Methodenartikel

Onderzoek naar het mechanisme van β-elemene-gemedieerde LINC00511 modulatie om cisplatineresistentie bij longkanker te onderdrukken

DOI:

10.3791/68825

⸱

19 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resistentie tegen cisplatine (DDP) beperkt de werkzaamheid van chemotherapie bij longkanker. Deze studie had tot doel te verduidelijken hoe β-Elemene(β-Ele) de resistentie in A549/DDP-cellen omkeert door LINC00511 te downreguleren. In vitro en RNA-seq-analyses toonden aan dat deze regulatie aërobe glycolyse en Wnt/β-catenine-signalering remt, wat een potentiële strategie biedt om chemoresistentie te overwinnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cisplatineresistentie beperkt de werkzaamheid van chemotherapie bij niet-kleincellige longkanker aanzienlijk, waardoor de ontwikkeling van nieuwe strategieën nodig is om deze barrière te overwinnen. Deze in vitro studie had tot doel het mechanisme op te helderen waarmee β-Ele de cisplatineresistentie in longadenocarcinoomcellen omkeert via de LINC00511-gemedieerde glycolyse en Wnt/β-catenine-signaleringsroutes. De cisplatine-resistente humane long adenocarcinoom cellijn (A549/DDP), met ofwel LINC00511 overexpressie of knockdown, werd tot stand gebracht door middel van plasmidetransfectie. De transfectieefficiency werd geëvalueerd gebruikend Quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) om LINC00511 expressieniveaus te ontdekken. Beoordeling via de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)-test wees op significante β-Ele-gemedieerde remming van A549/DDP-celproliferatie. Verdere RNA-seq-analyse toonde aan dat het remmende effect van β-Elemene op cisplatineresistentie nauw verband hield met de interferentie van cellulaire glycolyse en de onderdrukking van de activering van de Wnt/β-catenine-signaalroute. Western blot-analyse van belangrijke eiwitten, waaronder glucosetransporter 1 (GLUT1), pyruvaatkinase M2 (PKM2), lactaatdehydrogenase A (LDHA), β-catenine en glycogeensynthasekinase 3β (GSK-3β), toonde aan dat β-Elemene de resistentie tegen cisplatine omkeerde door aërobe glycolyse te remmen en de activering van de Wnt/β-catenine-signaleringsroute te blokkeren door neerwaartse regulatie van LINC00511. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat β-Elemene de cisplatineresistentie bij longkanker overwint door zich te richten op LINC00511 en de bijbehorende aërobe glycolyse/Wnt/β-catenineroute. Dit stelt een theoretisch kader vast voor toekomstig preklinisch en klinisch onderzoek en onthult potentiële therapeutische doelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder kwaadaardige tumoren wereldwijd vertoont longkanker uitzonderlijk hoge incidentie- en sterftecijfers, gekenmerkt door de kwaadaardige transformatie en invasieve groei van bronchiale epitheelcellen 1,2. Op basis van histopathologische kenmerken wordt longkanker gecategoriseerd als niet-kleincellig carcinoom (NSCLC) of kleincellig carcinoom (SCLC)3. Het is vermeldenswaard dat NSCLC ongeveer 85% van het totale aantal gevallen van longkanker vertegenwoordigt 4,5. Als eerstelijns chemotherapeutische standaard voor NSCLC is cisplatine (DDP) klinisch onmisbaar6. Klinische observaties hebben echter aangetoond dat tumorcellen resistentie tegen geneesmiddelen kunnen ontwikkelen via meerdere mechanismen, voornamelijk met betrekking tot de activering van immuunontsnappingsroutes, mutaties in doelgenen van geneesmiddelen en ontregeling van de metabolismeroutes van geneesmiddelen 7,8,9.

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA) vertegenwoordigen transcripten > 200 nucleotiden (nt) die geen eiwitcoderende capaciteit hebben10. Accumulerend bewijs geeft aan dat lncRNA de cisplatineresistentie in tumorcellen kan omkeren via meerdere mechanismen, zoals functioneren als concurrerende endogene RNA's (ceRNA's) om miRNA's te sponsen en hun doelgenen vrij te geven11, het moduleren van apoptose-signaleringsroutes12, deelnemen aan het herstel van DNA-schade13 en het reguleren van cellulaire autofagie14. Bovendien is er, met de vooruitgang van het onderzoek naar metabole herprogrammering van tumoren, substantieel bewijs naar voren gekomen dat aantoont dat lncRNA een cruciale regulerende rol speelt in dit proces. Het Warburg-effect, dat aërobe glycolyse aanduidt, vormt een fundamenteel metabolisch kenmerk van kwaadaardige cellen15. Het levert niet alleen energie voor snelle celproliferatie, maar genereert ook intermediaire metabolieten die dienen als voorlopers voor biosynthese en de eiwit- en lipidesynthese ondersteunen om te voldoen aan de eisen van kwaadaardige tumorgroei16. Bij longkanker is bevestigd dat lncRNA de tumorprogressie en resistentie tegen chemotherapie significant beïnvloedt door de aërobe glycolyseroute te reguleren17,18.

Hiervan is gemeld dat LINC00511, een veel bestudeerd lncRNA-molecuul in de afgelopen jaren, nauw verband houdt met het ontstaan en de ontwikkeling van verschillende kwaadaardige tumoren19. Deze bevindingen verduidelijken niet alleen de specifieke mechanismen van lncRNA-betrokkenheid bij tumormetabole herprogrammering, maar bieden ook een theoretische basis voor lncRNA-gerichte tumorbehandelingsstrategieën, waardoor potentiële therapeutische wegen worden geopend.

Afgeleid van de wortelstokken van Curcuma zedoaria, is β-Ele een bioactieve sesquiterpenoïde met bewezen antitumorwerkzaamheid. Onze eerdere studies hebben aangetoond dat β-Ele dient als een selectieve remmer van de PI3K/Akt/mTOR-signaleringsroute en een synergetisch effect heeft met cisplatine door zich te richten op het tumormetabolisme. Het onderdrukte de tumorgroei aanzienlijk in het NSCLC-muis xenotransplantaatmodel20. Daaropvolgend onderzoek toont het vermogen van β-Ele aan om aërobe glycolyse in NSCLC-cellen te verzwakken via modulatie van de miR-301a-3p/AMPKα-signaleringsas, wat resulteert in oncostatische resultaten21. Op basis van onze eerdere bevindingen hebben we bevestigd dat LINC00511 de cisplatineresistentie bij longkanker verzwakt; Desalniettemin moet het exacte moleculaire werkingsmechanisme nog volledig worden opgehelderd.

Gezien de cruciale rol van aërobe glycolyse bij de metabole herprogrammering van tumoren en de cruciale rol van LINC00511 bij de ontwikkeling en progressie van tumoren, heeft deze studie tot doel te onderzoeken of β-Ele de cisplatineresistentie bij longkanker kan omkeren door de LINC00511-gemedieerde aërobe glycolyseroute te moduleren.

Voorafgaand bewijs geeft aan β-Ele de cisplatineresistentie kan omkeren en de antitumoreffecten kan versterken door apoptotische routes te activeren22, exosoomsecretiete reguleren 23 en de celcyclus te stoppen24. Deze bekende mechanismen vertonen echter doorgaans brede effecten en missen een nauwkeurige regulatie van specifieke moleculaire doelen, waardoor hun klinische vertaalbaarheid wordt beperkt. Daarom is er een dringende behoefte aan het verkennen van nieuwe strategieën die meer gericht zijn, goed gedefinieerde mechanismen hebben en een sterk potentieel voor klinische vertaling aantonen om cisplatineresistentie te overwinnen. In tegenstelling tot eerder onderzoek dat de nadruk legde op de onmiddellijke biologische werking van β-Ele, karakteriseert deze studie de impact van β-Ele op het Warburg-metabolisme en de Wnt/β-catenine-signaleringsroute in A549/DDP-cellen door de regulatie van lncRNA-gemedieerde moleculaire routes, met als doel een nieuw mechanisme op te helderen dat ten grondslag ligt aan de omkering van chemosensibilisatie bij longkanker. Dit artikel onthult niet alleen een nieuwe benadering voor β-Ele om chemoresistentie om te keren door zich te richten op lncRNA, maar biedt ook een nieuwe theoretische basis en mogelijke interventiedoelen voor de klinische behandeling van longkanker. Deze bevindingen, door hun gedetailleerde opheldering van een specifiek moleculair doelwit (LINC00511) en belangrijke signaalroutes (Warburg en Wnt/β-catenine), tonen een significant verbeterd klinisch translationeel potentieel aan. Verwacht wordt dat ze een solide wetenschappelijke basis zullen bieden voor het verbeteren van de gevoeligheid voor chemotherapie bij longkankerpatiënten en het verbeteren van hun kwaliteit van leven, en om de ontwikkeling van precisiebehandelingsstrategieën voor longkanker te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van oplosmiddelen

  1. Bereiding van mediumoplossing voor A549/DDP-cellen: Kweek A549/DDP-cellen in het complete F-12K-medium van Ham (zie materiaaltabel voor details), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS, zie materiaaltabel voor details), 1% penicilline-streptomycineoplossing (P/S, zie materiaaltabel voor details) en 2 μg/ml cisplatine (DDP, zie materiaaltabel voor details).
    1. Bereiding van complete mediumoplossing: Bereid een complete mediumoplossing voor door 50 ml FBS en 5 ml P/S toe te voegen aan 500 ml Ham's F-12K-medium, gevolgd door grondig mengen.
    2. Bereiding van een complete mediumoplossing die cisplatine bevat: Weeg 1 mg cisplatinepoeder af (DDP, zie materiaaltabel voor details) en los het op in 1 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) om de bouillonoplossing te bereiden. Voeg 200 μl van de stockoplossing toe aan 100 ml volledig medium (bereid volgens stap 1.1.1) en meng grondig tot een werkoplossing van volledig medium dat 2 μg/ml cisplatine bevat.
      OPMERKING: Aangezien cisplatine een cytotoxische stof is, dient u alle procedures uit te voeren in een zuurkast of bioveiligheidskast en beschermende uitrusting te dragen, zoals handschoenen, laboratoriumjassen en een veiligheidsbril.
  2. β-Ele toedieningsoplossing: De geneesmiddelconcentratie die in dit onderzoek werd gebruikt, was gebaseerd op de resultaten van eerdere experimenten uitgevoerd door ons onderzoeksteam20,21. Los 1 mg β-Ele (zie materiaaltabel voor details) op in 20 μl dimethylsulfoxide (DMSO, zie materiaaltabel voor details) om de voorraadoplossing te bereiden. Verdun de stockoplossing tot 25 ml met volledig medium om een β-Ele-werkoplossing van 40 μg/ml te verkrijgen.
    OPMERKING: Aangezien DMSO de opname van andere stoffen door de huid kan verbeteren, dient u alle bedieningsstappen uit te voeren in een zuurkast of bioveiligheidskast en beschermende uitrusting te dragen, zoals handschoenen, laboratoriumkleding en een veiligheidsbril.

2. Celcultuur 

  1. Gebruik de cisplatine-resistente cellijn van humaan longadenocarcinoom (A549/DDP, Procell, zie materiaaltabel voor details) in dit onderzoek. Bevestig dat deze cellijn is geïdentificeerd door middel van korte tandemherhaling (STR)-analyse en met succes is gematcht met standaardlijnen in ATCC en andere databases.
    1. Verzamel voor de STR-analysemethode ongeveer 1 x 106 cellen en extraheer genomisch DNA met behulp van een commerciële DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel voor details).
    2. Gebruik een gevalideerd multiplex STR-systeem dat geschikt is voor DNA-typering om 20 STR-loci samen met de geslachtsbepalende locus te amplificeren. Voer PCR-amplificatie uit onder de volgende thermische cyclusomstandigheden: eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 2 min, gevolgd door 29 denaturatiecycli bij 94 °C gedurende 30 s, gloeien bij 59 °C gedurende 45 s en verlenging bij 72 °C gedurende 45 s, met een laatste verlengstap bij 72 °C gedurende 10 min.
    3. Analyseer de resulterende PCR-producten via capillaire elektroforese met behulp van een geautomatiseerde genetische analysator volgens de instructies van de fabrikant. Hier werd alleltypering uitgevoerd met behulp van een fragmentanalysesoftware (zie Materiaaltabel voor details), met een piekdetectiedrempel ingesteld op 150 Relative Fluorescence Units (RFU).
      OPMERKING: Het gegenereerde 20-locus STR-profiel werd vergeleken met referentieprofielen van A549/DDP-cellijnen die beschikbaar zijn in openbare databases. Een matchpercentage van meer dan 80% werd beschouwd als een indicatie van homologie. De afwezigheid van externe allelpieken bevestigde verder de afwezigheid van kruisbesmetting.
  2. Haal de cellen uit vloeibare stikstof en plaats ze in een waterbad van 37 °C om snel te ontdooien totdat de vloeistof volledig is gesmolten. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 5 ml, voeg twee delen volledige mediumoplossing toe en suspendeer het mengsel voorzichtig. Gooi het bovenstaande na centrifugatie (358 × g, 5 min, kamertemperatuur) voorzichtig weg.
    OPMERKING: Draag bij het gebruik van cryopreservatiebuisjes van cellen uit vloeibare stikstof antivrieshandschoenen en een veiligheidsbril of een gezichtsmasker en kijk niet naar de mond van de buis.
  3. Resuspendeer de celpellet in 1 ml volledig medium door voorzichtig te pipetteren en verdun de suspensie vervolgens tot 10 ml door 9 ml volledig medium toe te voegen. Zaai de cellen in celkweekschaaltjes van 100 mm en kweek ze in een incubator (zie materiaaltabel voor details) bij 37 °C en 5% CO2. De celpassageverhouding werd gehandhaafd tussen 1:2 en 1:3.
    OPMERKING: Cisplatine is een platina chemotherapeutisch geneesmiddel met cytotoxiciteit. Bij deze methode worden A549/DDP-cellen gekweekt met een medium dat cisplatine bevat. Verzamel daarom het afvalkweekmedium dat cisplatine bevat in een speciaal vat voor afvalvloeistof en stuur het regelmatig naar het verwerkingsbedrijf voor gevaarlijk afval voor professionele verwijdering.

3. De transfectie van het plasmide 

  1. Gebruik een plasmideconstructie voor LINC00511 overexpressie en een genspecifiek siRNA gericht op LINC00511 (gen-ID: 400619; transcript-ID: NR_033876.1) voor celtransfectie. De gebruikte siRNA-sequenties worden weergegeven in tabel 1.
siRNA-sequenties
NaamGevoel 5'-3'Antisense 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabel 1: lijst met siRNA-sequenties

  1. Selecteer willekeurig A549/DDP-cellen die na reanimatie naar de derde generatie zijn overgegaan en inoculeer ze uniform in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 x 105 cellen/putje. Elke put werd willekeurig genummerd en de putjes werden op basis van deze willekeurige getallen toegewezen aan experimentele groepen.
  2. Transfecteer de cellen met behulp van een transfectiereagens (zie Tabel met materialen voor details) wanneer hun dichtheid ongeveer 70% bereikt.
    1. Bereid de siRNA-transfectieoplossing voor.
      1. Meng 250 μL geoptimaliseerd minimaal essentieel medium (Opti-MEM, zie materiaaltabel voor details) met 5 μl transfectiereagens, draai voorzichtig 3-5x om homogeniteit te garanderen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Verdun 5 μL siRNA (50 nM) in 250 μL Opti-MEM, vortex voorzichtig 3-5x om grondig te mengen. Combineer het verdunde transfectiereagens met de siRNA-oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om het siRNA-transfectiecomplex te vormen.
    2. Bereid de plasmidetransfectieoplossing voor.
      1. Meng 250 μL Opti-MEM met 5 μL transfectiereasens, vortex voorzichtig 3-5x om homogeniteit te garanderen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Verdun 2 μg plasmide in 250 μL Opti-MEM, draai voorzichtig 3-5x om een grondige menging te garanderen. Combineer het verdunde transfectiereagens met de plasmideoplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de plasmidetransfectieoplossing voor te bereiden.
      3. Voeg de siRNA-transfectieoplossing en de plasmide-transfectieoplossing toe aan respectievelijk de platen met 6 putjes. Voeg 1.500 μL volledig medium toe aan elk putje. Meng de celplaten voorzichtig voor en na de toevoeging om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer de platen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur na de transfectie voorafgaand aan de analyse.

4. Het opsporen van de transfectieefficiency door de Kwantitatieve Omgekeerde Kettingreactie van het Transcriptasepolymerase (qRT-PCR)

OPMERKING: Neem de cellen na transfectie 24 h in stap 3.3 voor qRT-PCR opsporing volgens de volgende procedure. Alle experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).

  1. RNA-extractie
    1. Gebruik een ultrazuivere RNA-extractiekit (zie Materiaaltabel voor details). Gooi het medium in de plaat met 6 putjes weg volgens de instructies van de kit en was de cellen met PBS. Voeg vervolgens 500 μL lysisreagensoplossing op basis van fenol-guanidine toe aan elk putje, blaas de cellen voorzichtig met de punt van het pistool om ze volledig te suspenderen en breng het mengsel over in een centrifugebuis. Laat het 5 minuten intrekken om een volledige lysis van het celmonster te garanderen.
    2. Voeg 100 μL fenol-guanidine-isothiocyanaatlysisagens toe, schud scherp gedurende 15 s en laat het 2 minuten op kamertemperatuur staan. Zuig ten slotte de bovenste waterige fase voorzichtig op, breng deze over naar de adsorptiekolom en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 13.400 x g .
    3. Bind RNA aan het silicagelmembraan. Was het met Buffer RW1 en Buffer RW2 om eiwitten te verwijderen. Voeg vervolgens DNase I toe om het resterende DNA te verteren en voer een secundaire wasbeurt uit met Buffer RW2 om volledige verwijdering van onzuiverheden te garanderen. Verzamel ten slotte RNA-monsters door RNA te eluleren met RNase-vrij water en gedurende 1 minuut te centrifugeren op 13.400 x g .
  2. Meet de RNA-concentratie.
    1. Plaats elke 1.5 μL monster-RNA-oplossing in een micronucleïnezuurdetector (zie materiaaltabel voor details) en lees de A260/A280-waarden af.
      OPMERKING: Als de gemeten A260/A280-waarden binnen het bereik van 1.8 tot 2.0 liggen en de RNA-concentratie tussen 20 ng/μL en 200 ng/μL ligt, geeft dit aan dat de RNA-kwaliteit acceptabel is en kan worden gebruikt voor latere experimenten.
    2. Verdun op basis van de metingen de RNA-oplossing met diethylpyrocarbonaat (DEPC) water om consistente RNA-concentraties voor alle monsters te garanderen, waarbij de gemeten minimale RNA-concentratie als benchmark wordt gebruikt, gevolgd door PCR-experimenten.
  3. Omgekeerde transcriptie van RNA
    1. Gebruik het geëxtraheerde totale RNA als sjabloon en synthetiseer cDNA volgens de instructies van de reverse transcriptiekit (zie Materiaaltabel voor details). Bereid het reactiesysteem voor volgens de vereisten van de kit.
    2. Voeg de geëxtraheerde RNA-oplossing en het reactiesysteem toe aan een buis met acht rijen en plaats twee replicate-putjes in elke groep. Start de reactie in opeenvolgende omstandigheden: 15 minuten incubatie bij 37 °C, 5 s warmtedenaturatie bij 85 °C, 5 minuten afkoelen bij 4 °C.
  4. PCR-reactie
    1. Voer PCR-amplificatie uit op een real-time fluorescentie kwantitatief PCR-systeem (zie Materiaaltabel voor details) met behulp van de op SYBR Green gebaseerde voorgemengde PCR-mastermix (zie Materiaaltabel voor details). Gebruik GADPH als het referentiegen, met primersequenties vermeld in tabel 2, en bereid het reactiemengsel als volgt voor: voeg achtereenvolgens 0,4 μL van de corresponderende primer, 2 μL cDNA-sjabloon en het reactiemengsel toe aan een stripbuis met acht putjes om het uiteindelijke reactievolume te bereiken.
    2. Voer PCR-amplificatie uit: 95 °C 30 s (1 cyclus), 95 °C 5 s (40 cycli), 60 °C 20 s (40 cycli). Bereken de relatieve expressieniveaus van doelgenen met behulp van de 2 -ΔΔCt-methode 25. Herhaal alle experimenten zelfstandig drie keer om de betrouwbaarheid van de gegevens te garanderen.
      OPMERKING: Chemisch afval dat tijdens experimentele procedures wordt gegenereerd, moet worden ingezameld in aangewezen containers voor gevaarlijk afval en worden verwijderd door gecertificeerde diensten voor het beheer van gevaarlijk afval in overeenstemming met het institutionele beleid.
Primer sequenties
AbcReeks (5'-3')
menselijke-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
menselijke-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

Tabel 2: Primersequenties voor PCR-assays

5. EdU-detectie

  1. Evalueer het effect van veranderde LINC00511 expressie op de proliferatie van A549/DDP-cellen met behulp van een EdU-testkit (zie materiaaltabel voor details).
    1. Selecteer willekeurig A549/DDP-cellen die na reanimatie naar de derde generatie zijn overgegaan en inoculeer ze uniform in platen met 24 putjes met een dichtheid van 2 x 104 cellen/putje.
      OPMERKING: Hier werden alle experimenten uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).
    2. Nummer elke put willekeurig en wijs de putjes toe aan een van de vier experimentele groepen op basis van deze willekeurige getallen: controlegroep, β-Ele-groep, β-Ele + LINC00511 overexpressie (β-Ele + OV-LINC00511) groep en β-Ele + LINC00511 knockdown (β-Ele + si-LINC00511) groep.
  2. Wanneer de celdichtheid ongeveer 70% bereikt, voer plasmidetransfectie en interferentiebehandeling uit volgens stap 3.3. Na 24 uur transfectie, gooi het originele medium weg en voeg 1 ml middelgrote oplossing met β-Ele (40 μg/ml) toe aan elk putje van de groep van de medicamenteuze behandeling.
  3. Incubeer de cellen met EdU voor labeling nadat ze gedurende 24 uur zijn behandeld met 40 μg/ml β-Ele. Fixeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten met 4% paraformaldehyde en permeabiliseer ze met 0,5% Triton X-100.
  4. Voeg de klikreactieoplossing toe (bereid door een injectieflacon van het door de kit meegeleverde Click Additive-reagens op te lossen in 1,3 ml gedeïoniseerd water en grondig te mengen) in het donker en houd de reactie 30 minuten in het donker. Was de cellen met PBS nadat de reactie is voltooid, gevolgd door Hoechst-kleuring gedurende 5 minuten. Bekijk ten slotte de resultaten met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 1 en Figuur 2).
    OPMERKING: DMSO is zeer doorlaatbaar en een ontvlambare vloeistof. In dit schema bevat de β-Ele toedieningsoplossing DMSO. Verzamel daarom de β-Ele toedieningsoplossing na gebruik in een speciaal vat voor afvalvloeistof en overhandig deze regelmatig aan het verwerkingsbedrijf voor gevaarlijke afvalstoffen voor professionele verwijdering.

6. Detectie van glucosegehalte 

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).

  1. Selecteer willekeurig A549/DDP-cellen die na reanimatie naar de derde generatie zijn overgegaan en inoculeer ze uniform in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 x 105 cellen/putje. Nummer elke put willekeurig en wijs de putjes toe aan experimentele groepen op basis van deze willekeurige nummers.
  2. Wanneer de celdichtheid ongeveer 70% bereikt, ga dan verder met plasmidetransfectie en interferentie zoals beschreven in stap 3.3. Na 24 uur transfectie worden de cellen in de behandelde groepen behandeld met 40 μg/ml β-Ele.
  3. Verzamel na 24 uur medicamenteuze behandeling het bovenste kweekmedium van de cellen en centrifugeer het gedurende 5 minuten op 1000 × g . Verzamel de supernatant. Bereid de reactieoplossing volgens de instructies in de glucosetestkit (zie Materiaaltabel voor details) en meng deze grondig met het supernatant.
  4. Plaats de monsters in platen met 96 putjes met vijf replicatieputjes per groep. Schud de platen voorzichtig en incubeer ze gedurende 10 minuten bij 37 °C. Meet de absorptie van elk putje met behulp van een microplaatlezer bij een golflengte van 505 nm en bereken het glucosegehalte met behulp van de meegeleverde formule in de testkit:
    figure-protocol-1
    Hier isC-standaard = 5,55 mmol/L, N = verdunningsfactor.
    OPMERKING: Chemisch afval dat tijdens experimentele procedures wordt gegenereerd, moet worden ingezameld in aangewezen containers voor gevaarlijk afval en worden verwijderd door gecertificeerde diensten voor het beheer van gevaarlijk afval in overeenstemming met het institutionele beleid.

7. Detectie van melkzuurgehalte 

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).

  1. Selecteer willekeurig A549/DDP-cellen die na reanimatie zijn overgegaan naar de derde generatie en inoculeer ze uniform in platen met 6 putjes (1 × 105 cellen/putje). Nummer elke put willekeurig en wijs de putjes toe aan experimentele groepen op basis van deze willekeurige nummers. Wanneer de celdichtheid ongeveer 70% bereikt, ga dan verder met plasmidetransfectie en interferentie zoals beschreven in stap 3.3. 24 uur na transfectie, behandel de cellen in de behandelde groepen met 40 μg/ml β-Ele.
  2. Verzamel na 24 uur medicamenteuze behandeling het bovenste kweekmedium van de cellen en centrifugeer het gedurende 5 minuten op 1000 x g . Verzamel de supernatant. Volgens de instructies in de melkzuurtestkit (zie Materiaaltabel voor details), bereid de reactieoplossing en meng deze grondig met het supernatant.
  3. Voeg in totaal 250 μL monster toe aan elk putje van een plaat met 96 putjes, en plaats vijf duplicaatputjes voor elke groep. Schud de plaat voorzichtig en incubeer hem gedurende 10 minuten bij 37 °C. Meet de absorptie van elk putje bij een golflengte van 530 nm met behulp van een microplaatlezer (zie materiaaltabel voor details) en bereken het lactaatgehalte met behulp van de meegeleverde formule in de testkit:
    figure-protocol-2
    Hier is C-standaard = 3 mmol/L, N = verdunningsfactor.
    OPMERKING: Chemisch afval dat tijdens experimentele procedures wordt gegenereerd, moet worden ingezameld in aangewezen containers voor gevaarlijk afval en worden verwijderd door gecertificeerde diensten voor het beheer van gevaarlijk afval in overeenstemming met het institutionele beleid.

8. Bulk RNA-seq

  1. Een voorbeelddatabase opzetten
    1. Selecteer A549/DDP-cellen voor het experiment en verdeel ze in de volgende groepen: controlegroep, DDP-groep, β-Ele (40 μg/ml) + DDP (48 μM) groep, β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 groep en β-Ele + DDP +si-LINC00511 groep. Voeg 3 monsters toe aan elke groep.
    2. Extraheer totaal RNA uit elke celgroep. Gebruik een mRNA-isolatiekit op basis van magnetische kralen (zie Materiaaltabel voor details) om eukaryotisch mRNA te verrijken, waarin Oligo(dT)-gecoate kralen selectief binden aan de poly(A)-staarten van mRNA via AT-basenparing. Voeg fragmentatiebuffer toe (1 μL/μg RNA, zie Materiaaltabel voor details) en incubeer gedurende 7 minuten bij 94 °C om het mRNA in korte segmenten te fragmenteren.
    3. Ga verder met de eerste streng cDNA-synthese met behulp van willekeurige hexamaerprimers volgens de instructies van de fabrikant. Voeg voor tweedestrengs cDNA-synthese de juiste hoeveelheden reactiebuffer, RNase H en DNA-polymerase I toe om het proces te voltooien.
    4. Voer eindreparatie en A-tailing uit op dubbelstrengs cDNA door incubatie bij 25 °C gedurende 30 minuten (eindreparatie), onmiddellijk gevolgd door 72 °C gedurende 30 minuten (A-tailing). Ligate sequencing adapters naar de eind-gerepareerde fragmenten.
    5. Zuiveren en op maat selecteren van afgeligeerde producten met behulp van carboxyl-gemodificeerde magnetische silicakorrels (zie materiaaltabel voor details). Bouw ten slotte de sequencingbibliotheek op door middel van PCR-amplificatie.
    6. Analyseer na de voorbereiding van het monster de sequencingbibliotheek op het DNBSEQ-T7-platform (zie Materiaaltabel voor details). Laad het monster op een Patterned Array-microarray-chip voor sequencing.
      OPMERKING: Het instrument verzamelde, las en identificeerde optische signalen met behulp van een beeldvormingssysteem met hoge resolutie om de sequentie-informatie van individuele basen te bepalen. Voer vervolgens aanvullende volgordecycli uit om de volgorde van de volgende basen te verkrijgen. Na meerdere cycli werden de ruwe sequencinggegevens gegenereerd.
  2. Bio-informatica analyse
    1. Rangschik de monsters op de machine om de onbewerkte gegevens te verkrijgen, ook wel de gegevens buiten de machine genoemd. Verwerk de sequentiegegevens verder met behulp van fastp (v 0.21.0). Verwijder lezingen met 3'-adaptersequenties en elimineer lezingen van lage kwaliteit met een gemiddelde kwaliteitsscore onder Q20 als onderdeel van de primaire filtercriteria. Voer alle downstream-analyses uit op basis van de opgeschoonde gegevens van hoge kwaliteit.
      OPMERKING: Voer de eerste filtering van sequentiegegevens uit met behulp van fastp. Raadpleeg de officiële documentatie voor transcriptomische datasets (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) voor de specifieke opdrachtregelparameters.
    2. Gebruik FastQC (v 0.12.0) om de kwaliteit van de opgeschoonde sequencinggegevens te beoordelen. De kwaliteitseisen zijn als volgt: ten minste 90% van de basen moet een kwaliteitsscore hebben die hoger is dan Q20 en het percentage resterende adaptersequenties mag niet hoger zijn dan 1%. Gegevens die aan deze criteria voldoen, worden als gekwalificeerd beschouwd en kunnen worden gebruikt voor downstreamanalyse.
      OPMERKING: Beoordeel de kwaliteit van de opgeschoonde sequencinggegevens met behulp van FastQC, volgens de officiële richtlijnen (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analyse van genexpressie
    1. Gebruik DESeq2-software om differentiële expressieanalyse uit te voeren tussen de twee vergelijkingsgroepen.
      1. Voer eerst de gegevens in de software in om een DESeq-dataset samen te stellen. Filter vervolgens genen uit met een totale telling van minder dan 10 in alle monsters.
      2. Voer ten slotte de differentiële genanalyse uit en extraheer de resultaten. De voorwaarden voor het screenen van differentieel tot expressie gebrachte genen zijn als volgt: de vouwverandering in expressie |log2FoldChange| > 1, en de betekenis padj ≤ 0,05.
        OPMERKING: Raadpleeg de gedetailleerde stappen op de officiële website voor gedetailleerde bedieningsstappen van DESeq2-software voor gedetailleerde bedieningsstappen van DESeq2: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Detectie van veranderingen in het eiwitexpressieniveau door Western blot (WB) 

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).

  1. Voer Western blotting uit om de expressieniveaus van cellulaire eiwitten te kwantificeren.
    1. Selecteer willekeurig A549/DDP-cellen die na reanimatie naar de derde generatie zijn overgegaan en inoculeer ze uniform in platen met 6 putjes met een dichtheid van 1 x 105 cellen/putje.
    2. Nummer elke put willekeurig en wijs de putjes toe aan een van de zes experimentele groepen op basis van deze willekeurige getallen: Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 en β-Ele + si-LINC00511.
    3. Wanneer de celdichtheid ongeveer 70% bereikt, voer plasmidetransfectie en interferentie uit zoals beschreven in stap 3.3. Na 24 uur transfectie, stel de behandelingsgroep bloot aan β-Ele (40 μg/ml), terwijl het verstrekken van vers medium aan de controlegroep. Cultuur beide groepen voor een extra 24 uur.
    4. Verzamel vervolgens celpellets door centrifugatie bij 1675 × g gedurende 5 minuten. Lyseer elke groep cellen met 500 μL RIPA lysisbuffer met 1 mM PMSF op ijs gedurende 30 minuten (zie Materiaaltabel voor details).
  2. Centrifugeer de cellysaten bij 13.400 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en vang het supernatant op. Meet eiwitconcentraties met behulp van de BCA Protein Concentration Assay Kit (zie Materiaaltabel voor details). Scheid gelijke hoeveelheden eiwitmonsters door 10% SDS-PAGE en breng ze via elektroforese over naar polyvinylideenfluoride (PVDF)-membranen.
  3. Dompel de membranen 2 uur bij kamertemperatuur onder in een blokkerende oplossing (5% magere melk/Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST)) en incubeer ze een nacht bij 4 °C met primaire antilichamen tegen GLUT1, PKM2, LDHA, β-catenine, GSK-3β (1:1000) en β-actine (1:2000, zie materiaaltabel voor details).
    1. Was de membranen de volgende dag drie keer met TBST, elk 5 minuten, op kamertemperatuur met zacht schudden.
  4. Incubeer de membranen de volgende dag met secundaire antilichaamoplossingen (HRP-gelabeld geitenanti-konijn IgG, 1:2000) en schud voorzichtig gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Voeg ten slotte 0,1 ml/cm2 in de handel verkrijgbare ECL-chromogene oplossing toe om de PVDF-membranen volledig te bedekken. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur voordat u wordt blootgesteld. Visualiseer en analyseer de banden met behulp van een verbeterd chemiluminescentiesysteem (zie Materiaaltabel voor details). Zie Figuur 4C en Figuur 5B.
    OPMERKING: Chemisch afval dat tijdens experimentele procedures wordt gegenereerd, moet worden ingezameld in aangewezen containers voor gevaarlijk afval en worden verwijderd door gecertificeerde diensten voor het beheer van gevaarlijk afval in overeenstemming met het institutionele beleid.

10. Statistische analyse 

OPMERKING: Alle experimenten werden uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replicaten (n = 3).

  1. Organiseer de experimentele gegevens per groep en voer ze in de GraphPad Prism-software in (versie 8.0.2; zie Materiaaltabel voor details). Voer datavisualisatie en statistische significantieanalyse uit in overeenstemming met de softwarerichtlijnen. De meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische verschillen tussen groepen werden beoordeeld met behulp van One-way ANOVA met η² (eta-kwadraat) effectgrootteberekening, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest26. Beschouw **P < 0,01 als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-Ele onderdrukt de proliferatie van A549/DDP-cellen aanzienlijk

In dit experiment werden de toedieningsconcentraties van β-Ele en DDP bepaald op basis van de resultaten van onze eerdere studies 20,21. A549/DDP-cellen werden behandeld met β-Ele, alleen of in combinatie met DDP, om de impact ervan op DDP-chemoresistentie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie richtte zich op de kritieke klinische kwestie van cisplatineresistentie bij longkanker. Longkanker, verantwoordelijk voor het hoogste aantal dodelijke slachtoffers door kanker wereldwijd, heeft nog steeds een overlevingspercentage van vijf jaar onder de 20%29,30. Cisplatine, als de hoeksteen van op platina gebaseerde chemotherapiemedicijnen, is een efficiënt, breedspectrum antikankermiddel dat de DNA-replicatie remt o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor deze studie werd verstrekt door de Jilin Provincial Natural Science Foundation onder Award No. YDZJ202401058ZYTS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A549/DDP cellenProcellCL-0519URLs:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Een uitzonderlijk schone werkbankSuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDURLs:http://www.sz-antai.com
BCA-eiwitconcentratietestkitSolarbioPC0020URLs:https://www.solarbio.com
Centrifuge voor op tafelThermoPico17URLs:https://www.thermofisher.com
CelcultuurkamerThermo3111URLs:https://www.thermofisher.com
CelcultuurschaalBIOFILTCD000100URLs:http://www.biofil.com.cn
Chemiluminescentie-analysatorQinxiang Instruments 4300URLs:https://www.clinx.cn/about_us
CisplatinAladdinC295225-250mgURLs:https://www.aladdin-e.com/
DNBSEQ-T7 GensequencerMGI Tech CO., LtdT7URLs:https://www.mgitech.cn/
EasyPure Micro genomisch DNA-kitTransGen BiotechEE181-01URLs:https://www.transgen.com/
ECL chromogene oplossingSolarbioPE0010URLs:https://www.solarbio.com
EDU detectiekitBeyotimeC0071SURLs:https://www.beyotime.com
Enzym-gelabeld instrumentDetie EquipmentHBS-1096AURLs:https://www.detiebio.cn/
Foetaal runderserum (FBS)CLARKFB15015URLs:https://zn.clarkbio.com/
Frag/Prime Buffer Yeasen11277ESURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper Software 6ThermoVersie 6Fragmentanalysesoftware. URLs:https://www.thermofisher.cn/  
GenReader-platformBeijing Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlAutomatische genetische analyzer voor capillaire elektroforese
Glucose-testkitJiancheng BioA154-1-1URLs:http://www.njjcbio.com
GLUT1 polyklonaal antilichaamProteintech Group21829-1-APURLs:https://www.ptglab.com
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersie 8.0.2URLs:https://www.graphpad.com
GSK-3βAntilichaamAffinityAF5016URLs:https://www.affbiotech.com
Ham's F-12KProcellPM150910URLs:https://www.procell.com.cn/
Hieff NGS DNA-selectiekralenYeasen12601ESURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/939
HieffNGS mRNA-isolatie Master KitYeasen12603ZHURLs:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
HRP-gelabeld geitenanti-konijn IgGServicebioGB23303URLs:https://www.servicebio.cn
Lactaat-testkitJiancheng BioA019-2-1URLs:http://www.njjcbio.com
LDHA-specifiek polyklonaal antilichaamProteintech Group19987-1-APURLs:https://www.ptglab.com
Light Cycler 96RocheLC96URLs:https://lifescience.roche.com
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019URLs:https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco31985-070URLs:https://www.thermofisher.com/gibco
Penicilline-streptomycine(P/S)BiosharpBL505AURLs:https://www.biosharp.cn/
PKM2-specifiek polyklonaal antilichaamProteintech Group15822-1-APURLs:https://www.ptglab.com
PMSF BeyotimeST506URLs:https://www.beyotime.com
PrimeScript RT-reagenskit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AURLs:https://www.takarabio.com
RIPA-lysaatBeyotimeP0013BURLs:https://www.beyotime.com
Sequencing-platformBGIDNBSEQ-T7URLs:https://www.bgi.com/global
TB Green Premix Ex TaqTaKaRaRR420AURLs:https://www.takarabio.com
Trace nucleic acid testerAosheng InstrumentNano-100URLs:http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SURLs:https://www.canvaxbiotech.com
TrypsineBiosharpBL501AURLs:https://www.biosharp.cn/
Ultrapuur RNA-kit (DNase I)Canvax BiotechCW0597SURLs:https://www.canvaxbiotech.com
β-Actine-antilichaamProteintech Group60008-1-IgURLs:https://www.ptglab.com
β-catenine-antilichaam AffinityDF6794URLs:https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGURLs:https://www.sigmaaldrich.com

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

B ta elemeneWnt b ta catenineaerobe glycolyseA549 DDP cellenwestern blotqRT PCREdU assay
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen