putjes en noteer de gemiddelde FITC-A-gegevens.
  11. Selecteer een CMV-eGFP die goed is getransfecteerd en klik op Uitvoeren.
  12. Pas de FITC-spanning aan om zowel autofluorescerende als fluorescerende cellen vast te leggen in de SSC-A versus FITC-A-plot.
    1. Maak een veelhoek om de fluorescerende cellen af te schermen tegen de niet-fluorescerende cellen, terwijl wordt verwezen naar de initiële poort in niet-getransfecteerde cellen (aanvullende figuur 2E).
  13. Neem monsters automatisch op bij 60 μL/min totdat 200 s zijn bereikt en/of gebeurtenissen 10.000 hebben bereikt (aanvullende figuur 2F).
  14. Exporteer Mean FITC als een CSV-bestand en analyseer de gegevens.
  15. Reinig de flowcytometer via de optie Dagelijkse reiniging (aanvullende afbeelding 2G).

6. Optimalisatie van de LED-intensiteit

  1. Bewerk het microcontrollerscript om de gewenste LED-intensiteiten te testen (aanvullend coderingsbestand 1, regels 200-215).
    OPMERKING: Equivalente LED-intensiteiten met betrekking tot de waarden in het microcontrollerscript worden elders gerapporteerd38. Zelfkalibratie kan nodig zijn bij het gebruik van verschillende LED's.
  2. Zorg ervoor dat het script de volgende waarden bevat (aanvullend coderingsbestand 1, regels 200-215) zoals beschreven in tabel 2 en upload de code naar de microcontroller.
  3. Herhaal stap 1-5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door workflow-elementen uit eerdere literatuur 37,38,55 over te nemen, hebben we gelijktijdige verlichting met hoge doorvoer van de OptoPlate-96 toegevoegd en een pijplijn gedemonstreerd om snel een licht-induceerbaar genexpressiesysteem in zoogdiercellen te optimaliseren (Figuur 1).

Voor induceerbare genexpressiesystemen zijn hoge dynami...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert de optogenetische controle van een transiënte genexpressie met meerdere componenten in zoogdiercellen, waardoor andere onderzoekers snel en gelijktijdig modulaire optogenetische systemen kunnen karakteriseren met een fluorescerende reporter.

In dit geval werd een lichtinduceerbaar systeem met twee plasmiden geoptimaliseerd voor de expressie van eGFP in HEK293T cellen. Voor succesvolle co-transfectie is het essentieel om zaaidichtheden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het Translational Research Institute via NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A en door het Good Foods Institute. Dit project werd ondersteund door het UC Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory met technische assistentie van Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke en Ashley Karajeh, met financiering van het NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) en S10OD018223 (Beckman Coulter "Cytoflex" cytometer).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR10025-724
10 mL Reagent ReservoirsVWR77395-252
10 mL serological pipettesVWR75816-100
1000 μL filter tipsVWR76322-154
15 mL High-Performance Centrifuge Tubes, flat capVWR89039-664
1931-C Optical Power MeterNewport1931-C
2 mL serological pipettesVWR75816-104
20 μL filter tipsVWR76322-134
200 μL filter tipsVWR76322-150
50 mL High-Performance Centrifuge Tubes, flat capVWR89039-656
96-well v-bottom platesBRANDplates781661
A21, LED Red light bulbBluex BulbsN/Arood lichtbron
Arduino IDE SoftwareArduinoN/A
Biosafety Cabinet, Class IINuAireN/A
Bright-Line HemocytometerHausser Scientific3110
Cell counting slidesBioRad1450016
Cell Culture Plate 96-well, #1.5H glass bottom plateCellvisP96-1.5H-N
CytExpert SoftwareBeckman CoulterN/A
CytoFLEX Ready to Use Daily QC FluorospheresBeckman CoulterC657194 °C
CytoFLEX-S Flow Cytometer (4 violet, 2 blue, 4 Yellow Green, 3 Red channels)Beckman CoulterC09766
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline powder, no calicum, no magnesiumFisher Scientific21600069Kamertemperatuur
Eppendorf Centrifuge 5804Eppendorf022622501v-bottom plate centrifuge stap
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8-channel, variable volume, 30 - 300 μLEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 100 - 1000 μLEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 2 - 20 μLEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 20 - 200 μLEppendorf3123000055
General Purpose Laboratory Labeling TapeVWR89097-920
Gibco DMEM, powder, high glucoseFisher Scientific121000614 °C
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15-250-061Kamertemperatuur
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 °C
Gibco, Trypsin-EDTA (0.05%), with EDTA, Animal Origin, 1X, Phenol Red, 500 mLGibco25300062-20 °C
HEK293T CellsATCCCRL-11268-80 °C, vloeibare stikstof
Lab markers, MicronovaVWR89205-944
Metal Desk LampSimple DesignsN/ALamp voor rood licht
OptoPlate-96LABmakerN/A
Pipet-aid XPDrummond4-000-101
Plasmid: CIBN-gRNAN/AN/A-20 °C
Plasmid: CMV-eGFPN/AN/A-20 °C
Plasmid: CRY2-eGFPN/AN/A-20 °C
PolyJet DNA In Vitro Transfection ReagentFisher ScientificNC15361174 °C
T-75 Cell Culture FlaskVWR10062-860
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-884

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische systemeninduceerbare genexpressieCRISPR effectorflowcytometriehigh throughput screeningblauw lichtactivatieHEK293T cellenfluorescentiebeeldvorming

Gerelateerde artikelen