Methodenartikel

Productie van stabiele, met monodisperse fosfolipiden beklede microbellen bij kamertemperatuur met behulp van een microfluïdische stroomfocusseerder

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 oktober 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een methode om monodisperse met fosfolipiden beklede microbellen te produceren met behulp van een microfluïdisch stroomfocusserend apparaat bij kamertemperatuur, inclusief hoe de fosfolipidecoatingformulering moet worden bereid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monodisperse microbellen hebben een aanzienlijk potentieel aangetoond bij het verbeteren van de werkzaamheid van ultrasone contrastmiddelen voor zowel beeldvorming als therapeutische toepassingen. Deze microbellen kunnen direct worden geproduceerd met behulp van een microfluïdische flow-focusseringsmethode, die nauwkeurige controle over hun grootte mogelijk maakt. Het voorkomen van samensmelting tijdens de productie blijft echter een cruciale uitdaging. Hoewel verhoogde productietemperaturen (bijv. 55 °C) coalescentie kunnen onderdrukken, bemoeilijken dergelijke omstandigheden het ontwerp van microfluïdische apparaten en kunnen ze onverenigbaar zijn met targetingmiddelen en geneesmiddelconjugaten. Dit protocol schetst een methode voor het produceren van monodisperse met fosfolipiden beklede microbellen bij kamertemperatuur, waarbij de stabiliteit en monodispersiteit van de microbellen ten minste 7 dagen behouden blijven. Het protocol beschrijft ook de fabricage van herbruikbare PDMS-microfluïdische chips en de bereiding van de fosfolipidecoatingformulering die de oppervlakteactieve stof Pluronic F68 bevat. Onze bevindingen tonen aan dat de microbellen die met deze methode worden geproduceerd, hun grootte en stabiliteit gedurende 7 dagen behouden, wat hun toekomstige toepasbaarheid ondersteunt in klinische omgevingen waar stabiele en controleerbare ultrasone contrastmiddelen essentieel zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultrasone contrastmiddelen (UCA) worden veel gebruikt in klinische echografie en therapeutische toepassingen 1,2,3. Intraveneus toegediend blijven deze microbellen opgesloten in het vasculaire systeem en fungeren ze als bloedpoolmiddelen 4,5. Een stabiliserende schaal bedekt de microbellen en vermindert de gasdiffusie aangedreven door Laplace-druk, waardoor de levensduur van de microbel wordt verlengd 3,6. Bij blootstelling aan echografie beginnen microbellen te oscilleren en produceren ze sterke echo's vanwege de samendrukbaarheid van de gaskern 7,8. De oscillatie is het meest uitgesproken bij de resonantiefrequentie van de microbel, die wordt beïnvloed door de grootte van de microbel en de eigenschappen van de schaal 9,10,11. Klinisch goedgekeurde UCA bestaan over het algemeen uit polydisperse microbellen met een brede grootteverdeling, meestal variërend van ongeveer 0,5-10 μm in diameter 12,13,14. Deze brede grootteverdeling leidt tot een breed scala aan frequenties waarop deze microbellen resoneren. Aangezien klinische ultrasone sondes doorgaans in een smalle frequentiebandbreedte werken, resoneert slechts een subgroep van de UCA-populatie effectief15. Van monodisperse microbellen, die een smalle grootteverdeling hebben (bijv. PDI 3~10%16,17), is aangetoond dat ze de diagnose en therapie verbeteren in vergelijking met polydisperse microbellen. Voor contrastversterkte echografie nam de intensiteit toe met twee tot drie ordes van grootte18, terwijl de gevoeligheid voor niet-invasieve drukdetectie door middel van subharmonische signalen bijna verdubbelde 19,20,21, en de efficiëntie van de medicijnafgifte werd verhoogd met bijna één orde van grootte 22. Bijgevolg is het produceren van monodisperse microbellen met een smalle grootteverdeling en dus akoestische respons van cruciaal belang voor het maximaliseren van hun potentieel voor ultrasone beeldvorming en therapeutische toepassingen, waarbij gecontroleerde microbellenoscillaties van cruciaal belang zijn.

Monodisperse microbellen kunnen op verschillende manieren worden geproduceerd, zoals decanteren23, mechanische filtratie24 en centrifugeren van een polydisperse microbellenagent25. Het bereiken van nauwkeurige groottecontrole en hoge monodispersiteit blijft echter een uitdaging met deze technieken26. Een alternatieve en meer gecontroleerde benadering is de directe productie van monodisperse microbellen met behulp van een microfluïdisch stroomfocusseringsapparaat. In dit proces wordt een gasdraad gefocusseerd tussen twee waterige liposoomstromen op een microfluïdische chip, wat leidt tot reproduceerbaar afknijpen van de gasdraad, wat een snelle productie van monodisperse microbellen op de gewenste grootte mogelijk maakt27. Hoewel flowfocusmethoden op grote schaal zijn gebruikt voor het produceren van monodisperse druppeltjes28,29, is hun toepassing bij de productie van monodisperse microbellen minder gebruikelijk vanwege de moeilijkheid om samensmelting te voorkomen en de stabiliteit op lange termijn goed te behouden in termen van grootte, monodispersiteit en concentratie30. Coalescentie, waarbij meerdere microbellen samensmelten tot grotere, heeft invloed op de monodispersie. Het is aangetoond dat verhoogde productietemperaturen de coalescentie verminderen31, maar dit bemoeilijkt het ontwerp van het microfluïdische systeem en is mogelijk niet geschikt voor formuleringen met targetingmiddelen of geneesmiddelconjugaten. Daarom zou het produceren van monodisperse microbellen bij kamertemperatuur voordelig zijn. Even belangrijk is de methode om deze monodisperse microbellen op te slaan, aangezien met fosfolipiden beklede microbellen de neiging hebben om na verloop van tijd te krimpen, in te storten en hun monodispersiteit te verliezen32. Het garanderen van stabiliteit op lange termijn, gedurende meerdere dagen, tijdens opslag is van cruciaal belang voor het vertalen van monodisperse microbellentechnologie naar klinische toepassingen.

In dit protocol beschrijven we een methode voor de productie van met fosfolipiden beklede monodisperse microbellen met behulp van een stromingsfocusserend microfluïdisch platform bij kamertemperatuur. Deze methode is compatibel met lipidedebieten van 13-42 μL/min en is ontworpen voor gebruik bij kamertemperatuur, waardoor het geschikt is voor laboratoria zonder temperatuurregeling op hun microfluïdische systeem. Het protocol maakt gebruik van een fosfolipideformulering bestaande uit 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[carbonyl-methoxypolyethyleenglycol] (DPPE-PEG5000) en Pluronic F68, dat stabiliteit en reproduceerbaarheid garandeert. Het protocol biedt stapsgewijze instructies voor het vervaardigen van herbruikbare PDMS-microfluïdische chips, het voorbereiden van de fosfolipidecoatingoplossingen en het opnemen van de oppervlakteactieve stof Pluronic F68 om het samensmelten van microbellen tijdens de productie bij kamertemperatuur te voorkomen. Het beschrijft ook de procedures voor het reinigen van het microfluïdische systeem om verstopping van het mondstuk te voorkomen, het aanpassen van de gasdruk en het vloeistofdebiet om de grootte van de microbellen te regelen, en het verzamelen en opslaan van de geproduceerde microbellen voor stabiliteit op lange termijn. Deze methode biedt een praktische benadering voor het genereren van stabiele monodisperse microbellen met nauwkeurige grootteregeling bij kamertemperatuur.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Lipidenfilms maken

OPMERKING: Het lipidenmengsel voor de productie van monodisperse microbellen is geformuleerd met een binair mengsel van DSPC en DPPE-PEG5000 met een molaire verhouding van 90:10. DSPC werd gekozen als het belangrijkste lipide omdat is aangetoond dat het een superieure stabiliteit biedt tegen gasoplossing in zowel polydisperse33,34 als monodisperse microbellen31. Deze verbeterde stabiliteit wordt verondersteld het gevolg te zijn van de relatief hoge gel-naar-vloeistof kristallijne faseovergangstemperatuur van 55 °C35, wat hoger is dan die van andere veelgebruikte lipiden zoals DPPC (~41 °C)35, wat leidt tot een stijver en ondoorlaatbaar lipidenomhulsel bij kamertemperatuur36. Hier wordt een voorbeeld gedemonstreerd van het bereiden van een fosfolipidecoatingoplossing van 3 ml. Om een uiteindelijke fosfolipidenconcentratie van 20 mg/ml te bereiken, wat een typische concentratie is voor het produceren van monodisperse microbubbels16,17, is 60 mg fosfolipiden vereist. De gewenste hoeveelheid van elke fosfolipidecomponent wordt gegeven in tabel 1.

  1. Haal het fosfolipidenpoeder uit de vriezer van -20 °C en laat 1 uur bij kamertemperatuur ontdooien.
  2. Weeg het benodigde lipidenpoeder af in afzonderlijke maatkolven van 2 ml.
  3. Bereid 100 ml van een 90:10 v/v-mengsel van chloroform:methanoloplosmiddel in een zuurkast door 90 ml chloroform te meten met behulp van een glazen maatcilinder van 100 ml en dit vervolgens over te brengen naar een glazen erlenmeyer van 250 ml. Meet vervolgens 10 ml methanol af met behulp van de glazen maatcilinder van 100 ml en giet dit in de glazen erlenmeyer van 250 ml die de chloroform al bevat. Sluit de glazen erlenmeyer af met een glazen stop en meng de twee oplosmiddelen door de erlenmeyer voorzichtig rond te draaien tot de oplossing helder is geworden.
    LET OP: Chloroform en methanol zijn giftige chemicaliën. Chloroform is potentieel kankerverwekkend en kan irritatie van de luchtwegen, de huid en de ogen veroorzaken. Methanol is licht ontvlambaar, giftig bij inademing, inname of opname door de huid en kan blindheid veroorzaken bij inslikken. Werk altijd met chloroform/methanolmengsels in een goed geventileerde zuurkast om inademing van dampen te voorkomen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas. Zorg ervoor dat er geen open vuur of ontstekingsbronnen aanwezig zijn bij het hanteren van methanol. Gooi oplosmiddelhoudend afval weg volgens de protocollen voor gevaarlijk afval van de instelling.
  4. Om de in stap 1.2 gewogen lipidenpoeders volledig op te lossen, voegt u ml chloroform/methanolmengsel toe aan elke volumetrische glazen kolf van 2 ml en sluit u snel het glazen deksel om verdamping te voorkomen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het lipidenpoeder volledig is opgelost. Draai de kolf zo nodig voorzichtig rond om het oplossen te vergemakkelijken.
  5. Meng de opgeloste lipideoplossingen in een glazen injectieflacon van 30 ml door elke oplossing achtereenvolgens te gieten.
  6. Verdamp het oplosmiddel onder een constante stroom argongas, waarbij de injectieflacon wordt gedraaid om een gelijkmatige verdeling van de lipidenfilm over het glasoppervlak te garanderen.
    OPMERKING: De laatste sporen van het oplosmiddel kunnen moeilijk te verdampen zijn met alleen argongas. Laat de injectieflacon 2 uur in de zuurkast zitten om verder te kunnen drogen. Als er geen argongas beschikbaar is, kan stikstofgas37 of een vacuüm roterende verdamper die werkt bij 6 °C31,38 (d.w.z. boven de faseovergangstemperatuur van DSPC van 55 °C35) worden gebruikt om het chloroform/methanol-oplosmiddel te verdampen.
  7. Na het verdampen van het oplosmiddel wordt het lipidenmengsel vacuüm gehouden om eventuele resterende organische oplosmiddelresten te verwijderen. Sluit de glazen injectieflacon af met een laag parafilm en prik met een naald verschillende gaten door om luchtstroom tijdens het vacuüm mogelijk te maken.
    OPMERKING: Het doel van het gebruik van parafilm is om te voorkomen dat het lipide tijdens het vriesdroogproces uit de glazen injectieflacon verspreidt.
  8. Plaats de injectieflacons een nacht in een vriesdroger onder vacuüm om eventueel achtergebleven organisch oplosmiddel te verwijderen.
  9. Ga verder met de volgende stap of bewaar de lipidenfilm bij -20 °C totdat u deze nodig heeft.
    OPMERKING: Er wordt geen centrifugatiestap gebruikt in dit gedeelte of elders in het protocol.

2. Fabricage van vloeifocussende microfluïdische chips

OPMERKING: Monodisperse microbellen worden geproduceerd met behulp van een stromingsfocussende microfluïdische chip, zoals geïllustreerd in figuur 1A. Een schema van de geometrie van het microfluïdische kanaal, inclusief de afmetingen van het mondstuk en de uitlaat, wordt gegeven in aanvullende figuur S1. Een gedetailleerd fabricageprotocol voor op SU-8 gebaseerde fotolithografie die wordt gebruikt om deze mallen voor te bereiden, is eerder beschreven37 en is te vinden als aanvullende informatie bij dit protocol. Het fabricageproces van de PDMS-chip wordt beschreven in de volgende stappen.

  1. Meng de PDMS-basis (23 g) en het verharder (2,3 g) in een gewichtsverhouding van 10:1 om in totaal 25,5 g PDMS te verkrijgen.
  2. Plaats de mastervorm in een petrischaaltje en giet het PDMS-mengsel eroverheen.
  3. Ontgas het mengsel onder vacuüm (2~7 mbar) gedurende 40 minuten om de ingesloten luchtbellen te verwijderen.
    OPMERKING: Voor grotere volumes kan een langere ontgassingstijd nodig zijn om de luchtbellen volledig te verwijderen.
  4. Plaats de vorm gedurende 1 uur op een warmhoudplaat van 75 °C.
    OPMERKING: Voor grotere volumes kan een langere uithardingstijd nodig zijn.
  5. Laat het PDMS afkoelen tot kamertemperatuur. Snijd met een scalpel voorzichtig rond het uitgeharde PDMS en pel het eraf om de chip los te maken.
  6. Knip de PDMS-chip op de gewenste maat en pons de inlaat-/uitlaten met een pons van 1 mm.
  7. Reinig de PDMS-chip met plakband om stofdeeltjes te verwijderen.
  8. Reinig zowel de PDMS-chip als de glazen dia met isopropanol, gevolgd door gedeïoniseerd water.
  9. Bevestig de PDMS aan de glasplaat door ze gedurende 1 minuut te behandelen in een luchtplasmareiniger op 60% vermogen (60 W).
  10. Plaats de gebonden chip gedurende 3 minuten op een warmhoudplaat van 95 °C om de hechting te verbeteren.
  11. Laat de PDMS-chip afkoelen tot kamertemperatuur. De volledig gefabriceerde chip is te zien in figuur 1C en een microscopisch helder veldbeeld van het mondstuk is te zien in figuur 1D.
  12. Plaats de gebonden chip gedurende 5 minuten op 80% vermogen (80 W) in de plasmareiniger om de oppervlaktehydrofiliciteit van het microfluïdische kanaal te herstellen.
  13. Vul de chip onmiddellijk met Milli-Q water om de hydrofiliciteit te behouden.
  14. Bewaar de chips bij kamertemperatuur in Milli-Q water tot gebruik.

3. Bereiding van de fosfolipidecoatingoplossing

  1. Haal de voorbereide lipidenfilm uit de vriezer van -20 °C en ontdooi gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 3 ml voorverwarmde (55 °C) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de lipidenfilm (60 mg) om een uiteindelijke lipideconcentratie van 20 mg/ml te bereiken. Plaats de injectieflacons gedurende 40 minuten in een waterbad van 55 °C en draai elke 15 minuten op gemiddelde snelheid (niveau 3 van 5 op de vortexmixer).
    OPMERKING: Deze stap dient om de lipidecomponenten in PBS voor te lossen en gelijkmatig te dispergeren voorafgaand aan sonicatie in stap 3.5. Deze temperatuur is de faseovergangstemperatuur van DSPC39, die gedeeltelijke oplosbaarheid bevordert en de aggregatie van lipiden vermindert. Hoewel sonicatie in stap 3.6 vereist is om volledige optische helderheid te bereiken, vergemakkelijkt de voorlopige thermische incubatie een efficiëntere en reproduceerbare sonicatie door de vorming van grote lipideaggregaten te minimaliseren en de homogeniteit van de dispersie te verbeteren.
  3. Voeg 0,43 ml Pluronic F68-oplossing toe aan het lipidenmengsel om een molaire concentratie van 10% te bereiken, namelijk DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Daarna moet het monster visueel lijken op figuur 2A, wat een troebele oplossing is.
    OPMERKING: Pluronic F68 is een oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om samensmelting te voorkomen tijdens de productie van monodisperse microbellen16,40. Bij afwezigheid van Pluronic F68 kunnen monodisperse microbellen niet worden gevormd met behulp van het Horizon-microfluïdische apparaat37en de lipideformulering beschreven in dit protocol16. Er werd geen propyleenglycol gebruikt in de lipidenformulering, aangezien is gemeld dat deze verbinding zowel de monodispersiteit als de stabiliteit van de resulterende monodisperse microbellensuspensie in gevaar brengt38.
  4. Voor de bereiding van fluorescerend gelabelde monodisperse microbubbels, voeg in dit stadium een lipidekleurstof, zoals een lipofiele carbocyaninekleurstof, toe aan het mengsel.
  5. Sonificeer het lipidenmengsel in een waterbad op 100% vermogen gedurende 20 minuten en houd de watertemperatuur op 55 °C. De lipidenoplossing moet na 20 minuten lijken op figuur 2B , wat een minder troebele oplossing is dan in stap 3.4. Ga door met sonicatie met tussenpozen van 10 minuten totdat de oplossing helder is, zoals weergegeven in figuur 2C.
    OPMERKING: Voor de oplossing in figuur 2C was 30 minuten sonicatie nodig om een heldere oplossing te verkrijgen. Karakterisering van de lipidenoplossing kan worden uitgevoerd door de liposoomgrootte te meten met behulp van bijvoorbeeld een dynamische lichtverstrooier.
  6. Laat de lipidenoplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u deze verder verwerkt.

4. Bereiding van de flacon voor het verzamelen van microbellen

OPMERKING: Om langdurige opslag van monodisperse microbellen te garanderen, is een gasdichte medische injectieflacon nodig als opvangfles.

  1. Sluit een glazen medische injectieflacon van 5 ml af met een rubberen stop en vul de injectieflacon met C4F10 gas. Krimp vervolgens een aluminium dop rond de flacon om de gasdichtheid te garanderen. De opvangflacon is nu klaar voor gebruik.

5. Voorbereiding van het microfluïdische platform

OPMERKING: Zoals geïllustreerd in figuur 3A, bestaat het systeem uit het Horizon microfluïdische platform37 (hierna "microfluïdisch platform" genoemd), een computer voor besturing, een hogesnelheidscamera voor het bewaken van het productieproces, een externe lichtbron met lichtgevende diode (LED) voor verlichting tijdens snelle beeldvorming, en een functiegolfvormgenerator voor het activeren van hogesnelheidsbeeldvorming met specifieke tussenpozen tijdens de productie. Voordat de productie van microbellen wordt gestart, moet het apparaat worden gereinigd om de kans op verstopping van het mondstuk te verkleinen. De reinigingsprocedure omvat zowel de slang als de microfluïdische chip.

  1. Procedure voor het reinigen van slangen
    1. Zet de aan/uit-schakelaar van het microfluïdische platform aan, dat zich aan de rechterkant bevindt (Figuur 3A).
      OPMERKING: De "aan/uit-schakelaar" verwijst naar de belangrijkste vermogensregeleenheid van het Horizon-platform, die de interne microcontroller, pompen en sensoren van het systeem activeert.
    2. Plaats een glazen injectieflacon van 4 ml gevuld met 70% ethanol in de linkerkant van de P-pompkamer van het microfluïdische platform (Figuur 3). Start de vloeistofstroom op 100 μL/min, zodat de vloeistofinlaatslang wordt gespoeld met de 70% ethanol uit de injectieflacon. Stop het spoelen door de vloeistofstroom na 5 minuten te stoppen.
      OPMERKING: P-pomp verwijst naar de drukgeregelde gastoevoereenheid die is geïntegreerd in het microfluïdische systeem. Deze stap is alleen bedoeld om de slang schoon te maken; De slang mag in dit stadium niet worden aangesloten op de microfluïdische chip. Dit proces verwijdert in ethanol oplosbaar stof en verontreinigingen uit het fluïdische systeem.
    3. Vervang de met ethanol gevulde injectieflacon door een met water gevulde Milli-Q-injectieflacon.
    4. Spoel de slang gedurende 5 minuten met Milli-Q-water van 100 μL/min om eventuele resterende ethanol uit het systeem te verwijderen.
  2. Procedure voor het reinigen van spanen
    1. Zet de interne LED-lichtschakelaar van het microfluïdische platform aan.
    2. Plaats de PDMS-chip in de houder.
    3. Plaats het spruitstuk over de chip en zet het vast met het verstelbare wiel.
    4. Bevestig de gas-, vloeistof- en uitlaatslang met een pincet aan de PDMS-chip. De verbindingsconfiguratie wordt weergegeven in Figuur 3B. Zorg ervoor dat de uitlaatslang naar een injectieflacon leidt om de afvaloplossing van het reinigingsproces op te vangen.
    5. Pas het platform aan om het mondstuk van de chip binnen het gezichtsveld van het objectief te plaatsen.
    6. Reinig de chip gedurende 5 minuten met Milli-Q water met een gasdruk van 1000 mbar en een vloeistofdebiet van 100 μL/min. Start eerst de gasstroom, daarna volgt de vloeistofstroom.
      OPMERKING: Deze stap is om de microfluïdische chip stroomopwaarts van het mondstuk te reinigen.
    7. Stop de vloeistofstroom, gevolgd door de gasstroom.
    8. Sluit de gas- en uitlaatslang weer aan zoals weergegeven in (Figuur 3C).
    9. Herhaal de wasprocedure met Milli-Q water nog 5 minuten, met een gasdruk van 1000 mbar en een vloeistofdebiet van 50 μL/min. Start eerst de gasstroom, daarna volgt de vloeistofstroom.
      OPMERKING: Deze opstelling reinigt de microfluïdische chip stroomafwaarts van het mondstuk.
    10. Stop de vloeistofstroom, gevolgd door de gasstroom. De PDMS-chip is nu klaar voor de productie van microbellen.

6. Opstelling van high-speed beeldvorming

OPMERKING: Om de productie van monodisperse microbellen te bewaken en te controleren, wordt aanbevolen om een hogesnelheidscamera te integreren met het microfluïdische platform, aangezien de microbel zal worden geproduceerd met een productiesnelheid van meer dan 105 microbellen/s. Met de hogesnelheidscamera kunnen de grootte van de microbubbels en de productiesnelheid op de chip worden gemeten, en kan de samensmelting van microbubbels op de chip worden bewaakt.

  1. Monteer een LED-lichtbron boven het montageplatform (Figuur 3A) om de microfluïdische chip te verlichten tijdens high-speed imaging.
  2. Koppel de hogesnelheidscamera aan de beeldvormingspoort aan de zijkant van het microfluïdische platform.
  3. Gebruik een externe golfvormgenerator om hogesnelheidsopnames te activeren met intervallen van 10 s gedurende de gehele duur van de productie van microbellen. Sluit de TTL-triggeruitgang van de golfvormgenerator aan op de externe triggeringang van de hogesnelheidscamera met behulp van een standaard BNC-kabel om gesynchroniseerde acquisitie te garanderen. Deze monitoring is nodig om de vorm van de gasdraad en de groottestabiliteit van de microbellen tijdens de productie te beoordelen.
    OPMERKING: Continue bewaking is belangrijk, omdat verstopping tijdens de productie kan optreden. Bovendien worden de snelle beeldsequenties gebruikt om tijdopgeloste microbellengrootteverdelingen op de chip te extraheren. Dit interval van 10 s kan worden aangepast aan de eisen van de gebruiker."

7. Productie en karakterisering van monodisperse microbellen

  1. Voordat u met de productie begint, moet u de opvangflacon instellen zoals weergegeven in afbeelding 4A. Prik een naald door de rubberen stop om als verzamelnaald te dienen, en een andere naald door de stop als ventilatienaald, met de punt van de naald dicht bij de onderkant van de injectieflacon. Houd de opvangflacon tijdens de productie omgekeerd met behulp van een klem.
    OPMERKING: De ventilatienaald zorgt voor een constante druk in de injectieflacon tijdens het afnemen. Omdat C4F10 zwaarder is dan lucht, verlaat het niet spontaan de injectieflacon.
  2. Laad de bereide fosfolipide-oplossing in de P-pomp van het microfluïdische platform.
  3. Verplaats het mondstukgedeelte van de chip naar het gezichtsveld van het objectief.
    OPMERKING: Het microfluïdische platform bevat een interne optische module met instelbare zoom en focus, en een externe F-mount-koppeling voor het bevestigen van een hogesnelheidscamera.
  4. Om de productie van microbellen op gang te brengen, stelt u de gasdruk in op 800 mbar en het vloeistofdebiet op 40 μL/min.
    OPMERKING: Het microfluïdische platform integreert twee stroomgeregelde vloeistofkanalen, 1-5 μL/min aan de linkerkant en 1-100 μL/min aan de rechterkant, en één drukgestuurd gaskanaal. In dit protocol werden het vloeistofkanaal van 1-100 μL/min en het drukgeregelde gaskanaal gebruikt.
  5. Zodra de vloeistof het mondstuk bereikt, knijpt de gasdraad af en laat monodisperse microbellen vrij via de uitlaat (Figuur 4A).
  6. Stel de high-speed opname in op een framerate van ≥ 200.000 fps en gebruik high-speed opnames om de grootte van de geproduceerde microbubbels te meten via de imfindcircles-functie in MATLAB.
  7. Pas de gasdruk en het vloeistofdebiet aan om de grootte van de microbellen te regelen.
    OPMERKING: Gebruik na het aanpassen van het debiet en/of de gasdruk het MATLAB-script om de grootteverdeling op de chip van de hogesnelheidsopname uit te zetten. Door de grootteverdeling te koppelen aan een Gauss-verdeling, kunnen de gemiddelde μ en de standaarddeviatie σ worden afgeleid. De μ vertegenwoordigt de grootte op de chip van de geproduceerde monodisperse microbellen. Microbellencoalescentie kan optreden in de beginfase van de productie als gevolg van achtergebleven Milli-Q-water in de slang, waardoor de lipidenconcentratie wordt verdund. Dit probleem verdwijnt meestal zodra de onverdunde lipideoplossing het mondstuk bereikt. Tabel 2 geeft een overzicht van de resulterende microbellendiameters voor verschillende toegepaste debieten bij een constante gasdruk van 800 mbar; Verschillende combinaties van gasdruk en vloeistofdebiet kunnen vergelijkbare microbellengroottes produceren, hoewel verschillende parametercombinaties ook van invloed zijn op de productiesnelheid. Bij een constant gasdebiet is bekend dat de productiesnelheid positief gecorreleerd is met het vloeistofdebiet41. De productiesnelheid van microbellen in dit protocol ligt in de orde van ~105 microbellen per seconde, gebaseerd op een frame-voor-frame analyse van de hogesnelheidsopnames, die consistent is met eerder gerapporteerde waarden voor vergelijkbare stroomfocusgeometrieën37.
  8. Zodra de gewenste grootte van de microbellen is bereikt, verzamelt u de geproduceerde microbellen door de uitlaatslang aan te sluiten op de opvangflacon.
  9. Stel tijdens het verzamelen de hogesnelheidsopname zo in dat deze elke 10 s wordt geactiveerd om het productieproces te bewaken.
    OPMERKING: Het interval tussen opnames kan worden aangepast op basis van specifieke vereisten.
  10. Nadat er voldoende microbellensuspensie is verzameld, verwijdert u zowel de ventilatienaald als de verzamelnaald uit de opvangflacon.
  11. Stop de vloeistofstroom, gevolgd door de gasstroom.
  12. Bewaar de verzamelde microbellen rechtop bij kamertemperatuur en zorg ervoor dat de injectieflacon minimaal mechanisch wordt geschud.
    OPMERKING: De microbellenoplossing heeft drie lagen, zoals weergegeven in afbeelding 5A: een schuimlaag, een monodisperse microbellenlaag en een subnatant. Het is het beste om de schuimlaag in de injectieflacon te laten, aangezien eerdere studies meldden dat schuim-geassocieerde bubbels geleidelijk kunnen krimpen tot een monodisperse grootte16,38. De microbubbels die met dit protocol worden geproduceerd, hebben geen wettelijke veiligheidsevaluatie ondergaan. De samenstellende lipiden (DSPC, DPPE-PEG5000) en oppervlakteactieve stof (Pluronic F68) worden echter vaak gebruikt in door de FDA goedgekeurde injecteerbare formuleringen en worden als biocompatibel beschouwd 42,43. Verdere preklinische evaluatie is nodig om de veiligheid voor medisch gebruik vast te stellen.
  13. 2 uur na de productie (d.w.z. 2 uur na de productie van de monodisperse microbellen), karakteriseer de uiteindelijke grootte en concentratie van de microbellen met behulp van een deeltjeskarakteriseringsmachine.
    OPMERKING: Monodisperse microbellen geproduceerd door de flow-focusseringsmethode hebben ongeveer 90 minuten nodig om zich te stabiliseren tot hun uiteindelijke grootte44. Daarom wordt aanbevolen om ten minste 2 uur stabilisatie toe te staan voordat u de microbellen gebruikt.
  14. Bevestig een naald van 19 G op een ml-spuit, hierna de "extractiespuit" genoemd.
  15. Steek een aparte naald van 19 G in de injectieflacon met microbellen als ventilatienaald. Zorg ervoor dat de punt van de naald in de buurt van de bovenkant van de injectieflacon blijft om lucht binnen te laten en de interne druk te behouden tijdens het extraheren van microbellen.
  16. Draai de injectieflacon voorzichtig rond om de suspensie te homogeniseren. De suspensie valt uiteen in drie lagen: een bovenste schuimlaag, een middelste laag met monodisperse microbellen en een onderste waterige laag.
  17. Plaats snel de extractiespuit en plaats de naaldpunt voorzichtig in het midden van de monodisperse microbellenlaag, waarbij u het schuim en de onderste waterige subnatanslaag vermijdt. Zuig de gewenste hoeveelheid microbellensuspensie op en verwijder de extractiespuit uit de injectieflacon. Wanneer de extractie van de microbellen is voltooid, verwijdert u de ventilatienaald.

8. Reinigings- en afsluitprocedure

OPMERKING: Na de productie van microbellen moeten het microfluïdische platform en de chip grondig worden gereinigd om een goede werking te garanderen en hergebruik van de chip mogelijk te maken. De volgende stappen schetsen het reinigingsproces.

  1. Ga voor de chip als volgt te werk:
    1. Vervang de lipidenflacon door een Milli-Q waterflacon.
    2. Spoel de microfluïdische chip met een gasdruk van 800 mbar en een vloeistofdebiet van 40 μL/min gedurende 5 minuten.
    3. Stop eerst de vloeistofstroom, gevolgd door het stoppen van de gasstroom.
    4. Koppel alleen de gasinlaatslang los van de microfluïdische chip.
    5. Vul de microfluïdische chip met Milli-Q-water om de hydrofiliciteit van de interne oppervlakken te behouden.
    6. Stop de vloeistofstroom en koppel alle resterende slangen los van de chip.
    7. Bewaar de chip in Milli-Q water totdat deze nodig is voor toekomstig gebruik.
  2. Ga voor het microfluïdische systeem als volgt te werk:
    1. Vervang de Milli-Q waterflacon door een injectieflacon met 70% ethanol in het microfluïdische platform.
    2. Spoel de vloeistofinlaatslang gedurende 5 minuten met 70% ethanol met een debiet van 100 μl/min om eventuele lipidenresten te verwijderen.
    3. Vervang de ethanolflacon door een Milli-Q waterflacon in P-Pump1.
    4. Spoel de slang gedurende 5 minuten met Milli-Q-water van 100 μL/min om eventuele resterende ethanol uit het systeem te verwijderen. Het systeem is nu schoon.
    5. Sluit het microfluïdische platform en het hogesnelheidscamerasysteem af.

9. Stappen voor probleemoplossing

  1. Verstopping van het mondstuk
    OPMERKING: Gezien het kleine formaat van de nozzle (5 μm) kunnen er verstoppingen optreden tijdens het productieproces. Volg de onderstaande stappen om de blokkade te verhelpen.
    1. Stop onmiddellijk de vloeistofstroom, gevolgd door de gasstroom.
    2. Sluit de slang weer aan volgens de opstelling die wordt weergegeven in afbeelding 3B.
    3. Vervang de met fosfolipiden gevulde injectieflacon door een met water gevulde Milli-Q-injectieflacon in P-Pump1.
    4. Pas een gasdruk van 1000 mbar toe en stel het vloeistofdebiet in op 100 μL/min gedurende 5 minuten om het mondstuk door te spoelen.
      OPMERKING: In de meeste gevallen zijn verstoppingen na een spoelbeurt van 5 minuten verholpen. Als de verstopping echter aanhoudt, kan het nodig zijn om de PDMS-chip te vervangen door een nieuwe.
    5. Zodra de verstopping is verholpen, sluit u de slang opnieuw aan zoals aangegeven in afbeelding 3C.
    6. Spoel de chip opnieuw gedurende 5 minuten met Milli-Q-water, met een gasdruk van 1000 mbar en een vloeistofdebiet van 50 μL/min om volledige klaring te garanderen.
    7. Vervang de met water gevulde injectieflacon Milli-Q door de met fosfolipiden gevulde injectieflacon in P-Pump1 en hervat de productie van microbellen.
      OPMERKING: Als er tijdens de productie verstoppingen aanhouden, kan dit duiden op onvoldoende reiniging van de slang of microfluïdische chip. Koppel in dit geval de slang los van de chip en volg de reinigingsprocedure die in stap 5 wordt beschreven. Als er verstoppingen blijven optreden na grondige reiniging van het hele systeem, kan dit duiden op een storing van het interne filter in het microfluïdische platform. Het probleem kan worden opgelost door het filter te vervangen door een nieuw exemplaar.
  2. Hergebruik de microfluïdische chip indien gewenst.
    OPMERKING: Als de chip niet goed wordt opgeslagen, kan deze hydrofiliciteit verliezen. Als dit gebeurt, kan het afknijpen van de gasdraad lijken op het patroon dat wordt weergegeven in afbeelding 5E. In dergelijke gevallen wordt aanbevolen om over te schakelen op een nieuwe chip die hydrofiel is om een consistente en betrouwbare productie van microbellen te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol presenteren we een methode voor het produceren van stabiele, monodisperse microbellen bij kamertemperatuur met behulp van een stromingsfocussende microfluïdische chip. De PDMS-chip wordt vervaardigd door gieten uit een mastermal, zoals weergegeven in figuur 1. Om de PDMS-chip aan een glasplaatje te hechten, wordt plasmabehandeling toegepast. Plasmabehandeling is cruciaal omdat het het PDMS-oppervlak verandert van hydrofoob naar hydrofiel. Dez...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft in detail hoe stabiele monodisperse microbellen bij kamertemperatuur kunnen worden geproduceerd en opgeslagen met behulp van een microfluïdische flowfocusseringschip. De monodisperse microbel kan worden gebruikt voor contrastversterkte ultrasone beeldvorming18, niet-invasieve drukdetectie19 en microbellen-gemedieerde medicijnafgifte22, zowel in vitro als in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels gefinancierd door de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 Research and Innovation Program van de Europese Unie (Grant Agreement 805308) en deels door de TTW Toegepaste en Technische Wetenschappen (VIDI-project 17543), onderdeel van NWO, beide gegund aan K.K. Het Horizon Microfluidic Platform is ontwikkeld met financiering van EPSRC-subsidies (subsidienrs. EP/I000623 en EP/K023845). De auteurs bedanken het Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) van de Universiteit van Leeds voor nuttige discussies, evenals Stuart Weston en Andrew Price voor hun hulp bij het conceptualiseren van het instrument en de productie van onderdelen voor het Horizon Microfluidic Platform. De hoofdmal voor het fabriceren van de PDMS-chips werd vriendelijk ter beschikking gesteld door de Universiteit van Leeds. De auteurs danken Robert Beurskens van Biomedische Technologie, afdeling Cardiologie, en Geert Springeling van de afdeling Experimentele Medische Instrumentatie, beiden van het Erasmus MC, Nederland, voor technische assistentie tijdens de experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mm biopsy punch Kai Medical143831
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine (DiD)Thermo Fisher ScienticD307een lipofiele carbocyanine kleurstof
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[carbonyl-methoxypolyethylene glycol] (DPPE-PEG5000)LipoidCAS-No. 384835-61-4
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)LipoidCAS-No. 816-94-4
100 mL glazen meetcilinderBLAUBRAND
2 mL volumetrische glazen kolvenBLAUBRAND
250 mL glazen ErlenmeyerBLAUBRAND
30 mL glazen injectieflacon DWK Life SciencesSCERC40752700D0C2
70% ethanol
75 °C hot plate 
Kleefband
Aluminium dop Sigma-aldrich27016
Argon gas Linde Gas Benelux
C4F10 gasF2 Chemicals
ChloroformMerck KGaA67-66-3
Klinisch beschikbare  echografie contrastmiddel (d.w.z. microbubbel)Bracco,
Plan-LesOuates, Zwitserland		SonoVueFiguur 6A.
Verzamel- en ventilatie 19G naald100 Sterican4657799
Coulter Counter Multisizer 3Beckman CoulterDeeltjeskarakterisatiemachine
Op maat gemaakt echografie contrastmiddel (d.w.z. monodisperse microbubbel)NAF1-10PFFiguur 6A. Geproduceerd zoals beschreven door: Wang, Y. et al. Invloed van Pluronic F68 op de groottestabiliteit en akoestisch gedrag van monodisperse fosfolipide-gecoate microbubbels geproduceerd bij kamertemperatuur. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Op maat gemaakt echografie contrastmiddel (d.w.z. monodisperse microbubbel)NAF2-10 PFFiguur 6A. Geproduceerd zoals beschreven door: Wang, Y. et al. Invloed van Pluronic F68 op de groottestabiliteit en akoestisch gedrag van monodisperse fosfolipide-gecoate microbubbels geproduceerd bij kamertemperatuur. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Demi water
Externe LED-lampGSVITECGS02370
DiepvriesdrogerMertin Christ GmbHAlpha 1–2 LD plus
Functiegolfvormgenerator Agilent33220A
Gasdichte glazen injectieflaconSigma-aldrichZ113964-288EA
GlijplaatjeVWR631-1552
HogesnelheidscameraPhotronNova S16
Horizon microfluidic platformUniversity of Leeds, EngelandHet platform is commercieel verkrijgbaar en wordt in detail beschreven in: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Microfluidische platform voor de productie van therapeutische microbubbels en nanobubbels. Review of Scientific Instruments. 92 (7), 074105 (2021).
MatlabThe MathWorksR2023a
MethanolMerck KGaA67-56-1
Milli-Q water
PDMS-gelSYLGARDSYLGARD® 184
Fosfaat-gebufferd zoutoplossing (PBS 1x) Gibco10010023
PlasmareinigerHenniker ScientificHPT-100
Pluronic F68Thermo Fisher Scientific24040032
Rubberen stopSigmaZ166065-100EA
SlangMasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16 " OD; 25 ft
Pincet
Vortex Sigma-aldrichZ654779
Waterbad sonicatorEMAGEMMI 30HC

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Monodisperse microbellenfosfolipidecoatingechocontrastmiddelenproductie bij kamertemperatuurmicrobelstabiliteitPDMS microfluidische chipscontrole van microbelgroottesurfactant Pluronic F68therapeutische toepassingen van microbellen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen