Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verfijning van de productie van OnePot PURE en ruwe ribosomen voor reproduceerbare celvrije eiwitsynthese

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een geactualiseerd protocol voor de productie van het OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE)-systeem en ruwe ribosomen voor celvrije eiwitsynthese, met de nadruk op het beheersen van celgroei om batch-tot-batchvariaties te minimaliseren.

Samenvatting

Recente ontwikkelingen hebben het mogelijk gemaakt om het celvrije systeem Protein synthesis Using Recombinant Elements (PURE) in individuele laboratoria economisch en met minder arbeidslast te produceren. De bereiding van de 36 eiwitcomponenten en het ribosoom, waaruit PURE bestaat, is echter nog steeds een complexe onderneming, met veel ruimte voor variatie en fouten. We presenteren een gedetailleerde en bijgewerkte procedure voor de productie van PURE op basis van het onlangs gepubliceerde OnePot-protocol, dat het reguleren van een aantal belangrijke stappen omvat, met name de inoculatie van culturen met behulp van optische dichtheid (OD)-genormaliseerde glycerolvoorraden, zorgvuldige monitoring van celgroei en het controleren van de uiteindelijke glycerolconcentraties. Met behulp van deze aanpak rapporteren we reproduceerbare preparaten van PURE van meerdere biologische replicaten en gebruikers. Dit protocol dient als referentie en startpunt voor andere laboratoria om hun eigen PURE-systemen te produceren en problemen op te lossen, waardoor de democratisering van de vele toepassingen die PURE mogelijk maakt, zoals de bottom-up constructie van biomoleculaire systemen en de ontwikkeling van synthetische cellen, wordt vergroot.

Inleiding

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is volwassen geworden als een technologie voor diverse toepassingen, waaronder bioproductie, biosensing en diagnostiek, prototyping van genetische en metabolische onderdelen en routes, snelle eiwitengineering en onderwijs 1,2. CFPS-systemen met gezuiverde componenten, oorspronkelijk ontwikkeld als het 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) system3, bieden een aantal voordelen ten opzichte van hun op lysaat gebaseerde alternatieven. PURE-systemen hebben een gedefinieerde samenstelling, bestaande uit 36 eiwitfactoren, het 70S E. coli-ribosoom en een gedefinieerd mengsel van chemische substraten, waaronder nucleosidetrifosfaten (NTP's), aminozuren en tRNA's, die naar believen kunnen worden aangepast aan de vereiste toepassing. Ze zijn dus zeer geschikt voor studies zoals niet-canonieke aminozuurincorporatie, mechanistische modellering en de bottom-up constructie van biomoleculaire systemen en synthetische cellen1. Hoewel PURE verkrijgbaar is bij commerciële leveranciers, zijn de kosten ($ 0,34 - $ 1,63 per reactie van 1 μl) onbetaalbaar voor grootschalige experimenten; en de alternatieve strategie om PURE in eigen huis te produceren is tot nu toe belemmerd door arbeidsintensieve protocollen met parallelle zuivering van 36 eiwitten en ribosomen4, die een uitdaging zijn om robuust en reproduceerbaar uit te voeren, vooral voor onervaren gebruikers.

Recente ontwikkelingen hebben bijgedragen aan de zelfgemaakte productie van PURE. Wang et al. hebben bijvoorbeeld stammen van E. coli gemanipuleerd om genomisch geïntegreerde hexa-histidine-tags op de vertaalmachine op te nemen, waardoor een zuivering in één stap mogelijk wordt5. Genen die coderen voor alle PURE-eiwitten zijn geassembleerd in een klein aantal plasmiden, die op dezelfde manier zijn gebruikt om de zuiveringsarbeid te verminderen6. Villareal et al. hebben elegante consortia van PURE-stammen ontwikkeld, die expressie in evenwicht brengen om eiwitten in de juiste verhouding te produceren, terwijl ze tegelijkertijd zuivering in één stap mogelijk maken7.

Het innovatieve OnePot PURE-systeem, ontwikkeld door Lavickova et al., is veelbelovend op het gebied van gebruiksgemak 8,9. In dit systeem worden de originele PURE-stammen samen gekweekt en gezuiverd via een enkele chromatografiestap. Hoewel het niet mogelijk is om de samenstelling van het resulterende PURE-systeem precies te definiëren, hebben de auteurs aangetoond dat meerdere batches van het systeem grotendeels reproduceerbaar zijn en dat een grof controleniveau kan worden bereikt door het inoculatievolume van elke stam te variëren. De afweging van nauwkeurige controle van de samenstelling voor productiegemak is er een die voor veel gebruikers acceptabel zal zijn, aangezien de totale eiwitsyntheseopbrengst van het OnePot-systeem vergelijkbaar is met die welke commercieel wordt verkregen. Hoewel er gedetailleerde protocollen bestaan voor het OnePot-systeem, was het een uitdaging om de resultaten van Lavickova et al. volledig te reproduceren in andere laboratoria. Er zijn bijvoorbeeld instabiliteit van expressievectoren, langzaam groeiende stammen en proteolyse waargenomen10.

In dit werk presenteren we een gedetailleerd en verfijnd OnePot PURE-protocol, dat de celgroei regelt met behulp van gestandaardiseerde glycerolvoorraden en media-aanpassingen, richtlijnen geeft voor het monitoren van de groei en oogst-OD, en de hoeveelheid glycerol in de uiteindelijke zuivering normaliseert. Ten tweede presenteren we een geoptimaliseerde zuiveringsprocedure voor ruwe ribosomen met behulp van alleen differentiële ultracentrifugatie, die de afweging tussen ribosoomactiviteit en de kosten en complexiteit van meer geavanceerde methoden in evenwicht brengt.

Hoewel dit meer stappen in het OnePot-protocol introduceert, bieden ze de gebruiker meer mogelijkheden om de procedure indien nodig grondiger op te lossen en aan te passen aan hun behoeften. We demonstreren de reproduceerbaarheid van het proces door meerdere biologische replicaten te laten zien die door meerdere gebruikers in hetzelfde laboratorium zijn uitgevoerd. We vinden dat controle over zowel de PURE-componenten als de ribosoomvoorbereiding cruciaal zijn om hoge CFPS-prestaties van het systeem te garanderen.

Het preparaat van PURE en ribosoom duurt elk respectievelijk 4 of 5 dagen en kan opeenvolgend door één gebruiker of gelijktijdig door twee gebruikers worden uitgevoerd. Het PURE-preparaat omvat 4x500 ml vloeibare cultuur, die elk ~2 g celpellet en ~1 ml PURE-eiwitten oplevert in een concentratie van ~15 mg/ml. Het ribosoompreparaat omvat 4 × 500 ml = 2 L vloeibare cultuur, wat leidt tot een totaal van ~3 g celpellet en ~1 ml ruwe ribosomen oplevert bij een concentratie van ~17 μM. Het huidige protocol produceert PURE-systemen met syntheseopbrengsten tot ~100 μg/ml GFP of ~130 μg/ml mCherry gedurende 2 uur batchreactie11, wat gunstig afsteekt bij de originele OnePot en commerciële systemen (~140-160 μg/ml)8,12. Daarom is het een geschikt uitgangspunt voor verdere optimalisatie door suppletie of modulatie van gevoelige componenten zoals zouten, verdringingsmiddelen en individuele eiwitfactoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het protocol is opgedeeld in drie delen. Omwille van de beknoptheid en duidelijkheid benadrukken we de belangrijke veranderingen die specifiek zijn voor dit werk, en daarom wordt verwezen naar details die dezelfde zijn als die in andere publicaties.

Voorwerkzaamheden hoeven maar één keer te worden uitgevoerd. De vier secties omvatten het voorbereiden van glycerolvoorraden en startplaten voor de PURE-eiwitten, evenals het verifiëren en meten van expressietijden van de stammen. Het gebruik van startplaten verwijdert de variabiliteit die gepaard gaat met directe inoculatie uit geschraapte glycerolvoorraden. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat dit werk grondig wordt gedaan voordat u overgaat tot de productiefase. Vanwege het grote aantal verschillende glycerolvoorraden dat betrokken is bij de bereiding van PURE, is het essentieel om de integriteit en expressie van het plasmide van elke stam te verifiëren voordat u probeert het systeem te produceren.

Een schema van de workflow wordt gegeven in Figuur 1 en een aanbevolen tijdschema in Tabel 1. De benodigde materialen en de stappen waarin ze worden gebruikt, worden gegeven in de Tabel met materialen, en het overzicht van buffers en media die in elke fase nodig zijn, is samengevat in Aanvullende Figuur S1.

1. Voorbereidende werkzaamheden

  1. Genereren van glycerolvoorraden
    OPMERKING: Alle plasmiden zijn verkrijgbaar bij Addgene.
    1. Genereer 25% g/v glycerolvoorraden van alle stammen vermeld in tabel 2, volgens standaardprocedures9, en bewaar in cryovials bij -80 °C.
  2. Bereiding van PURE startplaten ('s nachts)
    1. Bereid 20 ml LB-media voor aangevuld met 100 μg/ml ampicilline (LB+AMP).
    2. Label 36x steriele 1,5 ml microcentrifugebuisjes van #1-#36.
    3. Voeg 500 μL LB+AMP toe aan elke buis. Inoculeer elke buis met de bijbehorende stam door een pipetpunt te gebruiken om een kleine hoeveelheid van de oorspronkelijke glycerolvoorraad te schrapen. Zorg ervoor dat de glycerolvoorraden niet ontdooien. Vortex om grondig te mengen.
    4. 300 μl uit elke geënte buis in het overeenkomstige putje van een steriele plaat van 1 ml 96 met diepe putjes volgens de in figuur 2 aangegeven lay-out.
      OPMERKING: Houd in alle volgende stappen met platen dezelfde plaatlay-out aan.
    5. Incubeer de plaat een nacht in een plaatschudder bij 37 °C, 1.000 RPM gedurende 15 uur.
    6. Bereid de volgende dag 25 ml LB-media aangevuld met 100 μg/ml ampicilline (LB+AMP) en 15 ml steriel 50% (v/v) glycerol.
    7. Breng 30 μl van elke cultuur over van de deepwell-plaat in de bodem van een optische plaat met 96 putjes, met behulp van een meerkanaalspipet. Voeg 270 μL LB+AMP-media toe aan elk putje met culturen, om een 10x verdunning van elke cultuur te bereiken.
    8. Meet de OD600 van elke cultuur met behulp van een plaatlezer. Bereken het volume van elke cultuur dat nodig is om 650 μl verse LB+AMP te inoculeren tot een start-OD600 van 0,2. Een spreadsheet om te helpen bij berekeningen wordt geleverd als aanvullende tabel S1.
    9. Bereid drie nieuwe steriele platen van 1 ml 96 voor met diepe putjes. Voeg in één plaat 650 μL LB+AMP toe aan 36 putjes en inoculeer elk putje met het berekende volume nachtcultuur om OD600 = 0,2 te verkrijgen.
    10. Breng 300 μl geënte cultuur over in elk van de andere twee platen. De ene plaat zal de cultuur zijn en de andere zal worden gebruikt om OD te monitoren. Incubeer de twee platen in een plaatschudder bij 37 °C, 1000 RPM, tot de culturen OD600 ~ 1 (~1,5-2 uur) bereiken. Bewaak de OD na 1 uur, en vervolgens opnieuw indien nodig, door 30 μL monsters van de tweede plaat te verwijderen en toe te voegen aan 270 μL LB+AMP voor een 10x verdunning.
    11. Als individuele putten OD600 ~ 1 bereiken, verwijdert u ze uit de schudder. Voeg een gelijk volume steriele 50% (v/v) glycerol toe aan elke cultuur om een uiteindelijke concentratie van OD600 = 0,5 in 25% glycerol te bereiken. Meng grondig en bewaar deze tubes op ijs. Dit zijn de meester-werkvoorraden.
    12. Verdeel maximaal 40 μl van elke mastervoorraad in PCR-platen met 96 putjes, waarbij het oorspronkelijke putpatroon behouden blijft. Verdeel over zoveel mogelijk borden op basis van opslagcapaciteit. Sluit af met folieplaatafdichtingen en bewaar deze PURE startplaten bij -80 °C.
      LET OP: Deze startplaten mogen maximaal 3x ontdooid worden. Vervang deze limiet door nieuwe platen als deze limiet wordt overschreden om de integriteit en reproduceerbaarheid van de spanning te behouden.
  3. Bepalen van de groeitijden van startercultuur ('s nachts)
    1. Ontdooi een PURE startplaat op ijs.
    2. Voeg 50 μl 100 mg/ml ampicilline toe aan 50 ml steriele LB-media in een steriele conische buis (LB+AMP).
    3. Label 36 x 1,5 ml steriele microcentrifugebuisjes van #1-#36 en voeg 1 ml LB+AMP toe aan elke buis.
    4. Voeg 10 μL van elk van de glycerolbouillons toe aan de bijbehorende geëtiketteerde buis en meng goed door vortexing.
    5. Voeg 300 μl van de geënte cultuur uit elk buisje toe aan het overeenkomstige putje van een steriele plaat van 1 ml 96 diepe putjes. Sluit de platen af met een ademende plaatafdichting en incubeer de kweekplaat in een plaatschudder bij 1000 RPM, 37 °C. Bepaal en noteer de tijd die culturen nodig hebben om OD600 ~2-3 te bereiken zonder OD600 = 3 te overschrijden. Stel deze parameter in voordat u verder gaat.
      LET OP: In ons lab duurt dit 15 uur.
  4. Expressieproef van PURE-stammen
    1. Bereid 38 ml LB-media aangevuld met 100 μg/ml ampicilline (LB+AMP), 10 mM IPTG-bouillon en 1x eiwitextractiereagens.
    2. Ontdooi een PURE startplaat op ijs.
    3. Voeg 1 ml LB+AMP toe aan elk van de 36 putjes van een steriele plaat van 2 ml 96 diepe putjes. Inoculeer elk putje met 20 μl van de bijbehorende startercultuur. Incubeer de plaat in een plaatschudder bij 1000 tpm bij 37 °C gedurende ongeveer 1 uur, of totdat OD600 = 2 is bereikt.
    4. Induceer eiwitexpressie door 10 μL 10 mM IPTG toe te voegen aan elk putje, voor een uiteindelijke IPTG-concentratie van 0,1 mM. Ga door met de incubatie gedurende 3 uur bij 1000 RPM, 37 °C.
    5. Aan het einde van de afkoelperiode van 3 uur wordt 700 μl van elke cultuur overgebracht in steriele microcentrifugebuisjes van 36 x 1,5 ml. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg.
    6. Resuspendeer elke pellet in 70 μL 1x eiwitextractiereagens. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht roeren om cellyse mogelijk te maken.
    7. Centrifugeer lysaten bij 20.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de onoplosbare fractie te pelleteren.
    8. Voer kleinschalige His-tag-zuivering van elk eiwit uit met behulp van Ni-NTA magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant.
    9. Analyseer gezuiverde eiwitten met behulp van SDS-PAGE om de expressie van elk eiwit en/of kruisbesmetting tussen stammen9 te bevestigen.
      OPMERKING: Stammen die eiwit tot expressie brengen, vertonen verschillende banden op SDS-PAGE die overeenkomen met het verwachte molecuulgewicht van het doeleiwit. Als er geen banden worden gedetecteerd, brengt de stam het eiwit mogelijk niet tot expressie. Isoleer en sequentie in dergelijke gevallen het plasmide om de identiteit en integriteit van de sequentie te bevestigen, en vervang het plasmide indien nodig.

2. OnePot PURE eiwitzuivering (4 dagen)

OPMERKING: Een enkele voorbereiding van het PURE-systeem vereist de verwerking van 500 ml vloeibare cultuur. Het is raadzaam om 4 x 500 ml preps tegelijkertijd te produceren om vier onafhankelijke PURE-batches in één run te produceren. Deze batches kunnen vervolgens onafhankelijk of indien nodig worden gekwantificeerd. Het 4-daagse protocol kan worden ingekort tot 3 dagen door de harsincubatiestap 's nachts uit te voeren, maar dit houdt een lange derde dag in. Beide opties worden hieronder beschreven.

  1. Dag 1: voorbereiding van materialen en groei van starterculturen
    1. Bereid voorraadoplossingen en buffers voor het PURE-preparaat voor zoals beschreven in aanvullende tabel S2 en aanvullende figuur S1.
      OPMERKING: Bereid de relevante media en buffers voor die onmiddellijk voorafgaand aan de uitvoering van elk deel van het protocol vereist zijn en bewaar deze alleen gedurende het maximale aantal dagen voor gebruik zoals aangegeven.
    2. Ontdooi een PURE startplaat op ijs.
    3. Voeg 50 μl 100 mg/ml ampicilline toe aan 50 ml steriele LB-media in een steriele conische buis van 50 ml (LB+AMP).
    4. Label 36 x 1,5 ml steriele microcentrifugebuisjes van #1-#36 en voeg 1 ml LB+AMP toe aan elke buis.
    5. Voeg 10 μL van elk van de glycerolbouillons toe aan de overeenkomstige geëtiketteerde buis en meng goed door vortex.
      OPMERKING: Om de inoculatie van elke stam gemakkelijk te volgen, werpt u na het toevoegen van de stam aan elke buis de pipetpunt uit in het overeenkomstige putje van de PURE-startplaat. Herhaal dit proces voor alle soorten. Als u klaar bent, verwijdert u de pipetpunten voorzichtig van de plaat voordat u deze opnieuw afsluit met folie en autoclaaftape en bewaart bij -80°C.
    6. Voeg 300 μl van de geënte cultuur uit elk buisje toe aan het overeenkomstige putje van een steriele 1 ml 96 diepe putplaat, behalve stam #25 (EF-Tu). Dicht platen af met een ademende plaatafdichting. Incubeer de kweekplaat in een plaatschudder bij 1.000 tpm 37 °C gedurende 14 uur.
    7. Voeg 1 ml geënte cultuur uit buis #25 toe aan 10 ml LB in een conische buis van 50 ml om de EF-Tu-startercultuur te bereiden. Incubeer de buis in een broedmachine bij 260 RPM, 37 °C gedurende 14 uur.
      OPMERKING: Stam #25, EF-Tu, is nodig in een veel hogere concentratie dan de andere componenten en wordt daarom afzonderlijk verwerkt, zoals beschreven in het oorspronkelijke protocol8.
    8. Plaats 2 L steriel 2x YTP media in een glazen fles van 2 L en plaats in een statische incubator bij 37°C om een nacht voor te verwarmen.
  2. Dag 2: groei en pelleteren
    1. Bereid de benodigde reagentia voor:
      1. 2 L steriel voorverwarmd 2x YTP media (vanaf dag 1)
      2. 2 ml 100 mg/ml ampicilline
      3. 100 mM IPTG, steriel
      4. 100 ml PBS, steriel, ijskoud
      5. 10 ml LB media
    2. Breng 30 μl van elke startercultuur over van de startplaat voor diepe putjes en de EF-Tu-startbuis op de bodem van een optische plaat met 96 putjes, met behulp van een meerkanaals pipet.
    3. Voeg 270 μL LB-media toe aan elk putje met culturen, om een 10x verdunning van elke cultuur te bereiken.
    4. Meet de OD600 van elke cultuur met behulp van een plaatlezer. Alle stammen moeten een OD600 = 2-3 hebben.
      OPMERKING: Als een cultuur boven OD600 = 3 is overwoekerd, verdun dan tot OD600 = 3 met behulp van 2x YTP+AMP (aanvullende tabel S1). Het verdunnen van overwoekerde starters kan tijdrovend en foutgevoelig zijn. Daarom is het raadzaam om de exacte incubatietijd vast te stellen die nodig is om OD600 2-3 te bereiken, zoals beschreven in hoofdstuk 1.3 van de voorbereidende werkzaamheden.
    5. Breng 500 ml voorverwarmde 2x YTP-media en 500 μl 100 mg/ml ampicilline over in een steriele kolf van 2,5 l met schotten (2x YTP+AMP).
    6. Voeg in een enkele steriele conische buis van 15 ml 55 μl van elke cultuur van de startercultuurplaat en 1675 μl van de EF-Tu-cultuur toe. Meng goed door vortex.
      LET OP: Dit is de OnePot-cultuur die alle PURE-soorten combineert. Het is in dit stadium dat knock-out (ΔPURE) systemen kunnen worden gecreëerd door sommige stammen weg te laten, of andere componenten die co-zuivering vereisen, kunnen worden toegevoegd.
    7. Voeg de inhoud van deze tube toe aan de 2,5 L baffled flask met daarin 500 ml 2x YTP+AMP. Herhaal stap 5-7 om 4x onafhankelijke culturen te verkrijgen.
    8. Incubeer de kolven bij 260 tpm 37 °C gedurende 1,5-2 uur tot OD600 = 0,2-0,3.
    9. Zodra OD600 = 0,2-0,3 is bereikt, inoculeert u elke kolf met 500 μl 100 mM IPTG, voor een uiteindelijke inductieconcentratie van 0,1 mM IPTG.
    10. Incubeer de culturen nog 3 uur bij 260 RPM, 37 °C.
    11. Weeg en label tijdens de incubatie vier steriele conische buisjes van 50 ml.
    12. Koel centrifuges indien nodig voor tot 4 °C en etiketteer en koel vier polypropyleen copolymeer centrifugeflessen voor.
    13. Plaats vier geëtiketteerde glazen flessen van 500 ml in een ijswaterbad.
    14. Aan het einde van de 3 uur durende incubatie, decanteer je elke cultuur voorzichtig in een glazen fles op ijs om de groei te beëindigen.
      OPMERKING: Het overbrengen van culturen in gekoelde flessen is essentieel om de groei snel te stoppen: het rechtstreeks in het ijswaterbad plaatsen van warme kolven zal niet leiden tot een efficiënte beëindiging van de groei. Alle volgende stappen worden op ijs uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
    15. Voeg 250 ml van elke cultuur toe aan de bijbehorende centrifugeflessen en centrifugeer bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten, terwijl u de andere 250 ml in het ijswaterbad houdt.
    16. Decanteer het bovenstaande voorzichtig en dep het droog op keukenpapier.
    17. Voeg de resterende 250 ml van elke cultuur toe aan de bijbehorende centrifugeflessen en centrifugeer opnieuw bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten.
    18. Decanteer het bovenstaande voorzichtig en dep het droog op keukenpapier.
    19. Voeg 20 ml steriel ijskoud PBS toe aan elke centrifugefles en suspendeer de celpellet grondig.
    20. Breng elke resuspensie over in de voorbereide conische buisjes van 50 ml.
    21. Centrifugeer de buisjes 8 minuten bij 2.000 × g, 4 °C.
    22. Verwijder het bovenstaande door voorzichtig te decanteren.
    23. Centrifugeer de buisjes opnieuw bij 2.000 × g, 4 °C, gedurende 2 min.
    24. Verwijder achtergebleven supernatans door te pipetteren en bewaar de celpellets op ijs.
    25. Elke tube bevat nu de celpellet van een enkele cultuur van 500 ml. Weeg elke buis, bereken de massa van de celpellets (meestal ~2 g) door het lege gewicht van elke buis af te trekken en noteer.
    26. Vriescelpellets snel in en bewaar ze bij -80 °C tot lysis.
      OPMERKING: Optioneel kan het protocol in 3 dagen worden voltooid door op dit punt direct door te gaan naar de lysisstap.
  3. Dag 3: lyse, zuivering en dialyse
    1. Bereid de benodigde reagentia voor:
      1. Bereid 50 ml resuspensiebuffer voor.
      2. Bereid 0,5 m TCEP.
    2. Ontdooi de celpellets op ijs.
    3. Breng 50 ml resuspensiebuffer in een conische buis van 50 ml en voeg 100 μl 0,5 M TCEP toe. Meng goed door vortex.
    4. Resuspendeer celpellets in Resuspend Buffer + TCEP in een verhouding van 2 ml per 1 g celpellet. Vortex grondig om te resuspen.
    5. Verdeel de celresuspensie over conische buisjes van 50 ml, zodat elke buis 5 ml suspensie heeft. Label de tubes zoals vereist om de 4 onafhankelijke culturen bij te houden. Bewaar op ijs.
    6. Lyseer cellen via sonicatie met een amplitude van 30%, 20s aan, 20s uit, gedurende 10 cycli in een ijswaterbad met behulp van een gekoelde sonicatiesonde (Figuur 3A,B).
      OPMERKING: Tijdens de sonicatie moet ongeveer 1000 J energie in elke buis worden overgebracht. Gebruik een beveiligde standaard om de buis op zijn plaats te houden tijdens sonicatie om een consistente energieoverdracht te garanderen.
    7. Verdeel het lysaat over steriele microcentrifugebuisjes van 2 ml, zodat elk buisje 1 ml lysaat bevat. Herhaal stap 2.3.6 en 2.3.7 om alle vier de culturen te lyseren. De volgende stappen worden parallel uitgevoerd voor 4 lysaten.
    8. Centrifugeer bij 15.923 × g, 4 °C, gedurende 20 min.
    9. Was en breng tijdens het centrifugeren 5 ml eiwitzuiveringshars in evenwicht (bereid vier kolommen voor op de vier lysaten):
      1. Voeg 2 ml verse eiwitzuiveringshars toe aan een zwaartekrachtchromatografiekolom.
      2. Was de kolom twee keer met 30 ml steriel gedestilleerd water om opslagethanol te verwijderen.
      3. Vul 30 ml resuspensiebuffer aan met 60 μl 0,5 M TCEP tot een eindconcentratie van 1 mM.
      4. Aangezien de kolom een volume van 30 ml heeft, giet u buffers rechtstreeks in de kolom om deze te vullen. Zorg ervoor dat de klep gesloten is, breng de kolom in evenwicht door 30 ml resuspensiebuffer + TCEP toe te voegen.
      5. Open de klep om ~25 ml buffer door te laten stromen, voordat u de kolomklep sluit, waarbij u ~5 ml buffer boven het harsbed laat om uitdroging te voorkomen. De zuil is nu klaar voor gebruik.
    10. Meng na het centrifugeren alle geklaarde pelletvrije supernatans van elke cultuur in 4x verse conische buisjes van 50 ml op ijs.
    11. Resuspendeer de hars in de resterende 5 ml resuspensiebuffer + TCEP in elke kolom en voeg buffer en hars toe aan elk van de conische buisjes die het lysaatsupernatant bevatten.
    12. Sluit het deksel en sluit het af met Parafilm en incubeer in een rotisserie-shaker bij 4 °C gedurende 5 uur.
      OPMERKING: Als de lysis onmiddellijk na de groei is uitgevoerd, kan dit lysaat een nacht met hars worden geïncubeerd.
    13. Bereid de benodigde reagentia voor:
      1. Voeg TCEP in een eindconcentratie van 1 mM toe aan was- en elutiebuffers en bewaar tot gebruik bij 4 °C.
      2. Houd 20% (v/v) ethanol bij de hand.
    14. Pulseer de buizen na de incubatie kort in een centrifuge om de hars naar de bodem van de buis te verzamelen.
    15. Resuspendeer de hars met een pipet en voeg de hars weer toe aan de eiwitzuiveringskolom.
    16. Zodra de hars zich in een bed aan de onderkant van de kolom heeft genesteld, laat u de buffer erdoorheen lopen.
      OPMERKING: Verzamel optioneel doorstroming en wasbeurten tijdens de eiwitzuivering voor analyse via SDS-PAGE om problemen met de zuiveringsprocedure op te lossen
    17. Waskolom met één kolomvolume van Wash Buffer + TCEP.
    18. Voeg 5 ml Elution Buffer + TCEP toe aan de kolom, suspendeer de hars een paar keer met een pipet en incubeer gedurende 10 minuten.
    19. Verzamel na de incubatie de elutie in een geëtiketteerde bijoux-tube van 5 ml en bewaar deze op ijs.
    20. Reinig en bewaar de eiwitzuiveringshars:
      1. Nadat de elutie is voltooid, wast u de kolom met 30 ml elutiebuffer om eventuele resterende gebonden eiwitten te verwijderen.
      2. Spoel de hars af met 30 ml steriel gedestilleerd water, 3x herhaald.
      3. Laat eenmaal 30 ml 20% (v/v) ethanol door de kolom lopen.
      4. Vul de kolom met 20% ethanol en sluit af met een deksel of parafilm. Tot het volgende gebruik bewaren bij 4 °C.
        OPMERKING: Alleen reiniging is vereist - probeer het nikkel niet van de hars te verwijderen. Gereinigde hars is geschikt voor hergebruik in standaard PURE-systeempreparaten; gebruik echter voor ΔPURE-systeemvarianten altijd verse hars om kruisbesmetting te voorkomen.
    21. Week een dialysecassette van 15 ml 2 kDa gedurende 10 minuten in Buffer HT (zonder TCEP).
    22. Voeg 5 ml geëlueerde eiwitoplossing toe aan de dialysecassette.
    23. Verwijder zoveel mogelijk lucht uit de cassette voordat u het deksel er weer op plaatst.
    24. Dialyseer 5 ml geëlueerd eiwit tegen 1 l Buffer HT (zonder TCEP) gedurende 2 uur, gevolgd door nog eens 1 L verse Buffer HT 's nachts bij 4 °C onder voorzichtig roeren.
      OPMERKING: Als eluties van meerdere zuiveringen worden gecombineerd, kan tot 10 ml elutie worden gedialyseerd tegen 2 L Buffer HT gedurende 2 uur, gevolgd door nog eens 2 L Buffer HT 's nachts bij 4 °C. Als de harsincubatie 's nachts is uitgevoerd, kan de dialyse overdag worden uitgevoerd met behulp van een protocol van 2 uur gevolgd door 4 uur, onmiddellijk gevolgd door de onderstaande stappen voor eiwitconcentratie.
  4. Dag 4: concentratie en opslag
    1. Bereiding van de benodigde reagentia:
      1. Bereid Buffer HT Refresh + TCEP voor.
      2. Bereid Stock-60 + TCEP voor.
    2. Na voltooiing van de dialyse wordt 5 ml van het gedialyseerde monster uit de cassette verwijderd en 500 μl aliquots in 5 x 2 ml steriele microcentrifugebuisjes verdeeld.
    3. Draai om de neergeslagen eiwitten te pelleteren bij 14.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten.
    4. Combineer het pelletvrije supernatans opnieuw en voeg toe aan een MWCO-centrifugaalfiltereenheid van 3 kDa en vul het volume bij met 10 ml Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Centrifugeer bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 30 minuten OF totdat het monstervolume is teruggebracht tot 1,5 ml.
      OPMERKING: Eiwitneerslag tijdens concentratiestappen kan de algehele CFPS-prestaties aanzienlijk verminderen. Gebruik na elke centrifugatiecyclus van 30 minuten een pipet van 1 ml om het monster in de centrifugaalfilterbuis opnieuw te suspenderen om eventuele neergeslagen eiwitten van de bodem van het filter los te maken.
    6. Verwijder het monster uit de centrifugaaleenheid en verdeel 500 μL aliquots in 3 x 2 ml steriele microcentrifugebuisjes.
    7. Draai om de neergeslagen eiwitten te pelleteren bij 14.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten.
    8. Combineer het pelletvrije supernatans opnieuw in een verse steriele microcentrifugebuis op ijs.
    9. Bepaal de concentratie van eiwitten in oplossing met behulp van een Bradford-test, volgens de instructies van de fabrikant.
    10. Concentraat de eiwitoplossing door deze toe te voegen aan een vers MWCO-filter van 3 kDa en te centrifugeren bij 14.862 × g, 4 °C, gedurende 15 minuten OF totdat het monstervolume is bereikt om een eindconcentratie van 25-30 mg/ml te verkrijgen.
    11. Verwijder het monster uit de centrifugaaleenheid en verdeel 500 μL aliquots in steriele microcentrifugebuisjes van 2 ml.
    12. Draai om de neergeslagen eiwitten te pelleteren bij 14.000 × g, 4 °C, gedurende 10 minuten.
    13. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test. Ga pas verder met de volgende stap als de concentratie tussen 25 en 30 mg/ml ligt.
    14. Combineer het pelletvrije supernatans opnieuw in een verse microcentrifugebuis op ijs.
    15. Voeg een gelijke hoeveelheid Stock-60 + TCEP toe aan de geconcentreerde eiwitoplossing en meng door voorzichtig te pipetteren.
    16. Bepaal de uiteindelijke eiwitconcentratie met behulp van een Bradford-test.
      OPMERKING: Het eiwit zit nu in Buffer HT + 30% glycerol en elke extra verdunning met Stock-30 verandert de glycerolconcentratie niet.
    17. Verdun het monster indien nodig met Stock-30 + TCEP om een eindconcentratie van ongeveer 12,5 mg/ml te bereiken.
    18. Aliquot PURE eiwitoplossing in PCR-buisjes bij 20 μL aliquots, snel invriezen in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de eiwitconcentratie nauwkeurig te bepalen voordat u Stock-60 toevoegt, aangezien het concentreren van eiwitoplossingen die glycerol bevatten, kan resulteren in inconsistente CFPS-prestaties als gevolg van variabele hoeveelheden glycerol in de uiteindelijke CFPS-reactie. Stock-60 mag daarom alleen worden toegevoegd nadat is bevestigd dat de eiwitconcentratie binnen het optimale bereik van 25-30 mg/ml ligt.

3. Ruwe ribosoombereiding (5 dagen)

OPMERKING: Het zuiveringsprotocol voor ribosomen is geoptimaliseerd voor de verwerking van 2 L (4 x 500 ml kolven) vloeibare cultuur, wat leidt tot een totaal van ~3 g celpellet en het opleveren van ~1 ml ruwe ribosomen bij een concentratie van 15-24 μM.

  1. Dag 1: bereiding en groei van starterculturen
    1. Bereid voorraadoplossingen en buffers voor de bereiding van het ribosoom voor, zoals beschreven in aanvullende tabel S2 en aanvullende figuur S1.
      OPMERKING: bereid de relevante media en buffers voor die onmiddellijk voorafgaand aan de uitvoering van elk deel van het protocol vereist zijn en bewaar deze alleen gedurende het maximale aantal dagen voor gebruik zoals aangegeven.
    2. Bereid twee conische buizen van 50 ml voor: voeg 10 ml LB-media toe aan de ene buis en 5 ml LB-media aan de andere.
    3. Verwijder de glycerolvoorraad van BL21(DE3) uit de vriezer van -80 °C en plaats deze op ijs, zorg ervoor dat de volgende stappen zijn voltooid voordat de bouillon ontdooit.
    4. Inoculeer de 10 ml LB-media met een schraping van de cellen uit de glycerolvoorraad, om een LB 'minicultuur' te creëren. Incubeer bij 37 °C, 220 RPM, samen met de andere (niet-geënte) buis om te controleren op mediabesmetting, aangezien alle gezwellen zonder antibiotica worden gedaan.
    5. Vervang de glycerolbouillon terug in de vriezer van -80 °C.
    6. Doe 2,2 l steriele Terrific Broth (TB) in steriele glazen flessen en bewaar in een statische broedmachine bij 37 °C om een nacht voor te verwarmen.
  2. Dag 2: groei en pelleteren
    1. Verwijder culturen uit de incubator en zorg ervoor dat er geen verontreiniging is in de niet-geënte buis of voorverwarmde mediafles voordat u verder gaat.
    2. Bereid een 10-voudige verdunning voor door 100 μL van de minicultuurcultuur toe te voegen aan 900 μL LB in een cuvet van 1 cm en meet de OD600 met behulp van een spectrofotometer (controleer of het ~4-6 is).
    3. Voeg 200 ml van de voorverwarmde TB toe aan een steriele erlenmeyer van 500 ml en inoculeer met de juiste hoeveelheid minicultuur om een start-ODvan 600 = 0,05 te verkrijgen (aanvullende tabel S1). Dit is de 'midi-cultuur'.
    4. Incubeer de midi-cultuur bij 37 °C, 220 RPM tot OD600 = 1, wat ongeveer 1,5-2 uur duurt.
    5. Voeg 500 ml TB toe aan elk van de 4 steriele kolven van 2,5 l met schotten. Inoculeer elk van deze stoffen met een geschikte hoeveelheid midicultuur om een start-OD600 = 0,05 te verkrijgen (aanvullende tabel S1). Dit zijn de 4 'maxi-culturen'.
    6. Incubeer de maxi-culturen bij 37 °C, 220 RPM tot OD600 = 0,7-0,8, wat ongeveer 1,5-2 uur duurt.
    7. Etiketeer en plaats in de tussentijd vier schone polypropyleen copolymeer centrifugeflessen en 4 schone glazen flessen van 500 ml op ijs om af te koelen.
      OPMERKING: Meet de maxi-cultuurdichtheid elke 15 minuten na 1 uur groei om overschrijding van OD600 = 0,7 te voorkomen.
    8. Zodra OD600 = 0,7 is bereikt, brengt u de culturen snel over in gekoelde glazen flessen en plaatst u deze 20 minuten in een ijswaterbad om de groei te beëindigen.
      OPMERKING: Het overbrengen van culturen in gekoelde flessen is essentieel om de groei snel te stoppen: het rechtstreeks in het ijswaterbad plaatsen van kolven zal niet resulteren in een efficiënte beëindiging van de groei. Alle volgende stappen worden op ijs uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
    9. Terwijl de culturen afkoelen in het ijswaterbad, koelt u de centrifuge voor het pelleteren van de cellen voor en plaatst u 500 ml PBS-oplossing op ijs om af te koelen.
    10. Breng na 20 minuten 250 ml van elke cultuur over in de bijbehorende voorgekoelde centrifugefles en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.220 × g, 4 °C, terwijl u de andere 250 ml op ijs houdt.
    11. Decanteer het bovenstaande voorzichtig en dep het droog op keukenpapier.
    12. Voeg de resterende 250 ml van elke cultuur toe aan de bijbehorende centrifugefles en centrifugeer opnieuw bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 min.
    13. Verwijder het bovenstaande door te decanteren en dep de flessen droog op keukenpapier voordat u de celpellets weer op ijs plaatst.
    14. Voeg 30 ml steriel ijskoud PBS toe aan elke centrifugefles en suspendeer de celpellet grondig.
    15. Weeg en label 4x schone 50 ml conische buisjes.
    16. Breng de celsuspensie over in de conische buizen van 4 x 50 ml.
    17. Centrifugeer opnieuw bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 min.
    18. Verwijder het bovenstaande door decanteren en dep de buisjes droog op keukenpapier voordat u de celpellets weer op ijs plaatst.
    19. Voeg 30 ml steriel ijskoud PBS toe aan elke conische buis en suspendeer de celpellet grondig door middel van vortexing.
    20. Centrifugeer opnieuw bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 min.
    21. Verwijder het bovenstaande door decanteren en dep de buisjes droog op keukenpapier voordat u de celpellets weer op ijs plaatst.
    22. Voeg 30 ml steriel ijskoud PBS toe aan elke conische buis en suspendeer de celpellet grondig door middel van vortexing.
    23. Centrifugeer opnieuw bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 10 min.
    24. Verwijder het bovenstaande middel door te decanteren en dep de flessen droog op keukenpapier voordat u de celpellets weer op ijs legt.
    25. Centrifugeer een laatste keer bij 3.220 × g, 4 °C, gedurende 2 min.
    26. Verwijder overtollig supernatans door te pipetteren.
    27. Weeg en noteer de massa van elke conische buis. De massa van de celpellets is het verschil tussen deze waarden en het leeggewicht van de buisjes (moet ~1 g zijn).
    28. Vriescelpellets snel in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C.
  3. Dag 3: lysis, ultracentrifugatie en Buffer B weken
    1. Ontdooi de celpellets op ijs.
    2. Voeg 50 ml Ribosome Buffer A toe aan een schone conische buis.
    3. Neem 100 μL Ribosome Buffer A uit de conische tube en voeg toe aan een injectieflacon met No-Weigh DTT. Los de DTT-pellet volledig op om een DTT-voorraad van 0,5 M te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereid de volgende 0,5 M DTT-voorraden voor zoals hier beschreven, maar gebruik de juiste buffer voor elke stap.
    4. Voeg 100 μL 0,5 M DTT weer toe aan de 50 ml conische buis om een uiteindelijke concentratie van 1 mM DTT te verkrijgen in 50 ml ribosoombuffer A. Bewaar de oplossing op ijs.
    5. Resuspendeer elke celpellet in Ribosoom Buffer A + DTT, in een verhouding van 2 ml per 1 g celpellet, door grondig te vortexen. Combineer alle geresuspendeerde cellen in één conische buis om het totale volume van de geresuspendeerde slurry te controleren, dat 10 ml van 2 l cultuur moet zijn. Vul indien nodig het volume bij tot 10 ml met extra Ribosome Buffer A + DTT.
    6. Verdeel de slurry in 2 x 5 ml monsters in afzonderlijke conische buisjes.
    7. Lyseer de cellen in elke buis via sonicatie met een amplitude van 30%, 20 s aan, 20 s uit gedurende 10 cycli (3 min 20 s totale programmaduur), in een ijswaterbad, met behulp van een gekoelde sonicatiesonde (Figuur 3A, 3C).
      OPMERKING: Tijdens sonicatie moet ongeveer 1.000 J energie per buis worden overgedragen. Gebruik een beveiligde standaard om de buis op zijn plaats te houden tijdens sonicatie om een consistente energieoverdracht te garanderen.
    8. Vul het volume van elk gelyseerd monster bij tot 25 ml met ribosoombuffer A + DTT en vortex kort om te mengen.
    9. Breng de inhoud over naar 2x gekoelde S30 centrifugatiebuisjes.
    10. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 30.000 × g bij 4 °C (figuur 3E).
    11. Win maximaal 75% van het pelletvrije supernatans terug (om membraanverontreiniging door de pellet te voorkomen) uit elke S30-buis in twee schone voorgekoelde S30-buizen.
    12. Centrifugeer 30 minuten bij 30.000 × g bij 4 °C.
    13. Win maximaal 75% van het pelletvrije supernatans terug in twee schone conische buizen van 50 ml en vul het volume van elk bij tot 25 ml met Ribosome Buffer A + DTT.
    14. Breng het monster over in twee schone, voorgekoelde S100 tubes.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de buizen nauwkeurig zijn uitgebalanceerd (max. 0.01 g verschil tussen tegenoverliggende buizen) voorafgaand aan ultracentrifugatie en gevuld zijn tot een volume van 25 ml (maximale capaciteit van S100-buis).
    15. Centrifugeer bij 100.000 × g gedurende 4 uur bij 4 °C (Figuur 3F).
    16. Bereid dertig minuten voor het einde van de S100-run een 0.5 M DTT-voorraad voor met ijskoude Ribosoombuffer B volgens de bovenstaande instructies, en genereer een eindoplossing van 1 mM DTT in 50 ml Ribosoombuffer B.
    17. Verwijder het bovenstaande uit de ultracentrifugebuisjes door te decanteren. Voeg 5 ml ijskoude Ribosome Buffer B + DTT toe aan elke S100 tube met ribosomale pellet. Bewaar de resterende Ribosoom Buffer B + DTT bij 4 °C voor gebruik de volgende dag.
    18. Incubeer buizen op ijs in een koude ruimte om de ribosoomkorrel een nacht te laten weken in Ribosome Buffer B + DTT.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de ribosoompellet volledig is ondergedompeld in Ribosoom Buffer B + DTT. Dit kan worden bereikt door buizen onder een hoek in ijs te plaatsen (Figuur 3D).
  4. Dag 4: ultracentrifugatie en Buffer C soak
    1. Voeg de volgende dag nog eens 5 ml ijskoude Ribosome Buffer B + DTT toe aan elke S100-tube met de ribosoompellet die een nacht is geweekt.
    2. Probeer de pellet voorzichtig opnieuw te suspen door te pipetteren. Gebruik de pipetpunt om de pellet van de wand van de buis te schrapen en op deze manier opnieuw te suspenderen. Breng de inhoud over in twee schone, voorgekoelde S30-buizen.
    3. Voeg nog eens 10 ml ijskoude Ribosoombuffer B + DTT toe aan elke S100-tube met de ribosoompellet en herhaal de resuspensiestappen zoals hierboven.
    4. Sorteer de resuspensie in dezelfde S30-buis als voorheen.
    5. Centrifugeer bij 30.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C (Figuur 3G).
    6. Win maximaal 75% van het pelletvrije supernatans terug in twee schone conische buizen van 50 ml en vul het volume bij tot 25 ml met Ribosome Buffer B + DTT.
    7. Breng dit monster over in twee schone, voorgekoelde S100-buizen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de buizen nauwkeurig zijn uitgebalanceerd voorafgaand aan ultracentrifugatie en zijn gevuld tot een volume van 25 ml (maximale capaciteit van de S100-buis).
    8. Centrifugeer bij 100.000 g × g gedurende 4 uur bij 4 °C (figuur 3H).
    9. Bereid dertig minuten voor het einde van de S100-run een 0.5 M DTT-bouillon met ijskoude Ribosome Buffer C volgens de bovenstaande instructies, en genereer een eindoplossing van 1 mM DTT in 5 ml Ribosome Buffer C. Bewaar deze buffer op ijs.
    10. Gooi na ultracentrifugatie het bovenstaande weg en verwijder de resterende buffer door pipetteren. Werk snel om te voorkomen dat de pellet te lang onbedekt blijft door de buffer.
    11. Voeg 400 μL ijskoude Ribosome Buffer C + DTT toe aan elke ultracentrifugebuis met ribosomale pellet.
    12. Incubeer buisjes op ijs in een koude ruimte om de ribosoomkorrel een nacht te laten weken in Ribosome Buffer C + DTT.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de ribosoompellet volledig is ondergedompeld in Ribosoom Buffer C + DTT. Dit kan worden bereikt door buizen onder een hoek in ijs te plaatsen.
  5. Dag 5: afhaling
    1. Resuspendeer de ribosoompellet de volgende dag voorzichtig met behulp van een pipet van 1 ml en door zachtjes ronddraaien om de heldere halo-ribosoompellet volledig op te lossen.
      OPMERKING: De ribosoompellet moet in dit stadium volledig oplossen in de buffer: er mag op dit punt geen onoplosbare pellet zijn, maar als er een gele onoplosbare pellet achterblijft, probeer deze dan niet opnieuw te suspenderen: suspendeer alleen de heldere halo-ribosoompellet.
    2. Breng de ribosoomoplossing over in twee steriele microcentrifugebuisjes van 2 ml en centrifugeer bij 20.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 20.000 g om het resterende onoplosbare materiaal te pelleteren.
    3. Verzamel het pelletvrije supernatans in een schone buis en bewaar het op ijs (Figuur 3I).
    4. Creëer een 100x verdunning van de ribosoomoplossing door 2 μL toe te voegen aan 198 μL Ribosoom Buffer C, in drievoud.
    5. Meet de concentratie van RNA bij 260 nm; 10 extinctie-eenheden van het verdunde monster komt overeen met 24 μM ribosomen13.
    6. Aliquot ribosoomoplossingen (bijv. in aliquots van 50 μl, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker), snel invriezen in vloeibare stikstof met een maximale concentratie van 24 μM en bewaren bij -80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Het protocol moet leiden tot ongeveer 1 ml ribosomen met een concentratie van 12-18 μM. Als de ribosomen te verdund zijn, kan de concentratie worden bereikt met behulp van een MWCO-filter van 3 kDa8.

4. CFPS-experimenten opzetten

  1. Voorbereidend werk
    1. Bereid de DNA-sjabloon (lineair of plasmide) voor volgens vastgestelde protocollen9.
      OPMERKING: In ons lab gebruiken we DNA-sjablonen op basis van het T7p14-expressiesysteem dat is geoptimaliseerd voor celvrije expressie14. Gezuiverde PCR-producten kunnen worden gebruikt als lineaire sjablonen. Het is belangrijk op te merken dat plasmiden na miniprep moeten worden opgeruimd en dat verschillende commerciële kits verschillende resultaten opleveren15.
    2. Bereid 5x energieoplossing voor zoals beschreven in tabel 3.
    3. Bereid 6x matrixoplossing zoals beschreven in tabel 4.
  2. Instellen en monitoren van een PURE-reactie
    OPMERKING: Dit protocol beschrijft de instelling van een drievoudige meting met behulp van een mastermix. Het aantal reacties kan naar wens worden opgeschaald of verkleind met behulp van de spreadsheet in aanvullende tabel S3, maar we raden een minimum aan drievoudige herhalingen aan voor een enkele experimentele conditie.
    1. Voor dooi waren aliquots van PURE, ribosomen, energieoplossing en matrixoplossing op ijs nodig.
    2. Bereid een basismengsel voor een enkele set drievoudige reacties in een PCR-buisje van in totaal 17 μl, zoals weergegeven in tabel 5, door de componenten in de volgende volgorde samen te stellen: energieoplossing, PURE eiwitten, ribosomen, matrixoplossing, nucleasevrij water tot 17 μl.
    3. Stel de pipet in op 5.1 μL en zuig de oplossing 5-6 keer voorzichtig op om te mengen, zodat homogeniteit wordt gegarandeerd.
    4. Laad het mastermengsel met dezelfde pipetinstelling (5,1 μl) in drie afzonderlijke putjes van een optische plaat met 384 putjes. Duw de pipet niet voorbij de eerste stop om luchtbelvorming te voorkomen. Laat één putje ruimte tussen elke replicaat om fluorescentieoverspraak te minimaliseren.
    5. Sluit de plaat af met een zelfklevende plaatafdichting.
    6. Ga indien nodig verder met stroomafwaartse incubatie- of plaatlezermetingen.
      OPMERKING: Wanneer u extra componenten bevat die glycerol bevatten (bijv. Enhancer-eiwitten), zorg er dan voor dat het uiteindelijke volume van dergelijke componenten niet groter is dan 10% van het reactievolume. Een component met 30% glycerol moet bijvoorbeeld worden beperkt tot 1,7 μL per 17 μL mastermix.
      Centrifugeer de plaat met 384 putjes niet na het laden. Centrifugatie kan leiden tot scheiding van glycerolrijke componenten (bijv. het PURE-systeem), wat resulteert in inconsistente expressieniveaus. Het plaatontwerp ondersteunt reacties met een klein volume en zorgvuldig pipetteren zorgt voor voldoende bezinking zonder centrifugatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De workflow voor de PURE- en ribosoompreparaten wordt weergegeven in figuur 1 en een aanbevolen tijdschema voor het werk wordt weergegeven in tabel 1. Doorgaans worden reacties gecontroleerd door de productie van fluorescerende eiwitten zoals GFP of mCherry, en RFU-metingen kunnen worden omgezet in concentraties door kalibratie11. De opbrengst van CFPS is echter afhankelijk van het spe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een gedetailleerde procedure gepresenteerd die ons in staat heeft gesteld om reproduceerbare PURE-systemen te verkrijgen over meerdere batches en gebruikers in hetzelfde laboratorium. Er zijn een aantal cruciale stappen nodig om dit te bereiken.

De eerste belangrijke stap is het waarborgen van de integriteit van de 36 PURE-stammen: naast het sequencen van alle plasmiden, is het essentieel om een expressieproef uit te voeren om te controleren of alle ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

SL is mede-oprichter en CTO van Biophoundry Inc., dat celvrije technologie ontwikkelt voor faagengineering.

Dankbetuigingen

NL, SL, AB en NZ worden ondersteund door NL's UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1). SL wordt bovendien ondersteund door Biophoundry Inc. SY wordt ondersteund door een Darwin Trust PhD-studentschap van de Universiteit van Edinburgh. CW wordt ondersteund door een BBSRC Eastbio PhD-studentschap. De auteurs danken A. Pompa voor zijn hulp bij het gebruik van de ultracentrifuge, die werd ondersteund door financiering van het Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Daarnaast danken wij B. Lavickova en S. J. Maerkl voor hun hulp bij het opzetten van het originele OnePot-protocol. Met het oog op open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending. Figuur 1 is gedeeltelijk gemaakt in BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2x YTSigmaY2377-250G
amino acidsSigmaLAA21-1KT
ammonium acetate RNAse-freeThermo ScientificAM9070G
ammonium chlorideSigma09718-1KG
ampicillinSigmaA8351-5G
BL21(DE3) competent E. coliNEBC2527H
bottle, centrifuge (Nalgene)Thermo Scientific3120-9500polypropyleen copolymeer fles
bottle, glass (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Bradford assay, Quick Start 1x Dye ReagentBio-Rad5000205
centrifugeThermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
centrifuge, microEppendorf5424R 
chromatography columnBio-Rad7321010
creatine phosphateSigma27920
cuvettes, semi micro 1.6 mLFisherbrandFB55147
di-sodium hydrogen orthophophosphate dihydrateFisher ChemicalS/4450/60
dialysis cassette, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mLThermo ScientificA52962
dipotassium hydrogen orthophosphate anhydrousFisher ChemicalP/5240/60
DTT No-WeighThermo ScientificA39255
filter unit, centrifugal 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
flask, 500 mLVWR214-1133
flask, baffled 2.5 L TunairSS-5013
folinic acidSigmaF7878-100MG
glycerolSigmaG5516-1L
HClFisherbrandH/1200/PB17
HEPES buffer, 1 M solution pH 7.3Thermo ScientificBP299
imidazoleSigmaI2399-500G
incubatorEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermo ScientificR0392
KOH pelletsThermo ScientificP1767-500G
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrateSigma49605-250G
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrateSigma49601-500G
magnesium acetate tetrahydrateSigmaM5661-50G
magnesium chlorideFluka63020-1L
magnetic stirring setupStuartUS152
NanodropThermo ScientificNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Mag BeadsNEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipette, multichannel Eppendorf Research Plus 30-300 µLEppendorf3125000052
plate adhesive seal for plate readerExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Sterile)
plate breathable sealStarlabE2796-3005
plate foil sealExcelScientificFCS-25
plate readerBioTekSynergy H1
plate shakerAllshengMBI100-4A
plate, 384 wellThermo Scientific242764
plate, 96 deep well 1 mLThermo Scientific736-0601
plate, 96 deep well 2 mLSarstedt82.1972.002
plate, 96 well PCRSarstedt721,978
plate, optical 96 wellThermo Scientific10057581
potassium chlorideSigmaP5405-500G
potassium dihydrogen orthophosphateFisher ChemicalP/4800/53
protein extraction (BugBuster) reagentEMD Millipore70584-3
protein purification resin (cOmplete)Roche5893682001
rotisserie shakerStarlabRM-Multi 1
sodium chlorideFisher ChemicalS/3105/70
sonication probe, FisherBrand 15-50 mLThermo Scientific12931181
sonicatorFisher ScientificFB120
spectrophotometerJenwayGenova Plus
spermidineSigmaS2626-1G
TCEP 0.5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris bufferedThermo ScientificR1481
tRNA from E. coli MRE600Roche10109541001
tryptoneFormediumTRP02
tube, 0.2 mL PCR gradeSarstedt72,737,002
tube, bijoux Sterilin 7 mL polystyreneThermo Scientific129A
tube, conical (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tube, conical (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tube, microcentrifuge (Eppendorf) 1.5 mLSarstedt72.690.001
tube, microcentrifuge (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
tube, S100 centrifugation Beckman-Coulter355619
tube, S30 centrifugation Thermo Scientific3118-0050
ultracentrifugeBeckman-CoulterOptima XPN-100
ultracentrifuge rotorBeckman-Coulter70Ti fixed angle rotor
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water

Referenties

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

PURE-systeemribosoompreparatiesynthetische biologieultracentrifugatieGFP-fluorescentienormalisatie van de optische dichtheidglycerolconcentratieeiwitexpressie
Verfijning van de productie van OnePot PURE en ruwe ribosomen voor reproduceerbare celvrije eiwitsynthese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.