Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Expressie, klinische betekenis en rol bij de evaluatie van de werkzaamheid van immunotherapie van het co-stimulerende molecuul LLT1 bij maagkanker

619 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68827

⸱

10 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

In dit artikel

Samenvatting

Dit onderzoek onderzoekt LLT1 als een voorspellende biomarker voor immunotherapie bij maagkanker door middel van multi-omics en klinische analyses. De studie evalueert de rol van LLT1 bij immuunontwijking en modulatie van de micro-omgeving van tumoren om precisie-immunotherapiebenaderingen te vergemakkelijken voor verbeterde behandelingsresultaten.

Samenvatting

LLT1 is een nieuw immuuncheckpointmolecuul en een potentieel therapeutisch doelwit. Immunotherapie heeft de resultaten bij gevorderde maagkanker verbeterd; Veel patiënten reageren echter niet of ontwikkelen resistentie, en voorspellende biomarkers ontbreken. De rol van LLT1 bij het ontwijken van het immuunsysteem van maagkanker en het effect ervan op de respons op immunotherapie blijven onduidelijk. Om dit te beoordelen, werd LLT1-expressie geanalyseerd in de Cancer Genome Atlas (TCGA) maagadenocarcinoom-dataset met behulp van meerdere algoritmen (TIMER, CIBERSORT en ESTIMATE) om de infiltratie van immuuncellen te kwantificeren. Eiwitexpressie werd gevalideerd door immunohistochemie (IHC) in 268 maagadenocarcinoommonsters en door multipleximmunofluorescentie (MIF) in 115 weefsels na immunotherapie. Geïntegreerde transcriptomische en proteomische gegevens werden geanalyseerd op associaties met kenmerken van de micro-omgeving van de tumor en klinische immunotherapie-resultaten. De resultaten toonden aan dat een hoge LLT1-eiwitexpressie significant geassocieerd was met minder geavanceerde tumorkenmerken (lagere invasiediepte en nodale metastase; P < 0,05) en langere totale overleving (P = 0,012). LLT1-mRNA- en eiwitniveaus correleerden met grotere CD8+ T-cel- en M1-macrofaaginfiltratie en verhoogde PD-L1-expressie in de micro-omgeving van de tumor. Van het eerste cohort van 198 patiënten met beschikbare prognostische gegevens vertoonden patiënten met een hoge LLT1-expressie (n=117) een significant langere totale overleving in vergelijking met patiënten met een lage expressie (n=81). In het tweede cohort van patiënten die werden behandeld met gecombineerde immunotherapie en chemotherapie, hadden tumoren met hoge LLT1-expressie (n=48) een langere progressievrije overleving (P = 0,014) dan tumoren met een lage LLT1-expressie (n=67). Een significante toename (P < 0,05) in PD-1+CD161+ immuuncelpopulaties werd waargenomen bij patiënten die effectief zijn bij immunotherapie (n=62) ten opzichte van therapieresistente patiënten (n=53). Concluderend is LLT1-expressie een veelbelovende biomarker voor een gunstige prognose bij maagkanker. Voor zover wij weten, is dit de eerste studie die aantoont dat LLT1-expressie een verbeterde respons op gecombineerde chemotherapie en immunotherapie bij maagkanker voorspelt, wat het potentieel ervan bij het begeleiden van immunotherapeutische strategieën ondersteunt.

Inleiding

Gastro-oesofageale kanker, met name maagkanker (GC), onderscheidt zich als de 5emeest voorkomende vorm van kanker ter wereld en de 5emeest dodelijke. Wereldwijde statistieken tonen aan dat er elk jaar ongeveer 1 miljoen nieuwe gevallen worden geïdentificeerd, waarbij Oost-Azië een onevenredig groot deel van de ziekte op zich neemt en bijdraagt aan meer dan de helft van de wereldwijde incidentie1. Voor degenen bij wie GC in een vroeg stadium is vastgesteld, is het vooruitzicht op overleving aanzienlijk gunstig, waarbij meer dan 90% overlevingspercentages na 5 jaar bereikt na endoscopische submucosale dissectie (ESD) of radicale chirurgische ingreep2. De subtiele presentatie van de eerste symptomen leidt echter vaak tot de diagnose van een lokaal gevorderde of gemetastaseerde fase 3,4. De vooruitzichten voor patiënten in deze vergevorderde stadia zijn somber, waarbij degenen die onbehandeld blijven een mediane totale overleving (OS) van amper 6 maanden ervaren. Zelfs bij toediening van combinatiechemotherapieregimes op basis van fluorouracil en platina, wordt de mediane OS slechts verlengd tot ongeveer een jaar5.

Onlangs is er een significante verandering opgetreden in de behandeling van maagkanker in een laat stadium, als gevolg van deze nieuwe geneesmiddelen die immuuncheckpointremmers worden genoemd. Ze zijn vergelijkbaar met een wondermiddel voor kankercellen met een bepaalde marker, PD-L1, die erop verschijnt - ten minste een score van 1 op de Combined Positive Score (CPS) -schaal. Deze behandelingen zijn ook zeer effectief voor kankers die allemaal door elkaar lopen in hun DNA, wat hoge microsatellietinstabiliteit (MSI-H) wordt genoemd. Deze nieuwe aanpak maakt het verschil om patiënten meer tijd te geven 6,7. Cruciale klinische onderzoeken geven aan dat binnen het PD-L1-positieve cohort personen met een CPS van 10 of hoger een meer uitgesproken toename van de overleving krijgen na behandeling met PD-1 monoklonale antilichamen 8,9. Desalniettemin wordt de huidige immunotherapie nog steeds geconfronteerd met meerdere klinische uitdagingen: objectieve responspercentages (ORR) over het algemeen onder de 20%, secundaire resistentiepercentages zo hoog als 40%-60%, onvolmaakte biomarkervoorspellingssystemen (bestaande biomarkers kunnen slechts 30%-40% van de potentiële begunstigden identificeren) en moeilijkheden bij het beheersen van immuungerelateerde bijwerkingen (irAE's)10,11,12,13,14. Hoewel dubbele blokkade van het immuuncheckpoint (bijv. gecombineerde PD-1/CTLA-4-remming) of chemo-immunotherapieregimes de responspercentages kunnen verhogen tot 40%-60%, slaagt ongeveer de helft van de patiënten er nog steeds niet in om aanhoudende klinische voordelen te behalen15. Daarom zijn het opzetten van precisieclassificatiesystemen op basis van multi-omics-kenmerken, de ontdekking van nieuwe voorspellende biomarkers en de identificatie van nieuwe immuuncontrolepunten cruciale onderzoeksrichtingen geworden voor het verbeteren van de klinische resultaten van GC-immunotherapie.

Lectine-achtig transcript 1 (LLT1) is een C-type lectine-gerelateerd eiwit, met CD161, een bestanddeel van de natural killer (NK) celreceptorfamilie, die dient als de geïdentificeerde bindingspartner. Het CLEC2D-gen, dat verantwoordelijk is voor de synthese ervan, geeft aanleiding tot vijf verschillende isovormen door middel van alternatieve splitsingsgebeurtenissen die bepaalde exonen omzeilen. Variant 1, bekend als LLT1, is gevalideerd als de enige variant die aanwezig is op het celmembraan16,17. LLT1-expressie wordt voornamelijk waargenomen in verschillende immuunceltypen, zoals B-lymfocyten, NK-cellen, dendritische cellen (DC's), specifieke T-celpopulaties (inclusief geactiveerde en regulerende T-cellen), monocyten en macrofagen, en wordt ook waargenomen in bepaalde kwaadaardige cellen en tijdens ontstekingsepisodes18. De eerste bevindingen geven aan dat LLT1 wordt opgereguleerd in DC's en B-cellen na stimulatie van de Toll-like receptor (TLR). Het is aangetoond dat de betrokkenheid van LLT1 bij CD161 NK-celgemedieerde cytotoxiciteit onderdrukt, wat suggereert dat het betrokken is bij het moduleren van de immuunrespons18. In B-cellen wordt de expressie van LLT1 opgereguleerd door een virale infectie of inflammatoire stimulatie. Wanneer de interactie functioneert als antigeenpresenterende cellen (APC's), oefent de LLT1-CD161-interactie dubbele immunomodulerende effecten uit door de NK-celfunctie te onderdrukken en tegelijkertijd de proliferatie van T-cellen of de productie van IFN-γ te co-stimuleren19.

Van LLT1 is bekend dat het aanwezig is in een reeks kankercellen, waaronder triple-negatieve borstkanker, glioblastoom en B-cel non-Hodgkin-lymfoom. Dit eiwit bindt zich aan de CD161-receptor die op NK-cellen wordt aangetroffen, waardoor hun vermogen om kankercellen te vernietigen effectief wordt geblokkeerd en zo wordt bijgedragen aan het ontwijken van de immuunrespons 20,21,22. Een opmerkelijke waarneming bij HPV-negatief orofaryngeaal plaveiselcelcarcinoom is de variabele expressie van LLT1, die volgens immunohistochemische studies een positieve prognostische betekenis aangeeft wanneer deze sterk tot expressie komt in tertiaire lymfoïde structuren (TLS), terwijl de aanwezigheid ervan op tumorcellen verband houdt met een slechtere uitkomst23. Bovendien wordt LLT1 in de context van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) niet gedetecteerd in de kankercellen zelf, maar wordt het aangetroffen in de micro-omgeving van de tumor (TME), en wordt het mRNA-expressieniveau geassocieerd met een betere prognose24.

Zoals aangetoond door Mathewson et al. in glioomonderzoek, verbetert het blokkeren van CD161 het door T-cellen gemedieerde doden van glioomcellen in vitro en verbetert het hun antitumorfunctie in vivo, wat het therapeutisch potentieel van CD161 als doelwit voor immuuncontrolepunten benadrukt25. Gezien het feit dat LLT1 het canonieke ligand van CD16118 is, verdient zijn rol als immunotherapeutisch doelwit serieuze overweging. Analoog aan de kritische interactie tussen PD-1 en PD-L1 in immunotherapie, heeft het onderzoeken van de biologische functies van LLT1 bij maagkanker en de correlatie met de resultaten van immunotherapie een aanzienlijke klinische waarde.

Deze studie biedt een uitgebreide analyse van LLT1-expressiepatronen binnen de micro-omgeving van de maagkankertumor, waarbij zowel mRNA- als eiwitniveauonderzoeken worden geïntegreerd. Het beoordeelt systematisch het potentieel van LLT1 als prognostische biomarker bij gevorderde maagkanker en evalueert de voorspellende waarde ervan voor de werkzaamheid van immunotherapie. Deze inzichten dragen bij aan een beter begrip van het klinische translationele potentieel ervan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het onderzoek met menselijke proefpersonen werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van Soochow University (goedkeuring nr. 2019026). De ethische toetsingscommissie van het First Affiliated Hospital van Soochow University heeft een vrijstelling goedgekeurd of verleend voor de ethische toetsing van dit gegevensgebruik. Bovendien werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle deelnemers.

Gegevensanalyse voor bio-informatica
Na een grondig onderzoek van de analyse van pan-kankerexpressie van de TCGA- en Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER)-databases, werd het gedrag van LLT1 onderzocht bij verschillende soorten kanker, met een bijzondere focus op maagkanker. De TISIDB-database werd gebruikt om de correlatie tussen LLT1-expressieniveaus en verschillende moleculaire subtypes van maagkanker te onderzoeken. De correlatie tussen de klinische kenmerken van patiënten en LLT1-expressie werd verder geanalyseerd met TCGA-gegevens via R-programmering. GO- en KEGG-analyses werden gebruikt om de functionele rol van LLT1 bij maagcarcinogenese te onderzoeken. Het ESTIMATE-algoritme (Estimation of STromale and Immune cells in MAlignant Tumor tissues using Expression data) werd bovendien gebruikt om de infiltratieniveaus van immuun- en stromale cellen in tumorweefsels te kwantificeren volgens LLT1-expressiepatronen. Verdere analyse met behulp van het CIBERSORT-algoritme werd uitgevoerd om correlaties tussen LLT1-expressieniveaus en specifieke infiltratiepatronen van immuuncellen in de micro-omgeving van de tumor te evalueren. Uitgebreide bio-informaticaanalyse werd uitgevoerd met behulp van TCGA-datasets en statistische R-programmering (v4.4.1) om mogelijke correlaties tussen LLT1-expressieprofielen en immunoregulerende biomarkers te onderzoeken. Ten slotte werd de TCIA-database (The Cancer Immunome Atlas) gebruikt om te onderzoeken of LLT1-expressie de respons op PD-1/PD-L1-immuuncheckpointblokkadetherapie kon voorspellen.

GAC-monsters en constructie van weefselmicroarray (TMA)
Er werden als volgt twee sets weefselmicroarray-gegevens gegenereerd:

De eerste set analyseerde retrospectief monsters van 268 patiënten met GAC die in 2011 een operatie ondergingen. Pathologen selecteerden paraffineblokken, identificeerden tumorkerngebieden en construeerden ze tot weefselmicroarrays. Elke individuele monsterplaats kreeg een afzonderlijke identificatie toegewezen om de bijbehorende klinische parameters zoals geslacht, leeftijd, neoplasmaafmetingen, mate van neoplastische differentiatie, fase van kankerprogressie, invasiediepte, lymfatische betrokkenheid en de aanwezigheid van verre verspreiding nauwgezet te volgen. De duur van de totale overleving (OS) werd gedefinieerd als het interval vanaf de start van de therapie tot het optreden van mortaliteit of de sluitingsdatum van december 2017. Benadrukt moet worden dat uitgebreide OS-gegevens alleen beschikbaar waren voor een subset van 198 deelnemers.

De tweede set omvatte 115 niet eerder behandelde patiënten met gevorderde GC, die tussen 2016 en 2023 een chirurgische/endoscopische resectie ondergingen in het First Affiliated Hospital van Soochow University. Pathologen evalueerden de paraffineblokken en geconstrueerde weefselmicroarrays met een nauwgezette follow-up van de ziekteprogressie. Met name werden alle monsters verzameld vóór elke preoperatieve behandeling en bestond de postoperatieve behandeling voornamelijk uit PD-1 monoklonale antilichamen in combinatie met chemotherapie.

Alle chirurgische resectiemonsters werden verzameld uit het antrum van de maag. Alle monsters werden gefixeerd in neutraal gebufferd formaline en ingebed in paraffine. Op basis van de evaluatie van H&E-gekleurde coupes identificeerden twee senior pathologen onafhankelijk van elkaar de meest representatieve weefselgebieden van de in paraffine ingebedde monsters. De weefselmicroarrays (TMA's) werden geconstrueerd met behulp van een geautomatiseerde weefselarrayer, waarbij weefselkernen nauwkeurig in de TMA-blokken zijn gepositioneerd volgens vooraf gedefinieerde modules. Ten slotte werden de voltooide TMA-blokken door een ervaren histotechnoloog op een dikte van 4 μm doorsneden.

Immunohistochemie (IHC) en multiplex immunofluorescentie (mIHC)
Immunohistochemische en multiplex immunofluorescentietesten werden uitgevoerd op een geconstrueerde weefselmicroarray. IHC-kleuring werd uitgevoerd in overeenstemming met een eerder vastgestelde methodologie26. De eerste set microarray-paraffinesecties werd overgebracht op glasplaatjes en gedurende 1 uur op 72°C gebakken. Nadat de secties waren gedeparaffiniseerd met xyleen en gerehydrateerd in achtereenvolgens toenemende ethanolverdunningen, werd de endogene peroxidase-activiteit geblokkeerd door de toepassing van peroxidase-blokkerende oplossing gedurende 30 minuten. Het ophalen van het antigeen werd uitgevoerd door de objectglaasjes gedurende 3 minuten bij 110 °C te koken in een citraatantigeenoplossing (pH 6,0). Na blokkering met 5% BSA-blokkeerbuffer werden de secties geïncubeerd met muis anti-humaan CLEC2D monoklonaal, muis anti-humaan CD3 monoklonaal (klaar voor gebruik), muis anti-humaan CD4 monoklonaal (klaar voor gebruik), konijn anti-humaan CD8 monoklonaal (klaar voor gebruik), muis anti-humaan CD11c monoklonaal (1:50) muis anti-humaan CD19 monoklonaal (klaar voor gebruik), muis anti-humaan CD31 monoklonaal (klaar voor gebruik), muis anti-humaan CD56 monoklonaal (klaar voor gebruik), muis anti-humaan CD68 monoklonaal (klaar voor gebruik), konijn anti-humaan Foxp3 monoklonaal (1:50), muis anti-humaan IL-17 monoklonaal (1:50), muis anti-humaan IFN-γ monoklonaal (1:50), muis anti-humaan Ki67 monoklonaal (1:50), muis anti-humaan PD-L1 monoklonaal (klaar voor gebruik) bij 4 °C 's nachts27,28. De objectglaasjes werden vervolgens gewassen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-gelabelde secundaire antilichamen (anti-muis en konijn). Na de incubatie werden de monsters gewassen en werd het EnVision-detectiesysteem gebruikt voor immunodetectie. Onder de microscoop, wanneer bruine gebieden op de chip beginnen te verschijnen, is zorgvuldige observatie vereist. De chromogene reactie moet worden gestopt zodra de bruine gebieden niet meer toenemen. Dia's werden gekleurd met Mayer's hematoxyline en gemonteerd met neutrale lijm. In de negatieve controle werd IgG van muizen of konijnen gebruikt in plaats van het primaire antilichaam. De positieve controle was menselijk amandelweefsel. De tweede set microarray-secties wordt gebruikt voor multiplex-immunohistochemie (mIHC). Door gebruik te maken van de bovengenoemde voorwaarden voor het ophalen en blokkeren van antigeen, wordt het antilichaampanel als volgt spectraal geoptimaliseerd: PD-L1 (480 nm), CD161 (520 nm), LLT1 (570 nm), PD-1 (620 nm), CD8 (690 nm) en PAN-CK (780 nm). Primaire antilichamen werden geïncubeerd onder dezelfde omstandigheden als in het oorspronkelijke protocol29 (behalve PANCK en CD161, die nieuw werden geïntroduceerd), bij de aanbevolen verdunning van 1:100, gevolgd door tyramidesignaalversterking (TSA) fluorescentiekleuring. Na elke ronde van fluorescentiekleuring wordt antilichaamstripping uitgevoerd, gevolgd door herhaalde extractie van antigeen, endogene peroxidaseblokkering en niet-specifieke doelblokkering voordat het volgende primaire antilichaam wordt geïncubeerd. Bij het uitvoeren van multiplex-immunohistochemie zijn drie punten cruciaal: pre-experimenten moeten worden uitgevoerd voor elke fluorescerende kleurstof, sterk tot expressie gebrachte antilichamen moeten worden gekoppeld aan zwakke fluorescerende signalen, terwijl zwak tot expressie gebrachte antilichamen moeten worden gekoppeld aan sterke fluorescerende signalen, en na het kleuren van elke fluorescerende marker moeten de kleuringsresultaten worden waargenomen onder een microscoop onder tegen licht beschermde omstandigheden. Na kleuring met de 6efluorescerende kleurstof wordt DAPI-tegenkleuring aangebracht om celkernen te labelen en worden de objectglaasjes gemonteerd. Ten slotte werden alle weefselmicroarrays gescand met behulp van een digitale pathologiescanner en geanalyseerd met een AI-aangedreven digitale pathologiebeeldanalysesoftware.

IHC/mIHC evaluatie van kleuring
De kleuringsresultaten werden door twee deskundige pathologen dubbelblind geïnterpreteerd. Ze maten de diepte van de kleuring met behulp van een krachtig objectief (200x vergroting) of bijpassende fluorescerende instelling (200x), waarbij ze scores toekenden variërend van 0 (geen kleuring) tot 3 (intense kleuring). De fracties van LLT1-positieve cellen in maagcarcinoommonsters werden verdeeld in vier stratificaties: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) en 3 (>50%). De immunoreactiviteitsscore (IRS) werd afgeleid van het product van de kleuringsdiepte en het aandeel LLT1-positieve cellen. Exemplaren die nul scoorden werden als negatief beschouwd, terwijl scores van 1-4 duidden op zwakke expressie, 5-7 matige en 8-9 sterke expressie; dezelfde criteria werden toegepast om de expressie van andere markers zoals Ki67 en CD3 te evalueren. Op basis van de evaluatie- en groeperingsmethodologie werden de monsters gelabeld als sterk (IRS8-9), matig (IRS5-7), zwak (IRS1-4) of geen expressie (IRS0). Patiënten met de laagste scores (IRS≤4) werden toegewezen aan de groep met lage expressie en degenen met hogere scores (IRS≥5) werden toegewezen aan de groep met hoge expressie.

Voor de PD-L1-marker werd echter een andere aanpak gekozen met behulp van de CPS. Deze score werd bepaald door de verhouding tussen PD-L1-positieve cellen (inclusief tumor-, immuun- en stromale cellen) en het totale aantal levensvatbare tumorcellen dat met een factor 100 werd opgeschaald. Personen met een CPS van meer dan vijf werden in het cohort met hoge expressie geplaatst, terwijl personen met een CPS van vijf of lager werden gegroepeerd in het cohort met lage expressie.

Groepering van immunotherapierespons
In overeenstemming met de Response Evaluation Criteria in Solid Tumors versie 1.1 (RECIST 1.1), valt de evaluatie van doellaesies bij patiënten in vier verschillende categorieën: (a) Volledige respons (CR): alle doellaesies zijn volledig verdwenen en de korte as van alle pathologische lymfeklieren (zowel doelwit- als niet-doelwit) moet kleiner zijn dan 10 mm; (b) Gedeeltelijke respons (PR): de cumulatieve diameter van alle meetbare doellaesies is met ten minste 30% afgenomen ten opzichte van de basismetingen; (c) Progressieve ziekte (PD): deze categorie is van toepassing wanneer de cumulatieve diameter van doellaesies met ten minste 20% is toegenomen in vergelijking met de kleinste waarde die tijdens het onderzoek is geregistreerd (waarbij de basislijn als referentie wordt gebruikt als deze de kleinste waarde vertegenwoordigt), waarbij de absolute toename niet minder dan 5 mm is; bovendien wordt het ontstaan van nieuwe laesies ook gecategoriseerd als progressieve ziekte (PD); (d) Stabiele ziekte (SD): de cumulatieve diameter van de doellaesies voldoet noch aan de reductiecriteria voor PR, noch aan de verhogingscriteria voor PD gedurende het hele onderzoek. Er werden twee stratificatietechnieken toegepast. De eerste methode omvatte het scheiden van patiënten op basis van hun responsstatus, waarbij PD (n=53) en SD (n=46) patiënten de non-respondergroep (n=99) vormden, terwijl PR (n=15) en CR (n=1) patiënten de respondergroep vormden (n=16). De tweede benadering omvatte het categoriseren van patiënten op basis van ziekteprogressie, waarbij CR-, PR- en SD-patiënten werden geclassificeerd als het immunotherapie-effectieve cohort (n=62) en PD-patiënten als het niet-effectieve cohort voor immunotherapie (n=53).

Statistische analyse
Empirische evaluaties werden uitgevoerd met behulp van het R computing platform (versie 4.4.1) en het SPSS Statistical softwarepakket (versie 27.0). Verschillen tussen studiecohorten werden onderzocht door de toepassing van de chi-kwadraattabelanalyse. De niet-parametrische correlatietechniek van Spearman werd gebruikt om de sterkte en richting van de associaties tussen variabelen te onderzoeken. Variaties in overlevingstijd werden geanalyseerd door de constructie van Kaplan-Meier-schatters, aangevuld met log-rank-testen op significantie. Vervolgens werden Cox-regressiemodellen voor proportionele risico's gebruikt om factoren te identificeren die mogelijk van invloed zijn op de overlevingsresultaten van de patiënt. Statistische significantie werd vooraf gedefinieerd als een tweezijdige p-waardedrempel van <0,05. Om de robuustheid van de bevindingen te garanderen, werden uitgebreide gevoeligheidsanalyses uitgevoerd om mogelijke verstorende variabelen te evalueren, waarbij multivariate modellen dienovereenkomstig werden aangepast. Bovendien werden expliciete interpretaties van hazard ratio's gegeven om het klinische begrip te vergemakkelijken, waarbij de nadruk werd gelegd op de praktische implicaties van geïdentificeerde risicofactoren voor de prognose van de patiënt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Associatie tussen CLEC2D-mRNA-expressie en subclassificatie van maagkanker/klinische parameters
Een eerste uitgebreid kankeronderzoek met behulp van de TCGA-dataset, gefaciliteerd door de TIMER-database, onthulde een opmerkelijke verhoging van de CLEC2D-transcriptieniveaus in verschillende kankerweefsels, zoals weergegeven in figuur 1A. Deze observatie impliceert dat CLEC2D kan ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Onze studie toonde een hogere CLEC2D-mRNA-expressie in tumorweefsels dan in normale weefsels. Immunohistochemische resultaten van maagkanker toonden aan dat hoge LLT1-eiwitexpressie in tumorweefsels geassocieerd was met een betere prognose en positief gecorreleerd was met infiltratie van immuuncellen in de micro-omgeving van de tumor. Analyse van weefsels van maagkankerpatiënten die immunotherapie kregen, gaf aan dat hoge LLT1-expressie een betere immunotherapeutische respons vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er wordt geen potentieel belangenconflict gemeld door de auteurs.

Dankbetuigingen

Dankbare dank gaat uit naar de TCGA-database voor het bieden van gegevensondersteuning. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81974375) en Grants of Suzhou Science and Technology Development Plan (SKY2022129). De studie voldoet aan de ARRIVE-richtlijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5% BSA Blocking BufferBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.,ChinaSW3015
anti-CD11c ZSGB-BIO,China5D11
Anti-CD161Abcam,Cambridge, UKab302564
anti-CD19  ZSGB-BIO,ChinaEPl69
anti-CD3 ZSGB-BIO,ChinaLNl0
anti-CD31ZSGB-BIO,China UMAB30
anti-CD4ZSGB-BIO,ChinaUMAB64
anti-CD56 ZSGB-BIO,ChinaUMAB83
anti-CD68 ZSGB-BIO,ChinaKP1
anti-CD8ZSGB-BIO,ChinaEP334
Anti-CLEC2DAbcam,Cambridge, UKab197341
anti-Foxp3R&D Systems, USA1054C
anti-IFN-γ Santa Cruz Biotechnologysc-74108
anti-IL-17R&D Systems, USA MAB317 
anti-Ki67 ZSGB-BIO,China8H5
Anti-pan Cytokeratin Abcam,Cambridge, UKab7753
Anti-PD-1Abcam,Cambridge, UKab137132
Anti-PD-L1DAKO,Denmark22C3
automated tissue array equipmentEstigen OU, Tartu, EstoniaBeecher ATA 27Dit instrument wordt voornamelijk gebruikt voor de constructie van weefselmicroarrays.
Citrate Antigen Retrieval SolutionAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaC752119
DAB chromogen kit AiFang Biological,ChinaAFIHC004
Digital pathology scannerNingbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd,ChinaKF-FL-020Dit instrument wordt voornamelijk gebruikt voor het scannen van immunohistochemie en multiplex immunohistologie chips.
GraphPad Prism 10GraphPad Software,USAv10.0.3Deze software is voor het plotten van Kaplan-Meier curven (met log-rank statistische analyse), wetenschappelijke data visualisatie en figuurvoorbereiding.
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaP743267
peroxidase blocking solutionAiFang Biological,ChinaAFIHC012
Polymer-HRP conjugated goat anti-mouse/rabbit secondary antibodyAiFang Biological,ChinaAFIHC001
Six-color seven-marker multiplex immunofluorescence staining kitAiFang Biological,ChinaAFIHC037Deze reagent kit is ontworpen voor multiplex immunohistologie (mIHC)
SPSSIBM Corporation,USAIBM SPSS Statistics 27De software werd gebruikt voor statistische analyse van de gegevens.
The R ProjectR Core TeamV4.4.1Alle R-pakketten, gerelateerde code en originele bestanden zijn geüpload naar de openbare database.
VISIOPHARM softwareVisiopharm,Denmark2025.02.2.18022 x64Deze software is voornamelijk ontworpen voor de kwantitatieven analyse van pathologische beelden.

Referenties

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  2. Suzuki, H., et al. Long-term survival after endoscopic resection for gastric cancer: Real-world evidence from a multicenter prospective cohort. Clin Gastroenterol Hepatol. 21 (2), 307-318.e2 (2023).
  3. Ma, S., et al. Clinical application and detection techniques of liquid biopsy in gastric cancer. Mol Cancer. 22 (1), 7(2023).
  4. Ugai, T., et al. Is early-onset cancer an emerging global epidemic? Current evidence and future implications. Nat Rev Clin Oncol. 19 (10), 656-673 (2022).
  5. Wagner, A. D., et al. Chemotherapy for advanced gastric cancer. Cochrane Database Syst Rev. 8 (8), Cd004064(2017).
  6. Chao, J., et al. Assessment of pembrolizumab therapy for the treatment of microsatellite instability-high gastric or gastroesophageal junction cancer among patients in the keynote-059, keynote-061, and keynote-062 clinical trials. JAMA Oncol. 7 (6), 895-902 (2021).
  7. Lee, K. W., et al. Association of tumor mutational burden with efficacy of pembrolizumab±chemotherapy as first-line therapy for gastric cancer in the phase III Keynote-062 study. Clin Cancer Res. 28 (16), 3489-3498 (2022).
  8. Wainberg, Z. A., et al. Efficacy of pembrolizumab monotherapy for advanced gastric/gastroesophageal junction cancer with programmed death ligand 1 combined positive score ≥10. Clin Cancer Res. 27 (7), 1923-1931 (2021).
  9. Zhao, J. J., et al. Low programmed death-ligand 1-expressing subgroup outcomes of first-line immune checkpoint inhibitors in gastric or esophageal adenocarcinoma. J Clin Oncol. 40 (4), 392-402 (2022).
  10. Zhu, Q., Zhang, R., Zhao, Z., Xie, T., Sui, X. Harnessing phytochemicals: Innovative strategies to enhance cancer immunotherapy. Drug Resist Updat. 79, 101206(2025).
  11. Khosravi, G. R., et al. Immunologic tumor microenvironment modulators for turning cold tumors hot. Cancer Commun (Lond). 44 (5), 521-553 (2024).
  12. Gibney, G. T., Weiner, L. M., Atkins, M. B. Predictive biomarkers for checkpoint inhibitor-based immunotherapy. Lancet Oncol. 17 (12), e542-e551 (2016).
  13. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  14. Naidoo, J., et al. Toxicities of the anti-PD-1 and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies. Ann Oncol. 27 (7), 1362(2016).
  15. Yang, M., Lin, W., Huang, J., Mannucci, A., Luo, H. Novel immunotherapeutic approaches in gastric cancer. Precis Clin Med. 7 (4), pbae020(2024).
  16. Germain, C., et al. Characterization of alternatively spliced transcript variants of clec2d gene. J Biol Chem. 285 (46), 36207-36215 (2010).
  17. Boles, K. S., Barten, R., Kumaresan, P. R., Trowsdale, J., Mathew, P. A. Cloning of a new lectin-like receptor expressed on human NK cells. Immunogenetics. 50 (1-2), 1-7 (1999).
  18. Rosen, D. B., et al. Cutting edge: Lectin-like transcript-1 is a ligand for the inhibitory human nkr-p1a receptor. J Immunol. 175 (12), 7796-7799 (2005).
  19. Germain, C., et al. Induction of lectin-like transcript 1 (llt1) protein cell surface expression by pathogens and interferon-γ contributes to modulate immune responses. J Biol Chem. 286 (44), 37964-37975 (2011).
  20. Marrufo, A. M., et al. Blocking llt1 (clec2d, ocil)-nkrp1a (cd161) interaction enhances natural killer cell-mediated lysis of triple-negative breast cancer cells. Am J Cancer Res. 8 (6), 1050-1063 (2018).
  21. Germain, C., et al. Lectin-like transcript 1 is a marker of germinal center-derived B-cell non-Hodgkin's lymphomas, dampening natural killer cell functions. Oncoimmunology. 4 (8), e1026503(2015).
  22. Roth, P., et al. Malignant glioma cells counteract antitumor immune responses through expression of lectin-like transcript-1. Cancer Res. 67 (8), 3540-3544 (2007).
  23. Sanchez-Canteli, M., et al. Lectin-like transcript 1 (llt1) checkpoint: A novel independent prognostic factor in hpv-negative oropharyngeal squamous cell carcinoma. Biomedicines. 8 (12), 535(2020).
  24. Braud, V. M., et al. Expression of llt1 and its receptor CD161 in lung cancer is associated with better clinical outcome. Oncoimmunology. 7 (5), e1423184(2018).
  25. Mathewson, N. D., et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis. Cell. 184 (5), 1281-1298.e26 (2021).
  26. Guo, L., et al. Association of increased B7 protein expression by infiltrating immune cells with progression of gastric carcinogenesis. Medicine (Baltimore). 98 (8), e14663(2019).
  27. Quan, Q., et al. Expression and clinical significance of PD-L1 and infiltrated immune cells in the gastric adenocarcinoma microenvironment. Medicine (Baltimore). 102 (48), e36323(2023).
  28. Varaden, D., Moodley, J., Onyangunga, O. A., Naicker, T. Morphometric image analysis of placental c-type lectin domain family 2, member d (clec2d) immuno-expression in hiv associated pre-eclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol X. 3, 100039(2019).
  29. Chen, S., et al. B7-h3 and CD47 co-expression in gastric cancer is a predictor of poor prognosis and potential targets for future dual-targeting immunotherapy. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (18), 16609-16621 (2023).
  30. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature. 513 (7517), 202-209 (2014).
  31. Cristescu, R., et al. Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med. 21 (5), 449-456 (2015).
  32. Thorsson, V., et al. The immune landscape of cancer. Immunity. 48 (4), 812-830.e14 (2018).
  33. Tumeh, P. C., et al. Pd-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).
  34. Lopez De Rodas, M., et al. Biological and clinical significance of tumour-infiltrating lymphocytes in the era of immunotherapy: A multidimensional approach. Nat Rev Clin Oncol. , (2025).
  35. Myojin, Y., et al. Multiomics analysis of immune correlatives in hepatocellular carcinoma patients treated with tremelimumab plus durvalumab. Gut. , (2025).
  36. Marvel, D., Gabrilovich, D. I. Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: Expect the unexpected. J Clin Invest. 125 (9), 3356-3364 (2015).
  37. Sautès-Fridman, C., Petitprez, F., Calderaro, J., Fridman, W. H. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 19 (6), 307-325 (2019).
  38. Ye, Z., et al. Gastric cancer-derived exosomal let-7 g-5p mediated by serpine1 promotes macrophage m2 polarization and gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 2(2025).
  39. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  40. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  41. Xiong, S., Dong, L., Cheng, L. Neutrophils in cancer carcinogenesis and metastasis. J Hematol Oncol. 14 (1), 173(2021).
  42. Mantovani, A., Locati, M. Tumor-associated macrophages as a paradigm of macrophage plasticity, diversity, and polarization: Lessons and open questions. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (7), 1478-1483 (2013).
  43. Niu, X., et al. Autophagy in cancer development, immune evasion, and drug resistance. Drug Resist Updat. 78, 101170(2025).
  44. Ikeda, H., et al. Immune evasion through mitochondrial transfer in the tumour microenvironment. Nature. 638 (8049), 225-236 (2025).
  45. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat Rev Immunol. 9 (3), 162-174 (2009).
  46. Pan, Y., et al. The protective and pathogenic role of Th17 cell plasticity and function in the tumor microenvironment. Front Immunol. 14, 1192303(2023).
  47. Smyth, M. J., et al. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma. J Exp Med. 192 (5), 755-760 (2000).
  48. Galon, J., et al. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-1964 (2006).
  49. Galon, J., Bruni, D. Approaches to treat immune hot, altered, and cold tumours with combination immunotherapies. Nat Rev Drug Discov. 18 (3), 197-218 (2019).
  50. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

LLT1 expressieimmuuncheckpointtumormicro omgevingimmuuncel infiltratiePD L1 expressieCD8 T cellenimmunohistochemiemultiplex immunofluorescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.