Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muismodel van leukemie Terugval naar inductiechemotherapie voor acute lymfoblastische leukemie

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol heeft tot doel een muismodel te beschrijven voor het genereren van recidieven van acute lymfatische leukemie, gebaseerd op de dynamiek van de respons op inductiechemotherapie.

Samenvatting

Acute lymfatische leukemie (ALL) is een neoplasma van onrijpe lymfoïde voorlopercellen en een van de meest voorkomende maligniteiten bij kinderen. Hoewel de genezingspercentages bij pediatrische ALL 90% benaderen, blijven terugval en resistentie tegen geneesmiddelen uitdagingen. In deze context is het bestuderen van kankerbiologie in vivo essentieel, en voor dit doel worden veel van patiënten afgeleide xenotransplantaten (PDX) gebruikt met behulp van muizenmodellen. PDX's van recidiverende monsters - of vergeleken met diagnostische monsters - beoordelen echter niet volledig de mechanismen achter het initiëren en verlopen van recidief. Dit protocol is gebaseerd op het genereren van B-ALL PDX-recidieven bij muizen, waardoor leukemische cellen kunnen worden verzameld tijdens het proces van het verwerven van resistentie tegen geneesmiddelen. Dieren die zijn geënt met B-ALL PDX-cellen worden behandeld met een combinatie van vier geneesmiddelen die vaak worden gebruikt in ALL-therapie, die verschillende werkingsmechanismen vertegenwoordigen: dexamethason, vincristine, L-asparaginase en daunorubicine. Na een inductiefase van 4 weken worden de dieren tijdens een rustperiode gecontroleerd op recidieven. De cyclus van behandeling en terugval wordt herhaald totdat de tijd tot terugval korter wordt, en dient als surrogaat voor verhoogde in vivo resistentie tegen geneesmiddelen. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan terugval en resistentie te onderzoeken, worden leukemische cellen voor en na elke behandelingscyclus verzameld voor fenotypische en genetische analyse. Om het model te valideren, werden verschillende pediatrische ALL-monsters getest, waaronder zowel goede als slechte responders, zoals beoordeeld aan de hand van de aanwezigheid van blasten in perifeer bloed na 7 dagen behandeling met corticosteroïden en aan de hand van minimale restziekte (MRD) op dag 15, 33 en 78/96. De resultaten die bij muizen werden waargenomen, kwamen overeen met patiëntgegevens, wat de nauwkeurigheid van het model bevestigde bij het nabootsen van de klinische respons op chemotherapie. Deze aanpak maakt de dynamische studie van terugval en geneesmiddelresistentie in B-ALL mogelijk, ter ondersteuning van mechanistisch onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën.

Inleiding

Acute lymfatische leukemie (ALL) is de meest voorkomende vorm van kanker bij kinderen. Ondanks de hoge genezingspercentages die de afgelopen decennia zijn bereikt, met een totale overleving van 5 jaar die 90% bereikt in landen met een hoog inkomen1 en grote inspanningen bij het zoeken naar nieuwe therapeutische strategieën, valt in ontwikkelde landen 15%-20% van de patiënten terug van de ziekte, bij wie het overlevingspercentage varieert tussen 30%-60%, afhankelijk van of de eerste terugval vroeg (jonger dan 18 maanden) of later (36 maanden) na de diagnose optreedt2, 3. okt. Met het oog hierop blijven refractair en terugval ALLEMAAL uitdagingen die moeten worden overwonnen. In termen van diagnose onderscheidt refractaire ALL zich van terugval door de slechte gevoeligheid voor chemotherapie, terwijl terugval ALL wordt gekenmerkt door het recidief van de ziekte na een periode van remissie. Net als bij andere vormen van kanker, wordt ALL gekenmerkt door genetische afwijkingen, waaronder aneuploïdieën, chromosomale herschikkingen en verschillende genmutaties die geassocieerd zijn met verschillende therapeutische reacties en terugvalrisico4. Aangezien ALLE recidieven vaker voorkomen bij patiënten met een hoog risico - die al chemotherapie met maximale intensiteit hebben gekregen - is het onwaarschijnlijk dat verdere aanpassingen van de geneesmiddeldoses of -combinaties voldoende zijn. In plaats daarvan moeten de inspanningen worden gericht op het identificeren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan resistentie en terugval bij geneesmiddelen.

In het licht hiervan hebben onderzoekers geprobeerd te begrijpen hoe de selectiedruk die door chemotherapie wordt uitgeoefend, bijdraagt aan het ontstaan van resistente cellen. Het grootste deel van de bestaande literatuur schrijft terugval toe aan de voortplanting van een resistente kwaadaardige subkloon die al aanwezig was op het moment van diagnose5. Een recente studie suggereert echter het bestaan van alternatieve mechanismen, zoals epigenetische modificaties die transcriptieprogramma's reguleren, die ook kunnen bijdragen aan terugval6.

Er is veel moeite gedaan om nauwkeurige in vivo modellen te maken om ALLE recidieven te bestuderen. Immunodeficiënte muizen zijn met succes gebruikt voor ALLE implantatie, waarbij de oorspronkelijke ziektekenmerken 7,8 behouden zijn gebleven, wat heeft geleid tot de ontwikkeling van van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDX's). Dit model maakt de implantatie en proliferatie van originele tumor-/leukemiecellen in een compatibele micro-omgeving mogelijk. Een van de grote voordelen is de mogelijkheid om de respons van getransplanteerde ALLE cellen op chemotherapie 9 tebeoordelen.

PDX-modellen zijn ook gebruikt om ALLE recidieven na te bootsen en te bestuderen. Een protocol ontwikkeld door Samuels et al.10 gebruikte bijvoorbeeld niet-obese diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiënte (NOD/SCID) muizen getransplanteerd met leukemiecellen van patiënten om resistentiemechanismen tegen een inductie-achtig chemotherapieregime te onderzoeken. De auteurs beschreven de behandeling met vincristine, dexamethason, L-asparaginase en daunorubicine (VXLD) en gaven voorbeelden van het aantal behandelingscycli en de timing van terugval. Het model concentreerde zich echter op het analyseren van cellen onmiddellijk na de behandeling - cellen die de initiële therapie overleefden - die waarschijnlijk een minimale restziekte (MRD) vertegenwoordigen in plaats van terugval.

Een recentere studie evalueerde of kortdurende behandeling van ALL-getransplanteerde NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma of NSG) immunodeficiënte muizen konden terugval voorspellen bij corresponderende patiënten11. ALL-monsters met een gemiddeld risico - van zowel recidiverende als niet-recidiverende patiënten - werden getransplanteerd in muizen en behandeld met een inductie-achtig regime bestaande uit vincristine, dexamethason en L-asparaginase (VXL). De tijd tot implantatie en terugval na de behandeling werden gemeten en vergeleken. De resultaten suggereerden dat dit PDX-model zou kunnen dienen als een prognostisch hulpmiddel voor het voorspellen van patiëntresultaten. Deze bevinding ondersteunt het nut van PDX-muizenmodellen bij het bestuderen van de biologie van ALLE recidieven. Relapsing cellen kunnen bijvoorbeeld op verschillende tijdstippen zijn onderzocht om de mechanismen die ten grondslag liggen aan terugval bloot te leggen.

In dit manuscript presenteren we verbeteringen aan het PDX-muizenmodel voor het bestuderen van B-ALL-terugval. We streven ernaar om ziekterecidief en de kenmerken van recidiverende cellen na hun vorming door inductiechemotherapie te bestuderen. Een inductie-achtig regime met vier geneesmiddelen - vincristine, dexamethason, L-asparaginase en daunorubicine - werd gestandaardiseerd, met behulp van de NSG-muizenstam. Van deze stam is bekend dat deze beperkingen heeft bij het weerstaan van herhaalde chemotherapiecycli als gevolg van de Prkdcscid-mutatie en verhoogde gevoeligheid voor genotoxische stress12. Daarom werd het lichaamsgewicht van het dier gecontroleerd als een marker voor de toxiciteit van de behandeling. Het B-ALL terugvalmodel kan worden onderverdeeld in drie hoofdstappen: (1) transplantatie van ALLE cellen in muizen, waarbij wordt gestreefd naar een implantatiedrempel van 0,2-1% menselijke CD45⁺-cellen in perifeer bloed; (2) 4 weken chemotherapie, gevolgd door een rustperiode tot de eerste terugval (R1); en (3) bij detectie van R1, herhaalde behandelingscycli van het inductietype van 1 week. Daaropvolgende recidieven (R2, R3... RN) kan optreden en het interval tussen behandeling en terugval (Δt) wordt geregistreerd. Een progressieve verkorting van Δt wordt geïnterpreteerd als een indicatie van verworven resistentie tegen geneesmiddelen. Als onderdeel van meer diepgaand onderzoek naar de mechanismen van terugval, kunnen B-ALL-cellen voor en na verschillende stadia van het protocol worden verzameld. Het is belangrijk om te benadrukken dat, afhankelijk van de tijd tussen het optreden van een terugval en het herstel van de cellen, de inherente mechanismen van dit fenomeen mogelijk niet behouden blijven. Met het oog hierop is het uiterst belangrijk dat terugvalcellen snel na bevestiging van de terugval worden verzameld. De verzamelde cellen kunnen worden gebruikt voor toekomstige fenotypische en genetische analyses, waaronder beoordelingen van de dynamiek van de celcyclus, celmigratie, leukemie-initiërende celfrequentie, chromosomale veranderingen en epigenetische modificaties.

Voor de doeleinden van dit artikel zullen we ons concentreren op het beschrijven van het terugvalmuismodel. Gedetailleerde informatie zal worden verstrekt voor de drie experimentele fasen - transplantatie, behandeling tot eerste terugval (R1) en cyclische behandeling tot meervoudige recidieven (R2, R3...). We hopen dat dit model onderzoekers in staat zal stellen om chemotherapie-resistente B-ALL-cellen te genereren uit verschillende subtypes, waardoor dieper onderzoek mogelijk wordt naar de cellulaire en moleculaire veranderingen die gepaard gaan met terugval. Uiteindelijk kan dit bijdragen tot een beter begrip van resistentiemechanismen en de ontwikkeling van effectievere en gepersonaliseerde therapieën vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd volgens de voorschriften en ethische richtlijnen van Comissão de Ética no Uso de Animais van Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). De leukemiemonsters die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit biobankflesjes van patiënten die werden behandeld in Centro Infantil Boldrini, die het gebruik van hun cellen toestonden via een geïnformeerd toestemmingsformulier. Het project werd goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Leukemieceltransplantatie en monitoring van implantatie

  1. Voorbereiding van leukemiemonsters voor muizentransplantatie
    1. Ontdooi eerder gecryopreserveerde monsters van ALLE cellen die uit het beenmergaspirataat van de patiënt zijn genomen. Gebruik een waterbad op 37°C. Ontdooi de monsters door de cryobuis in een cirkelvormige beweging te bewegen.
    2. Breng het ontdooide monster over in een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 14 ml 1x steriele PBS toe aan het monster om de cellen te wassen en verwijder de cryopreservatieoplossing. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder de supernatant.
  2. Bereiding van transplantatieoplossing
    1. Resuspendeer de ontdooide cellen in steriel 1x PBS. Gebruik 5-10 x 106 levensvatbare cellen in een volume van 100 μL PBS voor elk te transplanteren dier. Bewaar de transplantatieoplossing op ijs tot de transplantatie.
      OPMERKING: Cellen werden geteld volgens de semi-automatische methode13.
  3. Muizen transplantatie
    1. Selecteer NOD voor mannen of vrouwen van 2 maanden. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) muizen voor leukemietransplantatie.
      OPMERKING: Om een homogeen experimenteel ontwerp te behouden dat vrij is van interferentie met het geslacht van dieren, werden de ALL-monsters getransplanteerd in beide muizengeslachten, zodat alle goede en slechte responder-leukemieën gelijk vertegenwoordigd waren in beide geslachten. Als gevolg hiervan ontdekten we dat vrouwelijke muizen eerder enten dan mannelijke muizen. Gezien het feit dat, om mogelijke interferentie van het geslacht van muizen in toekomstige analyses (zoals implantatiekinetiek) te voorkomen, we voorstellen om slechts één muizengeslacht te gebruiken bij het werken met hetzelfde leukemiemonster. Er werden geen andere parameters gebruikt om het ene geslacht boven het andere te verkiezen.
    2. Plaats één muis tegelijk in een veilige en goedgekeurde muizenval om ervoor te zorgen dat het dier goed wordt ingesloten. Zorg ervoor dat de staart van het dier zich buiten de val bevindt en gemakkelijk toegankelijk is voor transplantatie.
      OPMERKING: Leukemiecellen worden in muizen getransplanteerd door middel van intraveneuze (i.v.) injectie. Vastgestelde protocollen gebruiken hiervoor de laterale aderen van de staart11.
    3. Gebruik infrarood licht om een goede aderexpansie te garanderen. Injecteer 100 μL van de transplantatieoplossing met behulp van een steriele, scherpe injectienaald voor eenmalig gebruik. Bewaar de getransplanteerde muizen in een specifieke pathogeenvrije faciliteit. Laat ze 15 dagen rusten.
      1. Om het infraroodlicht te gebruiken, houdt u het reeds vastgehouden dier buiten de kooi en op 30 cm afstand van het licht. Pas de belichtingstijd aan, afhankelijk van het potentiële lichtvermogen. Bij gebruik van een lamp met een gemiddeld vermogen is een periode van 5 minuten voldoende om aderexpansie te garanderen. Als u de staart voor een langere periode blootstelt, kan dit brandwonden en stress bij het dier veroorzaken.
      2. Gebruik voor de injectie een insulinespuit met een aangehechte naald, met een volume van 1 ml en een naalddikte van 12,7 mm x 0,33 mm. De specificatie van de gebruikte naald is te vinden in de materiaaltabel. Houd muizen in een licht/donker-cyclusregime van 12 uur/12 uur. Huisvest bovendien de dieren die in dit onderzoek zijn gebruikt in een autoclaveerbare doorschijnende amberkleurige polycarbonaat kooi met omgevingsverrijking om nesten te maken.
  4. Perifere bloedafname
    1. Verzamel 2 weken na inoculatie en daarna elke week een perifeer bloedmonster van 50 μl van elke muis.
    2. Houd het dier handmatig met de linkerhand vast en zorg ervoor dat de kop stevig wordt vastgehouden. Gebruik met de rechterhand een steriele, scherpe, wegwerpbare lancet om de gezichtsader van de submandibulaire plexus van het dier te doorboren.
      OPMERKING: Dit is een potentieel schadelijke procedure voor de muizen en moet zorgvuldig worden uitgevoerd.
      1. Zorg ervoor dat het dier gemakkelijk kan ademen tijdens het fixeren. Let op veranderingen in de ademhalingsfrequentie (kortademigheid) en veranderingen in de kleur van de mond (deze mag niet paars of donkerblauw worden). Als de submandibulaire plexus niet correct wordt aangeprikt, kan er een bloeding in het oor optreden als gevolg van de gehoorgangpunctie. Om toekomstige onderzoekers te begeleiden, is aanvullende figuur 1 beschikbaar om de juiste locatie van de plexus te garanderen.
        OPMERKING: Als alternatief kunnen staartaderbloedingen ook worden gebruikt om bloedmonsters te verzamelen.
    3. Laat het dier na het ophalen niet onbeheerd achter. Het moet actief en ongedeerd zijn. Als de muis tekenen van vallen (hoofd of lichaam) en inactiviteit vertoont, moet deze worden geëuthanaseerd. Overschrijd het volume van 50 μl niet, aangezien grotere hoeveelheden bloed de dood van het dier tot gevolg kunnen hebben.
    4. Bewaar het verzamelde bloedmonster in een centrifugebuis van 1.5 ml met 8 μl 50 mM EDTA om monsterstolling te voorkomen.
      OPMERKING: Hier hebben we een eerder bereide EDTA-oplossing als antistollingsmiddel gebruikt. Indien gewenst kunnen in deze stap ook in de handel verkrijgbare EDTA-buisjes met een laag volume voor bloedafname worden gebruikt. De bloedmonsters moeten op dezelfde dag worden verwerkt.
  5. Voorbereiding van perifere bloedmonsters voor verwerking
    1. Homogeniseer het bloed met EDTA. Breng 50 μL van het mengsel over in een flowcytometriebuisje.
    2. Bereid een antilichaammengsel voor dat aan elk monster moet worden toegevoegd, bestaande uit anti-muis CD45-antilichaam (mCD45), anti-humaan CD45-antilichaam (hCD45), anti-humaan CD19-antilichaam (hCD19) en steriel 1x PBS als verdunningsmiddel.
  6. Verwerking van bloedmonsters
    1. Voeg 10 μL van het antilichaammengsel toe aan elk bloedmonster. Homogeniseer door zachtjes met de wijsvinger te tikken. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht.
      OPMERKING: Selecteer de juiste antilichamen die hierboven zijn beschreven, rekening houdend met de beschikbare kanalen van de cytometer. Om de hoeveelheid antilichaam te bepalen die per monster wordt gebruikt, kunt u overwegen een titratiecurve uit te voeren voor elk antilichaam. De antilichamen die in onze studie zijn gebruikt, de fluorochromen en het volume dat voor de monsters is gekozen, worden vermeld in aanvullende tabel 1. Een volledige beschrijving van de catalogusnummers van antilichamen en de namen van de klonen staat in de Materiaaltabel.
    2. Voeg aan elk monster 1 ml commerciële 1x lysisoplossing voor rode bloedcellen (RBC) toe. Homogeniseer krachtig met de wijsvinger. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht.
      OPMERKING: De lysisoplossing die in deze stap wordt gebruikt, is een in de handel verkrijgbare 10x RBC-lysisoplossing. Als een ander reagens wordt gebruikt, moet het 1x werkvolume voor lysis worden aangepast.
    3. Voeg 2 ml steriel 1x PBS toe aan elk monster voor de eerste wasstap. Centrifugeer de monsters bij 200 x g (in een zwenkrotor) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg door het om te keren en droog de resterende vloeistof aan de bovenkant van de tube door voorzichtig te deppen met keukenpapier.
      OPMERKING: In de wasstappen worden de leukemiecellen op de bodem van de cytometerbuis gepelleteerd en wordt de resterende vloeistof weggegooid. Het is absoluut noodzakelijk om voorzichtig te zijn bij het hanteren van de monsters, omdat de pellet in bepaalde gevallen mogelijk niet waarneembaar is. Om de integriteit van de pellet te garanderen, moet u het monster niet schudden, omdat dit kan leiden tot verlies.
    4. Herhaal stap 1.6.3. Resuspendeer de leukemiecellen met 200 μL steriel 1x PBS door zachtjes met de wijsvinger op het cytometriebuisje te tikken. De steekproeven zijn klaar om door middel van flowcytometrie te worden geanalyseerd. De monitoring van de implantatie moet op dezelfde dag worden uitgevoerd als de bloedafname.
  7. Monitoring van implantatie door middel van flowcytometrie
    1. Gebruik standaard flowcytometriemethodologieën 9,14 om het percentage menselijke CD45+-cellen in het perifere bloed te bepalen ten opzichte van CD45+-cellen van muizen (% hCD45+).
    2. Verzamel gegevens die zijn gegenereerd door flowcytometrie voor daaropvolgende analyse van het percentage hCD45+ over het totale aantal CD45-cellen (hCD45+ plus mCD45+) met behulp van flowcytometrie-analysesoftware.
      OPMERKING: Om een goede monitoring van de implantatie te garanderen, moeten de volgende analysestappen op dezelfde dag worden uitgevoerd. Deze dagelijkse volgorde is vooral belangrijk bij het overwegen van de start van het toekomstige behandelschema, dat we aanraden om op maandag te beginnen. Als het niet mogelijk is om op maandag te beginnen, kan de behandeling op elke dag van de week beginnen, afhankelijk van het bereiken van de hCD45+% (0,2%-1%) op perifeer bloed.
  8. Voorbereiding van de omgeving voor de analyse van flowcytometriegegevens
    1. Start software voor flowcytometrieanalyse. Importeer de verzamelde gegevens en wacht op herkenning door de tool.
    2. Open de gegevens van het eerste monster om de poort met het label Lymfocyten te maken. Asinstellingen controleren: selecteer FSC-A voor de X-as en SSC-A voor de Y-as. Selecteer in het bovenste deelvenster voor het maken van de poort de tool polyliner en geef een overzicht van de belangrijkste celpopulatie.
      OPMERKING: Lymfocyten verschijnen meestal tussen 50.000-100.000 op de X-as en 0-50.000 op de Y-as. Waarden kunnen variëren afhankelijk van de kenmerken van elke leukemie.
    3. Dubbelklik op de Gated Population om een nieuwe poort te maken. Als u celdoubletten wilt uitsluiten, stelt u FSC-A in op de X-as en FSC-H op de Y-as. Gebruik de poly-liner-tool om de primaire celpopulatie te isoleren. Teken de poort dicht rond de populatie, met uitzondering van gebeurtenissen op afstand langs de X-as.
      OPMERKING: In deze stap worden individuele celgebeurtenissen onderscheiden.
  9. Het maken van het cytometriepaneel om celpopulaties te onderscheiden
    1. Dubbelklik op de geselecteerde populatie om onderscheid te maken tussen CD45-cellen van mensen en muizen. Stel de X-as in op de mCD45-fluorofoor en de Y-as op SSC-A. Teken met behulp van het vormgereedschap een vierkant rond de mCD45-negatieve populatie.
    2. Dubbelklik op de resulterende populatie om hCD19+- en/of hCD45+-cellen te onderscheiden. Stel de X-as in op de hCD19-fluorofoor en de Y-as op hCD45. Selecteer in het deelvenster voor het maken van poorten de optie Loodrechte lijnen om de afzonderlijke populaties te scheiden.
      OPMERKING: Als alternatief kan de onderzoeker de poort of mogelijkheid gebruiken om hCD45- en mCD45-cellen te onderscheiden. Deze mogelijkheid beschouwt de som van de gebeurtenissen als 100%, waardoor een preciezere strategie ontstaat voor het identificeren van populaties.
  10. Statistieken toepassen op het gemaakte paneel
    1. Bereken het percentage van elke geïsoleerde celpopulatie ten opzichte van alle verworven gebeurtenissen. Klik in het hoofdsoftwarevenster met de rechtermuisknop op het pictogram Subgraaf dat is afgeleid van de hoofdgrafiek van elk voorbeeld en selecteer Statistieken maken. Klik in het geopende venster op Frequentie van en selecteer Enkele cellen. Voer deze stap afzonderlijk uit voor elke subgraaf.
    2. Selecteer alle wijzigingen die zijn aangebracht om de poortstrategie en de bijbehorende statistieken op alle steekproeven toe te passen. Sleep vervolgens met de linkermuisknop de geselecteerde wijzigingen naar de optie Alle voorbeelden in het hoofdsoftwarevenster.
    3. Klik op Tabeleditor in het hoofdvenster om een tabel te genereren met alle berekende frequenties. Kies in het pop-upvenster de bestandsindeling .xls, wijs de doelmap aan en klik op Tabel maken.
      OPMERKING: Alle stappen die worden uitgevoerd met behulp van de flowcytometrie-analysesoftware kunnen worden gevisualiseerd in aanvullende figuur 2. De uiteindelijke tabel die door deze stap wordt gegenereerd, bevat het percentage hCD45+ dat nodig is om grafieken te genereren om de implantatieprogressie in de loop van de tijd te analyseren.
  11. Uitzetten van het verloop van de implantatie
    1. Start een software voor het plotten en analyseren van grafieken. Selecteer de XY-tabelindeling. Kies in het hoofdvenster de optie Gegevens invoeren of importeren in een nieuwe tabel, stel X in op Getallen en Y op Repliceer waarden invoeren in subkolommen naast elkaar.
    2. Organiseer in de geopende tabel de kolomtitels: voer Dagen van implantatie in voor de X-kolom en % hCD45+ op PB voor de eerste groep Y-subkolommen. Vul de X-kolom in met de dagen na de injectie die overeenkomen met de dagen van bloedafname voor monitoring van de implantatie. Voer handmatig het wekelijks verzamelde percentage hCD45+-gegevens voor elke muis in de Y-subkolommen in.
    3. Selecteer in het softwaremenu onder de subset Familie de optie Gegevens 1. Kies in het pop-upvenster de tweede grafiekoptie met de naam Punten en verbindingslijn met foutbalken en schakel het plotten van gemiddelde en foutbalken in.
    4. Pas de grafiekassen aan op het gewenste bereik. Klik op Exporteren in de rechterbovenhoek van het menu om de definitieve grafiek te downloaden.
      OPMERKING: Alle gegevens die tijdens de experimenten met een enkele ALL worden verzameld, moeten in dezelfde grafiek worden uitgezet om analyses in de loop van de tijd sinds het begin van het experiment te vergemakkelijken. Een beschrijvend voorbeeld van het plotten van grafieken is te vinden in aanvullende figuur 3.

2. Behandeling van muizen

  1. Bereiding van oplossingen voor het bewerken van medicijnen
    1. Bereid een vincristine-werkoplossing voor in een concentratie van 1 mg/ml. Bereid een dexamethason-werkoplossing van 4 mg/ml. Bereid L-asparaginase werkoplossing voor bij 2.000 IE/ml. Bereid de daunorubicine-werkoplossing voor op 2 mg/ml.
      OPMERKING: De geneesmiddelen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gelijkwaardig aan de geneesmiddelen die worden gebruikt bij de klinische behandeling van patiënten15. Dexamethason werkoplossing voertuig is samengesteld uit creatinine, natriumcitraatdihydraat, natriumhydroxide, natriumbisulfiet, methylparaben, propylparabeen en water voor injectie. Vincristine werkoplossingsvoertuig is samengesteld uit mannitol, zwavelzuur, natriumhydroxide en water voor injectie. L-asparaginase en daunorubicine zijn vaak verkrijgbaar in gelyofiliseerde vorm. In dergelijke gevallen is het aanbevolen middel voor reconstitutie steriel water voor injecties, dat moet worden gebruikt om de juiste concentratie te bereiken. Om verlies van geneesmiddelactiviteit als gevolg van herhaalde cycli van ontdooien te voorkomen, moeten geneesmiddelen worden onderverdeeld in werkende aliquots die niet meer dan 3x worden gebruikt.
  2. Dieren die wegen wanneer leukemie wordt gedetecteerd
    1. Start de behandeling op het punt waarop het percentage hCD45+-cellen in het perifere bloed van muizen een mediaan bereik tussen 0,2% en 1% bereikt. Wanneer u het bereikt, verdeelt u de getransplanteerde muizen in twee verschillende groepen: een om behandeling te krijgen en een om als controle te dienen.
    2. Bij het bereiken van de vastgestelde drempel, volharden in de wekelijkse monitoring van de progressie van leukemie. Verzamel continu hCD45%-gegevens om de respons op de behandeling, het optreden van recidieven en de detectie van resistentie tegen geneesmiddelen te controleren.
    3. Weeg de te behandelen dieren. Gebruik het rekenkundig gemiddelde van het gewicht om de dosis van elk geneesmiddel te bepalen dat aan de groep moet worden toegediend. Weeg de dieren van de controlegroep om gewichtstoename/-verlies tussen groepen te vergelijken.
      1. Gebruik de volgende medicijndoses: vincristine, 0,15 mg/kg; dexamethason, 5 mg/kg; L-asparaginase, 1.000 IE/kg; en daunorubicine, 1,2 mg/kg. Weeg alle dieren minimaal 3x per week: op maandag, woensdag en vrijdag. Gebruik de gewichten om de behandelingsdoses van de geneesmiddelen aan te passen en om het niveau van behandelingstoxiciteit te controleren.
  3. Bereiding van de oplossingen voor medicijntoediening uit de aliquots van de werkende oplossing
    OPMERKING: Oplossingen voor medicijntoediening bestaan uit steriel 1x PBS als verdunningsmiddel en het juiste volume (afhankelijk van het gewicht van het dier) van werkende medicijnoplossingen (steriel water wordt uitsluitend gebruikt voor reconstitutie en niet voor injectie) die elke dag van de week worden toegediend. Geneesmiddelen die intraperitoneaal worden toegediend, kunnen in dezelfde oplossing worden verenigd; Als een geneesmiddel echter intraveneus wordt toegediend, moet het in een individuele oplossing worden geplaatst. Het volume van de geneesmiddeltoedieningsoplossing die aan elk dier moet worden toegediend, is 100 μl.
    OPMERKING: Een steriele insulinespuit met bevestigde naald (1 ml, met naaldafmetingen 12,7 mm x 0,33 mm) werd gebruikt in de hierboven beschreven stap. Een volledige beschrijving van de spuit is te vinden in de Materiaaltabel.
    1. Bereid op maandag een oplossing voor medicijntoediening voor die bestaat uit dexamethason, vincristine en PBS. Dien de medicijnen intraperitoneaal toe.
    2. Bereid op dinsdag en donderdag een oplossing voor medicijntoediening voor die bestaat uit dexamethason, L-asparaginase en PBS. Dien de medicijnen intraperitoneaal toe.
    3. Bereid op woensdag een oplossing voor medicijntoediening bestaande uit dexamethason en PBS en dien deze intraperitoneaal toe. Bereid een tweede oplossing voor toediening van het geneesmiddel, bestaande uit daunorubicine en PBS. Intraveneus toedienen.
    4. Bereid op vrijdag een oplossing voor medicijntoediening voor die bestaat uit dexamethason en PBS. Dien het medicijn intraperitoneaal toe.
    5. Laat de dieren rusten tijdens de weekenddagen. Herhaal de behandelingscyclus gedurende 4 weken.
      OPMERKING: Een uitgebreid behandelschema is te vinden in aanvullende tabel 2. Het is belangrijk om te verduidelijken dat andere protocollen die al waren opgesteld voor de behandeling van muizen werden getest, maar resulteerden in hoge niveaus van toxiciteit voor de NSG-stam. Daarom werd het voorgestelde behandelingsschema eerst onderworpen aan een standaardisatieproces voor de vermindering van de toxiciteit, wat resulteerde in de doses en frequentie van toediening die in dit protocol worden gepresenteerd. De verwachting is dat het percentage hCD45+ in de behandelde groep zal afnemen ten opzichte van het percentage hCD45+ in de controlegroep als gevolg van de toediening van de behandeling.
  4. Toediening van geneesmiddelen en monitoring van de respons op leukemie
    1. Houd het dier handmatig met de linkerhand in bedwang om medicijnen intraperitoneaal toe te dienen. Houd het dier met het buikgedeelte omhoog. Zoek op het ventrale gedeelte het kwadrant rechtsonder.
    2. Gebruik met de rechterhand een steriele, scherpe injectienaald voor eenmalig gebruik en injecteer 100 μl van de toedieningsoplossing van het geneesmiddel in het kwadrant rechtsonder van de muis.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het in bedwang houden van het dier; Het mag geen schadelijke procedure zijn voor de muizen. Houd net als bij het afnemen van bloed rekening met eventuele ademhalingscomplicaties. In het geval van intraperitoneale injecties dient de naald altijd loodrecht te worden gehouden om boren in organen te voorkomen.
    3. Volg dezelfde instructies die worden gebruikt om leukemiecellen te transplanteren om medicijnen intraveneus toe te dienen. Laat muizen rusten na 4 weken toediening van de behandeling totdat ALLE cellen weer verschijnen, hier eerste terugval (R1) genoemd.
      OPMERKING: Ondanks het verschil in toedieningsroute, gebruikt de intraveneuze injectie hetzelfde volume als intraperitoneaal geïnjecteerd.
  5. Monitoring van de respons op leukemie en detectie van eerste recidief (R1)
    1. Stop niet met de wekelijkse flowcytometriecontrole van leukemie tijdens de behandeling of in rustfasen.
      OPMERKING: Gezien de behandeling van 5 dagen per week, wordt sterk aanbevolen om aan het begin van de week controle uit te voeren. In ons onderzoek werden bloedafname, monsterverwerking en analyse altijd op maandag uitgevoerd.
    2. Voer bloedafname en alle daaropvolgende procedures uit die nodig zijn voor monitoring volgens stap 1.4 - 1.11.
      OPMERKING: Na de gegeven rustperiode zullen R1-cellen worden gedetecteerd door de plotselinge toename van het percentage hCD45+ in het perifere bloed van muizen. De periode tussen het einde van de behandeling en het optreden van een terugval is variabel en kan voor elke gescreende leukemie verschillend zijn. Bij de detectie van R1 moet de derde en laatste fase van het voorgestelde muismodel van terugval worden uitgevoerd. Om de monitoring en responsanalyses te verbeteren, stellen we voor om objectieve responsmaatstaven te gebruiken, zoals progressieve ziekte, stabiele ziekte, niveau van responsiviteit (gedeeltelijk, volledig of gehandhaafd), remissie en resistentie, volgens de richtlijnen beschreven door Randall et al. (2024)16.

3. Herhaalde behandelingscycli tot het verschijnen van resistente cellen

  1. Detectie van eerste terugval
    1. Dien een volledige week inductiebehandeling toe aan elke muis met leukemie-recidief (R1 genaamd), d.w.z. wanneer de drempel van 0,2% hCD45+ in perifeer bloed is bereikt. Volg gedurende 1 week, van maandag tot en met vrijdag, het toedieningsschema voor geneesmiddelen dat wordt gebruikt voor de 4 weken durende inductiebehandeling.
      OPMERKING: De toediening van slechts 1 week behandeling op dit moment is bedoeld om in vivo te testen of de leukemiecellen resistent zijn geworden tegen chemotherapie, terwijl ze uiteindelijk de progressie van leukemie in de loop van de tijd naar opeenvolgende recidieven stimuleren, onder druk van chemotherapie. We hebben ervoor gekozen om geen tweede schema van 4 weken af te nemen als middel om overmatige toxiciteit en verlies van dieren te voorkomen.
    2. Laat de muizen rusten aan het einde van de volledige week van toediening van het geneesmiddel. Ga door met de wekelijkse monitoring van de leukemierespons door middel van flowcytometrie volgens de stappen 1.4 - 1.11.
      OPMERKING: Op dit punt wordt verwacht dat de leukemiecellen blijven reageren op de behandeling. Bijgevolg zou bij het monitoren van de leukemie het percentage hCD45+ bij de muizen moeten afnemen en gedurende een bepaalde periode negatief moeten blijven.
  2. Monitoring voor R2-weergave
    1. Wacht tot terugval R2 verschijnt (hCD45+-cellen ≥ 0,2%). Wanneer het verschijnt, tel dan de tijd die is verstreken tussen het einde van de behandeling en het verschijnen van R2. Noem deze periode Δt1.
    2. Ga verder met een tweede volledige week van toediening van inductiebehandelingen. Volg dezelfde richtlijnen als de eerste afname van dit schema.
    3. Laat de muizen aan het einde van de behandeling rusten. Ga door met het monitoren van leukemie.
  3. Monitoring voor R3-weergave
    1. Wacht tot terugval R3 verschijnt. Tel de tijd op dezelfde manier als in stap 3.2.1. Noem het Δt2.
    2. Vergelijk Δt1 en Δt2. Herhaal de bovenstaande stappen N keer om meerdere leukemie-recidieven te krijgen (R1, R2... RN) als de Δt-periode hetzelfde blijft. Stop met de behandelingscycli zodra de Δt-periode korter wordt.
      OPMERKING: Een afname van Δt tot terugval is een indicatie van geneesmiddelresistentie die door de leukemiecellen wordt verkregen. Dit resultaat versterkt het vermogen van het muizenmodel van terugval om chemotherapie-resistente ALL-cellen te genereren.
    3. Herstel leukemiecellen zoals beschreven in stap 4 hieronder. Bewaar ze levend door cryopreservatie of met een conserveermiddel dat compatibel is met de beoogde latere analyses.
      OPMERKING: De aanbevolen gebeurtenis voor het herstel van leukemiecellen is maximaal 25% van hCD45+ in het perifere bloed, zoals beschreven in recente literatuur16.

4. Herstel van leukemische cellen door orgaanroof

  1. Muizen euthanasie met een overdosis chemische anesthetica
    1. Euthanaseer muizen door overdosering van chemische anesthetica, gevolgd door cervicale dislocatie voor euthanasiebevestiging zoals hieronder beschreven.
    2. Bereid een mengsel met drie anesthetica verdund in steriel 1x PBS voor diepe anesthesie. Gebruik 150 μL in de handel verkrijgbaar Acepromazinemaleaat, 50 μL in de handel gebrachte Xylazine, 80 μL in de handel gebrachte ketamine en 220 μL PBS voor elk dier dat moet worden geëuthanaseerd.
    3. Dien 500 μl van het bereide mengsel toe door middel van intraperitoneale injectie. Volg dezelfde fixatie- en injectierichtlijnen als beschreven in stap 2.4.
    4. Onder invloed van een overdosis chemische anesthetica gaan muizen op de bodem van de kooi liggen. Kijk na een paar minuten of de muizen een ademstilstand hebben. Als dit het geval is, wacht dan tot de ademhalingsinspanning is gestopt. Om na te gaan of de euthanasieprocedure effectief was, controleert u op de aanwezigheid van een onwillekeurige reflex door druk uit te oefenen op een van de achterpoten van het dier. Om euthanasie te bevestigen, gaat u verder met cervicale dislocatie.
  2. Cervicale dislocatie
    1. Houd het dier met de achterkant van het lichaam tegen het voerrooster in de kooi. Gebruik de wijs- en duimvinger van de linkerhand om de vorm van een pincet te vormen. Plaats de pincetvormige vingers direct onder de kop van het dier. Druk stevig tegen het cervicale gedeelte van de wervelkolom.
    2. Pak de staart van het dier vast met de rechterhand. Trek het met een stevige en gestage beweging naar achteren totdat de kop van het dier gescheiden is van de rest van zijn lichaam.
      OPMERKING: Cervicale dislocatie is een van de geaccepteerde methoden om euthanasie te bevestigen 17,18,19. Andere methoden, zoals voortdurende blootstelling aan CO2 gedurende ten minste 15 minuten na ademhalingsstilstand, kunnen als alternatief worden gebruikt.
  3. Dierlijk preparaat voor orgaanroof
    1. Ontsmet de muizen door 70% alcohol op hun hele lichaam aan te brengen. Plaats het lichaam van het dier over een chirurgisch platform voor knaagdieren met het ventrale gedeelte naar boven. Scheer het buikgedeelte van het lichaam.
      OPMERKING: Een volledige beschrijving van het chirurgische operatieplatform voor knaagdieren is te vinden in de Materiaaltabel.
  4. Milt oogsten
    1. Maak een kleine incisie met een steriele chirurgische schaar en pincet op de buikhuid. Verwijder het uit de buikstreek, waardoor het buikvlies bloot komt te liggen.
    2. Maak een kleine incisie in het buikvlies. Snijd het totdat volledige toegang tot de organen in de buik is verkregen.
    3. Zoek de milt, direct onder de maag van het dier. Verwijder de milt. Plaats het in een recipiënt met steriel 1x PBS voor verdere verwerking.
  5. Dijbeen oogsten
    1. Ga verder met het openen van de buikholte om toegang te krijgen tot de achterpoten van het dier.
    2. Zoek het dijbeen. Verwijder het door te snijden in de gewrichten die het verbinden met het bekkenbot en met het scheenbeen en kuitbeen. Voer dit proces uit voor beide dijbeenderen.
    3. Reinig de botten door alle resterende spieren, huid of weefsel te verwijderen. Plaats ze in een recipiënt met steriel 1x PBS voor verdere verwerking. Gooi het karkas van het dier weg volgens de richtlijnen van de Ethische Commissie Dieren.
      OPMERKING: Afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek, kunnen ALLE cellen ook worden verzameld uit de lever, het centrale zenuwstelsel, de thymus, de lymfeklieren, enz. In dit manuscript beschrijven we als voorbeeld de verzameling van ALLE cellen uit de milt en het beenmerg.
  6. Voorbereiding voor orgaanverwerking
    1. Verzamel een steriele centrifugebuis van 50 ml, twee steriele spuiten van 1 ml, een steriele injectienaald van 25 mm x 0,6 mm en twee steriele celzeefjes van 70 μm.
  7. Milt verwerking
    1. Plaats een celzeef op de bovenkant van een open centrifugebuis van 50 ml. Leg de milt op het oppervlak van de celzeef. Macereer het orgel met het platte deel van de zuiger van de spuit totdat er geen grote porties meer zichtbaar zijn.
    2. Voeg steriel 1x PBS toe aan de gemacereerde milt. Voer cirkelvormige bewegingen uit met het platte deel van de zuiger van de spuit om celfiltratie te garanderen.
      OPMERKING: Het PBS-gieten kan geleidelijk worden gedaan; het uiteindelijke gebruikte volume mag echter niet hoger zijn dan 6 ml. Na voltooiing van de miltverwerking moet de celzeef vrij zijn en vrij van restweefsel. In het geval van verzadiging van de celzeef is het mogelijk om een alternatieve celzeef in te zetten. De inhoud van de eerste zeef kan worden overgebracht naar de tweede zeef en de verwerking kan vervolgens worden voortgezet. Om toegang te krijgen tot de tumorlast in dit orgaan, kan een deel van de milt worden gescheiden voor histopathologische beoordeling.
  8. Verwerking van beenmerg
    1. Voeg een nieuwe celzeef voor beenmergverwerking toe aan de reeds gebruikte centrifugebuis. Snijd de randen van het dijbeen af totdat de beenmergopeningen toegankelijk zijn. Steek de injectienaald in een nieuwe spuit. Voeg 1 ml steriele 1x PBS toe aan de spuit.
      OPMERKING: Afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek, moeten ALLE cellen die uit de milt en het beenmerg zijn verkregen, afzonderlijk worden verzameld. In dit geval moet voor elk weefsel een aparte centrifugebuis worden gebruikt. Een deel van het dijbeen kan worden gescheiden voor histopathologische beoordeling om de tumorlast in dit orgaan te beoordelen.
    2. Voer het beenmerg spoelen uit over de celzeef. Steek de naaldpunt in één kant van de beenmergopening. Duw met een stevige en constante beweging op de zuiger van de spuit. Herhaal de procedure met het andere dijbeen.
    3. Ontkoppel de naald. Gebruik het platte deel van de spuit om het gespoelde beenmerg te macereren. Voeg steriel 1x PBS toe aan het gemacereerde beenmerg. Voer cirkelvormige bewegingen uit met het platte deel van de zuiger van de spuit om celfiltratie te garanderen. Na voltooiing van de verwerkingsprocedure zal de centrifugebuis van 50 ml een totaal volume van 10 ml bevatten, bestaande uit een mengsel van milt- en beenmergcellen die zijn verdund in PBS.
      OPMERKING: Het PBS-gietproces kan geleidelijk worden uitgevoerd; het is echter absoluut noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het uiteindelijke gebruikte volume niet meer dan 2 ml bedraagt.

5. Isolatie van leukemische cellen door gradiëntcentrifugatie

  1. Voorbereiding op isolatie van leukemische cellen
    1. Verzamel een centrifugebuisje van 15 ml, steriele pasteurpipetten voor eenmalig gebruik, het centrifugebuisje van 50 ml met de organen die zijn verwerkt en het dichtheidsgradiëntmedium voor de isolatie van lymfocyten.
      OPMERKING: Het medium vergemakkelijkt de isolatie van mononucleaire cellen door een dichtheidsgradiënt te creëren door middel van centrifugatie. Mononucleaire cellen (lymfocyten, monocyten en ALL-cellen) vormen een laag op het grensvlak tussen het medium en het plasma.
  2. Isolatie van leukemische cellen
    1. Voeg 5 ml van het dichtheidsgradiëntmedium voor lymfocytenisolatie toe aan de centrifugebuis van 15 ml met behulp van een pasteurpipet voor eenmalig gebruik. Voeg geleidelijk de 10 ml van het mengsel van milt- en beenmergcellen toe aan de middelgrote laag. Houd de buis in een ondiepe hoek, ongeveer 30° of minder, en voeg het celmengsel langzaam toe langs de buiswand zodat de middenlaag van de dichtheid niet wordt verstoord.
      OPMERKING: Wees tijdens dit proces voorzichtig om ervoor te zorgen dat de cellen zich niet vermengen met het dichtheidsmedium. Verstoring tijdens dit proces kan leiden tot het falen van de vorming van dichtheidsgradiënt tijdens het centrifugeren.
    2. Centrifugeer de buis van 15 ml bij 420 x g op een schommelende bakrotor gedurende 30 minuten, zonder versnelling en zonder pauze, om de gevormde fasen niet te verstoren.
      OPMERKING: Leukemische cellen gaan een laag vormen tussen het dichtheidsmedium en de waterige fasen.
    3. Verwijder de bovenste waterige fase en gooi deze weg met behulp van een steriele wegwerppasteurpipet. Verzamel de laag leukemische cellen gevormd met een steriele wegwerppasteurpipet. Breng het over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml.
      OPMERKING: Maak u geen zorgen als een deel van de middelste laag met een lagere dichtheid samen met de leukemiecellen wordt gepipetteerd.
  3. Leukemische cellen wassen
    1. Voeg 1x steriel PBS toe aan het buisje met de verzamelde cellen tot de limiet van 15 ml is bereikt.
    2. Centrifugeer de cellen op 300 x ggedurende 5 min. Herstel de maximale acceleratie en het remmen. Verwijder de supernatant en gooi deze weg. Resuspendeer de cellen in nieuwe steriele koude 1x PBS.5.3.3.Ga verder met de controle van de levensvatbaarheid van de cellen en de cellen. Volg de standaard richtlijnen voor de procedure voor het tellen van cellen13. De gewassen cellen kunnen worden gekleurd met anti-muis CD45-antilichaam (mCD45), anti-humaan CD45-antilichaam (hCD45) en anti-humaan CD19-antilichaam (hCD19), gevolgd door wasstappen en gegevensverzameling.
      OPMERKING: In het geval van het verwerken van de miltcellen en de beenmergcellen in verschillende centrifugebuisjes, kan een deel van deze monsters worden gebruikt om toegang te krijgen tot de tumorbelasting in deze organen door middel van flowcytometrie.
  4. Cryopreservatie van leukemische cellen
    1. Pellet de cellen door centrifugeren op 300 x g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg. Houd de cellen op ijs.
    2. Bereid een vriesmedium voor dat bestaat uit 90% steriel koud foetaal runderserum (FBS) en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Gebruik 1 ml van deze oplossing voor elke cryopreservatieflacon.
    3. Resuspendeer de cellen in de bereide oplossing op ijs in een concentratie van 2 x 107 cellen/ ml. Verdeel de cellen in de cryopreservatiebuisjes. Cryopreservatiecellen volgens de standaard richtlijnen voor cryopreservatie van celculturen20.
      OPMERKING: Deze cellen kunnen worden gebruikt voor verdere analyses. In plaats van levensvatbare cellen in te vriezen, kan men cellen ook aliquot en conserveren in verschillende conserveringsmiddelen voor daaropvolgende DNA-, RNA-, eiwit- en metabolietanalyses.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In het kader van onze studies werden voorloper B-cel ALL-monsters geselecteerd uit twee patiëntengroepen: één die een gunstige respons vertoonde, zoals bepaald door de afwezigheid van leukemische cellen in perifeer bloed op dag 8 en afwezigheid van resterende leukemiecellen in het beenmerg op dag 15, 33 en 78/96. De andere groep werd gevormd door ALL's die overeenkwamen met de moleculaire subgroepen van de vorige, verkregen van patiënten met een slechte k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Inzicht in de biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan neoplastische ziekten is essentieel voor de ontwikkeling van effectievere therapieën en voor het verbeteren van de patiëntresultaten. Bij aandoeningen zoals pediatrische acute lymfatische leukemie zijn deze onderzoekende benaderingen niet alleen relevant voor het verhogen van de genezingspercentages, maar hebben ze ook bijzondere waarde voor patiënten bij wie de standaardbehandelingen de grenzen van therapeutische intensi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken het Centro Infantil Boldrini en alle patiënten die hun monsters voor de studie hebben gedoneerd. Manuella M. Hoff ontving een fellowship van de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) van de São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes ontving een productiviteitsbeurs van de National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Dit werk werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van het Braziliaanse ministerie van Volksgezondheid door het PRONON-programma (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL  spuitBD #309628Orgaanophalang
10 mL steriele water voor injectieHalex Istar Indústria Farmacêutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Drug reconstitutie
10X RBC Lysis SolutionBioLegend#420302Bewerking van muizenbloedmonster
5-kanaals celanalysatorBD Biosciences658226R1Flow Cytometer 
70 uM CelzeefFalcom#352350Orgaanophalang
Acepromazinemaleaat Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Muizenanesthesie
APC anti-menselijke CD45 - isotype muis IgG1 - HI30 klonBioLegend#304037Lymfocytenvlekking
Asparaginase 10000 UAginase/medac#88660100Muizenbehandeling
Brilliant-Violet 605 anti-muis CD45 - isotype muis IgG2 - 30-F11 klonBioLegend#103139Lymfocytenvlekking
DaunorubicineFarmarin#116880025Muizenbehandeling
DexamethasonAché#00000066Muizenbehandeling
DimethylsulfoxideSigma-Aldrich#589569Lymfocytcryopreservering
Wegneembare naald - 0,60 x 25 mm (23G x 1’’)BD#300388Orgaanophalang
Sterile wegwerplancet Yancheng Huida Medical Instruments https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Muizenbloedafname
EthyleendiaminetetraazijnzuurLife technologies#15576-O28EDTA-oplossing
Fetaal bovien serumCultilab#F083Lymfocytcryopreservering
Flow Cytometry Software Analyse - Versie 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Flowcytometrieanalyse
Grafiek en Plotting Software Analyse - Versie 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresGrafiekplotting en analyse
Insulinespuit met gemonteerde naald 1mL FX 12,7 mm X 0,33 mmDescarpacke0342101Muizentransplantatie en medicatietoediening
Ketamine InjSespo Indústria e Comércio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Muizenanesthesie
Multifunctionele chirurgische platform voor knaagdierenKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Chirurgische muisprocedures
PE anti-menselijke CD19 - isotype muis IgG1 - HIB19 klonBioLegend#302208Lymfocytenvlekking
KaliumchlorideSigma-AldrichP3911-1KGPBS-oplossing
KaliumdiwaterstoffosfaatSigma-AldrichP0662-1KGPBS-oplossing
Reagens voor lymfocytisolatieCytiva#17-1440-02, pack of 6 × 100 mLLymfocytisolatie uit geoogste organen
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888-1kgPBS-oplossing
Natriumdiwaterstoffosfaat Sigma-AldrichS9763-1KGPBS-oplossing
Sterile Anatomische Dissectiepincet - 12 cm ABC 0170Lab Líder120Chirurgische muisprocedures
Steriele schaar 12 cm - ABC 0321Lab Líder136Chirurgische muisprocedures
VincristineLibbs#7896094208483Muizenbehandeling
Xylazin InjSespo Indústria e Comércio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Muizenanesthesie

Referenties

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Patient Derived Xenograftgeneesmiddelenresistentieflowcytometrieperifere bloedblastenminimale residueelziekteisolatie van leukemiecellen
Muismodel van leukemie Terugval naar inductiechemotherapie voor acute lymfoblastische leukemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.