Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

703 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68814

⸱

20 februari 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Engineering (Suzhou), Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China, 2Anhui Province Key Laboratory of Biomedical Imaging and Intelligent Processing, Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center, 3Department of Biomedical Engineering, City University of Hong Kong, 4Institute for Brain and Intelligence, Fudan University

In dit artikel

Samenvatting

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Samenvatting

Het begrijpen van de structurele en functionele relaties binnen complexe neurale netwerken in de hersenen vereist het opstellen van hersenatlassen die zowel een breed gezichtsveld als subcellulaire resolutie bezitten. Echter, de huidige optische en elektronenmicroscopie-beeldvormingsmethoden hebben elk beperkingen, waardoor het moeilijk is om alle cellen binnen één monster in beeld te brengen. Dit protocol introduceert een beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die willekeurige optische beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters mogelijk maakt na elektronenmicroscopie-monstervoorbereiding, waardoor een volledige hersenatlas van alle neurale cellen wordt gereconstrueerd. Daarnaast kan OMLIT-beeldvorming naadloos worden geïntegreerd met de beeldvormingsworkflow van geautomatiseerde bandverzamelende ultramicrotomie scanning elektronenmicroscopie (ATUM-SEM). Dit stelt onderzoekers in staat om mesoschaal structurele informatie van cellen te verkrijgen voorafgaand aan elektronenmicroscopiebeeldvorming, wat de precieze selectie van interessegebieden vergemakkelijkt en het benodigde oppervlak en datavolume voor hoogresolutie elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming aanzienlijk vermindert. We valideerden de nauwkeurigheid en compatibiliteit van deze methode in daadwerkelijke monsters uit de volwassen muishersenschors, waarmee we de brede toepassingsmogelijkheden in multischaal hersenatlasconstructie aantoonden.

Inleiding

Uitgebreide mapping van neurale circuits met cellulaire en subcellulaire resolutie is essentieel om de structuur en functie van de hersenen te onthullen. Traditionele optische beeldvormingsmethoden, zoals tweefotonmicroscopie1, fluorescentie micro-optische sectietomografie (fMOST)2,3,4 en het VISoR-systeem5, hebben mesoschaal neuronale beeldvorming en in vivo functionele beeldvorming mogelijk gemaakt. Door hun afhankelijkheid van spaarzame labeling slagen ze er echter niet in de volledige cellulaire populatie te vangen. Aan de andere kant bieden labelvrije optische beeldvormingstechnieken, zoals functionele fotoakoescopie (fPAM)6,7, optische coherentietomografie (OCT)8 en kwantitatieve fasemicroscopie9, het potentieel om alle neuronen binnen het gezichtsveld gelijktijdig te visualiseren. Desalniettemin worden deze methoden doorgaans beperkt door lage axiale resolutie en geringe beeldvormingsdiepte, en hun hardwarecomplexiteit belemmert de brede toepassing in de constructie van hersenatlassen. Daarentegen worden seriële sectie elektronenmicroscopie (ssEM) technieken, waaronder seriële blokvlak SEM (SBF-SEM)10,11, gefocuste ionenbundel SEM (FIB-SEM)12,13,14, en geautomatiseerde bandverzamelende ultramicrotomie SEM (ATUM-SEM)15,16,17, dichte synaptische connectiviteitsnetwerken op nanometerresolutie kunnen onthullen, wat essentiële tools biedt voor connectomics met hoge resolutie. Deze technieken hebben echter een lage doorvoersnelheid, lange acquisittijden, beperkte gezichtsvelden en hoge dataverwerkings- en hardwarekostenvan 18.

Om bovenstaande beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een beeldvormingsmethode genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die een goedkope en doorlopende oplossing biedt voor willekeurige, hoogcontrast, breedveldbeeldvorming van alle cellen op ultradunne secties, waarbij submicronresolutie wordt bereikt over grote weefselgebieden. Tegelijkertijd is OMLIT van nature compatibel met seriële sectie SEM-workflows: vóór hoogresolutie-elektronenmicroscopie levert OMLIT structurele informatie over dezelfde secties, wat nauwkeurige ROI-navigatie mogelijk maakt en het benodigde gebied en datavolume voor daaropvolgende EM-beeldvorming aanzienlijk vermindert. OMLIT biedt unieke voordelen op mesoschaal beeldvormingsniveau en dient als een cruciale brug die neurale structurele kaarten verbindt over verschillende ruimtelijke schalen. Het niet-destructieve karakter ervan behoudt het potentieel voor toekomstige integratie met specifieke labelstrategieën, zoals het gebruik van osmiumresistente fluorescerende eiwitten19 voor monstervoorbereiding en beeldvorming. Deze methode maakt mesoschaalbeeldvorming van geselecteerde hersengebieden mogelijk, waardoor snelle acquisitie van neuronale morfologie, hoeveelheid, distributie en dichtheid in de regio's mogelijk is. Het vergemakkelijkt ook de kwantitatieve karakterisering van axonale projecties en dendrietverdeling tussen neuronen in verschillende hersengebieden. Voor specifieke interessegebieden in de beeldvormingsresultaten kunnen in situ ultrastructurele details verder worden onderzocht met behulp van elektronenmicroscopie.

Het beeldvormingsprincipe van OMLIT is beschreven in het werk van Hao Fan20. Kort samengevat vormen tijdens de beeldvorming de ultradunne sectie, de gecoate laag, verzameltape, geleidende tape en wafer een meerlagige dunne filmstructuur. Wanneer een vlakke golf met deze structuur interageert, worden gereflecteerde golven gegenereerd op verschillende grensvlakken en overlappen ze in de detectieruimte, wat resulteert in optische interferentie door verschillen in reflectie, brekingsindex en absorptie tussen de materialen. Een op MATLAB gebaseerde simulatieprogramma, ontwikkeld op basis van dit principe, toonde redelijke overeenstemming met de experimentele resultaten.

Het OMLIT-beeldvormingsschema kan worden ingedeeld in twee typen op basis van de tapeverwerkingsstrategie. De eerste is de strategie met hoge reflectiviteit, waarbij metalen zoals Cr, Cu, Al of Ag worden gebruikt om het tapeoppervlak te coaten, wat resulteert in hogere optische intensiteiten in cytoplasmatische gebieden en harsgevulde vasculaire lumens vergeleken met omliggende gebieden. De tweede is de laagreflectiviteitsstrategie, waarbij ongecoate Kapton-tape, D-50-tape of CNT-gecoate PET-tape wordt gebruikt. In dit geval is het resultaat van optische beeldvorming het omgekeerde van het eerste: harsrijke membraanvrije gebieden (bijv. cytoplasma en vaatlumen) verschijnen met een lagere intensiteit.

We vatten systematisch samen en stellen gestandaardiseerde protocollen op die zijn afgestemd op twee verschillende beeldvormingsstrategieën. De hier gepresenteerde protocollen bieden uitgebreide en gedetailleerde experimentele procedures. Daarnaast worden veelvoorkomende problemen die tijdens de experimenten worden tegengekomen samengevat, samen met voorgestelde oplossingen. We richten ons op het presenteren van een dataset van de muiscortex die is verkregen met behulp van de low-reflectivity strategie (805 × 857,5 × 11,66 μm³), waarmee de onderscheidende kenmerken en voordelen van de OMLIT-beeldvormingsmethode worden geïllustreerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de University of Science and Technology of China en de relevante nationale regelgeving. De monstervoorbereiding voor OMLIT-beeldvorming volgt hetzelfde protocol als dat bij conventionele EM, en de specifieke procedure die we toepasten is elders beschreven21. Kort samengevat werden muizen na anesthesie transcardiaal geperfuseerd met natriumcacodylaatbuffer, kunstmatig cerebrospinaal vocht (ACSF) en tenslotte een fixatief met glutaraldehyde en paraformaldehyde. De hersenen werden zorgvuldig verwijderd en ongeveer 1 × 1 × 1 mm³ blokkades hersenweefsel werden doorgesneden. De monsters werden vervolgens chemisch gefixeerd, onderworpen aan seriële zware metaalverkleuring, gedehydrateerd en in hars ingebed. De algemene workflow van het protocol wordt weergegeven in Figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Overzicht van de workflow. (A) Verzamelbanden genoemd in het protocol (van links naar rechts: polyimide, D-50 en CNT-gecoate PET). (B) Seriële secties en verzameling van de getrimde monsters. (C) Montage van linten met verzamelde secties op een ronde siliciumwafer. (D) Lichtmicroscopiebeeldvorming, schaalbalk 100 μm. (E) Koolstofcoating. (F) Elektronenmicroscopiebeeldvorming komt overeen met het gebied dat is weergegeven in Figuur 1D, schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Tapevoorbereiding

OPMERKING: De volgende procedures moeten in een cleanroom worden uitgevoerd om vervuiling met stof te voorkomen.

  1. Strategie met hoge reflectiviteit
    1. Kies Kapton (hierna polyimidetape genoemd, 50 μm dikte) of Panlite-film (hierna aangeduid als D-50, 50 μm dikte) en monteer deze op het gemotoriseerde wikkelsysteem. Hier wordt het polyimidetape als voorbeeld gebruikt.
      OPMERKING: In deze studie werd een gemotoriseerd wikkelapparaat gebruikt, ontworpen om aangedreven te worden door een stappenmotor die via een Arduino-bord wordt aangestuurd om de band van de ene spoel naar de andere via de sputterplasmakegel te laten lopen. Om de toenemende lijnsnelheid van bandtranslatie te compenseren, veroorzaakt door de ophoping van tape op de aandrijfspoel, waardoor de diameter van de ophaalspoel toenam, werd er een programma geschreven om de hoeksnelheid van de ophaalspoel na elke 360° rotatie seriematig af te stemmen.
    2. Breng een uniforme dunne film Cr (of andere metalen zoals Al, Ag of Cu) aan op het oppervlak van de tape met behulp van een magnetron-sputtersysteem (double-head sputter). Plaats de tape op een afstand van 80 mm van het sputterende doel voor een optimale depositie. Voer het proces uit onder gelijkstroom en met een druk van 1,0 Pa, geregeld door 99,99% argongas.
    3. Stel de wikkelsnelheid van de band in op 0,6 mm/s om een metaalcoatingdikte van 50 nm te bereiken. Na depositie koel je de kamer langzaam af tot kamertemperatuur (RT) onder hoog vacuüm om coatingspanning te minimaliseren.
      OPMERKING: De optimale coatingdikte voor dezelfde tape kan variëren afhankelijk van het gebruikte metaaltype. Pas de translatiesnelheid van de tape aan om verschillende coatingdiktes te bereiken, zoals 50, 70, 100, 150 en 200 nm.
    4. Evalueer de dikte en uniformiteit van de coating met behulp van een stylusprofiler, atoomkrachtmicroscopie of scanning-elektronenmicroscopie.
    5. Maak de tape hydrofiel en maak de tape schoon met een plasmareiniger op 80 W vermogen, met een snelheid van 7 mm/s. Na de behandeling zouden waterdruppels die op het oppervlak van de tape worden geplaatst, zich snel verspreiden tot een dunne film (Figuur 2A).
  2. Lage reflectiviteitsstrategie
    OPMERKING: Dit protocol maakt het gebruik van D-50 tape of een commerciële koolstofnanobuis (CNT) gecoate polyethyleentereftalaat (PET) tape mogelijk. Omdat deze laatste tijdens elektronenmicroscopiebeeldvorming wat achtergrondruis kan introduceren - hoewel niet sterk - kan dit mogelijk de segmentatie van elektromagnetische beelden beïnvloeden. Daarom zal de volgende beschrijving nog steeds de D-50 tape als voorbeeld gebruiken.
    1. Bereid de D-50-films voor en knip het hele vel in banden van ongeveer 7 mm breed. Gebruik één blootgestelde kant van de tape om secties te verzamelen, terwijl je de andere kant beschermt met een laag matte folie om krassen en besmetting te voorkomen. Verwijder de matte folie tijdens de daaropvolgende montagestap voor de siliconenwafer.
    2. Voor grotere aantallen secties verbind je verschillende secties D-50 tape aan elkaar. Zet de verbindingen tussen de tapesegmenten vast met dubbelzijdig lijmband.
      OPMERKING: Bij het vastplakken van tapesegmenten moet je ervoor zorgen dat de leidende tape van boven naar beneden over de achterste tape loopt via de dubbelzijdige tape. Minimaliseer het lijmgebied en laat een marge langs de randen van de tape om te voorkomen dat er lijm wordt uitgeperst tijdens het opwinden van tape, wat de tape kan vervuilen (Figuur 2B).
    3. Maak de tape hydrofiel schoon met een plasmareiniger, volg dezelfde procedure en bereik hetzelfde effect als eerder beschreven.
      OPMERKING: Behalve de metalen coating en koolstofsputterstappen zijn de andere stappen in beide strategieën hetzelfde.

2. Seriële ultradunne sectievorming en tape-gebaseerde verzameling

  1. Met een kleine slijper of vergelijkbaar snijgereedschap snijd je de hars aan de zijkant met het monster ruw af, waarbij je de omliggende blanco hars verwijdert om het monsteroppervlak bloot te leggen.
  2. Plaats het met hars beliggende blok in de monsterhouder en draai de knop van de houder stevig vast.
  3. Bevestig de monsterhouder op de beweegbare arm van het microtoom. Plaats een glazen mes of een diamantafsnijder (onder een hoek van 45°) op de messenhouder. Onder de microscoop snijd je het monsteroppervlak in een piramidevorm en maak je het oppervlak glad.
    OPMERKING: De voor- en achterranden van het getrimde monsterblok moeten zo parallel mogelijk zijn (zie Figuur 2C).
  4. Trim en glad de vier zijden van het monsterblok om overtollige hars rond de randen te verwijderen, zodat botsingen met het diamantmes worden voorkomen. Draai de knop om ervoor te zorgen dat de voor- en achterranden van het afgeknipte blok horizontaal op elkaar liggen.
  5. Verwijder het trimmingsmes en vervang het door een diamantmesje dat onder een hoek van 45° staat. Stel de kantelhoek van de microtoombasis in op 6°. Beweeg de meshouder langzaam met de knop totdat de voorrand van het diamanten mes 1-2 mm van het monsteroppervlak verwijderd is.
  6. Let op de heldere band tussen het monsteroppervlak en de mesrand, en pas de kantelhoek aan zodat de band gelijk is van boven naar beneden en van links naar rechts. Dit helpt ervoor te zorgen dat het eerste gedeelte het hele monsteroppervlak bevat, niet alleen een hoek.
  7. Injecteer gedestilleerd water in de groef van het diamantmes, zodat het vloeistofniveau kan stijgen en het lemmet nat blijft. Gebruik vervolgens een spuit om wat water te verwijderen totdat het vloeistofniveau daalt en de reflectie zilverachtig lijkt.
  8. Stel de doorsnededikte (voering), snijsnelheid en snijvenster in in de besturingseenheid. Stel de doorsnedingssnelheid in op 0,6 mm/s en stel de doorsnededikte in op 60 nm (de specifieke snelheid en dikte hangen af van de kwaliteit van het monster).
  9. Begin met het indelen van secties. Zodra het microtoom stabiel draait en uniforme secties zijn geproduceerd, pauzeer je het doorsnijdingsproces. Gebruik een fijne kwast om de gesneden delen en eventueel vuil te verwijderen.
  10. Installeer zowel de gecoate tapespoel als een lege ophaalspoel op het automatische ultradunne sectieverzamelsysteem. Zet het vergrendelingsmechanisme vast en voer een proefrit uit om ervoor te zorgen dat de band soepel en constant snel beweegt en correct op de lege spoel wordt verzameld.
  11. Dompel de verzamelkop van het tape-verzamelapparaat onder in het waterbad van het diamantmes. Stel de positie van de verzamelkop zo aan dat deze parallel aan de mesrand ligt, op een afstand van 1,5 keer de stuklengte van het monster, zodat de gesneden delen soepel op de tape worden verzameld. Beveilig het verzamelapparaat en hervat de sectievorming terwijl het bandverzamelapparaat tegelijkertijd wordt gebruikt.
  12. Na het verzamelen van voldoende aaneengesloten secties, pauzeer je het doorsnedingsproces. Knip de tape in het sectiegebied waar geen secties zijn verzameld, en blijf het tapeverzamelapparaat gebruiken totdat alle resterende tape op de spoel is verzameld.
  13. Verwijder de spoel met de verzamelde delen en plaats deze in een elektronische droogoven. Maak het tapeverzamelapparaat en het microtoom schoon en zet alle accessoires terug op hun juiste plek.

figure-protocol-2
Figuur 2: Voorbereidingen vóór het insnijden. (A) Waterdruppels op het oppervlak van de D-50 tape vóór (boven) en na (onder) hydrofiele behandeling. (B) Boven- en zijdelingse schematische weergaven van het verbindingsgebied van de D-50 tape. Blauw: D-50 tape; oranje: dubbelzijdige lijm; Groene pijl: Richting van de tape beweging. (C) Frontaal beeld van het monster na het trimmen, met parallelle boven- en onderranden. (D) Geautomatiseerd tape-verzamelapparaat. a: Bandspoel voor D-50 bandvoeding uit; b: Bandspoel voor bandopvang; Rode pijl: richting van de bandbeweging. (E) Positie van de verzamelkop op het automatische tape-verzamelapparaat. Het gele vakje rechtsonder geeft een vers gesneden stuk aan dat op het punt staat door het apparaat te worden verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Montage op een siliciumwafer

OPMERKING: Zorg ervoor dat de werkruimte schoon is om besmetting van de tape door stof tijdens de volgende stappen te voorkomen.

  1. Gebruik een ronde siliciumwafer van 4 inch die vooraf is gereinigd en hydrofiliseerd in een plasmabehandelingssysteem (bij 80 W vermogen, 3 minuten).
  2. Trek schone handschoenen aan, plaats de siliconen wafer op een vlak oppervlak en knip een stuk dubbelzijdig geleidend carbontape op een geschikte lengte (met 2-3 cm overhang aan beide uiteinden). Haal de witte beschermlaag van één kant van de dubbelzijdige geleidende tape af en breng deze van boven naar beneden aan op de siliciumwafer.
    OPMERKING: De twee zijden van de geleidende tape moeten ongeveer 2 mm uit elkaar staan, en de randen van de tape moeten zichtbaar zijn op de siliciumwafer. Voor een dubbelzijdige geleidende tape van 25 mm breed kunnen drie segmenten tape op één 4-inch siliciumwafer worden aangebracht.
  3. Teken een omtrek van de 4-inch siliciumwafer op de werkbank en markeer de geschatte lengte van elk stuk tape dat op de wafer wordt aangebracht. Knip de tape die de secties heeft verzameld volgens de eerder gemarkeerde lengtes.
    OPMERKING: Het gesneden tape mag niet groter zijn dan de rand van de siliconenwafer en mag niet in de secties snijden.
  4. Haal de transparante beschermfolie van de dubbelzijdige geleidende tape af, en verwijder bij D-50 tape op dit punt de beschermfolie aan de achterkant van de tape. Breng de tape parallel aan de dubbelzijdige geleidende tape. Breng tot drie stukken tape aan op elk stuk dubbelzijdig geleidend tape.
    OPMERKING: Om het risico te verminderen dat de D-50 tape verkeerd uitlijnt of door stof besmet raakt, bedek je een deel van de geleidende tape met de transparante film die eerder werd afgepeld, zodat slechts een klein deel van de geleidende tape blootblijft om het uiteinde van de D-50 tape te bevestigen. Dit maakt het eenvoudiger om de richting van de tape aan te passen. Daarna pel je langzaam de resterende transparante film af, zodat de rest van de D-50 tape zachtjes kan vallen en aan de geleidende tape kan hechten.
  5. Nadat de tape is gemonteerd, kunnen er luchtbellen ontstaan tussen de tape en de geleidende tape, wat het daaropvolgende beeldvormingsproces kan verstoren. Plaats de siliciumwafer in een vacuümkamer (of andere vacuümapparatuur) en breng een vacuüm aan. Na het vacuümproces controleer je ervoor dat de luchtbellen verdwenen zijn.

4. Na-kleuring

  1. Maak 4% uranylacetaat en 3% loodcitraat en verwarm ze voor tot 50°C met een waterbadpot.
    VOORZICHTIG: Uranylacetat is radioactief en heeft aanzienlijke toxiciteit voor de lever en nieren. Loodcitraat kan loodvergiftiging veroorzaken, wat het zenuwstelsel, de nieren en het hematopoëtische systeem aantast. Het werk met deze reagentia moet worden uitgevoerd met een dampkap en passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, nitril handschoenen, masker en veiligheidsbril, moeten worden gedragen. Bij huid- of oogcontact was je onmiddellijk met grote hoeveelheden water, meld je bij het laboratoriumveiligheidspersoneel en zoek je medische hulp.
  2. Plaats de siliciumwafer, die is gevacuümeerd en vrij is van bellen, in een plasmahydrofilisatiesysteem voor hydrofilisatie en reiniging.
  3. Gebruik een 10 mL spuit zonder naald, bevestig een 0,22 μm spuitfilter en filter het 4% uranylacetaat. Laat de oplossing op de sectie vallen totdat het hele oppervlak van de sectie op de siliciumwafer bedekt is, en wacht dan 3 minuten.
  4. Was 3 minuten met gedestilleerd water, herhaal dit 3 keer, en föhn daarna het monsteroppervlak met stikstof.
  5. Gebruik een 10 mL spuit zonder naald om een 0,22 μm spuitfilter te bevestigen en het 3% loodcitraat te filteren. Laat de oplossing op de sectie vallen totdat het hele oppervlak van de sectie op de siliciumwafer bedekt is, en wacht dan 5 minuten.
  6. Was 3 minuten met gedestilleerd water, herhaal dit 3 keer, en föhn daarna het monsteroppervlak met stikstof.

5. Dataverzameling

  1. Optische microscopie
    OPMERKING: In deze sectie wordt een Research Slide Scanner (VS200, Olympus) gebruikt als voorbeeld voor optische microscopie. Andere microscopen, zoals de Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Duitsland), zijn ook geschikt voor de hier beschreven optische beeldvorming. De stappen voor andere optische microscopen zijn over het algemeen hetzelfde.
    1. Plaats de siliciumwafer op het podium van de optische microscoop en bevestig deze met niet-residu lijmband.
    2. Gebruik een 5x objectieflens om een overzichtsbeeld te krijgen van de siliciumwafer, de tape en het monster.
    3. Op het overzichtsbeeld maak je een omtrek van elk gedeelte en sorteer je, voeg dan scherpstelpunten en belichtingspunten toe om automatische beeldvorming met 20x of 50x vergroting over de hele siliciumwafer met alle secties uit te voeren.
    4. Na het afnemen van de beelden sla je de beelden op en controleer je vervolgens de beeldkwaliteit. Als er beelden onscherp of slechte kwaliteit zijn, herfocus en beeld dan opnieuw.
  2. Elektronenmicroscopie
    OPMERKING: Meerdere typen elektronenmicroscopen kunnen continue beeldvorming uitvoeren van ultradunne secties die op siliciumwafers zijn geplaatst. Hier wordt de Multibeam 505 (Zeiss) als voorbeeld gebruikt.
    1. Voer koolstofcoating uit op het monsteroppervlak met een hogevacuüm sputtercoater, met een koolstofdikte van 5,7 nm.
      OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen voor banden die zijn gecoated met metaal in een strategie met hoge reflectiviteit of gecoat met koolstofnanobuisjes (CNT) in een strategie met lage reflectiviteit.
    2. Gebruik een optische microscoop (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) om de optische navigatiekaart van de siliciumwafer vast te leggen.
    3. Plaats de siliciumwafer in de monsterkamer van de SEM. Koppel de optische navigatiekaart aan het elektronenmicroscoopbeeld door de twee geneste L-vormige markers op de monstertrap sequentieel te identificeren.
    4. Gebruik de SAT-module in de microscopiesoftware (v3.2, 64-bits) om semi-automatisch de sectieposities en beeldgebieden te identificeren op de optische navigatiekaart.
    5. Stel de pixelgrootte van het beeld in op 4 nm, de verblijftijd op 0,8 μs, focuspunten en -posities, en opslaglocaties.
    6. Begin met continue beeldvorming.

6. Gegevensverwerking

OPMERKING: Het 2D-borselen van OMLIT-afbeeldingen wordt automatisch uitgevoerd door de software. Voor grootschalige 3D-registratie en segmentatie van OMLIT-beelden zijn andere, krachtigere AI-algoritmen beschikbaar. Hier wordt, voor het gemak van de meeste laboratoria om het proces te verifiëren, het naaien, registreren en segmenteren met Fiji (v1.54p, 64-bit) en VAST (v1.5.0, 64-bit) gedemonstreerd.

  1. Open de afbeeldingsdataset in Fiji door de map met alle afbeeldingsbestanden naar de Fiji-interface te slepen en selecteer Virtual Stack wanneer daarom wordt gevraagd.
  2. Gebruik de Rechthoek-tool om het regio van interesse (ROI) te selecteren en snijd vervolgens de dataset bij via Image > Crop.
  3. Lijn de afbeeldingstack uit met de Register Virtual Stack Slices-plugin (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
  4. Sla de uitgelijnde dataset op in TIFF-formaat (Bestand > Opslaan als > Tiff).
  5. Importeer de TIFF-imagestack in VAST22 met Importeren > Importeer afbeeldingsvolume van afbeeldingen naar . VSV-bestand.
    OPMERKING: Voor een meer gedetailleerde tutorial kunt u terecht op de website: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
  6. Door een externe tablet aan te sluiten, gebruik je het penseelgereedschap in Draw Segment-modus om handmatig te segmenteren en te traceren (gebruik sneltoetsen A en Z om snel tussen afbeeldingsslices te navigeren).
  7. Visualiseer de gesegmenteerde structuur in 3D met Window > 3D Viewer > View > Update.
  8. Sla de segmentatieresultaten op via File > Save Segmentation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De algemene workflow van het protocol (Figuur 1) begint met de voorbereiding van verschillende verzamelbanden. Figuur 1 toont de drie typen tapes die in het protocol worden genoemd (van links naar rechts: Kapton, D-50 en CNT-gecoate PET), die verschillende optische eigenschappen vertonen wanneer ze op hetzelfde achtergrondsubstraat worden geplaatst. Na het voorbereiden van het monster en het trimmen van blokken moeten eerst enke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een optische beeldvormingsmethode ontwikkeld, genaamd OMLIT, die mesoscopische beeldvorming mogelijk maakt en compatibel is met tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopieworkflows. Met behulp van de OMLIT-methode kan optische microscopie worden ingezet om mesoscopische structurele kenmerken van hersenmonsters vast te leggen, waaronder bloedvaten, cellichamen, kernen, grote dendritische takken en enkele grote gemyeliniseerde axonen. Daarnaast kan OMLIT naadloos ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten opgegeven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation of China (32271430, 62361166631) en het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China (2023YFF0715904). Wij danken het Openbaar Technisch Centrum van het Suzhou Instituut voor Biomedische Technologie en Technologie, en de Brain Imaging Facility van het Instituut voor Kunstmatige Intelligentie, Hefei Comprehensive National Science Center, voor hun ondersteuning bij OMLIT en seriële EM-beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kleefband3MB5005094008Dubbelzijdig kleefband
Atomaire krachtmicroscoopBrukerDimension Icon
Automatisch ultradun systeem voor het verzamelen van secties LehuaAutoCUTS II
Geleidend kleefbandTed PellaFP16084-8
Dektak Stylus ProfilersBrukerDektakXT
Diamantmes voor het snijdenDiatomeDUJ3530Diatome Jumbo mes
Diamantmes voor het trimmenDiatomeDTB90Glas mes
ElektronenmicroscoopZeissMultiSEM505Alternatief: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit) Open sourcehttps://fiji.sc
Glas trimmesZelf gemaakt
Lead CitraatLeicaT534/2
LichtmicroscoopOlympus VS200Alternatief: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Lichtmicroscoop Zeiss Axio Imager.A2 Vario
Plasma cleanerYidon TechnologiesHydro-S4Alternatieven: Ted Pella Pelco of andere tafelplasma cleaner
PolymeertapeMeltonKaptonDe website van het bedrijf is niet meer toegankelijk. We raden onderzoekers aan lokaal verkrijgbare KAPTON-tapes te proberen.
PolymeertapeTeijinPEThttps://www.teijin.com/
PolymeertapeTeijinD-50https://www.teijin.com/
Silicium waferSaichi912303Wafer is aan één kant gepolijst.
Sputter Coater LeicaACE600Alternatief: Dubbelkopsputter, Yujie
UltramicrotoomLeicaUC7Alternatief: RMC PT-PC
UranylacetaatEMS22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)Howard Hughes Medical Institutehttps://software.dvid.io/vast/VAST A1:D32Lite is een gratis tool voor handmatige annotatie en segmentatie van grote 3D-microscopiedatasets.
ZEN software (v3.2, 64-bit)Zeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html

Referenties

  1. Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
  2. Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
  3. Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
  4. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  5. Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
  6. Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
  7. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Opt Lett. 45 (19), 5401(2020).
  8. Kut, C., et al. Detection of human brain cancer infiltration ex vivo and in vivo using quantitative optical coherence tomography. Sci Transl Med. 7 (292), (2015).
  9. Hu, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging (QPI) in neuroscience. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 25 (1), 1-9 (2019).
  10. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).
  11. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  12. Heymann, E. W. Scent marking strategies of new world primates. Am J Primatol. 68 (6), 650-661 (2006).
  13. Echlin, M. P., et al. Recent developments in femtosecond laser-enabled TriBeam systems. JOM. 73 (12), 4258-4269 (2021).
  14. Randolph, S., Geurts, R., Wang, J., Winiarski, B., Rue, C. Femtosecond laser-enabled TriBeam as a platform for analysis of thermally- and charge-sensitive materials. Microsc Microanal. 25 (S2), 352-353 (2019).
  15. Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
  16. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: A multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
  17. Schalek, R., et al. Development of high-throughput, high-resolution 3D reconstruction of large-volume biological tissue using automated tape collection ultramicrotomy and scanning electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (S2), 966-967 (2011).
  18. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  19. Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  20. Fan, H., et al. Optical multilayer interference tomography compatible with tape-based serial SEM for mesoscale neuroanatomy. ACS Photonics. 9 (1), 25-33 (2022).
  21. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nat Commun. 6 (1), 7923(2015).
  22. Berger, D. R., Seung, H. S., Lichtman, J. W. VAST (volume annotation and segmentation tool): Efficient manual and semi-automatic labeling of large 3D image stacks. Front Neural Circuits. 12, 88(2018).
  23. Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Syst Tech J. 27 (3), 379-423 (1948).
  24. Tsai, D. -Y., Lee, Y., Matsuyama, E. Information entropy measure for evaluation of image quality. J Digit Imaging. 21 (3), 338-347 (2008).
  25. Wang, T., et al. A convenient all-cell optical imaging method compatible with serial SEM for brain mapping. Brain Sci. 13 (5), 711(2023).
  26. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  27. Kislinger, G., et al. ATUM-Tomo: A multi-scale approach to cellular ultrastructure by combined volume scanning electron microscopy and electron tomography. eLife. 13, e90565(2024).
  28. Böhm, T., Felfer, P., Thiele, S. A modular and automated serial section collection system for ultramicrotomy and subsequent imaging. Microsc Microanal. 29 (1), 212-218 (2023).
  29. Wacker, I. U., et al. Multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes. J Vis Exp. (133), e57059(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Optische multilayer-interferentietomografiebreinatlas-mappingconnectomics-imaginggeautomatiseerde tape-ultramicrotomiemesoscopische breinmappingelektronenmicroscopie-imagingcerebrale cortex van de muishandmatige segmentatiedriedimensionale visualisatie
Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.