Method Article

Driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van beeldvorming van het hele weefsel

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie presenteert een 3D-beeldvormingsmethode met behulp van darmweefsel en multi-fotonmicroscopie om uitgescheiden slijm te kwantificeren, waardoor nauwkeurige volumetrische analyse en visualisatie van slijmdynamiek mogelijk is als reactie op stimuli zoals carbamoylcholinechloride.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Slijm speelt een cruciale rol bij het handhaven van de darmhomeostase door de spijsvertering te vergemakkelijken, een barrière te vormen tegen microben en de immuunrespons in de darm te reguleren. De afscheiding wordt gemoduleerd door verschillende intrinsieke en extrinsieke factoren, waaronder microbiële infecties en ontstekingen. Terwijl traditionele methoden voor slijmanalyse gebaseerd zijn op relatieve kwantificering, zoals het meten van de slijmdikte in histologische secties, bieden deze benaderingen een beperkt inzicht in het werkelijke volume en de ruimtelijke verdeling van uitgescheiden slijm in het darmlumen. Hier presenteren we een gedetailleerde methodologie voor de absolute, driedimensionale kwantificering van slijm met behulp van darmweefsel en multifotonenmicroscopie. Dit protocol omvat de voorbereiding van geligeerde darmlussen, behandeling met carbamoylcholinechloride als stimulans voor activering van slijmbekercellen, weefselfixatie en kleuring voor beeldvorming. Met behulp van multi-fotonmicroscopie verkrijgen we Z-gestapelde beelden van het luminale oppervlak. Deze worden in de software van Imaris verwerkt om het volume en de ruimtelijke verdeling van uitgescheiden slijm te kwantificeren. We tonen aan dat carbamoylcholinechloride binnen 30 minuten op robuuste wijze slijmafscheiding induceert in zowel ileum- als colonweefsel. Het uitgescheiden slijm verschijnt op een sporadische en discontinue manier door het lumen, wat het belang van volumetrische analyse ten opzichte van traditionele tweedimensionale benaderingen onderstreept. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om absolute kwantitatieve gegevens te verkrijgen en de slijmverdeling in situ te visualiseren, en biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de dynamiek van darmslijm onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mucosale omgeving van het maagdarmkanaal van zoogdieren is zeer dynamisch en ondersteunt de kolonisatie van een diverse microbiële gemeenschap. Het darmepitheel bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen die samenwerken om voedingsstoffen op te nemen, de integriteit van de barrière te behouden en te communiceren met het immuunsysteem1. Hiervan slaan slijmbekercellen mucinekorrels op en scheiden ze slijm af in het lumen onder steady-state omstandigheden. Dit slijm vormt een kritieke fysieke barrière, die direct microbieel contact met de epitheellaag voorkomt, weefselontsteking moduleert en de darmhomeostase 2,3 handhaaft. Ontregeling van de slijmafscheiding brengt de barrièrefunctie in gevaar en is in verband gebracht met ontsteking en tumorigenese 4,5,6,7.

De secretie van darmslijm kan worden veroorzaakt door intrinsieke factoren, zoals de neurotransmitter acetylcholine, en door microbiële componenten uit commensalen 8,9. Gezien de complexiteit van de darmomgeving, blijven veel factoren die van invloed zijn op de secretie van slijmbekercellen onontgonnen. Daarom is een nauwkeurige methode voor het kwantificeren van luminaal slijm essentieel om te onderzoeken hoe verschillende stimuli de secretiedynamiek beïnvloeden. Traditionele benaderingen zijn voornamelijk gebaseerd op relatieve kwantificering: bijvoorbeeld het meten van de slijmdikte met behulp van fluorescerende of houtskooldeeltjes in ex vivo darmexplantatiesystemen10,11, of het beoordelen van de afstand tussen luminale microben en het epitheel in gekleurde weefselsecties12,13. Hoewel deze methoden handig zijn voor relatieve vergelijkingen, kunnen ze niet de volledige verdeling of driedimensionale structuur van uitgescheiden slijm vastleggen, vooral omdat uitgescheiden slijm het epitheel niet altijd uniform bedekt.

In deze studie presenteren we een methode voor driedimensionale visualisatie en absolute kwantificering van luminaal slijm met behulp van darmweefsel in de hele berg. Deze benadering vereist fixatie van vers weefsel met een geschikt fixatief om de structurele integriteit en morfologie te behouden, gevolgd door fluorescerende kleuring en beeldvorming met behulp van een confocale of multifotonmicroscoop. Door testmiddelen rechtstreeks toe te dienen in geligeerde darmlussen van diep verdoofde muizen, gevolgd door onmiddellijke fixatie, behoudt de methode de inheemse slijmarchitectuur en maakt analyse van de secretiekinetiek mogelijk. Vergeleken met doorgesneden weefsels, waar de beeldvormingsdiepte voornamelijk wordt beperkt door de weefseldikte, bereikt de beeldvormingsdiepte van hele weefsels (zonder delipidatie) ongeveer 200-300 μm, beperkt door lichtverstrooiing en weefselopaciteit. Met behulp van deze techniek tonen we aan dat carbamoylcholinechloride (CCh), een acetylcholine-analoog waarvan de receptoren tot expressie worden gebracht op slijmbekercellen14, op robuuste wijze een snelle slijmafscheiding induceert. Met name vormt het uitgescheiden slijm zowel een continue laag langs het epitheel als discontinue structuren in het lumen, kenmerken die moeilijk te detecteren zijn in conventionele weefselsecties. Dit protocol biedt een robuust platform voor het kwantificeren van de driedimensionale verdeling van darmslijm en voor het vergelijken van het slijminducerende potentieel van verschillende stimuli.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Chang Gung University. De dierenfaciliteit van Chang Gung University is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). In deze onderzoeken werden geen problemen met de diergezondheid waargenomen.

1. Voorbereiding van de fixatiebasis

  1. Meng agarosepoeder met ddH2O tot een concentratie van 4% (m/v) in een magnetronkolf. Magnetron gedurende 2-3 minuten tot het kookt zonder kleine belletjes.
    OPMERKING: Het volume is afhankelijk van het aantal monsters; ongeveer 10 ml voor een schaal van 6 cm.
  2. Laat de agaroseoplossing afkoelen tot ~60 °C in ~3 min. Giet de agarose voorzichtig in een schaal van 6 cm tot de vloeistofhoogte de helft van de schaal bereikt (ongeveer 10 ml voor een schaal van 6 cm).
  3. Zet de schaal met deksel 20-30 minuten in een afgesloten ruimte, tot de agarose volledig gestold is.

2. Voorbereiding van het bevestigingsmateriaal

  1. Bereid nieuwe koperdraden voor en knip ze in lengtes van 5 mm. Voor elk stuk weefsel zijn 6-8 stukjes draad nodig.

3. Bereiding van CCh-oplossing

  1. Los kristallijn CCh op in steriele PBS-buffer tot een uiteindelijke concentratie van 10 μM (200 μL voor één darmlus).

4. Bereiding van injecteerbare anesthetica

  1. Om de stockoplossing voor anesthesie te bereiden, lost u 2,2,2-tribroomethanol op in 2-methyl-2-butanol.
  2. Gebruik steriel PBS om de stockoplossing te verdunnen, zodat de uiteindelijke werkoplossing 30 mg/ml 2,2,2-tribroomethanol en 3% (v/v) 2-methyl-2-butanol bevat.
  3. Draai grondig gedurende ~1 min totdat er geen pellet meer in oplossing is (maximale snelheid: 8).
  4. Bewaar de stockoplossing in het donker bij 4 °C om degradatie te voorkomen; Gooi de bouillon 1 maand na bereiding weg.
  5. Zuig vóór de verdoving de stockoplossing op in steriel PBS en meng goed om een gelijkmatige verspreiding te garanderen, waardoor een uiteindelijke dosis van 250 mg/kg per muis wordt bereikt.
    LET OP: 2,2,2-Tribroomethanol heeft neurotoxiciteit en 2-methyl-2-butanol is vluchtig en heeft een irriterende geur. Er moeten de juiste beschermingsmiddelen worden gebruikt. Verzamel het afval voor verwijdering in een verzegelde container en volg de procedures voor de verwijdering van gevaarlijk chemisch afval van de instelling.

5. Intestinale inoculatie via lusinjectie

  1. Verdoof een muis van 6-8 weken oud met een intraperitoneale injectie van 200 μl 2,2,2-tribroomethanol (250 mg/kg per muis) en plaats de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden.
  2. Nadat u het huidoppervlak met alcohol hebt gesteriliseerd, maakt u met een operatieschaar een incisie in de linker onderbuik van de muis en stelt u de blindedarm onder narcose bloot.
  3. Identificeer het ileum of proximale colon, plaats de darmlus op een steriel gaasje en gebruik arteriële klemmen om beide uiteinden vast te zetten, zodat een gesloten lus van 3 cm ontstaat.
  4. Spoel het orgaan op het gaas af met steriel PBS.
  5. Injecteer onder narcose steriel PBS- of CCh-reagens in een volume van niet meer dan 200 μl in de geligeerde darmlus.

6. Weefseloogst, fixatie en kleuring

  1. Euthanaseer na 30 minuten behandeling de muis door cervicale dislocatie en oogst de darmlus.
  2. Gebruik een tang om de darmlus vast te houden en spoel deze voorzichtig af in steriel PBS.
  3. Snijd de darmlus voorzichtig in de lengterichting open en spoel het weefsel in steriel PBS.
  4. Druk de tissue plat en gebruik segmenten van koperdraad om het in een schaal van 6 cm aan de agarose te verankeren.
  5. Fixeer de tissue met 10 ml 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 12-24 uur in de schaal.
  6. Was de tissue minstens 3x met PBS om achtergebleven paraformaldehyde te verwijderen.
  7. Dompel het weefsel onder in 10 ml blokkeerbuffer (PBS aangevuld met 0,4% Triton X-100 en 3% runderserumalbumine [BSA]) bij 4 °C gedurende 12-24 uur in het schaaltje.
  8. Kleur het weefsel met tarwekiemagglutinine (WGA, 1:200) en falloïdine (1:500) in blokkeerbuffer en schud bij 120 tpm bij 4 °C gedurende 12-24 uur in de schaal.
    OPMERKING: Om het kleurstofverbruik te minimaliseren, kan het weefsel worden verankerd op gestolde agarose in een schaaltje van 3 cm ondergedompeld in 2 ml kleurstofbuffer voor kleuring.
    LET OP: Paraformaldehyde vormt een gevaar voor inademing. Tijdens het hanteren moeten de juiste beschermingsmiddelen worden gebruikt, zoals bij gebruik in een zuurkast. Verzamel het afval voor verwijdering in een verzegelde container en volg de procedures voor de verwijdering van gevaarlijk chemisch afval van de instelling.

7. Beeldopname door multifotonmicroscopie

  1. Was de resterende kleurbuffer minimaal 3x uit met PBS.
  2. Veranker het weefsel op agarose met koperdraden in een schaaltje van 6 cm in 10 ml PBS.
  3. Verkrijg 100 optische secties (met een diepte van 99 μm) darmweefsel en bijbehorend uitgescheiden slijm met behulp van een multifotonmicroscoop die is uitgerust met een hoge NA-objectieflens voor diepe weefselbeeldvorming. Gebruik een excitatiebron voor multifotonmicroscopie die is ingesteld op een golflengte van 750 nm. Verzamel emissiesignalen met behulp van BP500-550 nm en BP565-610 nm banddoorlaatfilters. Stel de scansnelheid in op 8.
    OPMERKING: Voor multifotonmicroscopie is de maximale scansnelheid 9, waarbij hogere waarden duiden op een snellere acquisitie. De snelheidsinstelling is afhankelijk van de capaciteit van de microscoop. Bij het gebruik van het beeldvormingsplatform dat wordt gebruikt om 3D-stacks te verkrijgen, raden we een scansnelheid van 8 aan om de acquisitietijd en beeldkwaliteit in evenwicht te brengen.

8. Beeldanalyse en kwantificering van slijm (Figuur 1)

  1. Om het volume van elk slijmdeeltje (in het WGA-kanaal) te meten, opent u de afbeeldingsstapel in Imaris door het bestand naar de Arena-pagina te slepen en neer te zetten . Klik op het pictogram Surface om de workflow voor het maken van oppervlakken te starten. Volg de standaardstappen om deeltjesvolumes binnen de z-stack te segmenteren en te kwantificeren. Specifieke parameters en verwerkingsstappen worden beschreven in figuur 1.
  2. Sluit slijmdeeltjes kleiner dan 1.000 μm3 uit, die meestal slijmbekercellen zijn (Figuur 2A,B).
  3. Som de hoeveelheid uitgescheiden slijm voor elke groep samen.

9. Statistische analyse

  1. Analyseer en vergelijk het totale volume voor elke groep. Voer de waarde van het slijmvolume in Kolom in en analyseer met behulp van een niet-parametrische Mann-Whitney-test.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze methode kwantificeerden we het volume van darmslijm uit gestapelde beelden van hele weefsels verkregen via multifotonmicroscopie. Darmweefsels werden gekleurd met fluorescerend falloïdine en tarwekiemagglutinine (WGA) om respectievelijk cellulaire F-actine en slijm te visualiseren15,16. In zowel ileum- als colonweefsel dat met PBS werd behandeld, werd WGA+-slijm voornamelijk gedetecteerd in slijmbekercellen aan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een methode voor driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van weefselkleuring in de hele berg, multi-fotonmicroscopie en analyse met Imaris-software. Deze procedure maakt het mogelijk om de discontinue verdeling van slijm in het darmlumen te observeren en zorgt voor een absolute meting van het slijmvolume.

Discontinue slijmverdeling bij stimulatie is ook waargenomen in explantatieweefselkweeksystemen8...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Microscopy Core Laboratory, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, voor technische assistentie. We willen ook de hulp van de Imaging Core Facility van de National Yang Ming Chiao Tung University voor de service van Zeiss LSM 7 MP Multi-Photon Microscoop erkennen, in het bijzonder mevrouw Pei-jun Chen en Yung-yu Lu voor hun technische ondersteuning. De auteurs willen de steun van NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 en 113-2628-B-182-002-MY3 (aan YHT) erkennen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribromoethanolSigma-AldrichT48402
2-methyl-2-butanolSigma-Aldrich240486
6 cm dish Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
Carbamoylcholine chloride ≥98% (titration), crystallineSIGMASI-C4382-1G
Copper wire (new)TOP TECH WIRE & CABLE INDUSTRIALIW00125Koperdraad zonder isolatielaag
ForcepsShinetehST-M110
Gauze, sterielGMTHMay-40
GraphPad Prism 8 GraphPad Software
VerwarmingskussensCONFORTSY-666
IMARIS 10.0.0OXFORD INSTRUMENTS
ParaformaldehydeBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Phalloidin Labeling ProbesInvitrogenA12379
SchaarShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA) ConjugatesBiotium29027
Zeiss 7MP met een W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III water-immersie objectief (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti saffier femtosecondelaser (zonder DeepSee-module) met BP500 nm-550 nm en BP565 nm-610 nm detectoren en 750 nm lasergolflengtebeeldvormingsplatform dat wordt gebruikt om 3D-stacks te verwerven met een hoog-NA objectieflens voor diep weefselbeeldvorming; een excitatiebron voor multifotonmicroscopie ingesteld op een golflengte van 750 nm

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
  3. Johansson, M. E., et al. The inner of the two muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (39), 15064-15069 (2008).
  4. Nyström, E. E., et al. An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function. Science. 372 (6539), eabb1590(2021).
  5. Van Der Post, S., et al. Structural weakening of the colonic mucus barrier is an early event in ulcerative colitis pathogenesis. Gut. 68 (12), 2142-2151 (2019).
  6. Van Der Sluis, M., et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that muc2 is critical for colonic protection. Gastroenterology. 131 (1), 117-129 (2006).
  7. Velcich, A., et al. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin muc2. Science. 295 (5560), 1726-1729 (2002).
  8. Birchenough, G. M., Nyström, E. E., Johansson, M. E., Hansson, G. C. A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggering NLRP6-dependent Muc2 secretion. Science. 352 (6293), 1535-1542 (2016).
  9. Dolan, B., Ermund, A., Martinez-Abad, B., Johansson, M. E., Hansson, G. C. Clearance of small intestinal crypts involves goblet cell mucus secretion by intracellular granule rupture and enterocyte ion transport. Sci Signal. 15 (752), eabl5848(2022).
  10. Gustafsson, J. K., et al. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  11. Sawaed, J., et al. Antibiotics damage the colonic mucus barrier in a microbiota-independent manner. Sci Adv. 10 (37), eadp4119(2024).
  12. Bergstrom, K., et al. Core 1-and 3-derived o-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice. Mucosal Immunol. 10 (1), 91-103 (2017).
  13. Cortez, V., et al. Astrovirus infects actively secreting goblet cells and alters the gut mucus barrier. Nat Commun. 11 (1), 2097(2020).
  14. Knoop, K. A., Mcdonald, K. G., Mccrate, S., Mcdole, J. R., Newberry, R. D. Microbial sensing by goblet cells controls immune surveillance of luminal antigens in the colon. Mucosal Immunol. 8 (1), 198-210 (2015).
  15. Nikitas, G., et al. Transcytosis of Listeria monocytogenes across the intestinal barrier upon specific targeting of goblet cell accessible E-cadherin. J Exp Med. 208 (11), 2263-2277 (2011).
  16. Tsai, Y. H., Disson, O., Bierne, H., Lecuit, M. Murinization of internalin extends its receptor repertoire, altering Listeria monocytogenes cell tropism and host responses. PLoS Pathog. 9 (5), e1003381(2013).
  17. Birchenough, G. M., Johansson, M. E., Gustafsson, J. K., Bergstrom, J. H., Hansson, G. C. New developments in goblet cell mucus secretion and function. Mucosal Immunol. 8 (4), 712-719 (2015).
  18. Maheras, K. J., Gow, A. Increased anesthesia time using 2,2,2-tribromoethanol-chloral hydrate with low impact on mouse psychoacoustics. J Neurosci Methods. 219 (1), 61-69 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles