Methodenartikel

Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

DOI:

10.3791/68859

⸱

15 augustus 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een in vitro test voor het meten van de cellulaire lipideopname in endotheelcellen na stimulatie met BODIPY-C12 en BODIPY-C16 fluorescerende analogen van verzadigde vetzuren met lange en zeer lange ketens. Deze methode is efficiënt en kan worden aangepast aan andere celtypen en biedt een nuttige benadering voor het bestuderen van het lipidenmetabolisme.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheelcellen (EC's) spelen een centrale rol bij het reguleren van het transport van vetzuren (FA) van de bloedbaan naar metabole weefsels, maar de hulpmiddelen om de opname van EC FA op een betrouwbare, schaalbare manier te kwantificeren, blijven beperkt. Hier presenteren we een snelle, kwantitatieve en kosteneffectieve test om de FA-opname in EC's te meten met behulp van fluorescerende FA-analogen (BODIPY-C12 en BODIPY-C16), waarmee onderzoek kan worden gedaan naar de ketenlengtespecifieke opnamedynamiek in een plaatformaat met 96 putjes. Het protocol omvat positieve (3-hydroxyisobutyraat, lactaat) en negatieve (niclosamide) controles en is gevalideerd in zowel primaire (HUVEC's) als onsterfelijke (EA.hy926) EC-lijnen. De test detecteert tijd- en dosisafhankelijke FA-opname, waarbij de resultaten worden genormaliseerd tot celaantal met behulp van Hoechst-nucleaire kleuring en gecorrigeerd voor achtergrond met behulp van de juiste controles. Het kan worden aangepast aan een verscheidenheid aan celtypen, beeldvormingsmodaliteiten en experimentele omstandigheden, waaronder beeldvorming van levende cellen en pulsnavolgingsformaten. Vergeleken met traditionele lipidekleuring of radioactief gelabelde tracers, biedt deze methode verbeterde veiligheid, snelheid en veelzijdigheid terwijl dynamische FA-opname in levende cellen wordt vastgelegd. Deze test biedt een robuust platform voor het bestuderen van de regulatie van endotheliaal lipidentransport en de bijdrage ervan aan stofwisselingsziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om ervoor te zorgen dat door het bloed overgedragen voedingsstoffen, zoals lipiden, in metabolisch weefsel, zoals skeletspieren, terechtkomen, moeten ze eerst de endotheelcelbarrière (EC) passeren die de wanden van de capillaire bloedvaten omvat. Hoewel lang werd aangenomen dat vetzuren (FA's) eenvoudig over deze barrière diffundeerden om het onderliggende weefsel te bereiken, suggereert opkomend bewijs dat EC's dit proces actief reguleren via gespecialiseerde transportmechanismen die zijn geëvolueerd om hydrofobe moleculen over waterige extra- en intracellulaire werelden te verplaatsen1.

In de bloedbaan bestaan FA's ofwel als albuminegebonden vrije vetzuren (FFA's) of zijn ze verpakt in triglyceridenrijke lipoproteïnen (TRL's) zoals chylomicronen en lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL's)2. Aan het luminale oppervlak van EC's hydrolyseert lipoproteïnelipase (LPL) TRL's om FFA's vrij te maken voor opname. Een verscheidenheid aan eiwitten is betrokken bij FA-transport, waaronder CD36, dat de daadwerkelijke opname van de FA in de cel uitvoert; vetzuurtransporteiwitten (FATP's) en acyl-CoA-synthetasen (ACSL's), die vectorieel transport mediëren; vetbindende eiwitten (FABP's), die fungeren als lipofiele chaperonnes, en talloze andere, waarvan sommige nog moeten worden ontdekt en gecategoriseerd 2,3. Het onderliggende weefsel gebruikt ook vergelijkbare mechanismen om het getransporteerde vet op te nemen, hoewel de specifieke aanwezige isovormen vaak verschillen op basis van het celtype.

Recente studies hebben aangetoond dat EC's coördineren met naburige cellen door middel van paracriene signalering om FA-transport naar doelweefsels te moduleren. Skeletmyocyten scheiden bijvoorbeeld een verzameling paracriene factoren af, zoals 3-hydroxyisobutyraat (3-HIB), vasculaire endotheliale groeifactor B (VEGFB) en apelin om FA-transport door nabijgelegen endotheelte bevorderen 4,5,6. Interessant is dat het endocriene systeem ook betrokken kan zijn, zoals het geval is wanneer insuline adipocyten stimuleert om lactaat af te geven, wat ook EC's stimuleert omFA's 7 op te nemen.

EC's fungeren dus als modulerende poortwachters van vet, wat suggereert dat ze een sleutelrol spelen bij metabole stoornissen van lipiden, zoals hart- en vaatziekten of diabetes type 2. Recent bewijs heeft aangetoond dat de EC's zelf lipidedruppeltjes (LD's) ophopen als reactie op vetoverbelasting, mogelijk als een buffer die de vetzuurafgifte aan onderliggende weefsels reguleert 8,9. In het geval van een hoge vetconsumptie, zoals het geval is bij moderne diëten, kan overmatige ophoping van deze LD's bijdragen aan vasculaire disfunctie en ziekten, waaronder hypertensie10. Al met al kan een beter begrip van hoe EC's FA's opnemen en transporteren ons nieuwe therapeutische handvatten bieden voor het aanpakken van door lipiden overgedragen ziekten.

In deze studie beschrijven we een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve test voor het meten van endotheliale FA-opname met behulp van fluorescerende FA-analogen met lange ketens BODIPY-C12 en BODIPY-C16. Deze reagentia zijn redelijk goedkoop en redelijk veilig, vooral in vergelijking met radioactieve of zware isotoop gelabelde FA's, die traditioneel worden gebruikt om de opname van cellulair vet te meten11,12. Het is belangrijk op te merken dat deze reagentia verschillen van de ongeconjugeerde "vrije" BODIPY-kleurstof, die zich passief ophoopt in hydrofobe gebieden van de cel, voornamelijk in LD's13. Daarentegen produceert het conjugeren van BODIPY aan een alifatische FA-keten (bijv. C12 of C16) een molecuul dat structureel native FA's met lange ketens nabootst. Deze wijziging maakt het mogelijk om de dynamische opname van vetzuren in cellen specifiek te meten, in plaats van de intracellulaire opslag van lipiden of druppelvorming weer te geven.

Een belangrijke kracht van deze aanpak is de flexibiliteit. Onderzoekers kunnen andere celtypen, variabele incubatietijden en een reeks BODIPY-geconjugeerde FA-analogen gebruiken om ketenlengte-afhankelijke opname te bestuderen, of zelfs van nature fluorescerende lipiden zoals cis-parinarisch vetzuur14. Over het algemeen biedt dit protocol onderzoekers een gemakkelijke manier om te testen op cellulaire FA-opname onder meerdere omstandigheden en de weg vrijmaken voor het beantwoorden van fundamentele vragen over lipidenmetabolisme, endotheliale biologie en stofwisselingsziekten (Figuur 1).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle van mensen afgeleide endotheelcellen (HUVEC's) die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn verkregen uit in de handel verkrijgbare, geanonimiseerde bronnen in overeenstemming met de richtlijnen van instellingen en leveranciers voor ethisch gebruik van menselijk biologisch materiaal. Voer alle stappen uit in een steriele omgeving onder een laminaire stromingskap. Zie de materiaaltabel voor een lijst van alle reagentia en apparatuur.

1. Gelatinecoating van plaat met 96 putjes

  1. Bereid een 0,1% gelatineoplossing door 25 ml 2% gelatinebouillon te verdunnen in 500 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Meng grondig en filtreer met behulp van een vacuümfilter (of autoclaaf) van 0,2 μm.
  3. Voeg 100 μL per putje van de 0,1% gelatine toe aan een zwarte plaat met 96 putjes met heldere bodem.
  4. Incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten of idealiter een nacht.

2. Cellen zaaien

  1. Bereid een eencellige suspensie van EC's in volledige media.
    1. Bereid volledige media voor door het juiste basale medium aan te vullen met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine (v/v voor beide).
      OPMERKING: Het basale medium zal verschillen op basis van het specifieke celtype; in deze studie werden endotheelgroeimedium (EGM-2) en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's Medium (DMEM) gebruikt voor respectievelijk HUVEC's en EA.hy926-cellen.
  2. Pipetteer 100 μL van de celsuspensie in elk putje met een zaaidichtheid waardoor de cellen de volgende dag samenvloeien.

3. Bereiding en toepassing van behandelingsreagens

  1. Bereid alle reagentia in tweewaardig PBS (met Ca2+ en Mg2+) en verwarm voor tot 37 °C.
    1. Bereid 3-HIB (positieve controle) voor als een 20 mM werkoplossing. Los de stockoplossing op 1 M op in dubbel gedestilleerd water en bewaar bij 4 °C.
    2. Bereid lactaat (positieve controle) als een werkoplossing van 20 mM. Los de stockoplossing op 1 M op in dubbel gedestilleerd water en bewaar bij 4 °C.
    3. Bereid niclosamide (negatieve controle) in een eindconcentratie van 1 μM. Los de stockoplossing op bij 10 mM in DMSO. Verdeel in kleinere hoeveelheden om vries-dooicycli te voorkomen en bewaar bij -20 °C.
  2. Was de cellen eenmaal met voorverwarmde tweewaardige PBS.
  3. Voeg 50 μL per putje van het juiste behandelingsreagens (3-HIB, lactaat of niclosamide) toe en incubeer bij 37° C gedurende 30 minuten (voor niclosamide) of 60 minuten (voor 3-HIB en lactaat).

4. BODIPY-FA: BSA complex voorbereiding en toepassing

  1. Bereid BODIPY-FA: BSA-complexen voor bij 0,5 μM, 1 μM of 2 μM eindconcentraties in PBS, met behulp van een molaire verhouding van 2:1 FA: BSA. Voor een Bodipy-FA-oplossing van 2 μM incubeer je met 1 μM FA-vrije BSA in PBS. Gebruik voor 1 μM BODIPY-FA 0,5 μM BSA, enzovoort. Bescherm complexen altijd tegen licht tijdens de incubatie.
  2. Incubeer het mengsel 10 minuten bij kamertemperatuur voor gebruik.
  3. Voeg 50 μL van het complex toe aan behandelde putjes.
    OPMERKING: Gebruik alleen de middelste 10 kolommen om randeffecten te voorkomen. Reserveer de buitenste kolommen als autofluorescentieregelaars en voeg alleen PBS toe aan deze putten.
  4. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 1 min, 5 min of 10 min.

5. Fluorescentie-afschrikking en intracellulaire signaaldetectie

  1. Bereid 1 μM FA-vrije BSA in PBS als wasbuffer en verwarm voor tot 37 °C.
  2. Verwijder BODIPY-FA: BSA en was de hele plaat twee keer met 50 μL voorverwarmd 1 μM FA-vrij BSA in PBS. Voer elke wasbeurt 1,5 minuut uit.
  3. Voeg 50 μL 0,08% Trypan Blue toe om extracellulaire fluorescentie te doven.
  4. Meet onmiddellijk intracellulaire fluorescentie met behulp van een microplaatlezer met de volgende instellingen: Excitatie: 488 nm, Emissie: 515 nm, Afkap: 495 nm, Modus: Bottom-read.
    OPMERKING: Trek de autofluorescentieachtergrond af met behulp van putjes in de buitenste kolom die cellen bevatten die niet met BODIPY-FA zijn behandeld in stap 4.

6. Hoechst nucleaire kleuring voor celnormalisatie

  1. Verwijder de Trypan Blue-oplossing en was voorzichtig met PBS.
    OPMERKING: De cellen kunnen enigszins kwetsbaar zijn en vatbaar voor vervelling. Wees voorzichtig bij het wassen.
  2. Voeg 4 μg/ml Hoechst in 10% media toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: De incubatietijd van Hoechst moet mogelijk worden geoptimaliseerd. Afhankelijk van het celtype kan 5 minuten tot 60 minuten nodig zijn om een uniforme nucleaire labeling en voldoende signaalintensiteit te bereiken. Voeg Hoechst niet toe aan de buitenste kolommen.
  3. Was de plaat één keer met PBS.
  4. Voeg nieuwe PBS toe en meet de Hoechst-fluorescentie met behulp van de volgende instellingen: Excitatie: 350 nm, Emissie: 461 nm, Cutoff: 455 nm, Modus: Bottom-read.
    OPMERKING: Trek de Hoechst-autofluorescentieachtergrond af met behulp van de buitenste kolomputten.
  5. Normaliseer BODIPY-FA-fluorescentie naar celnummer door de autofluorescentie-gecorrigeerde waarden uit stap 5.3 te delen door de overeenkomstige Hoechst-waarden verkregen in stap 6.4. Gebruik achtergrondgecorrigeerde waarden voor zowel BODIPY- als Hoechst-signalen.
    OPMERKING: De uiteindelijke waarden vertegenwoordigen de BODIPY-FA-opname genormaliseerd naar celnummer, gecorrigeerd voor autofluorescentie in zowel BODIPY- als Hoechst-kanalen.

7. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyse uit voor figuur 2 met behulp van tweerichtings-ANOVA om de effecten van tijd, concentratie en hun interactie te beoordelen. Pas de post-hoctest van Tukey toe voor meerdere vergelijkingen.
  2. Gebruik voor Figuur 3 en Figuur 4 de ongepaarde tweezijdige t-toets van Student bij het vergelijken van twee aandoeningen. Voor experimenten met drie of meer aandoeningen, gebruik eenrichtings-ANOVA gevolgd door de test van Dunnett voor meerdere vergelijkingen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals geïllustreerd in figuur 1, maakt deze test gebruik van een plaatformaat met 96 putjes waarbij EC's rechtstreeks in putjes worden gezaaid. BODIPY-gelabelde FA's worden geconjugeerd aan runderserumalbumine (BSA) en toegepast op zowel experimentele als controleputten. Voorafgaand aan FA-behandeling kunnen EC's worden gemanipuleerd door middel van farmacologische behandelingen of genetische verstoringen zoals siRNA-transfectie of CRISPR-genbewerking. Cruciaal is dat dergelijke manipulaties het ook mogelijk maken om passende positieve en negatieve controles op te nemen om de betrouwbaarheid van de test te waarborgen.

Een duidelijke dosis- en tijdsafhankelijke toename van het intracellulaire BODIPY-C12-signaal werd waargenomen na incubatie van BODIPY-C12 bij 0,5 μM, 1 μM en 2 μM gedurende 1 minuut, 5 minuten en 10 minuten in zowel HUVEC's als EA.hy926-cellen (Figuur 2). Om rekening te houden met mogelijke variaties in het aantal cellen per putje, werden BODIPY-C12-waarden genormaliseerd naar Hoechst nucleaire kleuring en fluorescerend gemeten. Achtergrondautofluorescentie werd gecorrigeerd met behulp van no-BODIPY- en no-Hoechst-controleputjes.

Om de reproduceerbaarheid en het bereik van de test te valideren, werden bekende modulatoren van het vetzuurmetabolisme getest in EA.hy926 EC's met behulp van BODIPY-C12 (Figuur 3). 1-uurs behandeling met toenemende concentraties lactaat (0 mM, 5 mM, 20 mM) of 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) verhoogde de opname van BODIPY-C12 op een dosisafhankelijke manier, wat hun rol als positieve regulatoren van FA-opname bevestigde. Omgekeerd is eerder aangetoond dat de chemische stof niclosamide de opname van vetzuren kan remmen via mitochondriale ontkoppeling15. Inderdaad, vergelijkbare resultaten werden hier gereproduceerd, aangezien 30 minuten behandeling met niclosamide (1 μM) het BODIPY-C12-signaal significant verminderde ten opzichte van de voertuigcontrole, wat het nut ervan als negatieve controle valideerde. Hoewel deze gegevens worden genormaliseerd naar Hoechst om rekening te houden met eventuele verschillen in celaantal, veranderde geen van deze behandelingen de levensvatbaarheid van de cellen of de Hoechst-fluorescentiewaarden.

Om het aanpassingsvermogen van de test aan verschillende vetzuuranalogen te beoordelen, werd BODIPY-C16, dat kan worden beschouwd als een proxy voor een vetzuur met een zeer lange keten, aan HUVEC's gegeven en werd de opname ervan gemeten na incubaties van 5 minuten (Figuur 4). Er werd waargenomen dat lactaatbehandeling (0 mM, 10 mM, 20 mM) het BODIPY-C16-signaal op een dosisafhankelijke manier verhoogde, terwijl niclosamide (1 μM) het signaal verminderde, een weerspiegeling van de resultaten die werden waargenomen met BODIPY-C12.

Al met al heeft deze test een robuuste en reproduceerbare kwantificering van FA-opname in zowel primaire (HUVEC) als onsterfelijke (EA.hy926) EC's mogelijk gemaakt. Bovendien tonen deze bevindingen de veelzijdigheid van de test aan bij FA's van verschillende ketenlengtes, en tonen ze de validiteit van zowel positieve als negatieve controles aan.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van de vetzuuropnametest met behulp van BODIPY-gelabelde vetzuren. Endotheelcellen worden gezaaid in een zwarte plaat met 96 putjes met heldere bodem en geïncubeerd met BODIPY-geconjugeerde vetzuuranalogen (FA) om intracellulaire opname mogelijk te maken. Na incubatie wordt extracellulaire fluorescentie gedoofd met Trypan Blue en wordt het intracellulaire signaal gemeten met behulp van een aan de onderkant afgelezen fluorescentiemicroplaatlezer. Hoechst nucleaire kleuring wordt aangebracht na fluorescentiemeting om het celaantal te kwantificeren voor normalisatie. Farmacologische behandeling of genetische verstoringen kunnen worden toegepast voorafgaand aan BODIPY-FA-incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Kwantificering van de opname van BODIPY-C12 in primaire en onsterfelijke endotheelcellen. (A) Tijd- en concentratieafhankelijke toename van de opname van BODIPY-C12 in HUVEC's na incubaties van 1 minuut, 5 minuten en 10 minuten bij 0,5 μM, 1 μM en 2 μM BODIPY-C12 gecomplexeerd tot respectievelijk 0,25 μM, 0,5 μM en 1 μM FA-vrije BSA. (B) EA.hy926-cellen vertoonden een vergelijkbare tijd- en dosisafhankelijke BODIPY-C12-opname onder identieke omstandigheden. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd naar Hoechst-gekleurde kernen (celaantal) en geen-BODIPY-controles. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van tweerichtings-ANOVA om de effecten van tijd, concentratie en hun interactie te beoordelen, gevolgd door Tukey's post hoc-test voor meerdere vergelijkingen. Significante hoofdeffecten werden waargenomen voor tijd (p < 0,0001), concentratie (p < 0,0001) en hun interactie (p = 0,0443). Statistisch significante paarsgewijze vergelijkingen geïdentificeerd door de Tukey-test worden als volgt aangegeven in het staafdiagram: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Validatie van de test met behulp van positieve en negatieve controles in EA.hy926. (A) Lactaatbehandeling van 1 uur (0 mM, 5 mM, 20 mM) verhoogde de opname van BODIPY-C12 op een dosisafhankelijke manier. (B) 1-uur 3-HIB-behandeling (0 mM, 5 mM, 20 mM) verhoogde op dezelfde manier de FA-opname. (C) Niclosamidebehandeling van 30 minuten (1 μM) onderdrukte de opname van BODIPY-C12 significant ten opzichte van de mediumcontrole (DMSO). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd naar Hoechst-gekleurde kernen (celaantal) en geen-BODIPY-controles. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. 2 μM BODIPY-C12 (gecomplexeerd tot 1 μM vetzuurvrij BSA) werd gedurende 5 minuten geïncubeerd voor alle experimenten. Statistieken voor (A) en (B) werden bepaald met behulp van eenrichtings-ANOVA met de test van Dunnett voor meerdere vergelijkingen, en voor C met behulp van de ongepaarde tweezijdige T-test van Student. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Validatie van de test met behulp van BODIPY-C16 in HUVEC's. (A) Lactaatbehandeling (0 mM, 10 mM, 20 mM gedurende 1 uur) verhoogde de opname van BODIPY-C16 op een dosisafhankelijke manier. (B) Behandeling met niclosamide (1 μM gedurende 1 uur) verminderde het BODIPY-C16-signaal aanzienlijk in vergelijking met met het voertuig behandelde controle. De gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd naar Hoechst-gekleurde kernen (celaantal) en geen-BODIPY-controles. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. 2 μM BODIPY-C16 (gecomplexeerd tot 1 μM vetzuurvrij BSA) werd gedurende 5 minuten geïncubeerd voor alle experimenten. Statistieken voor (A) werden bepaald met behulp van eenrichtings-ANOVA met de test van Dunnett voor meerdere vergelijkingen, en voor B met behulp van de ongepaarde tweezijdige T-test van Student. *p < 0,05, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze test biedt een snelle, kwantitatieve en kosteneffectieve methode voor het meten van FA-opname in EC's met behulp van een op platen gebaseerd formaat met 96 putjes en fluorescerende FA-analogen met lange ketens. Door zowel positieve als negatieve controles op te nemen en te valideren over primaire (HUVEC's) en onsterfelijke (EA.hy926) EC's, toont dit protocol robuustheid, reproduceerbaarheid en brede toepasbaarheid aan.

Op fluorescentie gebaseerde analyses hebben een belangrijke rol gespeeld bij het blootleggen van paracriene regulatoren van endotheliaal lipidetransport, zoals eerder vermeld 4,5,7. Deze voorbeelden laten zien hoe een gestandaardiseerd systeem de metabolietgestuurde regulatie van lipidetransport op betrouwbare wijze kan blijven ophelderen in een gecontroleerde in vitro setting. Het hier beschreven protocol stelt de belangrijkste parameters vast voor betrouwbare FA-opnamemetingen, waaronder het gebruik van BODIPY-C12 en BODIPY-C16 bij meerdere concentraties (0,5-2 μM) en incubatietijden (1 min, 5 min en 10 min). Het detecteerde ook effectief een verhoogde opname als reactie op 3-HIB en lactaat, en een verminderde opname na behandeling met niclosamide, wat zowel de gevoeligheid als het dynamische bereik bevestigt. Hoewel deze test hier is geoptimaliseerd voor EC's, kan deze test gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypen zoals adipocyten, myotubes of hepatocyten met aanpassingen aan BODIPY: BSA-ratio's en behandelingsvoorwaarden. Het kan ook worden aangepast voor beeldvorming van levende cellen met behulp van compatibele platen of worden aangepast in een puls-chase-formaat om intracellulaire FA-retentie, metabolisme of efflux te evalueren.

In vergelijking met andere benaderingen biedt deze methode duidelijke voordelen: het is schaalbaar, kwantitatief en aanpasbaar aan verschillende FA-ketenlengtes. Bovendien is het kosteneffectief, omvat het slechts een handvol stappen en vereist het instrumenten die niet complexer zijn dan een gewone microplaatlezer, waardoor nieuwe gebruikers, waaronder studenten, dit protocol snel onder de knie kunnen krijgen. Ten slotte legt dit protocol, in tegenstelling tot op kwalitatieve microscopie gebaseerde methoden of eindpuntkleuringen zoals Oil Red O, die het cumulatieve lipidegehalte weerspiegelen, real-time FA-opname vast zonder dat fixatie of lysis nodig is.

Desalniettemin moeten verschillende beperkingen worden opgemerkt. Het gebruik van een 2D statisch kweeksysteem vat de fysiologische complexiteit van de vasculaire omgeving niet volledig samen. Belangrijke factoren zoals schuifspanning of LPL-gemedieerde lipolyse, evenals endotheel-parenchymale interacties, ontbreken in dit vereenvoudigde model. Geavanceerde systemen, zoals microfluïdische of organoïde-gebaseerde 3D-coculturen, bootsen in vivo architectuur en signalering beter na, hoewel ze wel meer technische expertise en infrastructuur vereisen16,17. Microfluïdische bioreactoren bieden bijvoorbeeld een omgeving waarin EC's de vorming van microvasculatuur kunnen nabootsen en kunnen interageren met andere weefseltypen, waardoor onderzoekers de paracriene dynamiek in een meer fysiologische setting kunnen modelleren18. Bovendien heeft recent werk aangetoond dat gespecialiseerde systemen kunnen worden ontwikkeld om live fluorescerende beeldvorming uit te voeren in 3D-hydrogelculturen19. Dergelijke ontwikkelingen geven het vertrouwen dat deze test op een dag zou kunnen worden aangepast aan celkweeksystemen die fysiologisch representatiever zijn, maar er zou optimalisatie moeten worden uitgevoerd.

Samenvattend vertegenwoordigt deze test een flexibel, toegankelijk en reproduceerbaar platform voor het onderzoeken van cellulaire FA-opname onder diverse omstandigheden. Hoewel het het meest geschikt is voor mechanistische in vitro studies, kunnen inzichten uit dit systeem toekomstig werk informeren met behulp van meer fysiologisch relevante modellen van endotheliaal lipidentransport.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben verklaard dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanisha Choudhury werd gefinancierd door een Summer Undergraduate Research Fellowship van het Office for Undergraduate Research aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. Boa Kim werd ondersteund door NHLBI (R56HL162660) en AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim werd gesteund door het Faculty Research Fund van Union College.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Hydroxyisobutyrate (3-HIB)Cayman Chemicals26105Positieve controle, 5 of 20 mM eindconcentratie
96 well black, clear-bottom Polystyrene microplateSigma-AldrichCLS3603-48EAVoor het plateren van cellen die worden getest
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Groen fluorescerende lange keten vetzuur
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Groen fluorescerend zeer lang keten vetzuur
Bovine Serum Albumine oplossingSigma-AldrichA9205-50MLWordt gebruikt om Bodipy:BSA complex voor te bereiden
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650Oplosmiddel voor geneesmiddelvoorraden
Dispositieve pipetteer reservoirsVWR89094-680Bevat de verschillende oplossingen die op de cellen moeten worden gepipetteerd
Dulbecco’s Aangepast Medium van EagleCorning Life Sciences10-013-CVMedia voor EA.hy926 cellen
EA.hy926 cellenATCCCRL-2922 Gekweekte hybride endotheelcel lijn
EGM-2 Endotheelcel Groei Medium-2 BulletKitLonzaCC-3162Media voor HUVECs
Fetaal Runderserum (FBS) VWR97068-08510% supplement in EGM-2 en DMEM
Fluorescentie microplaat lezerVerschillendeN/AElke microplaat lezer die in staat is tot fluorescentie metingen
Gelatine oplossingSigma-AldrichG1393-100mlWordt gebruikt om platen te coaten bij 0,1% werkconcentratie
Hoechst 33342 OplossingLife Science62249Kernkleuring voor cel normalisatie (4 μM)
Human umbilical vein endothelial cellen (HUVECs)LonzaC2519APrimaire humane endotheelcellen
Multikanaals PipetVWR76627-768Voor pipetten in een 96-well plaat
Niclosamide Millipore SigmaN3510-50GNegatieve controle, 1 μM  eindconcentratie
PBS, met calcium en magnesiumFisher Scientific21031CVWordt gebruikt voor het bereiden van behandelingen en als wasbuffer (met BSA)
PBS, zonder calcium en magnesiumGenesee Scientific25-508Voor gelatine verdunning, Hoechst kleuring, en algemene wasbeurten
Penicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific151401221% supplement in EGM-2 en DMEM
Natrium L-lactaatSigma-AldrichL7022-5GPositieve controle, 5 of 20 mM eindconcentratie
Trypan Blauw oplossingSigma-AldrichT8154-20MLWordt gebruikt bij 0,08% om extracellulaire fluorescentie te doven
Vacuum Filter Systemen, 500ml PES Membraan, 0,45µmGenClone25-227Om gelatine oplossing te steriliseren

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwenk, R. W., Holloway, G. P., Luiken, J. J. F. P., Bonen, A., Glatz, J. F. C. Fatty acid transport across the cell membrane: regulation by fatty acid transporters. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 82 (4-6), 149-154 (2010).
  2. He, Q., Chen, Y., Wang, Z., He, H., Yu, P. Cellular uptake, metabolism and sensing of long-chain fatty acids. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (1), 10(2023).
  3. Mashek, D. G., Coleman, R. A. Cellular fatty acid uptake: the contribution of metabolism. Curr Opin Lipidol. 17 (3), 274-278 (2006).
  4. Jang, C., et al. A branched-chain amino acid metabolite drives vascular fatty acid transport and causes insulin resistance. Nat Med. 22 (4), 421-426 (2016).
  5. Hagberg, C. E., et al. Vascular endothelial growth factor B controls endothelial fatty acid uptake. Nature. 464 (7290), 917-921 (2010).
  6. Hwangbo, C., et al. Endothelial APLNR regulates tissue fatty acid uptake and is essential for apelin's glucose-lowering effects. Sci Transl Med. 9 (407), eaad4000(2017).
  7. Ibrahim, A., et al. Insulin-stimulated adipocytes secrete lactate to promote endothelial fatty acid uptake and transport. J Cell Sci. 135 (5), jcs258964(2022).
  8. Kuo, A., Lee, M. Y., Sessa, W. C. Lipid droplet biogenesis and function in the endothelium. Circ Res. 120 (8), 1289-1297 (2017).
  9. Ibrahim, A., Arany, Z. Does endothelium buffer fat. Circ Res. 120 (8), 1219-1221 (2017).
  10. Kim, B., et al. Endothelial lipid droplets suppress eNOS to link high-fat consumption to blood pressure elevation. J Clin Invest. 133 (24), e173160(2023).
  11. Dubikovskaya, E., Chudnovskiy, R., Karateev, G., Park, H. M., Stahl, A. Measurement of long-chain fatty acid uptake into adipocytes. Methods Enzymol. 538, 107-134 (2014).
  12. Watkins, O. C., et al. Metabolism of 13C-labeled fatty acids in term human placental explants by liquid chromatography-mass spectrometry. Endocrinology. 160 (6), 1394-1408 (2019).
  13. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol. 2011, 598358(2011).
  14. Fraser, H., et al. Fatty acid uptake in diabetic rat adipocytes. Mol Cell Biochem. 167 (1-2), 51-60 (1997).
  15. Ibrahim, A., Yucel, N., Kim, B., Arany, Z. Local mitochondrial ATP production regulates endothelial fatty acid uptake and transport. Cell Metab. 32 (2), 309-319.e7 (2020).
  16. Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Opin Biotechnol. 25, 95-102 (2014).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).
  18. Maiullari, F., et al. Modeling breast cancer dynamics through modulable small vessel environment bioreactor (sVEB). Biomaterials. 323, 123441(2025).
  19. Murphy, A. R., Franco, R. A., Allenby, M. C. Fabricating microfluidic co-cultures of immortalized cell lines uncovers robust design principles for the simultaneous formation of patterned, vascularized, and stem cell-derived adipose tissue. Small. , e2501834(2025).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BODIPY vetzuurendotheelcellenvetzuurtransportassay in 96 wellplaatHoechst kernkleuringlive cell imagingdosisafhankelijke opnamemetabole ziekte

Gerelateerde artikelen