Methodenartikel

Beeldvorming van levende cellen van chromosoomscheiding tijdens eicelmeiose bij muizen

809 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68847

⸱

10 oktober 2025

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

In dit artikel

Samenvatting

Hier vatten we live-cell beeldvormingstechnieken samen voor het bestuderen van chromosoomsegregatie in eicellen van muizen, met behulp van H2B-RFP voor chromatine en SiR-Tubuline voor spindelvisualisatie. We beschrijven de voorbereiding van monsters, micro-injectie, kweek, beeldvormingsopstelling en analyse en bieden een praktische gids om een hoge resolutie en minimaal fototoxische beeldvorming van meiotische chromosoomdynamiek te bereiken.

Samenvatting

Nauwkeurige chromosoomscheiding tijdens eicelmeiose is essentieel voor een goede embryonale ontwikkeling en het voorkomen van aneuploïdie-gerelateerde aandoeningen. Beeldvorming van levende cellen in combinatie met fluorescentie-labeltechnieken is een krachtige benadering geworden voor het bestuderen van meiotische chromosoomdynamiek met een hoge spatiotemporele resolutie. In dit protocol vatten we de belangrijkste methodologieën samen voor het visualiseren van chromosoomsegregatie in levende eicellen van muizen, met de nadruk op het gebruik van histon H2B-RFP voor chromatinelabeling en SiR-Tubuline voor het volgen van spindels. We beschrijven de procedures voor monstervoorbereiding, mRNA-micro-injectie, eicelcultuur, opstelling van de beeldvormingskamer met levende cellen en confocale microscopie-instellingen, allemaal geoptimaliseerd om beeldvorming met hoge resolutie te bereiken en tegelijkertijd fototoxiciteit te minimaliseren. Verder belichten we kritische experimentele overwegingen zoals fototoxiciteit, beeldverwerking en kwantitatieve analyse van meiotische gebeurtenissen. Door een uitgebreide evaluatie van de huidige methodologieën te bieden, dient dit protocol als een praktische gids voor onderzoekers die de chromosoomdynamiek in levende eicellen willen onderzoeken en de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van meiotische studies willen verbeteren.

Inleiding

Nauwkeurige visualisatie van chromosomale en spoeldynamiek tijdens eicelmeiose is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen die de rijping van vrouwelijke gameten en het risico op aneuploïdie regelen 1,2,3,4,5. Eicellen van zoogdieren ondergaan een zeer gecoördineerde reeks meiotische gebeurtenissen, waaronder afbraak van kiemblaasjes (GVBD), chromosoomcondensatie, spoelassemblage en asymmetrische divisie6. Hoewel beeldvorming met een vast tijdstip waardevolle momentopnamen van deze processen heeft opgeleverd, ontbreekt het aan temporele resolutie en kunnen het geen voorbijgaande of snelle gebeurtenissen vastleggen die zich voordoen tussen bemonsteringsintervallen. Daarentegen biedt live-cell beeldvorming van fluorescerend gelabelde chromosomen en microtubuli een krachtige benadering om deze dynamische processen in realtime te volgen 2,3,7. Dit maakt directe observatie mogelijk van de timing, duur en volgorde van meiotische gebeurtenissen binnen individuele eicellen, en maakt het mogelijk om voorbijgaande gebeurtenissen te identificeren die anders zouden worden gemist in vaste steekproeven. Het behoud van de levensvatbaarheid van de eicellen en de fysiologische integriteit tijdens micro-injectie en beeldvorming vereist echter een nauwgezette behandeling en geoptimaliseerde omstandigheden8.

Dit protocol beschrijft een uitgebreide workflow voor het micro-injecteren van eicellen in het kiemblaasje (GV)-stadium van muizen met H2B-RFP-cRNA, waardoor fluorescerende labeling van chromatine mogelijk wordt, gevolgd door time-lapse confocale beeldvorming van chromosomen en spoelgedrag gedurende meiose4. De methode integreert belangrijke stappen, waaronder hormonale priming, eicelisolatie, micro-injectie onder gecontroleerde temperatuuromstandigheden en live beeldvorming met behulp van confocale microscopie met omgevingscontrole 4,9. Het algemene doel van dit artikel is om een robuuste en reproduceerbare workflow te presenteren voor real-time visualisatie van chromosomale en spindeldynamiek in levende muizeneicellen, en een platform te bieden voor het onderzoeken van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan meiotische regulatie en aneuploïdie risico.

Hoewel dit protocol een hoge temporele en ruimtelijke resolutie biedt, is het wel afhankelijk van exogene reporterexpressie, die de endogene eiwitdynamiek mogelijk niet volledig repliceert en mogelijk de inheemse meiotische processen kan verstoren als ze tot overexpressie worden gebracht. Onderzoekers moeten rekening houden met deze beperkingen en bevindingen valideren met behulp van complementaire benaderingen waar mogelijk.

Dit protocol is ontworpen ter ondersteuning van studies die meiotische mechanismen, chromosoomsegregatiefouten en de impact van genetische of omgevingsverstoringen op de eicelkwaliteit onderzoeken. Het biedt een robuust platform voor zowel fundamenteel onderzoek als translationele toepassingen in de reproductieve biologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor dieren. Experimentele procedures moeten zich strikt houden aan de 3V-principes: vervanging, vermindering en verfijning. Muizen moeten worden gehuisvest in een geaccrediteerde dierenfaciliteit onder gestandaardiseerde omgevingsomstandigheden (22 °C, 60% vochtigheid) met vrije toegang tot voedsel en water.

1. Verzameling en bereiding van eicellen

OPMERKING: Alle apparatuur en reagentia moeten steriel zijn. Voer alle eicelbehandeling uit met behulp van een mondpipet onder een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel). Bedek alle druppels van het kweekmedium met minerale olie (figuur 1A-E).

  1. Hormonale stimulatie
    1. Injecteer 3-4 weken oude vrouwelijke muizen intraperitoneaal met 5 internationale eenheden (IE) serumgonadotrofine (PMSG) van drachtige merries (PMSG; zie materiaaltabel) 46-48 uur voorafgaand aan het verzamelen van eicellen.
      OPMERKING: B6CBAF1 muizen (F1-nakomelingen van C57BL/6J × CBA/CaCrl) hebben de voorkeur vanwege de superieure eicelopbrengst en gunstige rijpingseigenschappen.
  2. Bereiding van cultuurmedia
    1. Filtreer M2- en M16-media (zie materiaaltabel) met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Vul aan met IBMX tot een eindconcentratie van 100 μM door te verdunnen uit een voorraad van 100 mM.
    2. Bereid 5-6 druppels M2-IBMX (~30 μL elk) en 3 druppels M16-IBMX in plastic weefselkweekschaaltjes van 35 mm. Bedek alle druppels met minerale olie. Plaats M2-IBMX-schaaltjes op een heet blok van 37 °C (figuur 1A) en M16-IBMX-schaaltjes in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten voordat de eicel wordt geïsoleerd (figuur 1C).
    3. Bereid een extra schaal voor met 800-1.000 μL M2-IBMX (geen olie) voor eierstokdissectie. Plaats op een verwarmingsplaat van 37 °C die over een stereomicroscoop is gemonteerd (Figuur 1B).
  3. Isolatie van eicellen
    1. Offer muizen door cervicale dislocatie. Veeg de onderbuik af met 70% ethanol en maak vervolgens een kleine horizontale incisie in de huid en het buikvlies om de buikholte binnen te gaan. Verleng de incisie door de randen van de incisie met de vingers uit elkaar te trekken.
    2. Veeg met een tang de darm uit de weg om de eierstokken in de bovenbuik bloot te leggen, die zich aan de bovenste pool van de nieren bevinden. Gebruik een fijne tang en een microschaar om de eierstokken voorzichtig weg te snijden en schade aan het weefsel te voorkomen. Breng de eierstokken onmiddellijk over in een buisje van 1,5 ml met 100-200 μl voorverwarmd M2-IBMX-medium.
    3. Breng de eierstokken over naar 1 ml voorverwarmd M2-IBMX-medium en ga over naar een verwarmde dissectiemicroscoopfase (Figuur 1B). Verwijder voorzichtig vetweefsel en oviductale resten.
      OPMERKING: Behandel de eierstokken voorzichtig om schade aan follikels of eicellen te voorkomen. Houd de eierstokken in een warm medium tijdens de overdracht van de dierenkamer naar het laboratorium.
    4. Maak cumulus-eicelcomplexen (COC's) vrij door follikels te doorboren met een naald van 27 G (Figuur 1A-B). Verzamel COC's en breng ze over in druppels M2-IBMX van 25-30 μl (Figuur 1D).
    5. Dissocieer cumuluscellen door herhaaldelijk te pipetteren met een glazen pasteurpipet met smalle boring (Figuur 1E).
      OPMERKING: Hoewel mondpipetteren vaak wordt gebruikt voor het hanteren van eicellen, bieden mechanische pipettors of micromanipulatoren alternatieven, vooral in omgevingen waar mondpipetteren beperkt of niet haalbaar is. Deze alternatieven zijn met succes toegepast in vergelijkbare protocollen10,11.
    6. Identificeer en selecteer volgroeide eicellen in het GV-stadium op basis van een grotere diameter en centraal gelegen GV met behulp van een stereomicroscoop met een vergroting van 20x-40x. Breng over op verse 30 μL M2-IBMX-druppels op een heet blok van 37 °C, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Houd de eicellen tijdens alle procedures op 37 °C om de fysiologische integriteit te behouden. Verwarm alle media voor en gebruik temperatuurgecontroleerde trappen voor alle behandelingen en micro-injecties op basis van microscopen.
    7. Laat de eicellen 20 minuten herstellen op een verwarmde fase van 37 °C voordat u ze micro-injectiet.

2. H2B-RFP cRNA-preparaat

NOTITIE: Voer alle stappen uit met handschoenen in een schone, RNase-vrije omgeving. Gebruik alleen RNase-vrij water en reagentia en werk bij voorkeur in de aanwezigheid van RNase-remmers.

  1. Sequentie-verifieer het H2B-RFP-plasmide (zie Materiaaltabel) door Sanger-sequencing met behulp van primers die de insert flankeren. Versterk het plasmide door competente E. coli (bijv. DH5α) te transformeren, een enkele kolonie te selecteren en deze te laten groeien in LB-bouillon met de juiste antibiotica. Zuiver het plasmide met behulp van een standaard midi- of maxi-voorbereidingsset. Voor gedetailleerde procedures, zie Green en Sambrook12.
  2. Zuiver plasmide-DNA met behulp van een in de handel verkrijgbare miniprep-kit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
  3. Lineariseer 2-4 μg plasmide-DNA stroomafwaarts van de insert met behulp van een geschikt restrictie-enzym dat eenmaal in de vectorruggengraat snijdt (NotI werd gebruikt voor H2B-RFP). Zet de verteringsreactie op met behulp van de juiste buffer- en enzymconcentratie zoals beschreven in tabel 1 en incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 °C. Bevestig volledige linearisatie door agarosegelelektroforese. Meerdere banden duiden op een onvolledige spijsvertering. Als u een in de handel verkrijgbare kit gebruikt, volg dan de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Kies een restrictie-enzym dat precies stroomafwaarts van het inzetstuk snijdt en onder optimale verteringsomstandigheden. Controleer de linearisatie door een klein aliquot op een agarosegel te laten lopen.
  4. Verwijder RNase-besmetting door de verteringsreactie te incuberen met 1 μL proteïnase K (10 μg/ml), 5,3 μL 10% SDS en 50 μL nucleasevrij water bij 50 °C gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Deze stap is essentieel voor het elimineren van RNase- en eiwitverontreinigingen. Gebruik alleen RNase-vrije reagentia en zorg voor schone werkomstandigheden.
  5. Extraheer het verteerde DNA met fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1), gevolgd door een chloroform-extractie.
    OPMERKING: Om de toxiciteit te minimaliseren en de verwerking van monsters te stroomlijnen, kunnen commerciële zuiveringsmethoden op basis van kolommen of kralen (bijv. silicamembraan of magnetische kralensystemen) ook worden gebruikt in plaats van fenol-/chloroformextractie.
  6. Sla DNA neer door 3 M natriumacetaat en 100% ethanol toe te voegen. Incubeer bij -80 °C gedurende ten minste 2 uur.
  7. Pellet het DNA door centrifugatie bij 12.000-14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Was de pellet met 70% ethanol, centrifugeer opnieuw op dezelfde snelheid gedurende 5 minuten bij 4 °C, laat kort aan de lucht drogen (2-5 min) en resuspendeer in 6 μL RNasevrij water.
    OPMERKING: Na ethanolprecipitatie en centrifugatie moet zich op de bodem van de buis een zichtbare doorschijnende of witte pellet vormen. Als er geen pellet wordt gezien, herhaal dan de centrifugatie met een hogere snelheid of beoordeel de DNA-concentratie opnieuw.
  8. Voer in vitro transcriptie uit met behulp van de T7 mMESSAGE mMACHINE-kit (zie tabel 2), volgens het protocol van de fabrikant.
  9. Incubeer de transcriptiereactie bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur. Verleng de incubatie als de transcriptielengte langer is dan 5 kb.
  10. Verwijder het DNA van de sjabloon door middel van een DNase-behandeling met 1 U DNase I per reactievolume van 10 μL, geïncubeerd bij 37 °C gedurende 15 minuten.
  11. Zuiver het gesynthetiseerde cRNA met behulp van lithiumchloride-precipitatie13. Na precipitatie en centrifugatie moet zich op de bodem van de buis een zichtbare doorschijnende of witte pellet vormen. Was de RNA-pellet met 70% ethanol.
  12. Resuspendeer de uiteindelijke cRNA-pellet in 20 μL RNase-vrij water. Meet de RNA-concentratie en bevestig de aanwezigheid en lengte van de poly(A)-staart door RT-PCR uit te voeren, gevolgd door sequencing van het PCR-product. Verdeel het cRNA in volumes van 1 μL en bewaar het bij -80 °C.

3. Bereiding en micro-injectie van eicellen

OPMERKING: Houd de eicellen tijdens de procedure op 37 °C met behulp van voorverwarmde media en temperatuurgecontroleerde microscooptrappen om de eicelkwaliteit te behouden.

  1. Voorbereiding
    1. Ontdooi H2B-RFP cRNA-aliquots op ijs, centrifugeer kort en verdun tot de gewenste concentratie (bijv. 250 ng/μL).
      OPMERKING: De optimale cRNA-concentratie kan variëren, afhankelijk van het construct, het expressiesysteem en de experimentele doelen. We raden aan om de cRNA-concentratie te titreren (bijv. binnen het bereik van 50-300 ng/μL) om overexpressie-artefacten te minimaliseren en tegelijkertijd voldoende signaal te garanderen. Gebruikers moeten ook de meiotische progressie (bijv. GVBD, spilvorming en extrusie van het polaire lichaam) controleren als een functionele uitlezing van de gezondheid en levensvatbaarheid van de eicellen na constructexpressie. Er is gemeld dat injectieconcentraties van cRNA doorgaans variëren van 0,2 tot 1 μg/μL, waarbij optimale resultaten vaak worden bereikt bij 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
    2. Bereid micro-injectienaalden voor van capillairen van borosilicaatglas (OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm, lengte = 100 mm) met behulp van een pipettrekker (Figuur 2A).
      OPMERKING: We gebruiken een verticale pipettrekker (zie Materiaaltabel; Figuur 2A). Optimaliseer trekparameters empirisch. De punt van de naald moet fijn genoeg zijn om schade aan de eicel tot een minimum te beperken, maar breed genoeg om verstopping te voorkomen en een vlotte afgifte van cRNA mogelijk te maken.
    3. Laad 0,5-1,5 μL cRNA-oplossing in de naaldpunt met behulp van RNase-vrije microloader-tips. Verwijder eventuele luchtbellen vóór de injectie.
  2. Opstelling van de micro-injectieschaal
    1. Bereid een micro-injectieschaal voor met 100 μL M2-IBMX-medium en bedek deze volledig met minerale olie om verdamping en osmolariteitsverschuivingen te voorkomen.
  3. Micro-injectie van eicellen
    1. Monteer de vasthoud- en injectiepipetten op het micromanipulatorsysteem (Figuur 2B,C).
    2. Plaats het micro-injectieschaaltje op de microscooptafel. Breng met behulp van een mondpipet eicellen over in de M2-IBMX-druppel.
    3. Breng de bewaar- en injectiepipetten in hetzelfde horizontale vlak als de eicellen.
    4. Vang één eicel vast met behulp van zachte zuigkracht met de vasthoudpipet (Figuur 2B en C).
    5. Steek de injectienaald door de zona pellucida en het oolemma, richt zich op het cytoplasma en vermijd de kern.
    6. Lever H2B-RFP cRNA af met behulp van een korte puls van negatieve capaciteit via een intracellulaire elektrometer (Figuur 2B-E). Houd het injectievolume ongeveer 5% van het eicelvolume aan. Een succesvolle injectie is meestal zichtbaar als een kleine maar duidelijke dispersie van cytoplasma. Pas de injectiedruk en het injectietijdstip aan om membraanbeschadiging te voorkomen.
    7. Trek de naald snel en soepel in dezelfde hoek terug om het scheuren van het membraan te minimaliseren.
    8. Maak de eicel los van de vasthoudende pipet en plaats deze terug naar een apart deel van de schaal om de geïnjecteerde van niet-geïnjecteerde eicellen te onderscheiden (Figuur 2F). Organiseer voor deze opstelling de workflow door niet-geïnjecteerde eicellen aan de bovenkant van de schaal te houden en geïnjecteerde eicellen naar de bodem te verplaatsen.
    9. Herhaal stap 3.3.4-3.3.8 voor alle resterende eicellen. Overlevingspercentages na injectie variëren afhankelijk van de techniek en de mRNA-eigenschappen. Verwacht 60%-80% levensvatbaarheid.
  4. Behandeling na injectie
    1. Breng de geïnjecteerde eicellen over naar een verse druppel M16-IBMX-medium in een schoon kweekschaaltje.
    2. Incubeer gedurende 1-4 uur bij 37 °C om H2B-RFP-expressie mogelijk te maken. Pas de incubatieduur aan op basis van cRNA-concentratie, transcriptgrootte en expressie-efficiëntie.

4. Timelapse-beeldvorming van H2B-RFP-gelabelde chromosomen tijdens meiose

  1. Voorbereiding van apparatuur en media
    1. Verwarm de confocale microscoop, de stage-incubator en de omgevingskamer voor gebruik gedurende ≥ 30 minuten voor op 37 °C (Figuur 3A). Zet de gasregelaar aan en start de gasstroom om de kamer op 5% CO2 en omgevingstemperatuur O2 te houden. Zorg ervoor dat de kamer wordt bevochtigd om de gezondheid van de eicellen te ondersteunen tijdens uitgebreide beeldvorming van levende cellen.
    2. Bereid kweekdruppels voor: Doe 5-6 druppels van 50 μL M16 medium aangevuld met SiR-Tubuline (100 nM eindconcentratie) in een petrischaaltje van 35 mm. Bedek met minerale olie. Plaats in een aparte beeldvormingsschaal met glazen bodem drie druppels van 5 μL M16 + SiR-Tubuline en bedek deze met minerale olie. Verwarm beide gerechten ≥ 30 minuten voor gebruik voor op 37 °C.
  2. Overdracht en wassen van eicellen
    1. Eicellen wassen: Breng de geïnjecteerde eicellen achtereenvolgens over door de 50 μL M16 + SiR-Tubuline-druppels om resterende IBMX weg te spoelen (5 wasbeurten aanbevolen). Voer wasbeurten voorzichtig uit om schade aan de eicel te voorkomen.
      OPMERKING: Resterende IBMX kan de hervatting van de meiose remmen, dus grondig wassen is van cruciaal belang.
    2. Eindoverdracht: Breng na het wassen 15-20 eicellen over in de druppel van 5 μL M16 + SiR-Tubuline in de voorverwarmde beeldvormingsschaal met glazen bodem.
  3. Microscoop opstelling
    1. Beeldschaal monteren: Plaats de schaal met glazen bodem op de confocale microscooptafel (Figuur 3A). Laat de eicellen ~10 minuten bezinken.
    2. Stage positionering: Met behulp van brightfield beeldvorming, midden eicellen in het gezichtsveld. Posities opslaan met behulp van microscoopsoftware.
      OPMERKING: In dit onderzoek hebben we een Leica TCS SP8 confocale microscoop gebruikt met een HC PL APO 20x/1.0 NA objectieflens voor onderdompeling in water. Afhankelijk van de beschikbaarheid kunnen echter andere confocale systemen en objectieflenzen met vergelijkbare specificaties worden gebruikt.
    3. Waterpompopstelling voor wateronderdompelingsdoelen: Als u een objectieflens voor wateronderdompeling gebruikt, bedien dan het waterpompsysteem om met tussenpozen van 5-10 minuten water te leveren. Deze periodieke stroom houdt de waterkolom tussen de lens en de beeldvormende schotel met glazen bodem in stand, waardoor uitdroging wordt voorkomen en stabiele beeldvormingsomstandigheden worden gegarandeerd tijdens langdurige experimenten. Voor lenzen met olie-onderdompeling is deze opstelling met waterstroom niet vereist.
  4. Instellingen voor beeldvorming
    1. Schakel over naar de laserscanmodus. Stel de laserintensiteiten als volgt in: 561 nm bij 0,5% (~100 μW bij het objectief) voor H2B-RFP (chromosomen); 633 nm bij 3% (~300 μW bij het objectief) voor SiR-Tubuline (spindel microtubuli; Figuur 3B,E).
      NOTITIE: Volg de juiste veiligheidsrichtlijnen voor lasers. Minimaliseer de blootstelling aan laser om de levensvatbaarheid van het monster te beschermen.
  5. Z-stack acquisitie
    1. Verkrijg Z-stacks van 30-50 μm met een stapgrootte van 2-4 μm (Figuur 3B,C).
    2. Leg beelden vast met tussenpozen van 5-10 minuten met een scansnelheid van 600 Hz (Figuur 3B,D). De totale beeldvormingsduur kan 12-16 uur bedragen, afhankelijk van het meiotische stadium dat wordt gecontroleerd, en wordt beperkt door fototoxiciteit en eiceltolerantie voor uitgebreide in-vitrocultuur.
  6. Sequentiële beeldacquisitie
    1. Voer op de microscoopsystemen sequentieel scannen uit met twee HyD-detectoren: H2B-RFP: excitatie bij 561 nm; emissie verzameld bij 580-630 nm; SiR-Tubuline-excitatie bij 633 nm; emissie verzameld bij 650-700 nm (Figuur 3E).
  7. Time-lapse-beeldvorming initiëren
    1. Voordat u begint met time-lapse-acquisitie op lange termijn, moet u de signaalkwaliteit controleren door een testfoto te maken. Fluorescerende signalen moeten gelijkmatig worden verdeeld: H2B-RFP moet chromatine duidelijk labelen en SiR-tubuline moet microtubuli-structuren markeren zonder overmatige achtergrond. Bevestig de stabiliteit van de autofocus en minimale fotobleken in korte voorbereidende beeldvormingsruns.
    2. Start time-lapse-beeldvorming door op Start te klikken.
      OPMERKING: GVBD, die de M-fase-ingang markeert, treedt meestal 60-90 minuten na IBMX-wash-out op (Figuur 4A). In deze opstelling extruderen C57BL/6-eicellen het eerste poollichaam ongeveer 8-9 uur na GVBD (Figuur 4A). De timing kan variëren afhankelijk van de stam van de muis en de kweekomstandigheden.

5. Verwerking na beeldvorming

  1. Open het afbeeldingsbestand in een beeldanalysesoftware door Bestand > Openen te selecteren en het .lif-bestand uit de beeldverwerkingssessie te kiezen.
  2. Genereer Z-projecties voor de H2B RFP- en SiR-Tubulin-kanalen door Processing > Generate Projection te selecteren. Stel het projectietype in op Projectie met maximale intensiteit. Selecteer zowel de RFP- als de SiR Tubulin-kanalen en klik vervolgens op Uitvoeren.
    OPMERKING Voer geen Z-projectie uit voor het DIC-kanaal, omdat dit kan resulteren in een wazig beeld. Identificeer en selecteer in plaats daarvan het enkele DIC-vlak dat het scherpst is gefocust. Gebruik dit gefocuste DIC-beeld in combinatie met de maximale intensiteitsprojecties van de H2B-RFP- en SiR-Tubulin-kanalen om een optimale visualisatie te bereiken.
  3. Extraheer een enkel helderveldbrandpuntsvlak. Ga terug naar Hulpmiddelen voor processen en selecteer Bewerken > bijsnijden. Kies het Brightfield-kanaal, gebruik de Z-schuifregelaar om het optimale brandpuntsvlak te vinden en klik op Toepassen.
  4. Voeg de projectie- en helderveldafbeeldingen samen door Proceshulpmiddelen te openen en Samenvoegen > Kanalen toevoegen te selecteren. Voeg de RFP-projectie, SiR-Tubulin-projectie en het enkele helderveldbeeld toe. Klik met de rechtermuisknop op de samengevoegde set en klik vervolgens op Toepassen.
  5. Exporteer de uiteindelijke samengevoegde afbeelding door Bestand > Exporteren > afbeelding te selecteren. Kies de TIFF-indeling voor ongecomprimeerde uitvoer van hoge kwaliteit.
    OPMERKING: Exporteren in TIFF-formaat wordt aanbevolen voor downstream-analyse en het opstellen van figuren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals te zien is in figuur 4A,B, maakt dit protocol hoogwaardige beeldvorming van levende cellen van chromosomen (H2B-RFP) en spindelmicrotubuli (SiR-tubuline) in eicellen mogelijk, waardoor uitgebreide spatiotemporele informatie wordt verstrekt tijdens de meiotische rijping.

Het H2B-RFP-kanaal in Figuur 4A onthult alle aspecten van chromosoombeweging, van de initiële uitlijning na GV...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol schetst een robuuste methode voor de micro-injectie en beeldvorming van levende cellen van eicellen van muizen, waardoor de visualisatie van chromosoomdynamiek tijdens meiose met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie mogelijk is. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is de nauwgezette behandeling van eicellen in elke fase van de procedure, van verzameling en micro-injectie tot beeldvorming. Eicellen zijn zeer gevoelig voor omgevingsfluctuaties en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het Professor Christopher Chen Endowment Fund, Startup-financiering van de Faculteit der Geneeskunde, University of Queensland, en National Health and Medical Research Council Project Grants (APP1078134 en APP1103689) aan H.A.H.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-ml spuitenTerumoSS+01T TuberculinSpuiten voor nauwkeurige PMSG-injecties.
AgarosegeelInvitrogen16500500Wordt gebruikt voor DNA- en RNA-gelelektroforese om nucleïnezuren te scheiden op grootte, om H2B-RFP-sequentie te conformeren
AlcoholbranderLabTekLW15557-01Wordt gebruikt voor sterilisatie en mondpijpettevoorbereiding.
Bacteriecultuurmedia (LB-bouillon)Sigma-AldrichL3022Standaardmedium gebruikt voor het kweken van E. coli en andere bacterieculturen.
Celcultuurschotels (35 × 10 mm en 60 × 15 mm)Sigma-AldrichCLS430165, CLS430166Wordt gebruikt voor het kweken van oocyten; verkrijgbaar in verschillende maten.
Centrifuge (tafelmodel)Eppendorf5424REen compacte centrifuge voor kleine monstervolumes die veel wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria.
Centrifugebuizen (15-ml en 50-ml)Corning352096, 352070Grotere buizen voor centrifugatie, vaak gebruikt voor cel- en eiwitverwerking.
ChloroformSigma-AldrichC2432Een oplosmiddel dat veel wordt gebruikt in moleculaire biologieprotocollen, vooral bij DNA/RNA-extractie.
CO2-incubatorSanyo (model: MCO-18AIC)Incubator ontworpen om een gecontroleerde CO2-atmosfeer te handhaven voor oöcytencultuur.
Disponibele ultrafijne naalden (27 G × 1/2”)Hanke Sass Wolf4710004012Fijne naalden voor oöcytenverzameling
DNase I (RNase-vrij)Thermo Fisher ScientificEN0521Enzym gebruikt om besmettend DNA uit RNA-voorbereidingen te verwijderen.
Droog verwarmingsblokGrant Instruments (model: QBD4)Een blok dat wordt gebruikt om monsters of reacties te verwarmen bij precieze temperaturen zonder dat water nodig is.
Ethanol (moleculair biologiekwaliteit)Sigma-AldrichE7023Wordt gebruikt voor DNA- en RNA-precipitatie, evenals bij sterilisatieprocedures.
Fijne dissectiescharenMet-App Scientific and Surgical Instruments2235Wordt gebruikt voor nauwkeurige dissectie van muizenoöcyten
Fijne pincettenMet-App Scientific and Surgical Instruments2127Wordt gebruikt voor nauwkeurige dissectie van muizenoöcyten
GelelektroforesesysteemBio-Rad1645050Een systeem voor het uitvoeren van elektroforese van nucleïnezuren of eiwitten in gels.
GentamicinesulfaatSigma-AldrichG1264Antibioticum gebruikt om bacteriële besmetting in celculturen te voorkomen.
Glas Pasteur-pipetten (230 mm)VWR6121702Glaspipetten gebruikt voor oöcytenmondpijpette 
IBMXSigma-AldrichI5879Een fosfodiësteraseremmer die wordt gebruikt om GVBD te voorkomen
Omgekeerde microscoopNikonEen microscoop ontworpen voor het observeren van levende cellen of organismen van onder de kweekschotel.
Lichte minerale olie geschikt voor muisembryocultuurSigma-AldrichM5310Wordt gebruikt om oöcyten in cultuur te bedekken om verdamping te voorkomen en de temperatuur te handhaven.
LithiumchlorideSigma-AldrichL9650Wordt gebruikt in RNA-precipitatiemethoden.
Live-Cell Imaging SysteemLeicaLAS XBeeldvormingssysteem ontworpen voor real-time observatie van levende cellen met behulp van geavanceerde microscopietechnieken.
M16-medium (voor in vitro-cultuur)Sigma-AldrichM7292Een medium ontworpen voor de kweek van muizenoöcyten en -embryo's en andere in vitro-toepassingen.
Microcentrifugebuizen (0,6 ml en 1,6 ml)Neptune3735.X, 3745.XKleine buizen voor centrifugatie, vaak gebruikt in moleculaire biologie- en biochemieprotocollen.
Microcentrifugebuizen (RNase-vrij)Eppendorf / Neptune022431081 (Eppendorf)RNase-vrije buizen voor RNA-werk om RNA-afbraak te voorkomen.
MicroinjectienaaldenSutter InstrumentsP-30 Pipette PullerNaalden voor nauwkeurige micro-injectie in oöcyten
MicroinjectiesysteemHarvard ApparatusFemtoJet, PicoPumpSystemen die worden gebruikt voor het injecteren van cRNA in muizenoöcyten met hoge precisie.
Miniprep-kitQiagen27106 (QIAprep Spin Miniprep Kit)Een kit voor het isoleren van plasmide-DNA uit bacterieculturen voor moleculaire biologietoepassingen.
MondaspiratorbuisassemblageSigma-AldrichA5177voor aspiratie van oöcyten
Pellet PaintMerck Millipore69049-3Een product voor het visualiseren van pelletvorming tijdens centrifugatie.
Feno:Chloroform:Isoamyl AlcoholThermo Fisher Scientific15593031Een oplossing die wordt gebruikt in H2B-RFP-extractie voor fasescheiding.
Plasmid dat H2B-RFP codeertAddgenePlasmid #20972 Plasmid dat wordt gebruikt voor het labelen van chromosomen met rood fluorescentie-eiwit (RFP) 
PMSGProspecHOR-272Voor muissuperovatie 
Proteinase KThermo Fisher ScientificEO0491Een enzym dat wordt gebruikt om eiwitten te verteren, vaak gebruikt in DNA/RNA-extractieprocedures.
Beperkingsenzym NotINew England Biolabs (NEB)R3189SEen beperkingsenzym dat wordt gebruikt in DNA-klonen en moleculaire biologietoepassingen, voor het lineariseren van H2B-RFP-plasmide. 
RNase-remmer (optioneel)New England Biolabs (NE

Referenties

  1. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  2. Wei, Z., Greaney, J., Loh, W. N., Homer, H. A. Nampt-mediated spindle sizing secures a post-anaphase increase in spindle speed required for extreme asymmetry. Nat Commun. 11 (1), 3393(2020).
  3. Zhou, C., Hancock, J. L., Khanna, K. K., Homer, H. A. First meiotic anaphase requires Cep55-dependent inhibitory cyclin-dependent kinase 1 phosphorylation. J Cell Sci. 132 (18), jcs233379(2019).
  4. Zhou, C., Homer, H. A. The oocyte spindle midzone pauses Cdk1 inactivation during fertilization to enable male pronuclear formation and embryo development. Cell Rep. 39 (5), 110789(2022).
  5. Zhou, C., Ye, Y., Homer, H. Using FRET to define Cdk1-dependent ordering of events during exit from second meiotic M-phase in oocytes. Methods Mol Biol. 2874, 99-114 (2025).
  6. Jones, K. T. Meiosis in oocytes: Predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age. Hum Reprod Update. 14 (2), 143-158 (2008).
  7. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  8. Verlhac, M. H., Lefebvre, C., Guillaud, P., Rassinier, P., Maro, B. Asymmetric division in mouse oocytes: with or without Mos. Curr Biol. 10 (20), 1303-1306 (2000).
  9. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-Organization of MTOCs Replaces Centrosome Function during Acentrosomal Spindle Assembly in Live Mouse Oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  10. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation, and ploidy assessment. J Vis Exp. (55), e2851(2011).
  11. Yoshida, N., Perry, A. C. F. Piezo-actuated mouse intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Nat Protoc. 2 (2), 296-304 (2007).
  12. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2012).
  13. Melton, D. A., Krieg, P. A., Rebagliati, M. R., Maniatis, T., Zinn, K., Green, M. R. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA probes. Nucl Acids Res. 12 (18), 7035-7056 (1984).
  14. Wei, Z., Greaney, J., Zhou, C., Homer, H. A. Cdk1 inactivation induces post-anaphase-onset spindle migration and membrane protrusion required for extreme asymmetry in mouse oocytes. Nat Commun. 9, 4029(2018).
  15. Davydenko, O., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Increased CDK1 activity determines the timing of kinetochore-microtubule attachments in meiosis I. J Cell Biol. 202 (2), 221-229 (2013).
  16. Swain, J. E., Pool, T. B. ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update. 14 (5), 431-446 (2008).
  17. Sun, Q. Y., Schatten, H. Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction. 131 (2), 193-205 (2006).
  18. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  19. Nakagawa, S., FitzHarris, G. Quantitative microinjection of morpholino antisense oligonucleotides into mouse oocytes to examine gene function in meiosis-I. Methods Mol Biol. 1457, 217-230 (2016).
  20. Courtois, A., Solc, P., Kitajima, T. S. Triple-color live imaging of mouse oocytes. Methods Mol Biol. 1818, 89-97 (2018).
  21. Kline, D. Quantitative microinjection of mouse oocytes and eggs. Methods Mol Biol. 518, 135-156 (2009).
  22. Yamagata, K., Suetsugu, R., Wakayama, T. Long-term, six-dimensional live-cell imaging for the mouse preimplantation embryo that does not affect full-term development. J Reprod Dev. 55 (3), 343-350 (2009).
  23. Rémillard-Labrosse, G., et al. Oocyte and embryo culture under oil profoundly alters effective concentrations of small molecule inhibitors. Front Cell Dev Biol. 12, 1337937(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizeocytenfluorescentie labelinghiston H2B RFPSiR tubulineconfocale microscopiemRNA microinjectiespoeltracking

Gerelateerde artikelen