Method Article

PCR-fluorescerende probe-gebaseerde detectie van Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een klinisch testprotocol gebaseerd op de PCR-fluorescentieprobemethode voor gelijktijdige detectie van Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure voor de kwalitatieve detectie van Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii in klinische sputummonsters met behulp van een PCR-fluorescerende probe-gebaseerde nucleïnezuurdetectiekit. De procedure omvat klinische monsterverzameling, voorbehandeling van alkalische vloeibaarheid, geautomatiseerde extractie van nucleïnezuren en realtime PCR-detectie via multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans en P. jirovecii worden gedetecteerd met doelspecifieke fluorescerende probes (respectievelijk FAM-, VIC- en CY5-kanalen), met een interne controle (ROX-kanaal) geïntegreerd voor kwaliteitsborging. De validiteit van de assay en interpretatie van monsterresultaten zijn gebaseerd op gedefinieerde cyclusdrempel (Ct) cut-off waarden. Een positieve regeling moet S-vormige versterkingscurves vertonen met Ct ≤ 33,7 in alle kanalen, terwijl de negatieve regeling geen versterking mag tonen. Voor klinische monsters duidt een Ct-waarde ≤ 33,7 in het FAM-kanaal op positiviteit voor Aspergillus-soorten , en een Ct-waarde ≤ 36 in het VIC- of CY5-kanaal geeft positiviteit aan voor respectievelijk C. neoformans of P. jirovecii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Invasieve schimmelinfecties, zoals die veroorzaakt door Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii, vormen een aanzienlijke bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten, wat leidt tot hoge morbiditeit en sterfte. Tijdige en nauwkeurige diagnose is cruciaal voor het starten van passende antischimmeltherapie en het verbeteren van klinische resultaten1. Conventionele diagnostische methoden, waaronder kweek, microscopie en antigeendetectie, hebben aanzienlijke beperkingen. Kweek kost veel tijd en vertoont een lage gevoeligheid, microscopie mist soortniveau identificatie en is afhankelijk van de operator, terwijl antigeenassays (bijv. galactomannan, β-D-glucan) kruisreactiviteit en inconsistente prestaties kunnen vertonen. Moleculaire diagnostiek, met name realtime PCR, kan enkele van deze hiaten aanpakken door snellere doorlooptijden en het potentieel voor hoge gevoeligheid en specificiteit te bieden. Vooruitgang in multiplex PCR maakt het mogelijk om meerdere pathogenen gelijktijdig in één monster te detecteren, wat de diagnostische efficiëntie verbetert.

Dit protocol beschrijft een multiplex fluorescent probe PCR-assay voor kwalitatief detectie van DNA van Aspergillus spp., C. neoformans en P. jirovecii in menselijke sputummonsters door geconserveerde gebieden van het 18S rRNA-gen (Aspergillus spp.), het ITS-gen (C. neoformans) en het mtLSU rRNA-gen (P. jirovecii) te targeten. Belangrijke kenmerken van deze methode zijn onder andere gedefinieerde analytische gevoeligheid: De detectielimiet voor Aspergillus spp., C. neoformans en P. jirovecii is 1.500 kopieën/mL; Specificiteit van primer/probe: doelspecifieke primers en probes minimaliseren kruisreactiviteit met menselijk DNA of andere veelvoorkomende flora; robuuste besmettingscontrole: de integratie van dUTP-UDG (uracil-DNA glycosylase) systemen voorkomt effectief overgedragen besmetting van eerdere PCR-amplicons, een cruciale eigenschap voor het behouden van de betrouwbaarheid van de assay in een klinisch laboratorium2; geïntegreerde procescontrole: een endogene interne controle gericht op het menselijke RP (Ribosomale eiwit) gen, gelabeld met ROX-fluorofoor, wordt co-amplified om de integriteit van nucleïnezuurextractie te monitoren en mogelijke PCR-inhibitie te identificeren, waardoor vals-negatieve resultaten worden verminderd3. Deze aanpak wordt ondersteund door vastgestelde richtlijnen voor kwaliteitsborging in moleculaire diagnostiek 4,5. Het protocol is voornamelijk toepasbaar op respiratoire monsters (sputum/BALF) van risicogroepen, zoals hematologie-oncologiepatiënten of transplantatiepatiënten. Mogelijke beperkingen, waaronder vals-positieven door milieuverontreiniging of verminderde gevoeligheid door overmatige monsterverdunning, worden ook besproken, samen met mitigatiestrategieën.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van klinische monsters is goedgekeurd door de betreffende ethische commissie (Goedkeuringsnummer: ZYS-GCP-2025006). Alle deelnemers gaven brede geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun gegevens en monsters in onderzoek. Alle reagentia en verbruiksartikelen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Table of Materials.

1. Monsterverzameling

  1. Verzamel 3–5 mL sputum of bronchoalveolaire spoelvloeistof in steriele containers en stuur het snel voor onderzoek.

2. Voorbereiding van reagens

OPMERKING: Deze stappen zijn uitgevoerd in de voorbereidingsruimte voor reagentia.

  1. Haal de detectiekit uit de -28 °C vriezer en ontdooi volledig op kamertemperatuur (25–30 °C) gedurende 30 minuten.
  2. Bereken het totale aantal reacties (N): N = aantal testmonsters (n) + positieve/negatieve controles (2) + 1
  3. Bereid het reactiemengsel voor in een steriele microcentrifugebuis. Voor een enkele reactie: 35 μL nucleïnezuurversterkingsmengsel + 5 μL primer-probe mix, vortex grondig en kort centrifugeren.
  4. Aliquot 40 μL van het reactiemengsel in elke PCR-buis (volgens het protocol van de fabrikant van de kit) en overbrengen naar het doorvoervenster van de monsterverwerkingsruimte.

3. Monsterverwerking

OPMERKING: Deze stappen werden uitgevoerd in de Sample Processing Room. Afvalverwijdering: Gooi supernatant uit stap 3.2.2 en ander vloeibaar afval met NaOH weg in een aangewezen chemische afvalcontainer.

  1. Liquefactie
    1. Voeg sputum/bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) toe aan een 50 mL schroefbuis.
    2. Voeg 1–2 volumes van 4% NaOH-verteringsoplossing toe (relatief tot de viscositeit van het sputum).
      WAARSCHUWING: NaOH is corrosief. Vermijd contact met huid en ogen.
    3. Draai de dop aan, laat het vortex 1 minuut draaien en incubeer in een bioveiligheidskast bij kamertemperatuur gedurende 15–20 minuten.
  2. Verrijking
    1. Centrifugeerde vloeibare monsters op 3.000 rpm gedurende 5 minuten.
    2. Verwijder het supernatant met een pipet, waarbij 1.000 μL sediment wordt vastgehouden.
    3. Draai het sediment grondig in vortex.
  3. Lysis
    1. Breng 500 μL sediment over naar een lysisbuis. Vortex 10 minuten en kort centrifugeren.
  4. Extractie
    OPMERKING: Afvalverwijdering: Gebruikte extractieplaten, tips en buizen die contact maakten met biologische monsters, moeten worden gedumpt in een goedgekeurde container voor biologisch gevaarlijk afval.
    1. Breng alle lysaatsupernatant en 100 μL negatieve/positieve regelingen over naar kolom 2 van de extractieplaat.
    2. Voer nucleïnezuurextractie uit met een geautomatiseerd nucleïnezuurextractiesysteem met het aangewezen programma6.
  5. Monsterlading
    1. Breng 10 μL geëxtraheerd nucleïnezuur (kolom 6) en controles over naar PCR-buizen. Centrifugeer kort en verplaats het naar het doorlaatvenster van de versterkingsruimte.

4. Nucleïnezuuramplificatie

OPMERKING: Deze stappen werden uitgevoerd in de Versterkingskamer.

  1. Laad de PCR-buizen in het geautomatiseerde nucleaire amplificatie-instrument en selecteer het juiste amplificatiesjabloon.
  2. Detectiekanalen toewijzen: Aspergillus spp.: FAM-kanaal; C. neoformans: VIC-kanaal; P. jirovecii: CY5-kanaal; Interne controle: ROX kanaal 7,8,9.
  3. Stel voorbeeldnamen in en start het programma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve amplificatiecurves verkregen met deze multiplex fluorescent probe PCR-test zijn weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. De validiteit van de assay werd bepaald op basis van vooraf gedefinieerde controlecriteria. In een geldige run produceerde de positieve controle karakteristieke S-vormige versterkingscurves in de FAM-, VIC-, CY5- en ROX-kanalen, met cyclusdrempels (Ct) waarden ≤ 33,7 in alle detectiekanalen (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het multiplex real-time PCR-protocol dat in deze studie is vastgesteld, biedt een gestandaardiseerde procedure voor de gelijktijdige en snelle detectie van drie belangrijke invasieve schimmelpathogenen (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii) in klinische sputummonsters. Deze methode maakt directe detectie van pathogeen-DNA uit klinische monsters mogelijk. In tegenstelling tot traditionele diagnostische methoden zoals kweek, microscopie of serologische antige...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen de afdeling Klinisch Laboratorium van het Shanshui District People's Hospital in Foshan bedanken voor het leveren van de apparatuur en technische ondersteuning.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Filter-Tip Sterile Extended Pipette Tips (Racked)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 μL Sterile Pipette TipsJiangsu Xinkang Medical Instrument Co.,Ltd241101
200 μL Extended Filter Sterile Pipette TipsXiaorui Biotechnology241001
Lysis TubesBeijing ZC Bio-Science & Technology CoF1040
Nucleic Acid Detection Kit voor Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jiroveciiBeijing ZC Bio-Science & Technology Co.CT8143-48T
Nucleic Acid ExtractiereagensBeijing ZC Bio-Science & Technology CoCN8053-B40T
Sample Dilution BufferBeijing ZC Bio-Science & Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles