Method Article

PCR-fluorescerende probe-gebaseerde detectie van Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een klinisch testprotocol gebaseerd op de PCR-fluorescentieprobemethode voor gelijktijdige detectie van Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure voor de kwalitatieve detectie van Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii in klinische sputummonsters met behulp van een PCR-fluorescerende probe-gebaseerde nucleïnezuurdetectiekit. De procedure omvat klinische monsterverzameling, voorbehandeling van alkalische vloeibaarheid, geautomatiseerde extractie van nucleïnezuren en realtime PCR-detectie via multiplex. Aspergillus spp., C. neoformans en P. jirovecii worden gedetecteerd met doelspecifieke fluorescerende probes (respectievelijk FAM-, VIC- en CY5-kanalen), met een interne controle (ROX-kanaal) geïntegreerd voor kwaliteitsborging. De validiteit van de assay en interpretatie van monsterresultaten zijn gebaseerd op gedefinieerde cyclusdrempel (Ct) cut-off waarden. Een positieve regeling moet S-vormige versterkingscurves vertonen met Ct ≤ 33,7 in alle kanalen, terwijl de negatieve regeling geen versterking mag tonen. Voor klinische monsters duidt een Ct-waarde ≤ 33,7 in het FAM-kanaal op positiviteit voor Aspergillus-soorten , en een Ct-waarde ≤ 36 in het VIC- of CY5-kanaal geeft positiviteit aan voor respectievelijk C. neoformans of P. jirovecii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Invasieve schimmelinfecties, zoals die veroorzaakt door Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii, vormen een aanzienlijke bedreiging voor immuungecompromitteerde patiënten, wat leidt tot hoge morbiditeit en sterfte. Tijdige en nauwkeurige diagnose is cruciaal voor het starten van passende antischimmeltherapie en het verbeteren van klinische resultaten1. Conventionele diagnostische methoden, waaronder kweek, microscopie en antigeendetectie, hebben aanzienlijke beperkingen. Kweek kost veel tijd en vertoont een lage gevoeligheid, microscopie mist soortniveau id....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van klinische monsters is goedgekeurd door de betreffende ethische commissie (Goedkeuringsnummer: ZYS-GCP-2025006). Alle deelnemers gaven brede geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun gegevens en monsters in onderzoek. Alle reagentia en verbruiksartikelen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Table of Materials.

1. Monsterverzameling

  1. Verzamel 3–5 mL sputum of bronchoalveolaire spoelvloeistof in steriele containers en stuur het snel voor onderzoek.

2. Voorbereiding van reagens

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Representatieve amplificatiecurves verkregen met deze multiplex fluorescent probe PCR-test zijn weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. De validiteit van de assay werd bepaald op basis van vooraf gedefinieerde controlecriteria. In een geldige run produceerde de positieve controle karakteristieke S-vormige versterkingscurves in de FAM-, VIC-, CY5- en ROX-kanalen, met cyclusdrempels (Ct) waarden ≤ 33,7 in alle detectiekanalen (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het multiplex real-time PCR-protocol dat in deze studie is vastgesteld, biedt een gestandaardiseerde procedure voor de gelijktijdige en snelle detectie van drie belangrijke invasieve schimmelpathogenen (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans en Pneumocystis jirovecii) in klinische sputummonsters. Deze methode maakt directe detectie van pathogeen-DNA uit klinische monsters mogelijk. In tegenstelling tot traditionele diagnostische methoden zoals kweek, microscopie of serologische antige.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen de afdeling Klinisch Laboratorium van het Shanshui District People's Hospital in Foshan bedanken voor het leveren van de apparatuur en technische ondersteuning.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μL Filter-Tip Sterile Extended Pipette Tips (Racked)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 μL Sterile Pipette TipsJiangsu Xinkang Medical Instrument Co.,Ltd241101
200 μL Extended Filter Sterile Pipette TipsXiaorui Biotechnology241001
Lysis TubesBeijing ZC Bio-Science & Technology CoF1040
Nucleic Acid Detection Kit for Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans, and Pneumocystis jiroveciiBeijing ZC Bio-Science & Technology Co.CT8143-48T
Nucleic Acid Extraction ReagentBeijing ZC Bio-Science & Technology CoCN8053-B40T
Sample Dilution BufferBeijing ZC Bio-Science & Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles