Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Chemische beeldvorming met ultrahoge informatie-inhoud met breedband coherente anti-stokes Raman en levenslange microscopie met twee-fotonfluorescentie

1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68845

⸱

7 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel demonstreert een multimodaal beeldvormingsplatform dat breedbandcoherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (BCARS), twee-foton-excitatiefluorescentie (TPEF) en twee-foton-fluorescentie-levenslange beeldvormingsmicroscopie (2p-FLIM) combineert, waardoor chemische bioimaging met een ultrahoge informatie-inhoud mogelijk wordt.

Samenvatting

Raman-vingerafdrukspectroscopie en fluorescentie-levenslange beeldvorming zijn opkomende hulpmiddelen voor het bestuderen van metabole profielen van biologische monsters. Terwijl Raman-vingerafdrukspectroscopie intrinsieke moleculaire trillingen detecteert die de moleculaire samenstelling en chemische omgeving van een monster weerspiegelen, meet fluorescentielevensduurbeeldvorming veranderingen in de opgewonden levensduur van fluoroforen die gevoelig zijn voor hun micro-omgevingen. Hier presenteren we een multimodaal beeldvormingsplatform dat breedband coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (BCARS) en twee-foton fluorescentie levenslange beeldvorming (2p-FLIM) microscopie combineert die biologisch relevante Raman-vingerafdrukspectra en fluorescentielevensduursignalen in vivo en gelijktijdig kan verkrijgen. De enorme chemische informatie die is verkregen uit ruimtelijk gecoregistreerde BCARS- en 2p-FLIM-beelden stelt ons in staat om de subtiele verschillen tussen subcellulaire compartimenten te karakteriseren en de potentiële vals-positieve resultaten te verifiëren die alleen door fluorescentiebeeldvorming worden gegenereerd. Dit wordt aangetoond door de BCARS-, 2p-FLIM- en twee-foton excitatiefluorescentie (TPEF) signalen die gelijktijdig zijn verkregen van hetzelfde met kleurstof gekleurde organel in de levende, intacte C. elegans die een groen fluorescerend eiwit (GFP) -marker tot expressie brengen, rechtstreeks te vergelijken. In dit werk introduceren we het BCARS/2p-FLIM/TPEF-installatieschema, de stappen voor beeldacquisitie, gegevensverwerking en representatieve resultaten die aantonen dat de cross-modale beeldvormingsmethode rigoureuze karakterisering en in vivo detectie met subcellulaire resolutie mogelijk maakt. Dit protocol biedt een kader voor gelijktijdige beeldvorming van chemicaliën en fluorescentie tijdens de levensduur om de nauwkeurigheid van biologische interpretatie in complexe levende systemen te verbeteren.

Inleiding

Een uitdaging in biologische studies is het nauwkeurig detecteren van biologische bouwmaterialen in hun oorspronkelijke staat en binnen de intacte architectuur van cellen en weefsels. Raman-spectroscopie toont een ongekend potentieel voor het detecteren van intrinsieke metabolieten en chemische stoffen in biologische monsters en is onlangs erkend als een opkomend hulpmiddel voor metabole profilering van biologische monsters1. Door de pieken van verschillende metabole groepen te analyseren die worden weergegeven in Raman-vingerafdrukspectra, toont toenemend bewijs aan dat de vingerafdrukkenmerken kunnen worden gebruikt om de vroege stadia van ziekten zoals kanker 2,3,4, hartaandoeningen 5,6 en neurodegeneratieve ziekten 7,8 te detecteren en is bijzonder nuttig voor het aanpakken van fundamentele biologische problemen 9,10 inclusief beeldvorming van intracellulaire structuren zonder enige labelverstoring11, differentiatie van verschillende celtoestanden12,13 en classificatie van celtypen 14,15,16. Het grootste deel van de chemische informatie (> 90%) die in de Raman-spectra is gecodeerd, bevindt zich in het vingerafdrukgebied (500 tot 1800 cm-1), waardoor dit gebied verreweg het meest bruikbaar is voor het onderscheiden van chemische samenstellingen in biologische monsters17. Het zwakke Raman-signaal in dit frequentiebereik maakt de toepassing van Raman-vingerafdrukspectroscopie in biologische studies echter uitdagend, met name voor levende, intacte biologische monsters1.

Coherente Raman-beeldvorming (CRI)-benaderingen verkorten de acquisitietijd van Raman-signalen aanzienlijk, maar de meeste hiervan verwerven relatief smalle spectrale segmenten en zijn geoptimaliseerd voor de sterke CH-reksignalen tussen 2800 - 3100 cm-1. Smalband CARS en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) (Figuur 1A,B) gebruiken twee picosecondepulsen, meestal om een smal deel van het sterke CH-signaal 18,19,20,21,22,23 te verkrijgen. Multiplex CRI-benaderingen, zoals multiplex CARS (Figuur 1C), gebruiken een combinatie van een picoseconde en ~100 fs-pulsen om een gematigd spectraal bereik te verkrijgen (meestal ≤ 400 cm-1), meestal in het CH-gebied 24,25,26,27,28,29,30. Het verkrijgen van een volledig biologisch relevant Raman-spectrum (van 600 - 3200 cm-1) per pixel met behulp van deze beeldvormingsbenaderingen is meestal onbetaalbaar omdat de meeste vingerafdruksignalen 10-100 keer zwakker zijn dan CH-stretchsignalen31. In tegenstelling tot de meeste CRI-benaderingen, is breedband coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (BCARS) geoptimaliseerd voor single-shot breedbandacquisitie die de vingerafdruk- en CH-stretchregio'sbestrijkt 31,32,33. BCARS gebruikt intra-puls interacties van een ~10 fs puls om laagfrequente (vingerafdruk) trillingen efficiënt op te wekken (Figuur 1D), en gebruikt hetzelfde mechanisme als multiplex CARS, de combinatie van de fs puls met een ps puls om vibrationele coherentie te genereren in het CH stretch gebied (Figuur 1C)32,33. Bovendien zijn de BCARS-signalen intrinsiek gekalibreerd vanwege hun interactie met de niet-resonante achtergrond (NRB), wat resulteert in een kwantitatief en instrumentinvariant volledig Raman-spectrum per laserpuls bij elke pixel31, met de mogelijkheid om snel gegevens met een hoge informatie-inhoud te verkrijgen van cellen, intacte weefsels en levende biologische organismen 32,34,35,36,37,38,39.

De verkregen ruwe BCARS-spectra bevatten een sterke zogenaamde "niet-resonante achtergrond" (NRB). De NRB is de bijdrage van de elektronische respons op de laserpulsen die niet chemisch specifiek is. De NRB interfereert coherent met het vibrationeel resonante signaal en fungeert als een heterodyne versterker32. De NRB vervormt ook het onderliggende Raman-spectrum (Figuur 2A), maar het Raman-spectrum kan worden achterhaald zolang er significante aaneengesloten spectraaldoorsneden worden verkregen. Momenteel is er geen nabewerkingsmethode beschikbaar om het resonante CARS-signaal te scheiden van de niet-resonante component met behulp van een smalband CARS-benadering. Het ophalen van het Raman-signaal uit het breedband CARS-signaal kan worden bereikt door gebruik te maken van de tijddomein Kramers-Kronig-relatie (of Hilberttransformatie)33,40 (Figuur 2B), maximale entropie41,42 of machine-learning 43,44,45,46,47,48 Benaderingen. Merk op dat de eerste twee methoden analytisch de fase (het resonante Raman-signaal) halen uit de ruwe BCARS-spectra, de machine-learning-benaderingen kunnen sterk afhankelijk zijn van de instrumentatie en de trainingsmodellen.

Hoewel BCARS-microscopie labelvrije karakterisering van metabole profilering van biologische monsters mogelijk maakt, kan dezelfde supercontinuümlaser (950 - 1200 nm voor de BCARS-opstelling die in dit werk wordt gepresenteerd) die wordt gebruikt voor het genereren van BCARS-signalen, ook een breed scala aan kleurstoffen exciteren, zoals op rhodamine gebaseerde, op Bodipy gebaseerde, op Alexa fluor gebaseerde en op cyanine gebaseerde kleurstoffen, en verschillende fluorescerende eiwitten, waaronder GFP en mCherry49, 50. okt. Vergeleken met single-photon excitatie met behulp van zichtbare continue golf (CW) lasers, biedt multifoton fluorescentiemicroscopie, zoals twee-foton fluorescentie levenslange beeldvormingsmicroscopie (2p-FLIM) en twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (TPEF), met behulp van nabij-infrarood (NIR) licht een diepere penetratiediepte van het monster, intrinsieke 3D-sectiemogelijkheden, contrastrijke beelden en een goede resolutie die vergelijkbaar is met state-of-the-art confocale microscopie, waardoor het een aantrekkelijk hulpmiddel is voor biologische Onderzoek 51,52. Fluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM) met behulp van een tijdgecorreleerde enkelvoudige fotontelling (TCSPC)-benadering detecteert de fluorescentievervalsignalen die herhaaldelijk worden opgewekt door een tijdgemoduleerde laserbron53,54. Het fluorescentiespectrum van een bepaalde fluorofoor kan veranderen door omgevingsfactoren zoals de polariteit van het oplosmiddel, maar deze veranderingen zijn meestal subtiel. Aan de andere kant varieert de levensduur van fluorescentie vaak met factoren van twee of meer met veranderingen in de omgeving zoals pH-waarden55, viscositeit56, polariteit57 en concentratie van ionische soorten58,59, bindingsinteracties, de aanwezigheid van quenchers of structurele veranderingen53,54. Deze unieke eigenschap van de fluorescentielevensduur zorgt voor een extra signaalcontrast in fluorescentiebeeldvorming en heeft met succes de problemen van autofluorescentie-interferentie in cel- en weefselbeeldvormingaangepakt 60, het ontmengen van meerdere fluoroforen met behulp van een spectraal opgeloste FLIM-benadering61, kankerdiagnose en behandelingsmonitoring62, labelvrije detectie van cellulaire heterogeniteit63 en metabole veranderingen64,65.

In dit werk introduceren we een multimodaal beeldvormingsplatform dat BCARS, 2p-FLIM en TPEF combineert. Voor zover wij weten, is dit de eerste keer dat een beeldvormingsplatform wordt gepresenteerd dat gelijktijdige BCARS en 2p-FLIM/TPEF-beeldvorming mogelijk maakt. We demonstreren de in vivo beeldvormingsmogelijkheden van dit instrument met behulp van een veelgebruikt genetisch traceerbaar modelorganisme, Caenorhabditis elegans (C. elegans). We laten zien dat de BCARS-spectra, het 2p-FLIM-verval van Nijlrood (een vitale lipidekleurstof) en de twee-fotonfluorescentie GFP-signalen van een gerapporteerde lipidemarker (DHS-3::GFP) tegelijkertijd in vivo kunnen worden verkregen van Nijlrood-gekleurde wormen. Een praktische gids voor de beeldvormingsbenadering die hier wordt gepresenteerd, omvat: (i) het monster moet optisch transparant zijn en een dikte hebben die doorgaans minder dan 100 μm is; (ii) de kleuringstoestand kan verschillen, afhankelijk van de kleurstoffen en monsters. In de hier getoonde resultaten van de Nijlrood-kleuring van C. elegans , ligt de Nijlroodconcentratie op ~μM-niveau en kan de kleuringstijd variëren van enkele uren tot 's nachts66; (iii) een donkere monsteromgeving is vereist om lekkage van zichtbaar licht in de 2p-FLIM/TPEF-detectoren te voorkomen. Deze beeldvormingsomstandigheden zijn identiek aan de beeldvormingsomstandigheden van de meeste niet-lineaire optische en fluorescentiemicroscopie. Bovendien kan ons hier gedemonstreerde systeem verder worden toegepast om naast Nile Red en GFP ook andere kleurstoffen en fluorescerende reporters te detecteren door een extra Ti:Sapphire fs-laser te introduceren die een bereik van 700 -950 nm bestrijkt voor de twee-foton fluorescentie-excitatie. Hoewel de representatieve resultaten die in dit protocol worden beschreven, de in vivo beeldvorming zijn van kleurstof-gekleurd C. elegans die GFP tot expressie brengt, heeft het chemische bioimaging-platform met ultrahoge informatie-inhoud toepassingen die breed en verreikend zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. C . elegans monstervoorbereiding en Nile Red Vital kleuring

OPMERKING: C. elegans is veel gebruikt voor meerdere beeldvormingstechnieken vanwege de transparantie van het hele lichaam. De inwendige organen en weefsels kunnen gemakkelijk in beeld worden gebracht in het intacte dier zonder dissectie. Bovendien is ethische goedkeuring niet vereist voor onderzoek waarbij C. elegans betrokken is, aangezien ze niet als gewervelde dieren worden beschouwd en niet onderworpen zijn aan dezelfde ethische regels als hogere dieren zoals knaagdieren. In dit hoofdstuk wordt de synchronisatie van C. elegans-wormen beschreven en de voorbereiding van monsters met Nijlrood gekleurd voor fluorescentiebeeldvorming. Gesynchroniseerde eendaagse volwassen wormen worden verkregen via een legprotocol van twee generaties en gekleurd met vers bereide Nile Red-OP50-platen.

  1. Onderhoud de C. elegans-stammen (bijv. N2, LIU1, ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) op standaard platen met nematodengroeimedium (NGM) gezaaid met OP50-bacteriën bij 20 °C.
  2. Synchroniseer de wormen
    1. Pluk 10-20 drachtige volwassen wormen op een vers gemaakte OP50-gezaaide NGM-plaat.
    2. Incubeer de plaat gedurende 1-3 uur bij 20 °C om eieren te kunnen leggen.
    3. Verwijder alle volwassen wormen en laat alleen de vers gelegde eieren op het bord liggen.
    4. Incubeer de plaat bij 20 °C totdat de wormen het eendaagse volwassen stadium bereiken.
    5. Herhaal de bovenstaande stappen voor een extra generatie om de synchronisatieprecisie te verbeteren.
  3. Bereid Nijlrode voorraadoplossing voor
    1. Los 15,92 mg Nijlrood op in 10 ml DMSO tot een eindconcentratie van 5 mM.
    2. Sonificeer indien nodig gedurende 10-30 minuten om het oplossen te bevorderen.
  4. Bereid Nile Red-OP50 kleurplaten voor.
    1. Meng OP50 bacteriële suspensie grondig met de Nijlrood-bouillon om een uiteindelijke Nijlroodconcentratie van 5 μM per NGM-plaat te bereiken. Meng bijvoorbeeld 10 μL van de Nijlrood-bouillon met 20 μL OP50 bacteriële suspensie en breng het hele mengsel vervolgens onmiddellijk aan op een niet-gezaaide NGM-agarplaat van 6 cm (met ~10 ml volume) om een uiteindelijke Nijlroodconcentratie van 5 μM per NGM-plaat te maken.
    2. Verdeel het mengsel gelijkmatig over ongezaaide NGM-platen van 6 cm.
    3. Bewaar borden een nacht in het donker bij kamertemperatuur om bacteriegroei en kleurstofabsorptie mogelijk te maken.
  5. Vlek gesynchroniseerde wormen
    1. Breng 30-50 gesynchroniseerde volwassen eendagswormen over op elke geprepareerde Nile Red-OP50-plaat.
    2. Incubeer de wormen in het donker bij 20 °C gedurende 1-2 uur voordat u de beeldvorming uitvoert.
  6. Immobiliseer wormen voor beeldvorming
    1. Breng een druppel 100 mM natriumazide aan op een 2% agarosepad op een microscoopglaasje (ongeveer 10-15 μL voor 20 wormen)
    2. Breng de bevlekte wormen over op het verdovende middel (natriumazide) en bedek de wormen met een dekglaasje voorafgaand aan de microscopie.
      OPMERKING: Bij het plukken van 10-20 zwangere volwassenen op een vers gemaakte NGM OP50-plaat in de eerste stap van de synchronisatie van het leggen van eieren, pluk dan alleen de volwassenen, maar geen verdwaalde eieren of larven. Dit is om ervoor te zorgen dat alle resterende eieren op de borden binnen het tijdsbestek van 1-3 uur voor het leggen van eieren worden geproduceerd door de geplukte wormen. Bovendien is natriumazide geclassificeerd als een gevaarlijk materiaal, hoewel het een zeer kleine hoeveelheid nodig heeft voor anesthesie. Het gebruik en de verwijdering van natriumazide-afval moet voldoen aan de richtlijnen van de institutionele afdeling Milieu, Gezondheid en Veiligheid.

2. Genereren van sondestralen

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de generatie van de picoseconde (ps) sondebundel met behulp van een zelfgebouwde optische parametrische oscillator (OPO) gevolgd door tweede harmonische generatie (SHG) met een zelfgebouwd signaalfeedbacklussysteem om het uitgangsvermogen van de sondestraal te stabiliseren.

  1. Schakel de OPO-pomplaser van 1030 nm in (Figuur 3A of de OPO-pomplaser van nabij 1ps, ~3 W weergegeven in afbeelding 4) en wacht ten minste 2 uur voor thermische evenwicht. Stabiele output is van cruciaal belang voor de werking van OPO.
  2. Leid de uitgang naar de OPO-holte
    1. Selecteer de juiste polingperiode op het OPO PPLN-kristal (Figuur 3A) die overeenkomt met de golflengte van het doelsignaal.
    2. Richt de straal op de eerste gebogen spiegel (CM) (Figuur 3A), die deel uitmaakt van een lineaire holte.
    3. Zorg ervoor dat de straal door het OPO periodiek gepoleerde lithiumniobaat (PPLN)-kristal gaat (Figuur 3A) om optische parametrische neerwaartse conversie te vergemakkelijken (Figuur 3B).
    4. Zorg ervoor dat de straal weerkaatst op een tweede gebogen spiegel (CM) en vervolgens op de eindspiegel (EM) (Figuur 3A) om de holtelius te vormen.
    5. Configureer de uitgangskoppeling (OC) (Figuur 3A) om de gegenereerde signaalbundel uit de holte te halen.
  3. Pas de temperatuur van het OPO PPLN-kristal aan met behulp van de temperatuurregelaar (TC) (Figuur 3A) om de signaalgolflengte te selecteren. Een typische signaalgolflengte is 1530 nm, wat overeenkomt met een uitgangsvermogen van ongeveer 0,8 W wanneer gepompt met 3 W bij 1064 nm.
  4. Optimaliseer de OPO-uitlijning
    1. Pas de positie en kanteling van twee CM's en EM aan om het uitgangsvermogen en de straalkwaliteit te maximaliseren.
    2. Pas de lengte van de holte aan om het signaalspectrum naar de gewenste frequentie te verschuiven.
  5. Leid de OPO-signaalstraal door een set collimator- en focusseeroptieken en leid deze naar de SHG-trap.
    1. Selecteer de juiste polingperiode op het SHG PPLN-kristal (Figuur 3A) om overeen te komen met de golflengte van het doelsignaal.
    2. Regel de kristaltemperatuur nauwkeurig met behulp van een temperatuurregelaar om de SHG-efficiëntie te maximaliseren.
    3. Richt de straal op het SHG PPLN-kristal voor de tweede harmonische generatie, waarbij het OPO-signaal van 1530 nm wordt omgezet in 765 nm (Figuur 3C). De typische SHG-conversie-efficiëntie is ongeveer 30% onder optimale uitlijningsomstandigheden.
    4. Plaats een 1300 nm shortpass-filter (SPF in figuur 3A, specificaties in materiaaltabel) na de SHG PPLN om het resterende fundamentele licht van 1530 nm te verwijderen.
    5. Collimeer de resulterende straal van 765 nm met behulp van een geschikte lens (zoals L in figuur 3A).
  6. Vermogensstabilisatie implementeren
    1. Gebruik een wigvenster (WW) om de SHG-straal te bemonsteren en richt deze op een fotodiode (PD).
    2. Zorg ervoor dat een feedbacklus het fotodiodesignaal (PD in figuur 3A) vergelijkt met een referentiewaarde en de picomotor op de eindspiegel (EM) bedient om de OPO-holtelengte in realtime aan te passen, waardoor het SHG-uitgangsvermogen wordt gestabiliseerd.
      NOTITIE: Om de referentiewaarde te bepalen, scant u eerst de EM-positie met behulp van de Picomotor terwijl u het SHG-uitgangsvermogen registreert. Identificeer de piekintensiteit in dit profiel en stel vervolgens de referentiewaarde in op 90% van de piek. Deze keuze zorgt voor een duidelijke richting van de feedbackcorrectie, waardoor het systeem zowel stijgende als afnemende trends in vermogen kan compenseren en het uitgangsvermogen in de loop van de tijd effectief kan stabiliseren.

3. Supercontinuüm (SC) generatie voor BCARS

OPMERKING: De vereenvoudigde opzet van het op BCARS gebaseerde multimodale systeem wordt weergegeven in figuur 4. Dit protocol beschrijft het genereren van de SC-balk.

  1. Pas de pre-chirp (Group Delay Dispersion, GDD) aan de femtoseconde (fs) pulsoutput aan (1030 nm, 150 fs, ~1 W) om een voldoende brede SC-bandbreedte te verkrijgen die de signalen van het vingerafdrukgebied dekt (SC-bandbreedte ≥ 1800 cm−1). Dit wordt bereikt door de scheiding van een roosterpaar aan te passen (zie figuur 4), waardoor een nauwkeurige controle over de spreiding mogelijk is.
    OPMERKING: De toepassing van voorgecompenseerde GDD is cruciaal voor het genereren van de gewenste puls en het optimaliseren van SC-generatie. De vereiste GDD-waarde kan variëren, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het gebruikte lasersysteem.
  2. Gebruik een straaltelescoop die bestaat uit twee lenzen met dezelfde brandpuntsafstanden om de divergentie van de pompstraal aan te passen.
    OPMERKING: Wanneer de straal zich over meters verplaatst voordat hij de verbredende vezel binnengaat, wordt een nauwkeurige regeling van de straaldivergentie essentieel. Het handhaven van een gecollimeerde straal gedurende deze afstand is van cruciaal belang om een efficiënte SC-generatie te garanderen.
  3. Stel de auto-aligner (Figuur 4) in met behulp van kinematische spiegelbevestigingen die zijn uitgerust met piëzo-actuatoren voor straalbesturing. Combineer deze met optische wiggen en een Position Sensing Detector (PSD) om de uitlijning van de bundel actief te bewaken en te corrigeren.
  4. Plaats de componenten zo dat de afstand van de wig tot de eerste spiegel gelijk is aan de afstand van de wig tot de eerste PSD. Deze symmetrische configuratie zorgt voor stabiliteit bij het richten van de balk in de verbredende vezel.
    OPMERKING: Actieve uitlijning is essentieel voor het maximaliseren van de spectrale verbredingsefficiëntie en het minimaliseren van het risico op schade aan de vezelinvoer.
  5. Gebruik een halvegolfplaat (HWP) en een polariserende straalsplitser (PBS) om het laservermogen te regelen voordat u deze in de vezel koppelt. Draai de hoogwerker om de polarisatiehoek ten opzichte van de PBS aan te passen, waardoor het uitgezonden vermogen wordt afgestemd. Hoewel deze componenten niet worden weergegeven in afbeelding 4, zijn ze van cruciaal belang voor een veilige uitlijning en vermogensregeling.
  6. Koppel ongeveer 1 W laservermogen aan een 10 cm Large-Mode-Area Polarization Maintaining (LMA-PM-5) fotonische kristalvezel (PCF) met behulp van een vezelkoppeling. De koppelingsprocedure is als volgt:
    1. Verminder eerst het laservermogen tot ~20-50 mW tijdens de eerste uitlijning om schade aan de vezel te voorkomen.
    2. Richt de gecollimeerde straal op de vezel en zorg ervoor dat er wat licht van de andere kant komt. Optimaliseer het straalpad door de positie aan te passen om het uitgangsvermogen te maximaliseren.
    3. Plaats de asferische lens (Figuur 4), stel de straal opnieuw af om het uitgangsvermogen te maximaliseren.
    4. Pas de z-positie van de asferische lens aan om een nauwkeurige scherpstelling op het facet van de vezel te garanderen.
    5. Herhaal de uitlijning en focusaanpassingen iteratief om de koppelingsefficiëntie te maximaliseren.
    6. Verhoog het laservermogen tot 1 W voor gebruik.
  7. Collimeer de resulterende breedband supercontinuüm (SC) output van de PCF met behulp van een off-axis parabolische (OAP) spiegel met brandpuntsafstand f = 15 mm, zoals weergegeven in figuur 4.
    OPMERKING: Reflecterende optica, zoals de OAP-spiegel, heeft de voorkeur voor breedbandbundels om chromatische aberratie veroorzaakt door brekingselementen te minimaliseren.
  8. Leid de gecollimeerde breedband supercontinuüm (SC)-uitvoer naar een prismacompressor (Afbeelding 4) die bestaat uit een paar Schott Flint (SF10) prisma's.
    1. Richt de SC-straal op de top van het eerste prisma om spectrale dispersie te initiëren.
    2. Plaats het tweede prisma zo dat de verspreide straal via de top naar binnen gaat.
    3. Monteer beide prisma's op een railsysteem om een grove afstelling van de prismascheiding mogelijk te maken. Vertaal het tweede prisma langs de rail om de optische weglengte en de algehele compressie aan te passen. De afstand voor dit systeem is 44 cm.
    4. Monteer het eerste prisma op een lineaire precisietranslatietafel. Pas de insteekdiepte van het eerste prisma aan om de dispersiecompensatie nauwkeurig af te stellen.
    5. Pas zowel de prismascheiding als de insteeklengte van het tweede prisma iteratief aan om een optimale tijdelijke compressie van de SC-puls te bereiken. Bepaal de optimale temporele compressie door het experimenteel waargenomen gedegenereerde vier-golf menging (DFWM) signaal te matchen met gesimuleerde resultaten die rekening houden met groepsvertragingsdispersie (GDD) en derde-orde-dispersie (TOD). Deze benadering omvat het uitvoeren van een simulatie van het supercontinuümgeneratieproces, waarbij de effecten van GDD en TOD zijn geïntegreerd, wat een referentie biedt voor de verwachte temporele en spectrale kenmerken van de optimaal gecomprimeerde SC-pulsen. Pas vervolgens iteratief de parameters van de prismacompressor aan om te compenseren voor de GDD en TOD die in het systeem aanwezig zijn totdat het experimentele DFWM-signaal overeenkomt met de simulatievoorspellingen. Een typisch resultaat van het spectrale profiel van de SC wordt weergegeven in figuur 5.
      OPMERKING: Een goede dispersiecompensatie verbetert de spectrale coherentie van de SC. Bij optimale uitlijning heeft de SC-uitgang een vermogen van ongeveer 150 mW, een centrale golflengte rond 1060 nm en een spectraal bereik van 950 tot 1200 nm (overeenkomend met 1800 cm-1). Deze waarden kunnen enigszins variëren, afhankelijk van de uitlijning en de efficiëntie van de vezelkoppeling.
  9. Combineer de sonde- en supercontinuümbundels met behulp van een dichroïsche spiegel (zie DM in figuur 4). Lijn ze uit met een paar gaatjes om ervoor te zorgen dat beide stralen collineair zijn. Concentreer de gecombineerde bundels op een hoogfrequente fotodiode (1 GHz bandbreedte). Voor een optimale signaalkwaliteit moeten beide bundels elkaar overlappen in zowel het ruimtelijke als het temporele domein. Het proces is als volgt:
    1. Leid de output van de fotodiode naar een hoogfrequente oscilloscoop (500 MHz bandbreedte). Gebruik de lasertrigger als referentieklok.
    2. Blokkeer de sondestraal en meet de SC-pulsen. Noteer de tijdelijke verschillen tussen de SC-pulsen en de laserreferentie.
    3. Blokkeer de SC-straal en meet de sondepulsen. Stel de mechanische vertragingslijn (zoals weergegeven in afbeelding 4) zo af dat de sondepulsen overlappen met de SC-pulsen in de tijd. Zorg ervoor dat de twee stralen tegelijkertijd hun maximum bereiken.
    4. Verwijder de fotodiode en laat de straal in de microscoop gaan.
      OPMERKING: De bovenstaande stappen beschrijven een grove aanpassing voor overlapping van de ligger. Verdere optimalisatie voor een nauwkeurigere uitlijning wordt behandeld in de stappen 6.1 tot en met 6.9.

4. Opzetten van de fluorescentiedetectie voor 2p-FLIM en TPEF en introduceren van een extra Ti:Sapphire fs-laser

  1. Zet de Ti:Sapphire laser aan en laat deze een thermisch evenwicht bereiken. Wacht ongeveer 2 uur om een stabiel uitgangsvermogen en straalrichting te garanderen.
    OPMERKING: In deze studie werden TPEF- en FLIM-beeldvorming uitgevoerd met behulp van de SC-bron, die een brede spectrale dekking en voldoende vermogen biedt voor fluoroforen zoals GFP en Nijlrood. De Ti:Sapphire laser is in het systeem opgenomen als een optionele excitatiebron voor fluoroforen met absorptiepieken van twee fotonen onder 950 nm, die mogelijk niet efficiënt worden geëxciteerd door de SC.
  2. Activeer het modusvergrendelingsmechanisme op de Ti:Sapphire laser. Controleer de stabiele modusvergrendeling via de ingebouwde monitor.
  3. Piep de Ti:Sapphire-pulsen voor voor optimale temporele compressie bij het monster met behulp van een prismacompressor. Plaats de prisma's in een configuratie die vergelijkbaar is met die beschreven in stap 3.8 en pas de insteeklengte van het tweede prisma aan om de pulsduur te verfijnen.
    OPMERKING: De juiste temporele compressie zorgt voor een piekintensiteit en een efficiënte excitatie van twee fotonen in het monstervlak.
  4. (Optioneel) Koppel de Ti:Sapphire-straal aan een polarisatiebehoudende single-mode vezel als de laser zich op een aparte optische tafel bevindt. Pas de optiek van de ingangskoppeling aan en bewaak de vezeluitvoer om koppelingsverliezen te minimaliseren.
  5. Combineer de Ti:Sapphire bundel met het supercontinuüm (SC) en sondebundels met behulp van een dichroïsche spiegel (zie het combinatiepunt bij PBS weergegeven in figuur 3). Lijn de bundels zorgvuldig uit om ruimtelijke overlapping bij de dichroïsche en co-propagatie naar de microscoop te garanderen.
  6. Leid de gecombineerde bundels naar de microscoop en stel hun ruimtelijke overlap nauwkeurig af. Gebruik een fluorescerend monster (bijv. een dia met fluorescerende polystyreenkorrels van 1 μm) om de uitlijning van de Ti:Sapphire-straal ten opzichte van het BCARS-excitatiepad te verifiëren. Pas de Ti:Sapphire-uitlijningsspiegels aan om ervoor te zorgen dat de fluorescentie-emissie samen met het BCARS-brandpunt binnen hetzelfde beeldveld wordt gelokaliseerd. Bevestig de colokalisatie door de overlap tussen de BCARS- en TPEF-beelden die tegelijkertijd worden verkregen te visualiseren, waarbij de ruimtelijke verschuiving minder dan één pixel moet zijn.
    OPMERKING: Het bereiken van ruimtelijke overlap tussen fluorescentie- en BCARS-signalen is essentieel voor multimodale beeldregistratie.
  7. Plaats een dichroïsche spiegel vóór de microscoopinvoer om terugverstrooide fluorescentie naar het detectiepad te reflecteren. Selecteer een dichroïsche met een geschikte cutoff-golflengte om fluorescentie efficiënt te scheiden van de excitatiebundels.
  8. Plaats een tweede dichroïsche spiegel stroomafwaarts in het emissiepad om het fluorescentiesignaal in twee detectietakken te splitsen:
    1. Zend golflengten ≥ 550 nm uit naar de FLIM-detector.
    2. Reflecteer golflengten ≤ 550 nm in de richting van een fotomultiplicatorbuis (PMT) voor detectie van analoge twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF).
      OPMERKING: Installeer banddoorlaatfilters in elke detectietak om resterend excitatielicht te blokkeren en om specifieke emissiebanden te isoleren.
  9. Sluit de PMT-uitgang aan op een voorversterker en voer het versterkte analoge signaal in een data-acquisitie (DAQ)-apparaat. Deel de globale synchronisatietrigger van de field programmable gate array (FPGA) met de DAQ om tijdelijke afstemming tussen beeldvormingsmodaliteiten te garanderen (Afbeelding 7).
  10. Sluit de FLIM-detectoruitgang aan op een tijdgecorreleerde module voor het tellen van enkelvoudige fotonen (TCSPC).
    1. Sluit het FLIM-detectorsignaal aan op de startingang van de TCSPC-module.
    2. Sluit de synchronisatie-uitgang van de Ti:Sapphire laser (of BCARS SC) aan op de referentie-ingang van de TCSPC-module.
    3. Sluit de globale cameratrigger (gegenereerd door de FPGA) aan op de framesynchronisatie-ingang van de TCSPC-module om te synchroniseren met lijngescande beeldacquisitie.

5. Het BCARS-detectiepad instellen

OPMERKING: In dit protocol wordt beschreven hoe een gescand detectiepad wordt ingesteld voor hyperspectrale beeldvorming bij het scannen van lijnen. De 1D galvospiegel scant de excitatiestraal langs de y-as met een verblijftijd van 2-4 ms per pixel voor voldoende signaalintegratie. Na elke lijnscan gaat de monsterfase één stap verder langs de x-as. Descanning met behulp van een gesynchroniseerde secundaire galvospiegel is essentieel om een consistente ruimtelijke registratie van het spectrale signaal op de camera te behouden tijdens het snel scannen van de bundel, waardoor signaaloverspraak tussen aangrenzende pixels wordt geëlimineerd en de ruimtelijk-spectrale getrouwheid behouden blijft39.

  1. Introduceer het supercontinuüm (SC) en de sondebundels in een eendimensionale (1D) galvoscanner (zoals weergegeven in afbeelding 4 en meer details in referentie39). Plaats de galvospiegel geconjugeerd naar de achteropening van het scherpstelobjectief om een nauwkeurige bundel over het gezichtsveld te kunnen scannen.
  2. Breid elke straal uit met behulp van een reflecterende straalexpander (zoals weergegeven in afbeelding 4) om overeen te komen met de achteropening van het excitatieobjectief. Dit zorgt voor een optimale scherpstelling en een maximale ruimtelijke resolutie in het samplevlak.
    OPMERKING: Gebruik reflecterende optiek om chromatische aberratie te minimaliseren en de breedbandspectrale inhoud van de SC-straal te behouden.
  3. Plaats een uitlijningsdoel op het achterste diafragmavlak van het excitatieobjectief. Stel de SC- en sondebundels zo af dat beide door het midden van het doel gaan, zodat ze samen langs de optische as worden uitgelijnd.
    OPMERKING: Nauwkeurige ruimtelijke overlapping maximaliseert de signaalsterkte van BCARS en zorgt voor een maximale ruimtelijke resolutie bij het brandpunt.
  4. Concentreer de bundels op het monster met behulp van een high-NA excitatie-objectief (bijv. 1.2 NA, 60x water-immersie-objectief) gemonteerd op een omgekeerde microscoop.
  5. Bereid een uitlijningsmonster voor door een druppel water tussen twee dekglaasjes te klemmen om een verzegeld microscoopglaasje te maken. Plaats het voorbereide glaasje op de microscooptafel en pas de scherpstelling aan om het monster in beeld te brengen.
  6. Verzamel het gegenereerde anti-Stokes-signaal tijdens de uitzending met behulp van een verzameldoel dat tegenover het excitatiepad is geplaatst.
  7. Implementeer een 4f-descansysteem (zoals weergegeven in afbeelding 4) om de ruimtelijke toewijzing van het anti-Stokes-signaal op vaste rijen van de detector te behouden.
    1. Geef het achterste brandvlak (BFP) van het verzamelobjectief door aan de as van de descanning galvospiegel met behulp van een optisch 4f-systeem. Deze bestaat uit twee precisiebuislenzen (zie materiaaltabel), die zo zijn gerangschikt dat:
      1. De eerste lens wordt één brandpuntsafstand (200 mm) na de BFP van het verzamelobjectief geplaatst.
      2. De tweede lens wordt één brandpuntsafstand voor de galvospiegel geplaatst.
    2. Synchroniseer de descangalvo met de scangalvo met behulp van een FPGA-gestuurde golfvormgenerator.
    3. Integreer een 7-bits digitale potentiometer in het FPGA-besturingssysteem om de amplitude van de descanning galvo aan te passen.
      OPMERKING: De descanning galvospiegel compenseert de hoekafbuigingen die worden veroorzaakt door de primaire scangalvo. Door de hoek dynamisch synchroon aan te passen, gaat het de beweging van de straal tegen en zorgt ervoor dat het anti-Stokes-signaal uitgelijnd blijft langs de optische as die naar de spectrometer leidt. Deze stabilisatie is essentieel om de ruimtelijke registratie op de detector te behouden en zijdelingse verplaatsing van het spectrale beeld tijdens het scannen te voorkomen.
  8. Configureer het FPGA-systeem (zie Materiaaltabel) om galvoscanning en cameratriggering te synchroniseren.
    1. Genereer analoge uitgangen voor de scan- en descangalvo's.
    2. Accepteer een invoerfasetrigger om het begin van elke lijnscan te markeren.
    3. Het vastleggen van het uitvoerframe activeert signalen naar de wetenschappelijke complementaire metaaloxide-halfgeleidercamera (sCMOS) op elke scanpositie.
    4. Regel onafhankelijk de descan-amplitude om tegemoet te komen aan verschillende inzamelingsdoelen.
      OPMERKING: Een typische FPGA-pulstrein bevat een scanning galvo-aandrijfsignaal, een descanning galvo-drive-signaal, een Stage-triggerinvoer en een pixelklok voor gesynchroniseerde frametiming.
  9. Leid het gecollimeerde anti-Stokes-signaal door twee kortdoorlaatfilters om de restpomp en het SC-excitatielampje te blokkeren.
  10. Richt het gefilterde anti-Stokes-signaal door de ingangsspleet van de spectrometer en op de sCMOS-detector. Pas de hoeken van zowel de scanning- als de descangalvo's aan om ervoor te zorgen dat de straal evenwijdig aan de lange as van de spleet wordt gescand, waarbij het optische beeldvlak wordt uitgelijnd met de spleet. Deze nauwkeurige uitlijning maximaliseert de spectrale resolutie en minimaliseert de laterale signaaloverspraak over de detectorrijen.
  11. Configureer de spectrometer om het anti-Stokes-spectrum verticaal langs de camerarijen te verspreiden. Kies een geschikt rooster (bijv. 300 lijnen/mm, gevlamd op 700 nm) voor een optimale spectrale dekking.

6. Signaaloptimalisatie en kalibratie van spectrale resolutie

  1. Start de zelfgebouwde acquisitiesoftware en begin met real-time signaalbewaking vanaf de sCMOS-camera. De acquisitiesoftware is zelf gebouwd in Python 3.8+ (Windows 10) met afhankelijkheden zoals Hamamatsu DCAM-API en Measurement Computing Universal Library-stuurprogramma's, die gegevens in HDF5-formaat uitvoeren. Software is beschikbaar op redelijk verzoek van de corresponderende auteur.
  2. Bereid een spectraal kalibratiemonster voor door een druppel benzonitril tussen twee dekglaasjes te plaatsen om een afgesloten objectglaasje te vormen. Plaats het objectglaasje op de microscooptafel en breng het scherp met behulp van het excitatieobjectief.
  3. Zoek het BCARS-signaal op de sCMOS-camera. Pas de z-positie van het verzamelobjectief aan om de intensiteit van het anti-Stokes-signaal te maximaliseren.
  4. Pas de zijwaartse positie van het verzamelobjectief aan om ervoor te zorgen dat het anti-Stokes-licht correct wordt gefocusseerd door de ingangsspleet van de spectrometer. Deze uitlijning zorgt voor een optimale koppeling in de spectrometer en een verbeterde spectrale getrouwheid.
  5. Optimaliseer de ruimtelijke overlap tussen het supercontinuüm (SC) en de sondebundels op het monstervlak. Gebruik spiegels in het straalpad van de sonde om de zijwaartse positie en invalshoek nauwkeurig aan te passen.
  6. Vertaal de optische vertragingslijn in het pad van de sondebundel om tijdelijke overlapping met de SC-pulsen te garanderen. Bewaak de signaalintensiteit en pas deze aan totdat het anti-Stokes-signaal is gemaximaliseerd, waardoor de juiste temporele synchronisatie wordt bevestigd.
  7. Identificeer een sterke, scherpe Raman-piek in benzonitril (bijv. 1002 cm-1) op het sCMOS-beeld.
  8. Registreer de golflengte van de sonde en de bijbehorende pixelpositie op de camera. Gebruik de Rayleigh-lijn (0 cm-1 op de golflengte van de sonde) en bekende benzonitril Raman-pieken op 1002 cm-1 en 3073 cm-1 om een lineaire pixel-naar-golfnummertoewijzing over de sCMOS-detector tot stand te brengen. De Rayleigh-lijn levert de nul-golfgetalreferentie, terwijl de benzonitrilpieken de golfgetaltoename per pixel bepalen.
    OPMERKING: Aangezien voor de analyse alleen informatie over het relatieve golfgetal nodig is (mapping tussen pixelpositie en Raman-verschuiving), is absolute golflengtekalibratie met emissielampen niet nodig.
  9. Voer de pixel-golfnummertoewijzing in de acquisitiesoftware in. Deze kalibratie moet geldig blijven, tenzij er wijzigingen worden aangebracht in het optische pad, de roosterinstelling in de spectrometer of de uitlijning.

7. Signaal acquisitie

  1. Laad het C. elegans-monster dat in de stappen 1.1 tot en met 1.6 is voorbereid, op de microscooptafel. Zoek een interessegebied en breng het in beeld met behulp van de excitatiedoelstelling.
  2. Identificeer een gebied op de dia dat geen Raman-actief signaal heeft (waterachtergrond of een kale glazen dekglaas) om te dienen als referentie voor niet-resonante achtergrond (NRB).
  3. Zoek het BCARS-signaal op de sCMOS-detector. Verfijn de z-positie van het verzamelobjectief om de anti-Stokes-signaalintensiteit te maximaliseren.
  4. Pas de zijwaartse positie van het verzamelobjectief aan om ervoor te zorgen dat het anti-Stokes-licht goed is uitgelijnd door de ingangsspleet van de spectrometer.
  5. Start het gesynchroniseerd scannen en scannen van galvospiegels met behulp van de FPGA. Pas de amplitude van de descanning galvo aan met behulp van de digitale potentiometer totdat de hoekafbuiging van de primaire scan volledig is gecompenseerd. Het anti-Stokes-signaal moet beperkt blijven tot ~12 rijen op de camera over het gehele scanbereik.
  6. Een temporele acquisitievolgorde definiëren
    1. Verkrijg een kruiscorrelatiesignaal tussen de SC- en sondepulsen door de sondepuls te vertragen. Om dit te verkrijgen, zet u het geïntegreerde driekleurige BCARS-signaal uit versus de tijdsvertraging van de sondepuls. Het sterkste signaal verschijnt op tijdstip 0 wanneer de SC- en sondepulsen elkaar tijdelijk overlappen.
      OPMERKING: Aangezien de FLIM- en TPEF-detectiesystemen dezelfde trigger delen als BCARS, worden hun signalen tegelijkertijd op dit tijdstip ontvangen.
    2. Neem op met een latere vertraging van de sondebundel (bijv. 1-2 ps) voor BCARS en een latere vertraging van de SC-bundel voor niet-resonante achtergrond (NRB-spectra in figuur 6A). Wanneer een tijdsvertraging wordt toegepast op de smalbandpuls (sonde), kan de NRB in het driekleurige CARS-signaal effectief worden onderdrukt en kan zo de signaal-ruisverhouding worden verbeterd67.
    3. Verkrijg een donker beeld zonder tijdelijke overlap tussen de SC en de sonde om de basislijndetectorruis (donkere referentie) vast te leggen.
    4. Sla alle BCARS-, NRB- en donkere afbeeldingen op, inclusief de metadata, in één h5-bestand.
  7. BCARS Protocol voor signaalverwerking
    1. Open de CRIkit2-software68.
    2. Laad alle benodigde datasets met behulp van de Open HDF-tool, zoals weergegeven in afbeelding 6B: Laad BCARS hyperspectrale gegevens, NRB-referentie en donkere referentie. Selecteer het frequentiegebied binnen de BCARS-bandbreedte voor het genereren van signalen met behulp van de Freq Window-tool (van 400 cm-1 tot ≥ 3200 cm-1 voor het BCARS-systeem dat hier wordt gedemonstreerd).
    3. Voer voorbewerkingsstappen uit:
      1. Gebruik de Anscombe-tool (zoals weergegeven in afbeelding 6B) om de BCARS- en NRB-datasets te stabiliseren.
      2. Gebruik de tool De-noise om Singular Value Decomposition (SVD) uit te voeren: Behoud de belangrijkste componenten op basis van visuele inspectie. Behoud componenten die ruimtelijke verdelingen vertonen die overeenkomen met de morfologie van het monster en verwijder componenten die worden gedomineerd door ongestructureerde of spikkelachtige ruis. Deze ruisonderdrukkingsstap verbetert de signaal-ruisverhouding (SNR), met name voor spectrale kenmerken met lage intensiteit.
      3. Gebruik de Inverse Anscombe-tool om de gegevens te herstellen naar het oorspronkelijke domein.
        OPMERKING: Deze stappen kunnen worden overgeslagen als er real-time verwerking wordt uitgevoerd bij acquisitie.
    4. Haal Raman-achtige spectra op met behulp van de Kramers-Kronig (KK) transformatie:
      1. Open de KK-tool (zoals weergegeven in afbeelding 6B).
      2. Schakel Norm naar NRB in om de juiste spectrale referentienormalisatie te garanderen.
      3. Stel parameters in, waaronder NRB-bias, padfactor en edge-pixelgemiddelde.
      4. Voer de KK-transformatie uit om opgehaalde Raman-spectra te verkrijgen.
    5. Post-KK-foutcorrecties uitvoeren
      1. Fasefouten corrigeren met Savitzky-Golay-afvlakking: Open de fasefoutcorrectietool (Afbeelding 6B). Pas de grootte van het afvlakkende venster en de volgorde van de polynoom aan. Inspecteer de originele versus gecorrigeerde spectra met behulp van het voorbeeldvenster .
      2. Schaalfouten corrigeren: Open de tool voor het corrigeren van schaalfouten (Afbeelding 6B). Normaliseer spectra om het schalen van de relatieve intensiteit in de gegevensset te corrigeren. Zorg voor consistentie tussen ruimtelijke en spectrale dimensies.
    6. Spectrale as kalibreren (optioneel, indien verkeerd uitgelijnd): Open de kalibratietool (Afbeelding 6B). Vergelijk de gemeten golfgetallen met de bekende referentiepieken. Pas de gecorrigeerde helling/snijpunt toe om de spectrale as opnieuw uit te lijnen.
    7. Definieer en extraheer gegevens uit interesseregio's (ROI's)
      1. Gebruik de ROI Spect. of Pt Spect. hulpmiddel (Figuur 6B) om ruimtelijke interessegebieden of aandachtspunten in de BCARS-afbeelding te markeren.
      2. Visualiseer en vergelijk de spectrale inhoud van verschillende ROI's.
      3. Exporteer opgehaalde spectra voor verdere kwantitatieve of chemometrische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 5 toont de gemeten spectra van de smalbandsonde en de breedband supercontinuüm (SC) pulsen die worden gebruikt voor BCARS-excitatie. De sondepuls, gegenereerd via de tweede harmonische generatie van een ~1530 nm-signaal van een zelfgebouwde optische parametrische oscillator (OPO, Figuur 3), is gecentreerd op 764,2 nm met een volledige breedte bij het halve maximum (FWHM) van 0,2 nm, wat de spectrale resolutie lev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit werk demonstreert de architectuur van BCARS en het 2p-FLIM/TPEF-beeldvormingsplatform in detail. Hoewel in onze huidige opstelling een dual-output 1030 nm-laser wordt gebruikt, kunnen de meeste krachtige fs-fiberlasers van 1030 nm worden gebruikt als hoofdlaserbron voor het bouwen van een BCARS-microscoop. Door zorgvuldig de lengte en periode van OPO/SHG PPLN-kristallen te kiezen, is het genereren van een sondepuls met een sub-ps OPO 1030 nm-pomp haalbaar. Hoewel hier een relatief ho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen en hebben geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

W-W.C. erkent de steun van NIH (R21AG086974). MTC erkent de steun van het Amerikaanse ministerie van Energie (DOE BERDE-SC0022121).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CameraHamamatsuORCA-FusionsCMOS, 2304×2304 pixels
Collectieobjectief Olympus LUMPLFLN60XW Water immersie, 1.0 NA
DAQ Diligent MCC USB-1208HS data aquisition card
Delay line Newport DL225 Mechanicale vertraging voor sondepulsatie
Dichroic Semrock FF925-Di01 combinatie van sonde en SC
Dichroic Semrock FF705-Di01 detectie van epi-mode fluorescentie
Dichroic Thorlabs DMLP550R scheiding van het FLIM-signaal en het TPEF-signaal
Excitatiobjectief Olympus UPLSAPO60XWIR Water immersie, 1.2 NA
Filter Semrock FF01-1326/SP-25 Weiger de fundamentele laser na SHG
Filter Semrock FF01-758/SP Weiger de fundamentele laser voor de BCARS-camera
Filter Thorlabs FESH0650 Weiger de fundamentele laser voor de fluorescentiemodaliteit
FLIM PMT PicoQuant PMA Hybrid FLIM enkele foton detector
FPGA Redpitaya STEMlab 125-14 Scansynchronisatie en triggeren
Galvo Thorlabs GVS101 Voor scannen en descanning
Grating Coherent LightSmyth 1040nm 1000 groeven/mm, pre-chirp voor SC
Half-wave plate Thorlabs AHWP05M-980 Polarisatiecontrole
K-cube Thorlabs KPA101 PSD-driver voor de auto-aligner
Laser Prospective Instruments FSX-Dual Dual-output femtosecondelaser
Laser Coherent Mira-900 Femtosecondelaser voor fluorescentie-excitatie
PBS Thorlabs PBS255 Straalverbinding voor SC en sonde
PCF Thorlabs LMA-PM-5 10 cm fotonische kristalvezel voor SC-generatie
PD Thorlabs PDA100A2 OPO feedback loop
Piezo-spiegelbevestiging Thorlabs POLARIS-K1S2P Piezo-elektrische aanpassing voor de auto-aligner
Pre-amp EdmundOptics 59-179 TPEF voorversterker
Prism Lambda Research optics EQP-30SF10 SC-compressie
PSD Thorlabs PDQ80A Positiegevoelige detector voor de auto-aligner
Spectrometer Teledyne Princeton Instruments IsoPlane 160 300 g/mm raster, gecentreerd op 700 nm
Stage ASI MS-2000 Gemotoriseerde 3-assige stage
TCSPC PicoQuant MultiHarp 150 Fotonteller voor FLIM
TPEF PMT Hamamatsu H9305-03 TPEF detector
Tube Lens Thorlabs TL200-2P2 Gebruikt in het descanningsysteem

Referenties

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FluorescentielevensduimbeeldvormingRaman-vingerafdrukspectroscopietweefotonmicroscopiemetabole profileringsubcellulaire resolutiein vivo beeldvormingC. elegansgroen fluorescent eiwit
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.