Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Samenvatting

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Samenvatting

Induceerbare genexpressietools kunnen nieuwe toepassingen openen in de menselijke gezondheid en biotechnologie, maar de huidige opties zijn vaak duur, moeilijk terug te draaien en hebben ongewenste off-target effecten. Optogenetische systemen gebruiken lichtgevoelige eiwitten om de activiteit van regulatoren te regelen, zodat de expressie wordt geregeld met de "flip of a switch". Deze studie optimaliseert een vereenvoudigd lichtgeactiveerd CRISPR-effectorsysteem (2pLACE), dat afstembare, omkeerbare en nauwkeurige controle van de genexpressie van zoogdieren biedt. De OptoPlate-96 maakt high-throughput screening mogelijk via flowcytometrie voor single-cell analyse en snelle optimalisatie van 2pLACE. Deze studie laat zien hoe het 2pLACE-systeem met de OptoPlate-96 in HEK293T cellen kan worden gebruikt om de optimale componentverhoudingen te identificeren voor het maximaliseren van het dynamisch bereik en om de responscurve voor de intensiteit van blauw licht te vinden. Soortgelijke workflows kunnen worden ontwikkeld voor andere zoogdiercellen en voor andere optogenetische systemen en golflengten van licht. Deze ontwikkelingen verbeteren de precisie, schaalbaarheid en het aanpassingsvermogen van optogenetische hulpmiddelen voor bioproductietoepassingen.

Inleiding

Synthetische biologie-instrumenten zoals induceerbare genexpressiesystemen hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan biologisch onderzoek. Hun vermogen om genexpressie op een afstembare, omkeerbare en nauwkeurige manier te reguleren, kan de controle van de eiwitproductie verbeteren 1,2,3,4,5,6, celmorfologie 7,8,9,10,11,12

Protocol

1. Plateren van HEK293T cellen in een formaat met 96 putjes

1. Verzamel in een bioveiligheidskast een bleekafvalcontainer, serologische pipetten, pipethulpmiddel, Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), Dulbecco-gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en een T-75-celkweekkolf met confluente HEK293T cellen. Verwarm de media voor op 37 °C.
2. Controleer in een T-75-kolf of de confluentie ongeveer 80%-100% confluent is door een omgekeerde microscoop.
3. Gebruik in de bioveiligheidskast een serologische pipet om de gebruikte media uit de celkweekkolf op te zu....

Resultaten

Door workflow-elementen uit eerdere literatuur 37,38,55 over te nemen, hebben we gelijktijdige verlichting met hoge doorvoer van de OptoPlate-96 toegevoegd en een pijplijn gedemonstreerd om snel een licht-induceerbaar genexpressiesysteem in zoogdiercellen te optimaliseren (Figuur 1).

Voor induceerbare genexpressiesystemen zijn hoge dynami.......

Discussie

Dit protocol demonstreert de optogenetische controle van een transiënte genexpressie met meerdere componenten in zoogdiercellen, waardoor andere onderzoekers snel en gelijktijdig modulaire optogenetische systemen kunnen karakteriseren met een fluorescerende reporter.

In dit geval werd een lichtinduceerbaar systeem met twee plasmiden geoptimaliseerd voor de expressie van eGFP in HEK293T cellen. Voor succesvolle co-transfectie is het essentieel om zaaidichtheden.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	10025-724
10 mL Reagent Reservoirs	VWR	77395-252
10 mL serological pipettes	VWR	75816-100
1000 μL filter tips	VWR	76322-154
15 mL High-Performance Centrifuge Tubes, flat cap	VWR	89039-664
1931-C Optical Power Meter	Newport	1931-C
2 mL serological pipettes	VWR	75816-104
20 μL filter tips	VWR	76322-134
200 μL filter tips	VWR	76322-150
50 mL High-Performance Centrifuge Tubes, flat cap	VWR	89039-656
96-well v-bottom plates	BRANDplates	781661
A21, LED Red light bulb	Bluex Bulbs	N/A	rood lichtbron
Arduino IDE Software	Arduino	N/A
Biosafety Cabinet, Class II	NuAire	N/A
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	3110
Cell counting slides	BioRad	1450016
Cell Culture Plate 96-well, #1.5H glass bottom plate	Cellvis	P96-1.5H-N
CytExpert Software	Beckman Coulter	N/A
CytoFLEX Ready to Use Daily QC Fluorospheres	Beckman Coulter	C65719	4 °C
CytoFLEX-S Flow Cytometer (4 violet, 2 blue, 4 Yellow Green, 3 Red channels)	Beckman Coulter	C09766
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline powder, no calicum, no magnesium	Fisher Scientific	21600069	Kamertemperatuur
Eppendorf Centrifuge 5804	Eppendorf	022622501	v-bottom plate centrifuge stap
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625501
Eppendorf Research plus, 8-channel, variable volume, 30 - 300 μL	Eppendorf	3125000052
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 100 - 1000 μL	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 2 - 20 μL	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus, single-channel, variable volume, 20 - 200 μL	Eppendorf	3123000055
General Purpose Laboratory Labeling Tape	VWR	89097-920
Gibco DMEM, powder, high glucose	Fisher Scientific	12100061	4 °C
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061	Kamertemperatuur
Gibco Value Heat Inactivated FBS	Fisher Scientific	A5256901	-20 °C
Gibco, Trypsin-EDTA (0.05%), with EDTA, Animal Origin, 1X, Phenol Red, 500 mL	Gibco	25300062	-20 °C
HEK293T Cells	ATCC	CRL-11268	-80 °C, vloeibare stikstof
Lab markers, Micronova	VWR	89205-944
Metal Desk Lamp	Simple Designs	N/A	Lamp voor rood licht
OptoPlate-96	LABmaker	N/A
Pipet-aid XP	Drummond	4-000-101
Plasmid: CIBN-gRNA	N/A	N/A	-20 °C
Plasmid: CMV-eGFP	N/A	N/A	-20 °C
Plasmid: CRY2-eGFP	N/A	N/A	-20 °C
PolyJet DNA In Vitro Transfection Reagent	Fisher Scientific	NC1536117	4 °C
T-75 Cell Culture Flask	VWR	10062-860
Water Jacketed CO2 Incubator	VWR	10810-884