Methodenartikel

In het veld inzetbaar lensloos beeldvormingsplatform voor snelle labelvrije analyse van de activering van natural killer-cellen

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68834

⸱

8 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK) cellen met behulp van lensloze schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door computeranalyse van hun diffractiepatronen.

Samenvatting

Natural killer (NK) cellen zijn belangrijke effectoren van aangeboren immuniteit die met virus geïnfecteerde en kwaadaardige cellen elimineren. Het monitoren van de activiteit van NK-cellen is essentieel voor het beoordelen van de immuunfunctie. Conventionele methoden, zoals flowcytometrie, zijn echter arbeidsintensief en tijdrovend. Dit protocol beschrijft een labelvrije techniek voor de snelle analyse van natural killer (NK) celactiviteit met behulp van lensvrije schaduwbeeldvormingstechnologie (LSIT). NK-cellen geïsoleerd uit perifeer bloed en gestimuleerd met een gepatenteerde activator werden binnen 5 minuten geanalyseerd met behulp van het LSIT-platform. Het LSIT-platform legt holografische beelden vast, ook wel schaduwbeelden genoemd, gemaakt door de interferentie van licht met NK-cellen, en bewaakt hun activeringsstatus door veranderingen in schaduwparameters te analyseren. Belangrijke parameters afgeleid van de schaduwbeelden, waaronder de piek-tot-piekafstand (PPD) en de standaarddeviatie van de secundaire maximabreedte (WSM-SD), weerspiegelden kwantitatief de celmorfologie en interne complexiteit. Deze parameters werden geïntegreerd in de gecombineerde schaduwparameter (CSP) en aangeboren immuniteitsindex (I3) om een uitgebreide beoordeling en kwantificering van NK-celactiviteit te bieden op basis van morfologische veranderingen in de cellen. I3, berekend als de procentuele verandering in CSP na activering, diende als een directe maat voor de NK-celactiviteit. NK-cellen van gezonde personen vertoonden consequent significant hogere I3-waarden dan die van immuungecompromitteerde personen. Het LSIT-platform maakt snelle en kosteneffectieve immuunprofilering mogelijk die geschikt is voor point-of-care diagnostiek.

Inleiding

Celmorfologie is in opkomst als een belangrijke indicator van de moleculaire mechanismen. Het biedt niet alleen een visuele weergave van de celstructuur, maar biedt ook waardevolle inzichten in de onderliggende processen en functies van individuele cellen1. Het analyseren van de vorm, grootte en activiteit van immuuncellen op het niveau van één cel levert cruciale inzichten op in hun gedrag, heterogeniteit en rol in gezondheid en ziekte 2,3,4,5,6.

Onder deze cruciale cellen bevinden zich natuurlijke killercellen (NK), die een centraal onderdeel zijn van het aangeboren immuunsysteem 7,8. Ze elimineren met virus geïnfecteerde en kankercellen en reguleren de adaptieve immuunrespons door cytokine-afgifte 9,10,11. Kanker, virale infecties en immunodeficiënties verminderen vaak het aantal NK-cellen en tasten hun functies aan 12,13,14. Daarom dient NK-celactivering als een belangrijke biomarker en geeft het informatie over de algehele gezondheid van het immuunsysteem. Bijgevolg is een snelle eencellige beoordeling van NK-celactivering essentieel voor prognose, diagnose, ziektemonitoring en patiëntstratificatie 15,16,17,18.

Momenteel wordt de activiteit van NK-cellen beoordeeld op basis van hun cytotoxische capaciteit (vermogen om doelwitcellen te doden) en cytokineproductie 19,20,21,22. Conventionele methoden voor het meten van celgemedieerde cytotoxiciteit23, zoals chroom-51 (51Cr) afgiftetests24,25, flowcytometrische assays26,27 en enzymgekoppelde immunosorbenttesten (ELISA) om interferon-gamma (IFN-γ) te kwantificeren dat door NK-cellen wordt uitgescheiden na stimulatie28,29,30 hebben verschillende beperkingen. Deze omvatten het gebrek aan standaardisatie, langdurige protocollen (bijv. Elisa-incubatie 's nachts), afhankelijkheid van cellabeling en hoge apparatuurkosten 31,32,33. Deze uitdagingen benadrukken de behoefte aan innovatieve methoden die snelle resultaten, kosteneffectiviteit, labelvrije analyse en hoge doorvoer bieden. Bovendien biedt de beoordeling van NK-celactivering op het niveau van één cel gedetailleerde inzichten in de heterogeniteit van de populatie en individuele cellulaire reacties op stimulatie.

Onder de opkomende technologieën die gericht zijn op het overwinnen van deze beperkingen, is lensvrije schaduwbeeldvormingstechnologie (LSIT) een bijzonder effectieve oplossing 34,35,36. LSIT, een vereenvoudigde digitale inline holografie (DIH), maakt snelle, labelvrije analyse met hoge doorvoer van NK-celactivering mogelijk met een resolutie van één cel 37,38,39. De DIH legt interferentiepatronen vast tussen verstrooid laserlicht en een collineaire referentiestraal op een digitale sensor om driedimensionale (3D) informatie over microscopisch kleine objecten te reconstrueren40,41. De LSIT vereenvoudigt deze aanpak door gebruik te maken van een gedeeltelijk coherente LED-, micropinhole- en CMOS-sensor om de diffractiepatronen (d.w.z. schaduwbeelden) van cellen 42,43,44,45 vast te leggen. De grondgedachte voor deze techniek is gebaseerd op de observatie dat de activering van immuuncellen vaak morfologische veranderingen veroorzaakt, waaronder variaties in celgrootte, vorm, cytoplasmatische granulariteit en nucleaire structuur 46,47,48,49,50. De LSIT is zeer gevoelig voor deze veranderingen, die een direct effect hebben op de diffractiepatronen 51,52,53.

Voortbouwend op de gevoeligheid van LSIT voor deze morfologische veranderingen en hun effecten op diffractiepatronen, presenteert dit protocol een nieuwe methode voor de snelle en nauwkeurige kwantificering van het aantal NK-cellen en functionele activiteit op het niveau van één cel met behulp van het Cellytics NK-platform, hierna het LSIT-platformgenoemd 54. Zoals te zien is in Figuur 1A, integreert het LSIT-platform monsterverwerking, activering en schaduwbeeldvorming in een compacte meerkanaals workflow. NK-cellen werden geïsoleerd uit volbloed, gestimuleerd met een speciaal samengestelde activeringsstimulatorcocktail (ASC) en op een speciale testchip geladen. ASC induceert morfologische veranderingen in NK-cellen binnen 1 uur na blootstelling, zoals verhoogde celgrootte en interne complexiteit, die nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd met behulp van het LSIT-platform55,56.

Het LSIT-platform maakt gebruik van een LED-lichtbron en een CMOS-sensor om de DIH-patronen (schaduwen) van individuele cellen vast te leggen (Figuur 1B). Een speciaal algoritme analyseert vervolgens deze schaduwpatronen en extraheert belangrijke parameters, zoals de piek-tot-piekafstand (PPD), die correleert met de celgrootte, en de standaarddeviatie van de breedte van het secundaire maximum (WSM-SD), die correleert met de complexiteit en onregelmatigheid van het cytoplasma (Figuur 1C,D). Door de waarden voor en na stimulatie te vergelijken, berekent het platform samengestelde indices: de gecombineerde schaduwparameter (CSP = PPD × WSM-SD) en de aangeboren immuniteitsindex (I³), die de procentuele verandering in CSP na activering weergeven. De reden voor het introduceren van CSP is dat immuunactivering zowel celvergroting als verhoogde cytoplasmatische complexiteit met zich meebrengt. Als u op slechts één van de twee criteria vertrouwt, kan u de activering op het randje missen of worden beïnvloed door ruis, zoals vuil of onregelmatige verlichting. De CSP verbetert de classificatie door consistente verschuivingen in beide metrieken te vereisen. Deze indices classificeren de activeringstoestanden van verschillende celpopulaties zonder fluorescerende labeling of complexe monsterverwerking.

Dit protocol is vooral nuttig voor onderzoekers en clinici die een snelle, kwantitatieve en labelvrije methode nodig hebben voor het monitoren van door activering geïnduceerde morfologische veranderingen in immuuncellen. Het is geschikt voor fundamenteel immunologisch onderzoek, preklinische screening van geneesmiddelen en evaluatie van immunotherapieën, en kan worden gebruikt als een diagnostisch of prognostisch hulpmiddel in klinische omgevingen waar een snelle beoordeling van de immuunstatus essentieel is. Deze methode vereist geïsoleerde celpopulaties, toegang tot het LSIT-platform en een specifieke NK-celactiveringscocktail.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het onderzoek volgde de institutionele richtlijnen en werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Korea University Anam Hospital (goedkeuringsnummer: 2021AN0040). De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Monsterverzameling en behandeling

OPMERKING: Behandel alle menselijke bloedmonsters met behulp van de standaard bioveiligheidsmaatregelen en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.

  1. Verzamel aseptisch perifeer volbloed van de patiënt in een steriele heparinebuis.
  2. Keer de tube 8-10 keer voorzichtig om om het antistollingsmiddel met het bloed te mengen.
  3. Analyseer het bloedmonster direct na afname. Als de analyse vertraging oploopt, bewaar het monster dan in een gehepariniseerd buisje bij 2-8 °C en gebruik het binnen 48 uur.
    OPMERKING: Vries geen volbloed in. Gebruik verse monsters om de cellulaire integriteit te behouden.

2. Isolatie en activering van NK-cellen

OPMERKING: Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde en uitgebreide workflow voor de isolatie en activering van NK-cellen rechtstreeks uit menselijk volbloed met behulp van de NK Prep Kit, die bestaat uit de NK Sep Kit voor celisolatie en de NK Activation Kit voor stimulatie. Deze kit integreert magnetische op kralen gebaseerde negatieve selectie en stimulatie om een snelle fenotypische beoordeling mogelijk te maken via een lensloos beeldvormingscytometrieplatform.

  1. Pre-test opstelling
    1. Haal de kits uit de koelkast en breng ze op kamertemperatuur (15-28 °C).
      LET OP: De NK Sep kit bevat de volgende onderdelen:
      (a) Groen deksel: reactiebuis met de antilichaamcocktail.
      b) Rood deksel: scheidingsbuis 1 met magnetische deeltjes in het verdunningsmedium (1,5 ml).
      (c) Paars deksel: Scheidingsbuis 2 met de magnetische deeltjes.
      (d) Grijs deksel: Vuilwaterreservoir (schoon en leeg).
      De NK Activatie kit bevat de volgende onderdelen:
      (a) Voertuig: Acht transparante buizen in een verzegelde aluminium zak.
      (b) ASC: Acht gele buizen in een verzegelde aluminium zak.
      Haal alleen de benodigde buisjes uit de verzegelde zakken. Sluit alle ongebruikte onderdelen opnieuw af en zet ze in de koelkast.
    2. Bereid de benodigde apparatuur voor: magnetische scheider, pipetten met steriele punten en een gekalibreerde broedmachine of verwarmingsblok ingesteld op 37 °C.
  2. Procedure voor de isolatie van NK-cellen
    1. Voeg 0,5 ml volbloed toe aan de reactiebuis met de groene dop met de antilichaamcocktail. Meng voorzichtig door de buis 2-3 keer om te keren en incubeer gedurende 5 minuten.
    2. Breng de volledige inhoud over in de scheidingsbuis 1 met een rode dop. Meng voorzichtig 2-3 keer.
    3. Plaats de buis op een magnetische scheider en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Breng met de magneet op zijn plaats ongeveer 1.5 ml van het bovenstaande over naar de scheidingsbuis met paarse dop 2. Meng voorzichtig 2-3 keer.
    5. Plaats de scheidingsbuis twee op de magnetische standaard en incubeer gedurende 10 minuten.
    6. Terwijl de magneet er nog aan zit, brengt u ongeveer 1.0 ml van het bovenstaande over in een herstelbuis met een grijs deksel. Meng voorzichtig.
  3. Activering van NK-cellen
    1. Voeg 100 μl van de geïsoleerde NK-celsuspensie toe aan de voertuigslang en nog eens 100 μl aan de ASC-buis
    2. Meng de inhoud van de twee buisjes voorzichtig.
    3. Incubeer de buisjes gedurende 1 uur bij 37 °C.
      NOTITIE: Gebruik een gekalibreerd verwarmingsblok om een constante incubatietemperatuur te behouden.

3. Beeldvorming en analyse met het LSIT-platform

OPMERKING: Cellen moeten onmiddellijk na incubatie worden geanalyseerd. Als onmiddellijke analyse niet mogelijk is, bewaar de geïncubeerde cellen dan bij 2-8 °C en analyseer ze binnen 6 uur. Het LSIT-platform evalueert de celmorfologie en het aantal cellen in menselijke bloedmonsters met behulp van DIH. Om de immuunactiviteit te analyseren, werden zowel niet-gestimuleerde als ASC-gestimuleerde NK-cellen op een speciaal objectglaasje geladen, in het apparaat ingebracht en automatisch afgebeeld.

  1. Apparaat instellen en kalibreren
    OPMERKING: Voer altijd een achtergrondkalibratie uit voordat u een monster analyseert.
    1. Schakel het LSIT-platform in. Zorg ervoor dat de LED, ventilator en camera werken.
    2. Start de LSIT Capture-software . Log in door uw ID en wachtwoord in te voeren.
    3. Ga naar Instellingen en selecteer Kalibreren.
    4. Druk op de Open-knop op het touchscreen of gebruik de fysieke schuifdeurknop om de deur te openen. Wanneer de lade opengaat, verwijdert u de kalibratieschuif en bergt u deze op.
    5. Zorg ervoor dat er geen testglaasje aanwezig is. Sluit de lade.
      OPMERKING: Gebruik alleen optische doekjes om de oppervlakken van de dia's schoon te maken.
    6. Klik op Achtergrond instellen om de optische intensiteit te kalibreren.
    7. Plaats de kalibratieschuif terug en sluit de lade.
    8. Klik op Kalibratie starten.
      NOTITIE: Als er vloeistof op het apparaat wordt gemorst, schakel het dan onmiddellijk uit. Veeg het schoon. Haal het apparaat niet uit elkaar.
  2. Voorbereiding en laden van de analyseglaasjes
    1. Haal een analyseglaasje uit het zakje, label het met de monstergegevens en plaats het op een schone, vlakke ondergrond.
    2. Pipetteer 10 μL van het voertuig (niet-gestimuleerd) monster in de kanalen A en B.
    3. Pipetteer 10 μL van het ASC-gestimuleerde monster in de kanalen C en D.
      OPMERKING: Vermijd luchtbelvorming en overvulling.
    4. Druk op Open om de lade uit te werpen, verwijder de kalibratieschuif en plaats deze in een opbergdoos.
    5. Plaats het voorbereide analyseglaasje en druk op Sluiten.
  3. Beeldacquisitie: Test Menu 1 - NK-celactiviteit
    OPMERKING: Als de beeldacquisitie mislukt, controleert u de verlichting en het samplevolume. Kalibreer indien nodig opnieuw.
    1. Log in op het LSIT-systeem en selecteer de NK-celactiviteitstest op het hoofdscherm.
    2. Voer de voorbeeld-ID in of gebruik de barcodescanner.
      OPMERKING: Gebruik de knop Ophalen om de voorbeeld-ID uit de gearchiveerde lijst op te halen.
    3. Druk op Vastleggen om de opname te starten.
    4. Klik na het vastleggen van de afbeelding op Analyseren
    5. Controleer de NK-celactiviteit (%) en het aantal cellen dat op het scherm wordt weergegeven.
      OPMERKING: Geldige resultaten worden numeriek weergegeven. Als I3 onder het bereik ligt, wordt "≤100%" weergegeven. Boven het bereik wordt ">300%" weergegeven.
    6. Download de resultaten naar een USB of druk ze af met behulp van het touchscreen-menu.
  4. Beeldacquisitie: Test Menu 2 - cellen tellen
    1. Selecteer de optie Cellen tellen onder Testmenu 2 op de hoofdinterface.
    2. Laad 10 μL van het monster op een nieuw analysediakanaal.
    3. Plaats de dia, sluit de lade en voer de voorbeeld-ID in.
    4. Voer de verdunningsfactor in, indien van toepassing.
    5. Druk op Tellen.
      OPMERKING: Als het resultaat binnen het testbereik ligt, wordt het aantal NK-cellen weergegeven als een numerieke waarde op het systeemscherm. Voor resultaten onder het testbereik wordt "≤ 10 cellen/μL" weergegeven, voor resultaten boven "> 1.000 cellen/μL".
    6. Geef de resultaten weer als cellen/μL.
      OPMERKING: Schakel het zwarte resultatenveld in om het werkelijke aantal cellen in afbeeldingen weer te geven.
    7. Bekijk de resultaten en download of print ze.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste verdunningsfactor is ingevoerd om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.

4. Opschoning na de analyse

  1. Open de lade met de knop Openen of de fysieke tuimelschakelaar.
  2. Verwijder de gebruikte dia.
  3. Plaats de kalibratieschuif terug in de lade om de sensor te beschermen.
  4. Sluit de lade.
  5. Gooi gebruikte buizen, tips en dia's weg in overeenstemming met de voorschriften voor laboratoriumafval.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens dit protocol maakt het LSIT-platform een kwantitatieve, labelvrije beoordeling van NK-celactivering mogelijk op basis van morfologische veranderingen in de cellen. Figuur 2A toont Hema-3-gekleurde cytospinpreparaten van primaire NK-cellen van gezonde donoren na incubatie van 2 uur met of zonder ASC. Activering door ASC resulteert in duidelijke veranderingen, voornamelijk celvergroting en verhoogde interne complexiteit of granulariteit, in vergelijkin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde, labelvrije methode voor het kwantificeren van NK-celactivering die celisolatie en activering combineert met behulp van de NK Prep Kit, met analyse via het LSIT-platform. Het biedt een snel en kwantitatief alternatief voor conventionele tests zoals 51Cr-afgifte, flowcytometrie en ELISA. Het protocol is ontwikkeld voor laboratoria die zijn uitgerust met het LSIT-platform en biedt eenvoudige resultaten op basis van schaduw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

I.L., S.H., H.S.J. en S.S. zijn gelieerd aan Metaimmunetech Inc., een bedrijf dat betrokken is bij de ontwikkeling en commercialisering van het LSIT-platform dat in deze studie wordt gepresenteerd. Concreet is H.S.J. de oprichter en CEO, S.H. is de CEO en S.S. is de CTO van het bedrijf. De auteurs bevestigen echter dat de resultaten en interpretaties in dit manuscript objectief worden gerapporteerd en niet worden beïnvloed door commerciële belangen van welke aard dan ook. Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de Basic Science Research Programs van de National Research Foundation (NRF) van Korea (Grant#: RS-2024-00353675, Grant#: 2021R1I1A3056109), het ITRC (Information Technology Research Center) ondersteuningsprogramma onder toezicht van het IITP (Institute for Information and Communications Technology Planning and Evaluation) en het Commercialization Promotion Agency for R&D Outcomes (COMPA), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap en ICT (MSIT), Korea (Grant#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), Grant#: 2710084652), het ondersteuningsprogramma van het Korea Institute of Marine Science and Technology Promotion (KIMST), gefinancierd door het Ministerie van Oceanen en Visserij, Korea (Grant#: 20210660), en de Korea University Grant. De auteurs erkennen Metaimmunetech Inc. voor hun samenwerking, gebaseerd op de technologie die is overgedragen van de Korea University, bij de ontwikkeling van het Cellytics NK-apparaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL Microcentrifuge TubesAXYGENMCT-175-CSteriele, DNase/RNase-vrij
Assay SlideMetaimmunetechAS050-GSpecifieke slide voor Cellytics systeem
50 slides in een doos
Cellytics systeem met softwareMetaimmunetechCS001Lensvrije schaduwbeelden platform
Centrifuge (swing-bucket rotor)LABOGENE1580R300–500 × g bereik
CMOS beeldsensorMeegeleverd met Cellytics apparaatGeïntegreerdGebruikt voor diffractie-beeldvorming
Cytospin CentrifugeNasco KoreaTXT3 Cyto CentrifugeVoor cytospin kleuring
Digitaal verwarmingsblok (37 °C)Daihan ScientificDH.WHB00349Voor celincubatie
ELISA Kit (IFN-γ)R&D systemDIF50CHuman IFN-γ ELISA kit
Guava easyCyte Flow CytometerMillipore0500-5005Voor CD107a expressie analyse
Hema 3 Stat PackThermoFisher122-911Voor cytospin kleuring
IL-12 (Recombinant Human)R&D systemOnderdeel van ASC
IL-2 (Recombinant Human)Peprotech200-02Onderdeel van ASC
Magnetische ScheidingsstandaardMetaimmunetechM13R8Voor parelscheiding
Microscoop slidesMarienfeld1000612Voor cytospin preparaten
NK activeringskitMetaimmunetechMIT2301V, MIT2301AVoor NK cel activering
NK Sep KitMetaimmunetechMIT2301-500Voor NK cel isolatie
PE Muis Anti-Human CD107a, 100 testBD biosciences555801Voor CD107a expressie analyse
Pinhole ApertuurMeegeleverd met Cellytics apparaatGeïntegreerdGebruikt in LSIT verlichtingspad
Pipetten (2–20 µL, 20–200 µL)AXYGENT-200-YInstelbaar volume
Schaduw KalibratieslideMetaimmunetechAS050-GVoor apparaat kalibratie.
1 Kalibratieslide in 1 Assay slide doos
Vortex MixerMerck SI-0246AVoor hersuspensie

Referenties

  1. Alizadeh, E., et al. Cellular morphological features are predictive markers of cancer cell state. Comput Biol Med. 126, 104044(2020).
  2. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single cell sequencing. Clin Transl Med. 13 (1), e1159(2023).
  3. McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17253-17258 (2013).
  4. Karetin, Y. Morphometry of cellular behavior of coelomocytes from starfish Asterias amurensis. PeerJ. 9, e12514(2021).
  5. Chen, D., Luo, Y., Cheng, G. Single cell and immunity: Better understanding immune cell heterogeneities with single-cell sequencing. Clin Transl Discov. 2 (4), e162(2022).
  6. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  7. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  8. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  9. Mujal, A. M., Delconte, R. B., Sun, J. C. Natural killer cells: From innate to adaptive features. Annu Rev Immunol. 39 (1), 417-447 (2021).
  10. Paolini, R., Bernardini, G., Molfetta, R., Santoni, A. NK cells and interferons. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (2), 113-120 (2015).
  11. Cook, K. D., Waggoner, S. N., Whitmire, J. K. NK cells and their ability to modulate T cells during virus infections. Crit Rev Immunol. 34 (5), 359-388 (2014).
  12. Kaur, G., Sandeep, F., Olayinka, O., Gupta, G. Morphologic changes in circulating blood cells of COVID-19 patients. Cureus. 13 (2), e13416(2021).
  13. Hammer, Q., Cuapio, A., Bister, J., Björkström, N. K., Ljunggren, H. G. NK cells in COVID-19-from disease to vaccination. J Leukoc Biol. 114 (5), 507-512 (2023).
  14. Frutoso, M., Mortier, E. NK cell hyporesponsiveness: More is not always better. Int J Mol Sci. 20 (18), 4514(2019).
  15. Dufva, O., et al. Single-cell functional genomics reveals determinants of sensitivity and resistance to natural killer cells in blood cancers. Immunity. 56 (12), 2816-2835.e13 (2023).
  16. Song, P., Li, W., Guo, L., Ying, J., Gao, S., He, J. Identification and validation of a novel signature based on NK cell marker genes to predict prognosis and immunotherapy response in lung adenocarcinoma by integrated analysis of single-cell and bulk RNA-sequencing. Front Immunol. 13, 850745(2022).
  17. Viel, S., et al. Monitoring NK cell activity in patients with hematological malignancies. Oncoimmunology. 2 (9), e26011(2013).
  18. Strauss-Albee, D. M., et al. Human NK cell repertoire diversity reflects immune experience and correlates with viral susceptibility. Sci Transl Med. 7 (297), 297ra115(2015).
  19. Liu, S., Galat, V., Galat, Y., Lee, Y. K. A., Wainwright, D., Wu, J. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development. J Hematol Oncol. 14 (1), 7(2021).
  20. Kim, J. M., et al. Assessment of NK cell activity based on NK cell-specific receptor synergy in peripheral blood mononuclear cells and whole blood. Int J Mol Sci. 21 (21), 8112(2020).
  21. Lorenzo-Herrero, S., Sordo-Bahamonde, C., González, S., López-Soto, A. Evaluation of NK cell cytotoxic activity against malignant cells by the calcein assay. Methods Enzymol. 631, 483-495 (2020).
  22. Nederby, L., Jakobsen, A., Hokland, M., Hansen, T. F. Quantification of NK cell activity using whole blood: Methodological aspects of a new test. J Immunol Methods. 458, 21-25 (2018).
  23. Meza Guzman, L. G., Nicholson, S. E. Determining activation status of Natural Killer cells following stimulation via cytokines and surface receptors. Methods Mol Biol. 2463, 181-194 (2022).
  24. Elsner, L., Dressel, R. 51Cr-release to monitor NK cell cytotoxicity. Methods Enzymol. 631, 497-512 (2020).
  25. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  26. Zarcone, D., Tilden, A. B., Cloud, G., Friedman, H. M., Landay, A., Grossi, C. E. Flow cytometry evaluation of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 94 (1-2), 247-255 (1986).
  27. Ogino, T., Wang, X., Ferrone, S. Modified flow cytometry and cell-ELISA methodology to detect HLA class I antigen processing machinery components in cytoplasm and endoplasmic reticulum. J Immunol Methods. 278 (1-2), 33-44 (2003).
  28. Lion, E., Smits, E. L. J. M., Berneman, Z. N., Van Tendeloo, V. F. I. Quantification of IFN-gamma produced by human purified NK cells following tumor cell stimulation: comparison of three IFN-gamma assays. J Immunol Methods. 350 (1-2), 89-96 (2009).
  29. Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
  30. Clay, T., Hobeika, A., Mosca, P., Lyerly, H., Morse, M. Assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer. Clin Cancer Res. 7 (5), 1127-1135 (2001).
  31. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A novel method for assessment of natural killer cell cytotoxicity using image cytometry. PLOS ONE. 10 (10), e0141074(2015).
  32. Rico, L. G., Ward, M. D., Bradford, J. A., Petriz, J. Flow cytometric quantification of cytotoxic activity in whole blood samples. Curr Protoc. 1 (8), e215(2021).
  33. Kang, H., Choi, A. R., Ryu, J. H., Oh, E. J. Establishing a reference interval for flow cytometry-based NK activity (FC-NKA) assay in healthy Korean population. Lab Med Online. 13 (4), 349-355 (2023).
  34. Baik, M., et al. Label-free CD34+ cell identification using deep learning and lens-free shadow imaging technology. Biosensors. 13 (12), 993(2023).
  35. Cheon, H., et al. Cellytics: A digital inline holography platform for single cell analysis in biomedical and environmental applications. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  36. Roy, M., Jin, G., Seo, D., Nam, M. H., Seo, S. A simple and low-cost device performing blood cell counting based on lens-free shadow imaging technique. Sens Actuators B Chem. 201, 321-328 (2014).
  37. Kim, J., Lee, S. J. Digital in-line holographic microscopy for label-free identification and tracking of biological cells. Mil Med Res. 11 (1), 38(2024).
  38. Wu, Y., Ozcan, A. Lensless digital holographic microscopy and its applications in biomedicine and environmental monitoring. Methods. 136, 4-16 (2018).
  39. Baker, M., Gollier, F., Melzer, J. E., McLeod, E. Lensfree air-quality monitoring of fine and ultrafine particulate matter using vapor-condensed nanolenses. ACS Appl Nano Mater. 6 (13), 11166-11174 (2023).
  40. Palacios, F., Ricardo, J., Palacios, D., Gonçalves, E., Valin, J. L., De Souza, R. 3D image reconstruction of transparent microscopic objects using digital holography. Opt Commun. 248 (1-3), 41-50 (2005).
  41. Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (20), 11301-11305 (2001).
  42. Shin, S., et al. Field-portable seawater toxicity monitoring platform using lens-free shadow imaging technology. Water Res. 230 (119585), 119585(2023).
  43. Su, T. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
  44. Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T. W., Tseng, D., Ozcan, A. Lensless on-chip imaging of cells provides a new tool for high-throughput cell-biology and medical diagnostics. J Vis Exp. (34), e1650(2009).
  45. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Kim, Y. J., Seo, S. Low-cost telemedicine device performing cell and particle size measurement based on lens-free shadow imaging technology. Biosens Bioelectron. 67, 715-723 (2015).
  46. Vaghashiya, R., et al. Machine learning based lens-free shadow imaging technique for field-portable cytometry. Biosensors. 12 (3), 144(2022).
  47. Roy, M., Seo, D., Oh, C. H., Nam, M. H., Seo, S. Staining-free cell viability measurement technique using lens-free shadow imaging platform. Sens Actuators B Chem. 224, 577-583 (2016).
  48. Cheon, H., et al. Multichannel Cellytics for rapid and cost-effective monitoring of leukocyte activation. Biosensors. 15 (3), 143(2025).
  49. Lee, A., et al. Quantification of natural killer cell activation using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac Rim. CMP15A_02. , (2022).
  50. Seo, D., Oh, S., Lee, M., Hwang, Y., Seo, S. A field-portable cell analyzer without a microscope and reagents. Sensors. 18 (1), 85(2017).
  51. Seo, D., et al. Field-portable leukocyte classification device based on lens-free shadow imaging technique. Biosensors. 12 (2), 47(2022).
  52. Baik, M., et al. Machine learning based CD34+ cell detection using lens-free shadow imaging technology. Proc Conf Lasers Electro-Opt Pac. 2022, 1-2 (2022).
  53. Roy, M., Seo, D., Oh, S., Chae, Y., Nam, M. H., Seo, S. Automated micro-object detection for mobile diagnostics using lens-free imaging technology. Diagnostics. 6 (2), 17(2016).
  54. Lee, I., et al. Use of a platform with lens-free shadow imaging technology to monitor natural killer cell activity. Biosens Bioelectron. 261 (116512), 116512(2024).
  55. Jang, H., et al. Investigation of NK cell activity in healthy and immunocompromised individuals using lens-free shadow imaging technology. 2024 IEEE SENSORS. 2024, 1-4 (2024).
  56. Lee, A., Lee, I., Nam, M. H., Jun, H. S., Seo, S. Single cell-based rapid natural killer cell activity measurement by using lens-free shadow imaging technology. Proc SPIE Biophotonics Immune Responses. 123800H, (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Natural killer cellenNK celactivatieimmuunprofileringschaduwbeeldvorminginnate immunity indexcelmorfologiemagnetische scheidingcytoplasmatische complexiteit

Gerelateerde artikelen