Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Summary

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Abstract

Het begrijpen van de structurele en functionele relaties binnen complexe neurale netwerken in de hersenen vereist het opstellen van hersenatlassen die zowel een breed gezichtsveld als subcellulaire resolutie bezitten. Echter, de huidige optische en elektronenmicroscopie-beeldvormingsmethoden hebben elk beperkingen, waardoor het moeilijk is om alle cellen binnen één monster in beeld te brengen. Dit protocol introduceert een beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die willekeurige optische beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters mogelijk maakt na elektronenmicroscopie-monstervoorbereiding, waardoor een volledige hersenatlas van alle neurale cellen wordt gereconstrueerd. Daarnaast kan OMLIT-beeldvorming naadloos worden geïntegreerd met de beeldvormingsworkflow van geautomatiseerde bandverzamelende ultramicrotomie scanning elektronenmicroscopie (ATUM-SEM). Dit stelt onderzoekers in staat om mesoschaal structurele informatie van cellen te verkrijgen voorafgaand aan elektronenmicroscopiebeeldvorming, wat de precieze selectie van interessegebieden vergemakkelijkt en het benodigde oppervlak en datavolume voor hoogresolutie elektronenmicroscopie (EM) beeldvorming aanzienlijk vermindert. We valideerden de nauwkeurigheid en compatibiliteit van deze methode in daadwerkelijke monsters uit de volwassen muishersenschors, waarmee we de brede toepassingsmogelijkheden in multischaal hersenatlasconstructie aantoonden.

Introduction

Uitgebreide mapping van neurale circuits met cellulaire en subcellulaire resolutie is essentieel om de structuur en functie van de hersenen te onthullen. Traditionele optische beeldvormingsmethoden, zoals tweefotonmicroscopie¹, fluorescentie micro-optische sectietomografie (fMOST)^2,3,4 en het VISoR-systeem⁵, hebben mesoschaal neuronale beeldvorming en in vivo functionele beeldvorming mogelijk gemaakt. Door hun afhankelijkheid van spaarzame labeling slagen ze er echter niet in de volledi....

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de University of Science and Technology of China en de relevante nationale regelgeving. De monstervoorbereiding voor OMLIT-beeldvorming volgt hetzelfde protocol als dat bij conventionele EM, en de specifieke procedure die we toepasten is elders beschreven²¹. Kort samengevat werden muizen na anesthesie transcardiaal geperfuseerd met natriumcacodylaatbuffer, kunstmatig cerebrospinaal vocht (ACSF) en tenslotte een fixatief met glutaraldehyde en paraformaldehyde. De hersenen werden zorgvuldig verwijderd en ongeveer 1 × 1 × 1 mm³ blokkad....

Results

De algemene workflow van het protocol (Figuur 1) begint met de voorbereiding van verschillende verzamelbanden. Figuur 1 toont de drie typen tapes die in het protocol worden genoemd (van links naar rechts: Kapton, D-50 en CNT-gecoate PET), die verschillende optische eigenschappen vertonen wanneer ze op hetzelfde achtergrondsubstraat worden geplaatst. Na het voorbereiden van het monster en het trimmen van blokken moeten eerst enke.......

Discussion

Hier hebben we een optische beeldvormingsmethode ontwikkeld, genaamd OMLIT, die mesoscopische beeldvorming mogelijk maakt en compatibel is met tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopieworkflows. Met behulp van de OMLIT-methode kan optische microscopie worden ingezet om mesoscopische structurele kenmerken van hersenmonsters vast te leggen, waaronder bloedvaten, cellichamen, kernen, grote dendritische takken en enkele grote gemyeliniseerde axonen. Daarnaast kan OMLIT naadloos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	3M	B5005094008	Double-sided adhesive
Atomic Force Microscope	Bruker	Dimension Icon
Automatic ultrathin section collecting system	Lehua	AutoCUTS II
Conductive adhesive tape	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530	Diatome Jumbo knife
Diamond knife for trimming	Diatome	DTB90	Glass knife
Electron microscope	Zeiss	MultiSEM505	Alternative: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64-bit)	Open source	https://fiji.sc
Glass trimming knife	Selfmade
Lead Citrate	Leica	T534/2
Light microscope	Olympus	VS200	Alternative: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Light microscope	Zeiss	Axio Imager.A2 Vario
Plasma cleaner	Yidon Technologies	Hydro-S4	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner
Polymer tape	Melton	Kapton	The website of the company is no longer accessible. We recommend that researchers try locally available KAPTON tapes.
Polymer tape	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Polymer tape	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Silicon wafer	Saichi	912303	Wafer is polished on one side.
Sputter Coater	Leica	ACE600	Alternative:Double-head Sputter, Yujie
Ultramicrotome	Leica	UC7	Alternative: RMC PT-PC
Uranylacetate	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64-bit)	Howard Hughes Medical Institute	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite is a free tool for manual annotation and segmentation of large 3D microscopy datasets.
ZEN software (v3.2, 64-bit)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html