Driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van beeldvorming van het hele weefsel

Summary

Deze studie presenteert een 3D-beeldvormingsmethode met behulp van darmweefsel en multi-fotonmicroscopie om uitgescheiden slijm te kwantificeren, waardoor nauwkeurige volumetrische analyse en visualisatie van slijmdynamiek mogelijk is als reactie op stimuli zoals carbamoylcholinechloride.

Abstract

Slijm speelt een cruciale rol bij het handhaven van de darmhomeostase door de spijsvertering te vergemakkelijken, een barrière te vormen tegen microben en de immuunrespons in de darm te reguleren. De afscheiding wordt gemoduleerd door verschillende intrinsieke en extrinsieke factoren, waaronder microbiële infecties en ontstekingen. Terwijl traditionele methoden voor slijmanalyse gebaseerd zijn op relatieve kwantificering, zoals het meten van de slijmdikte in histologische secties, bieden deze benaderingen een beperkt inzicht in het werkelijke volume en de ruimtelijke verdeling van uitgescheiden slijm in het darmlumen. Hier presenteren we een gedetailleerde methodologie voor de absolute, driedimensionale kwantificering van slijm met behulp van darmweefsel en multifotonenmicroscopie. Dit protocol omvat de voorbereiding van geligeerde darmlussen, behandeling met carbamoylcholinechloride als stimulans voor activering van slijmbekercellen, weefselfixatie en kleuring voor beeldvorming. Met behulp van multi-fotonmicroscopie verkrijgen we Z-gestapelde beelden van het luminale oppervlak. Deze worden in de software van Imaris verwerkt om het volume en de ruimtelijke verdeling van uitgescheiden slijm te kwantificeren. We tonen aan dat carbamoylcholinechloride binnen 30 minuten op robuuste wijze slijmafscheiding induceert in zowel ileum- als colonweefsel. Het uitgescheiden slijm verschijnt op een sporadische en discontinue manier door het lumen, wat het belang van volumetrische analyse ten opzichte van traditionele tweedimensionale benaderingen onderstreept. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om absolute kwantitatieve gegevens te verkrijgen en de slijmverdeling in situ te visualiseren, en biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de dynamiek van darmslijm onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Introduction

De mucosale omgeving van het maagdarmkanaal van zoogdieren is zeer dynamisch en ondersteunt de kolonisatie van een diverse microbiële gemeenschap. Het darmepitheel bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen die samenwerken om voedingsstoffen op te nemen, de integriteit van de barrière te behouden en te communiceren met het immuunsysteem¹. Hiervan slaan slijmbekercellen mucinekorrels op en scheiden ze slijm af in het lumen onder steady-state omstandigheden. Dit slijm vormt een kritieke fysieke barrière, die direct microbieel contact met de epitheellaag voorkomt, weefselontsteking moduleert en de darmhomeo....

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Chang Gung University. De dierenfaciliteit van Chang Gung University is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). In deze onderzoeken werden geen problemen met de diergezondheid waargenomen.

1. Voorbereiding van de fixatiebasis

1. Meng agarosepoeder met ddH₂O tot een concentratie van 4% (m/v) in een magnetronkolf. Magnetron gedurende 2-3 minuten tot het kookt zonder kleine belletjes.
   OPMERKING: Het volum....

Results

In deze methode kwantificeerden we het volume van darmslijm uit gestapelde beelden van hele weefsels verkregen via multifotonmicroscopie. Darmweefsels werden gekleurd met fluorescerend falloïdine en tarwekiemagglutinine (WGA) om respectievelijk cellulaire F-actine en slijm te visualiseren^15,16. In zowel ileum- als colonweefsel dat met PBS werd behandeld, werd WGA^+-slijm voornamelijk gedetecteerd in slijmbekercellen aan.......

Discussion

Hier presenteren we een methode voor driedimensionale kwantificering van darmslijm met behulp van weefselkleuring in de hele berg, multi-fotonmicroscopie en analyse met Imaris-software. Deze procedure maakt het mogelijk om de discontinue verdeling van slijm in het darmlumen te observeren en zorgt voor een absolute meting van het slijmvolume.

Discontinue slijmverdeling bij stimulatie is ook waargenomen in explantatieweefselkweeksystemen⁸.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486
6 cm dish	Alpha Plus	16021-1
Agarose	Hispanagar	A02599
BSA	BioShop	ALB001
Carbamoylcholine chloride ≥98% (titration), crystalline	SIGMA	SI-C4382-1G
Copper wire (new)	TOP TECH WIRE & CABLE INDUSTRIAL	IW00125	Copper wire without insulation layer
Forceps	Shineteh	ST-M110
Gauze, sterile	GMTH	May-40
GraphPad Prism 8	GraphPad Software
Heating pad	CONFORT	SY-666
IMARIS 10.0.0	OXFORD INSTRUMENTS
Paraformaldehyde	BIOVOVAS	BL0415-1000
PBS	GENESTAR	BL0180-1000
Phalloidin Labeling Probes	Invitrogen	A12379
Scissors	Shineteh	02-1250.18
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Conjugates	Biotium	29027
Zeiss 7MP with a W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III water immersion objective (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti sapphire femtosecond laser (without DeepSee module) with BP500 nm-550 nm and BP565 nm-610 nm detectors, and 750 nm laser wavelength			imaging platform used to acquire 3D stacks with a high-NA objective lens for deep tissue imaging; an excitation source for multi photon microscopy set to a wavelength of 750 nm