Methodenartikel

Evaluatie van het effect van SASP-factoren op de proliferatie van kankercellen met behulp van een vergelijkende analyse van drie verschillende methodologieën

DOI:

10.3791/68883

⸱

19 september 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie evalueert de proliferatieve effecten van senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)-factoren van senescente HeLa-cellen op niet-senescente HeLa-cellen met behulp van drie in vitro-modellen met real-time monitoring. De voordelen en beperkingen van elke methode werden systematisch vergeleken om de cel-celinteracties bij kanker beter te begrijpen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door chemotherapie geïnduceerde senescente kankercellen scheiden ook verschillende factoren af, het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, om hun extracellulaire micro-omgeving te reguleren. Eerdere studies hebben gemeld dat deze SASP-factoren schadelijke paracriene effecten hebben op omliggende cellen, waaronder het bevorderen van proliferatie, epitheel-mesenchymale overgang (EMT), angiogenese en migratie. Verschillende in vitro co-cultuurtechnieken worden veel gebruikt om de cellulaire processen te begrijpen die het gevolg zijn van interactie door dezelfde en verschillende soorten cellen samen te kweken. Hier werden de potentiële proliferatieve effecten van SASP-factoren die worden uitgescheiden door senescente HeLa-cellen op niet-senescente HeLa-cellen onderzocht met behulp van drie complementaire in vitro-benaderingen . De eerste benadering omvatte het co-kweken van senescente en niet-senescente cellen om de paracriene signalering te onderzoeken die door de SASP werd gemedieerd. In de tweede benadering werden geconditioneerde media verzameld uit senescente kankercellen geconcentreerd en vervolgens gebruikt om de impact van de geconditioneerde media te onderzoeken met real-time monitoring van proliferatie. In de derde methode werden senescente en niet-senescente cellen naast elkaar gekweekt om de juxtacriene effecten van SASP te beoordelen door direct cel-tot-cel contact. Alle drie de experimentele modellen toonden consequent aan dat SASP-factoren de proliferatie van niet-senescente kankercellen aanzienlijk verbeterden. Met name senescente celcocultuur verhoogde de proliferatiesnelheid met 64,6%, en 3x geconcentreerde SASP-geconditioneerde media verhoogden de proliferatie met meer dan 50% in vergelijking met controles. Op fluorescentie gebaseerde beeldvorming toonde een toename van 49,3% in het aantal GFP-positieve cellen onder juxtacriene omstandigheden. Deze methoden maakten samen een kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van door SASP geïnduceerde proliferatieve veranderingen mogelijk. De vergelijkende analyse van deze benaderingen benadrukt hun respectieve sterke punten en beperkingen en biedt waardevolle inzichten in de paracriene effecten van senescente cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In meercellige organismen communiceren cellen via paracriene en juxtacriene signalering door berichten uit te wisselen met hun micro-omgeving, waardoor ze elkaars gedrag beïnvloeden. Deze communicatie kan direct plaatsvinden, via tunnelende nanobuisjes en gap junctions, of indirect door de afscheiding van oplosbare chemische moleculen zoals cytokines, groeifactoren en chemokines in de extracellulaire matrix. Deze signaalmechanismen spelen een essentiële rol bij het reguleren van verschillende fysiologische processen, waaronder weefselontwikkeling en immuuncelresponsen, en zijn ook betrokken bij de pathogenese van tal van ziekten, zoals kanker, HIV, hypertensie en de ziekte van Alzheimer1.

In de jaren 1960 ontdekte Leonard Hayflick dat normale menselijke fibroblasten een beperkt vermogen hebben om in vitro te repliceren 2. Deze beperkte celproliferatietoestand die zich ontwikkelt als gevolg van telomerase-verkorting wordt replicatieve senescentie genoemd. Latere studies hebben aangetoond dat verschillende vormen van cellulaire stress ook cellulaire veroudering kunnen veroorzaken. Er is vastgesteld dat veel voorkomende kankerbehandelingen zoals chemotherapie en radiotherapie ook cellulaire senescentie induceren in zowel kanker als stromale cellen, therapie-geïnduceerde senescentie 3,4 genoemd. Cellulaire veroudering en veroudering zijn hiërarchisch verwante processen; Ze vertegenwoordigen verschillende biologische processen. De ophoping van senescente cellen in het organisme draagt bij aan veroudering door ontstekingen, weefseldisfunctie en de ontwikkeling van ouderdomsziekten te bevorderen. Veroudering omvat echter een veel breder scala aan systemische gebeurtenissen en mechanismen in vergelijking met veroudering5.

Senescente cellen worden gekenmerkt door het feit dat hun geëxpandeerde cytoplasma aanzienlijk groter is en een afgeplatte morfologie heeft in vergelijking met normale cellen6. Deze senescente cellen hebben een verhoogde lysosomale activiteit en zijn positief voor senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit, een lysosomaal enzym dat zelfs bij een zure pH van 6,0 actief blijft. SA-β-gal-kleuring is de meest gebruikte biomarker voor het detecteren van senescente cellen7. Vergroting en onregelmatige morfologie van kernen worden vaak waargenomen in cellen die veroudering ondergaan. Bovendien worden deze cellen gekenmerkt door unieke chromatine-herschikkingen, senescentie-geassocieerde heterochromatische foci (SAHF) genaamd, die onomkeerbare celcyclusstilstand mediëren 8,9.

Hoewel senescente kankercellen uiteindelijk hun vermogen om zich te vermenigvuldigen verloren, bleven ze levensvatbaar en metabolisch actief. Het is bekend dat senescente cellen ook verschillende factoren afscheiden om hun extracellulaire tumormicro-omgeving te reguleren, het zogenaamde senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)10,11. Deze SASP-factoren omvatten oplosbare signaalfactoren (interleukinen, chemokinen en groeifactoren), uitgescheiden proteasen en uitgescheiden onoplosbare eiwitten/extracellulaire matrix (ECM)-componenten. Gezamenlijk hebben deze factoren schadelijke paracriene effecten, waaronder het bevorderen van de proliferatie, migratie, invasie en de inductie van epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT)4,12. Bovendien zijn door chemotherapie veroorzaakte bijwerkingen gedeeltelijk toegeschreven aan de accumulatie van senescente cellen13. Daarom is het onderzoeken van de interactie tussen senescente en niet-senescente cellen een belangrijk onderzoeksgebied geworden in de context van kankertherapie. Vooral de analyse van SASP-factoren, met name hun samenstelling en de effecten op de micro-omgeving van kanker, wordt beschouwd als een veelbelovende strategie voor het identificeren van nieuwe doelmoleculen voor kankertherapie en het ontdekken van nieuwe geneesmiddelen voor deze moleculen.

In vitro co-cultuurtechnieken worden al lang gebruikt om het begrip van cel-tot-cel interacties te bestuderen14. In dit methodologische artikel was het doel om de mogelijke proliferatieve activiteit van factoren die worden uitgescheiden door senescente cellen op niet-senescente kankercellen te evalueren met behulp van drie verschillende methoden. Bovendien werden de resultaten van de drie verschillende methoden vergeleken en werden de respectieve voor- en nadelen van elke benadering kritisch geëvalueerd.

Eerst werd een co-cultuurmodel opgezet tussen senescente HeLa- en niet-senescente HeLa-cellen om de mogelijke veranderingen in de proliferatie van kankercellen in real-time te monitoren met behulp van het real-time celanalysesysteem12. Dit systeem bestaat uit twee platen om cel-celinteracties te evalueren. De e-plaatweergave, die de onderste laag vormt, heeft een oppervlak waar doelcellen worden gezaaid, met micro-elektroden die aan de onderkant van de plaat zijn geplaatst. De elektrische weerstand die ontstaat door de hechting van doelcellen aan dit oppervlak wordt uitgedrukt door de meetbare parameter Cell Index (CI). De CI-waarde is evenredig met het aantal cellen en de mate van hechting aan het oppervlak15. Bovendien maakt de e-plaatweergave morfologisch onderzoek van cellen onder een fasecontrastmicroscoop mogelijk. De e-plaatinzet, die de bovenste laag vormt, is het gebied waar effectorcellen worden gezaaid. De bodem van deze plaat is bedekt met een semi-permeabel membraan met een poriegrootte van 0,4 μm. Factoren die door effectorcellen worden uitgescheiden, kunnen door het membraan gaan en de doelcellen in de e-plaatweergave beïnvloeden. Als deze interactie de celproliferatie stimuleert, wordt dit waargenomen als een toename van de CI-waarde. Interacties tussen cellen kunnen dus kwantitatief worden geëvalueerd.

In de tweede methode werden geconditioneerde media verzameld uit senescente HeLa-cellen geconcentreerd en toegevoegd aan niet-senescente HeLa-cellen. Het potentiële proliferatieve effect op deze cellen werd gemonitord met behulp van het real-time celanalysesysteem.

In de derde methode was het de bedoeling om de senescente HeLa-cellen en de niet-senescente GFP-HeLa-cellen rechtstreeks in 2D te co-kweken en de mogelijke proliferatieve veranderingen in kankercellen in realtime onder een microscoop te volgen.

Het doel van dit experiment is om drie modellen op te zetten om de interactie tussen senescente HeLa- en niet-senescente HeLa-cellen te bestuderen en mogelijke veranderingen in de proliferatie van kankercellen in realtime te volgen. Zo kan het effect van SASP-factoren die door senescente kankercellen worden uitgescheiden op de andere kankercellen gemakkelijk worden onderzocht. Dienovereenkomstig werden de voordelen en beperkingen van de drie benaderingen systematisch geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle celkweekprocedures werden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau II+ (BSL2+) omstandigheden in een gecertificeerde veiligheidskast. Doxorubicine is een gevaarlijk chemotherapeutisch middel. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een gecertificeerde kast van bioveiligheidsniveau II+ (BSL2+) met behulp van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder laboratoriumjassen en handschoenen. Alle afvalstoffen die doxorubicine bevatten, met inbegrip van media en fixeermiddelen, moeten worden ingezameld in aangewezen en duidelijk geëtiketteerde containers voor gevaarlijk afval en worden verwijderd via het institutionele beheersysteem voor gevaarlijk afval.

1. Model 1: Co-culturing met behulp van het real-time celanalysesysteem

  1. Cellen kweken en inductie van veroudering (dag 1-2)
    1. Zaai 8 x 105 HeLa-cellen in een T25-kweekkolf met 5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en incubeer cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Vervang de volgende dag het medium van de cellen door 5 ml vers compleet medium. Behandel de cellen rechtstreeks met 300 nM doxorubicine door ze aan het medium toe te voegen om cellulaire veroudering op te wekken. Houd de T25-kolf in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 °C gedurende 72 uur.
  2. Niet-senescente cellen zaaien (dag 4)
    1. Zaai 8 x 105 onbehandelde HeLa-cellen (niet-senescente controle) in een nieuwe T25-kolf in 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en bewaar in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Bevestiging van de inductie van senescentie (dag 5)
    1. Om te bepalen of 72 uur behandeling met doxorubicine senescentie veroorzaakte, voert u SA-β-gal-kleuringuit 6. Voer deze test uit op een afzonderlijke set cellen die niet in de hoofdexperimenten zijn gebruikt. Voor de verkregen resultaten, zie figuur 1A,B.
    2. Meet IL-6 in de geconditioneerde media van senescente kanker HeLa-cellen om hun secretoire activiteit te evalueren. Behandel de cellen gedurende 72 uur met doxorubicine, gevolgd door incubatie in serumvrij en fenolroodvrij medium gedurende nog eens 2 dagen. Normaliseer de verzamelde geconditioneerde media naar het celaantal en meet IL-6-niveaus.
      OPMERKING: IL-6 is een kenmerkend cytokine van SASP12. De resultaten van de IL-6-meting worden weergegeven in figuur 1C.
  4. Instelling van het real-time celanalysesysteem (dag 5)
    1. Schakel het real-time celanalysesysteem in voordat de cellen worden gezaaid. Start RTCA-software 2.0. Klik op de knop Exp Notes (Figuur 2) en voer experimentele details in.
    2. Klik op de knop Plannen en voeg twee stappen toe. De eerste stap is voor de achtergrond. De tweede stap is het controleren van de celproliferatie elke 15 minuten gedurende 72 uur.
    3. Kies de eerste stap en klik op Afspelen om de achtergrondimpedantie op te nemen door 50 μL volledig medium toe te voegen aan elk putje van de weergave van de e-plaat.
  5. Cellen zaaien in de weergave van de e-plaat (dag 5)
    1. Controleer zowel met doxorubicine behandelde (senescente) als onbehandelde (niet-senescente) HeLa-cellen onder een fasecontrastmicroscoop met een vergroting van 10x voordat de cellen worden gezaaid. Onder de microscoop hebben senescente cellen een veel grotere morfologie dan normale cellen.
    2. Was zowel de senescente als de niet-senescente HeLa-cellen met 5 ml steriel voorverwarmd PBS en aspireer vervolgens.
    3. Voeg 1 ml voorverwarmde 0,05% trypsine toe en houd de kolven gedurende 2 minuten op 37 °C om de cellen los te maken. Neutraliseer de trypsine met 5 ml complete DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    4. Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellets in 5 ml volledige DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    5. Tel de levensvatbare cellen met behulp van de trypanblauwe kleurstofuitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer.
    6. Zaad niet-senescente HeLa-cellen met een dichtheid van 5 x 103 cellen/putje in elk putje van één e-plaat in volledige 100 μL DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    7. Plaats de e-plaatweergave in de houder van het real-time celanalysesysteem zodat de cellen zich kunnen hechten aan het plaatoppervlak in de incubator.
    8. Kies de tweede stap op de schemaknop en klik op de knop Afspelen om de impedantiemeting te starten met behulp van RTCA-software 2.0 gedurende 72 uur (Afbeelding 2).
  6. Cellen zaaien in de e-plaat insert
    1. Zaadcellen in één e-plaat voegen putjes in 60 μL volledige DMEM in, aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    2. Zaaicellen op de e-plaat invoegen onder drie verschillende experimentele opstellingen: Groep 1 (negatieve controle): Geen cellen gezaaid (alleen media)
      Groep 2: 2 × 104 niet-senescente HeLa-cellen
      Groep 3: 1 × 105 senescente HeLa-cellen
    3. Houd de inzet van de e-plaat in een broedmachine op 37 °C met 5% CO2 gedurende 6 uur voor bevestiging.
  7. Cellen co-kweken
    1. Klik op Onderbreken na 6 uur celzaaien. Zuig het kweekmedium voorzichtig op uit elk putje van de e-plaatweergave om serum en niet-aanhangende cellen te verwijderen.
    2. Was putjes 2x met voorverwarmde PBS op 37 °C.Voeg 140 μL serumvrije DMEM toe aan elk putje van de e-plaatweergave.
    3. Neem de e-plaatinzet en zuig het kweekmedium op. Spoel de putjes 2x voorzichtig met PBS op 37 °C en voeg 60 μL serumvrije DMEM toe.
    4. Plaats het inzetstuk van de e-plaat in het aanzicht van de e-plaat en druk het voorzichtig naar beneden totdat het inzetstuk volledig in de put zit.
    5. Plaats de gecombineerde plaat in het real-time celanalysesysteem en klik op Afspelen om de real-time monitoring van celindexwaarden met tussenpozen van 15 minuten te hervatten met behulp van de software (Afbeelding 2).
    6. Schakel het real-time celanalysesysteem uit wanneer de experimenttijd voorbij is (Figuur 3A).
  8. Beeldvormende cellen op e-plaat insert
    OPMERKING: Aangezien er een membraan in de e-plaat zit, kunnen de hier gezaaide cellen niet op het membraan worden gevisualiseerd met behulp van fasecontrastmicroscopie. Om te testen of de cellen tot het einde van het experiment levensvatbaar bleven en of de senescente cellen hun structurele integriteit behielden, werden ze daarom gekleurd met DAPI (Figuur 3B).
    1. Verwijder het inzetstuk van de e-plaat uit de weergave van de e-plaat. Kleur de cellen in de e-plaat met DAPI en controleer de aanwezigheid van cellen onder een fluorescerende microscoop16. Het is bekend dat de kernen van senescente cellen groter zijn dan die van normale cellen. Bepaal daarom, op basis van de nucleaire grootte van de cellen die met DAPI zijn gekleurd, welke put is gezaaid met niet-senescente en welke met senescente cellen.
  9. Beeldvorming van cellen op de e-plaatweergave
    1. Onderzoek de weergave van de e-plaat direct onder een fasecontrastmicroscoop met een vergroting van 10x (Afbeelding 3B). Aangezien vier rijen micro-elektrodesensoren uit het midden van elk putje in de weergave van de e-plaat werden verwijderd, werd ruimte 6 gecreëerd om celbewaking door microscopie mogelijk te maken.
  10. Gegevensanalyse
    1. Normaliseer de CI-waarden op het tijdstip waarop de e-plaatweergave en de e-plaatinvoeging worden gecombineerd en in het real-time celanalysesysteem worden ingevoegd.
    2. Klik op de knop Gegevensanalyse om de proliferatiesnelheid en -hoeveelheid te berekenen met behulp van de maximale celindex- en hellingsgegevens die zijn verkregen uit het real-time celanalysesysteem (Figuur 2). Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een geschikt statistisch programma (Figuur 3C,D).

2. Model 2: Geconditioneerde mediabehandelingstest met behulp van het real-time celanalysesysteem

  1. Cellen kweken en inductie van veroudering (dag 1-2)
    1. Zaai 35 x 104 HeLa-cellen in elk putje van 6 putjes met 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en incubeer cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Vervang de volgende dag het celmedium door 2,5 ml vers compleet medium. Behandel de cellen rechtstreeks met 300 nM doxorubicine door het aan het medium toe te voegen om cellulaire veroudering te induceren. Houd de 6-wells plaat in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 °C gedurende 72 uur.
  2. Niet-senescente cellen zaaien (dag 4)
    1. Zaai 35 x 104 onbehandelde HeLa-cellen (niet-senescente controle) in elk putje van een nieuwe plaat met 6 putjes in 2,5 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en bewaar in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Voer de bevestiging van de inductie van senescentie uit zoals beschreven in stap 1.3.
  4. Bereiding van geconditioneerd medium uit senescente en niet-senescente HeLa-cellen
    1. Controleer zowel met doxorubicine behandelde cellen (senescente cellen) als onbehandelde HeLa-cellen (niet-senescente cellen) onder een fasecontrastmicroscoop. Onder de microscoop hebben senescente cellen een veel grotere morfologie dan normale cellen.
    2. Zuig het kweekmedium op uit beide twee platen met 6 putjes (senescente en niet-senescente HeLa-cellen). Was de cellen 2x met voorverwarmd PBS op 37 °C om achtergebleven serum en celresten te verwijderen.
    3. Voeg 2 ml serumvrije DMEM aangevuld met penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) toe aan elk putje. Incubeer de cellen in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
  5. Geconditioneerde media verzamelen en concentreren (dag 7)
    1. Verzamel de geconditioneerde media van elke put in steriele buisjes in een laminaire veiligheidscabine.
    2. Trypsiniseer de cellen en tel de cellen met behulp van de trypanblauwe kleurstofuitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer om geconditioneerde media te normaliseren tot celaantallen.
    3. Pas de geconditioneerde media, genormaliseerd volgens het aantal cellen, aan op een eindvolume van 2 ml met serumvrije DMEM aangevuld met penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) in steriele buisjes van 2 ml.
    4. Centrifugeer de verzamelde geconditioneerde media bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen, gevolgd door centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het geklaarde supernatant te verkrijgen.
    5. Centrifugeer de geconditioneerde media met behulp van 2 ml ultracentrifugaalfilterunits bij 4 °C gedurende 60 minuten bij 3.000 x g om het te concentreren. Deze procedure concentreert de 2 ml geconditioneerde media tot 5x de geconcentreerde 400 μl geconditioneerde media.
    6. Verdun de verkregen 40 μl geconditioneerde media met vers serumvrij medium om 1x, 2x en 3x geconcentreerde geconditioneerde media te bereiden in steriele buisjes in een laminaire veiligheidscabine.
      OPMERKING: Aangezien het medium dat 48 uur op de cellen achterblijft, uitgeput is door cellulair verbruik, worden de verzamelde en geconcentreerde geconditioneerde media vervolgens verdund met een nieuw medium.
  6. Cellen zaaien naar e-plaatweergave
    1. Stel het real-time celanalysesysteem in zoals beschreven in de stappen 1.1-1.4.Was niet-senescente HeLa-cellen met voorverwarmde PBS en aspireer vervolgens.
    2. Voeg 1 ml voorverwarmde 0,05% trypsine toe en houd de kolven gedurende 2 minuten op 37 °C om de cellen los te maken. Neutraliseer de trypsine met 5 ml complete DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    3. Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellets in 5 ml volledige DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    4. Tel de levensvatbare cellen met behulp van de trypanblauwe kleurstofuitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer.
    5. Zaad niet-senescente HeLa-cellen met een dichtheid van 5 x 103 cellen/putje in elk putje van één e-plaatweergave in 200 μL volledige DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    6. Plaats de e-plaatweergave in de houder van het real-time celanalysesysteem zodat de cellen zich kunnen hechten aan het plaatoppervlak in de incubator.
    7. Kies de tweede stap op de schemaknop en klik op de knop Afspelen om de impedantiemeting te starten met behulp van RTCA-software 2.0 (Afbeelding 2). Klik op de knop Pauze op de software na 6 uur plateren van niet-senescente HeLa-cellen (Figuur 2).
    8. Zuig het kweekmedium voorzichtig op uit elk putje van de e-plaatweergave om serum en niet-aanhangende cellen te verwijderen. Spoelbakken 2x wassen met voorverwarmd PBS op 37 °C.
    9. Voeg de voorverwarmde geconditioneerde media tot 37 °C toe aan de juiste groepen:
      Groep 1: Verse media
      Groep 2: 1x niet-senescente HeLa-cel geconditioneerde media
      Groep 3: 2x niet-senescente HeLa-cel geconditioneerde media
      Groep 4: 3x niet-senescente HeLa-cel geconditioneerde media
      Groep 5: 1x senescente HeLa-cel geconditioneerde media
      Groep 6: 2x senescente HeLa-cel geconditioneerde media
      Groep 7: 3x senescente HeLa-cel geconditioneerde media
    10. Plaats de weergave op de e-plaat in het real-time celanalysesysteem en klik op Afspelen om de real-time monitoring van celindexwaarden te hervatten met tussenpozen van 15 minuten gedurende 48 uur (Afbeelding 2).
    11. Schakel het real-time celanalysesysteem uit wanneer de experimenttijd voorbij is (Figuur 4A).
  7. Beeldvorming van cellen op de e-plaatweergave
    1. Onderzoek de weergave van de e-plaat direct onder een fasecontrastmicroscoop met een vergroting van 10x (Figuur 4B). Aangezien vier rijen micro-elektrodesensoren uit het midden van elk putje in de weergave van de e-plaat werden verwijderd, werd er ruimte gecreëerd om celbewaking door microsopie mogelijk te maken.
  8. Gegevensanalyse
    1. Normaliseer de CI-waarden op het tijdstip waarop de geconcentreerde geconditioneerde media werden toegediend aan de niet-senescente HeLa-cellen.
    2. Klik op de knop Gegevensanalyse om de proliferatiesnelheid en -hoeveelheid te berekenen met behulp van de maximale celindex- en hellingsgegevens die zijn verkregen uit het real-time celanalysesysteem (Figuur 2). Analyseer vervolgens de gegevens met behulp van een geschikt statistisch programma (Figuur 4C,D).

3. Model 3: Real-time monitoring van cel-cel interactie

  1. Cellen kweken en inductie van veroudering (dag 1-2)
    1. Zaai 8 x 105 HeLa-cellen in een T25-kweekkolf met 5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en incubeer cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
    2. Vervang de volgende dag het medium van de cellen door 5 ml vers compleet medium. Behandel de cellen rechtstreeks met 300 nM doxorubicine door ze aan het medium toe te voegen om cellulaire veroudering op te wekken. Houd de T25-kolf in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 °C gedurende 72 uur.
  2. Niet-senescente cellen zaaien (dag 4)
    1. Zaai 8 x 105 GFP-HeLa-cellen (niet-senescente controle) in een nieuwe T25-kolf in 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en bewaar in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
    2. Zaai 8 x 105 HeLa-cellen (niet-senescente controle) in een nieuwe T25-kolf in 5 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) en bewaar in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Voer de bevestiging van de inductie van senescentie uit zoals beschreven in stap 1.3 (dag 5).
  4. Cellen co-kweken
    1. Controleer met doxorubicine behandelde cellen, onbehandelde GFP-HeLa- en onbehandelde HeLa-cellen onder een fasecontrastmicroscoop voordat u cellen zaait. Onder de microscoop hebben senescente cellen een veel grotere morfologie dan normale cellen.
    2. Was alle drie de T25-kolven met 5 ml steriel voorverwarmd PBS en zuig ze vervolgens op. Voeg 1 ml voorverwarmde 0,05% trypsine toe en houd de kolven gedurende 2 minuten op 37 °C om de cellen los te maken.
    3. Neutraliseer de trypsine met 5 ml complete DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    4. Centrifugeer de cellen bij 500 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min, gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellets in 5 ml volledige DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    5. Tel de levensvatbare cellen met behulp van de trypanblauwe kleurstofuitsluitingsmethode met behulp van een hemocytometer. Zaadcellen in 200 μL complete DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml).
    6. Zaai cellen op μ-slide 8-well hoog onder drie verschillende experimentele opstellingen:
      Groep 1: 7 x 103 GFP-HeLa-cellen
      Groep 2: 18 x 103 niet-senescente HeLa-cellen + 7 x 103 GFP-HeLa-cellen
      Groep 3: 18 x 103 senescente HeLa-cellen + 7 x 103 GFP-HeLa-cellen
    7. Houd de μ-schuif voor bevestiging 8 uur bij 37 °C in een broedstoof met 5% CO2 aan. Was de cellen na 8 uur 2x met voorverwarmd PBS (37 °C) om het effect van serum op de cellen te elimineren.
    8. Voeg 200 μL serumvrije DMEM met penicilline (100 E/ml) en streptomycine (0,1 μg/ml) toe aan elk putje.
  5. Microscoop opstelling
    1. Zet de temperatuurregelaar en de CO2-regelaar aan en laat het incubatiesysteem van de stage gedurende 30 minuten stabiliseren.
    2. Controleer de CO2 -concentratie en temperatuurinstellingen handmatig en zorg ervoor dat fysiologische omstandigheden (5% CO2, 37 °C) worden bereikt.
    3. Schakel de omgekeerde fluorescentiemicroscoop in en laat het systeem zichzelf kalibreren. Schakel de fluorescentielichtbron in. Start de beeldvormings- en analysesoftware om beeldvormingsparameters en beeldacquisitie te controleren.
  6. Time-lapse-beeldvorming
    1. Plaats het diaatje op de incubatiekamer van de omgekeerde fluorescentiemicroscopie met een hoge resolutie digitale camera. Open de software en selecteer de modi Deel X, Y, Z en T en voer experimenten uit in acquisitie-instellingen (Afbeelding 5A).
    2. Selecteer een 20x objectief met hoog contrast voor fluorescentie- en fasecontrastbeeldvorming (Figuur 5A). Voeg de fasecontrast- en fluorescentiekanalen (FITC-filter) toe om beeldvorming in beide modi mogelijk te maken (Afbeelding 5A).
    3. Klik op de Live-knop om beeldvorming van levende cellen te starten en breng vervolgens de cellen scherp onder fasecontrast (Figuur 5A). Open het z-stack-venster en markeer de positie van de cellen van belang (die zowel senescentie/niet-senescente HeLa-cellen als GFP HeLa-cellen bevatten). Navigeer door de trap tussen putten met behulp van de automatische trapcontroller, waarmee de geselecteerde gebieden voor positiemarkering nauwkeurig kunnen worden gelokaliseerd (Figuur 5A).
      OPMERKING: Op deze manier kan meer dan één gebied worden geselecteerd in hetzelfde vak van een dia.
    4. Schakel het kanaal over naar het fluorescentiekanaal om de fluorescentiebeeldvorming te starten. Stel de juiste instellingen voor belichting (89.506 ms), versterking (10) en intensiteit (136) in (Afbeelding 5A).
      OPMERKING: Deze parameters variëren afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit van de cellen die het fluorescerende eiwit tot expressie brengen.
    5. Selecteer een μm z-stack-interval, stel de bovenste en onderste posities in en configureer de z-stack onder fasecontrast (Afbeelding 5A). Klik op Stoppen om de optie Live te sluiten.
    6. Stel de duur (48 uur) en het tijdsinterval (30 min) in met behulp van de velden Duur en Tijdsinterval voor time-lapse-beeldvorming.
    7. Klik op Start om 48 uur lang met beeldvorming te beginnen (Afbeelding 5A). Sla het project na 48 uur op (Afbeelding 5A).
    8. Selecteer op elk tijdstip (0 uur en 48 uur) het beste frame uit de z-stack en exporteer de afbeelding (Afbeelding 5A).
    9. Tel de GFP-positieve cellen op 0 uur en 48 uur, bereken de procentuele toename van GFP-positieve cellen en analyseer de gegevens met behulp van een geschikt softwareprogramma (Figuur 1D,E).
  7. Film genereren
    1. Klik op Galerie weergeven om alle vastgelegde afbeeldingen weer te geven, geordend op tijdstippen en z-stack-lagen (Afbeelding 5B).
    2. Klik voor elk tijdstip met de rechtermuisknop op de afbeelding met de beste focus in de bijbehorende z-stack en selecteer Duimen in een rij selecteren. Sla de geselecteerde frames op (Afbeelding 5B).
    3. Herhaal dit proces afzonderlijk voor elke positie. Gebruik de functie Best gefocuste frames zoeken om te helpen bij het selecteren van de meest scherpgestelde afbeeldingen. Sla geselecteerde afbeeldingen op via de optie Geselecteerde frames opslaan. De opgeslagen afbeeldingen worden automatisch geüpload naar de sectie Open Project.
    4. Klik met de rechtermuisknop op de film en selecteer Afbeelding exporteren zodra de afbeeldingsreeksen volledig zijn geladen.
    5. Navigeer naar het tabblad Film in het exportvenster, stel de gewenste framesnelheid in (frames per seconde), selecteer indien nodig extra opties zoals schaalbalk, tijdstempel, enz. en voltooi de export door een bestemming te kiezen met behulp van de optie Bladeren (Afbeelding 5B, Video 1, Video 2 en Video 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze representatieve reeks experimenten onderzocht de mogelijke effecten van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype afgeleid van senescente kankercellen op andere kankercellen. Daarom werd eerst bevestigd of behandeling met doxorubicine gedurende 72 uur senescentie in HeLa-cellen kon induceren met behulp van SA-β-Gal-kleuring. In senescente cellen blijft het lysosomale enzym β-galactosidase actief, zelfs bij een lage pH en splitst het chromogene substraat X-gal en vormt een bl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dynamische interacties van kankercellen in hun micro-omgeving zijn cruciaal voor de progressie van tumoren, die de inductie van metastase en de ontwikkeling van een secundaire tumor beïnvloeden. Er wordt ook gemeld dat senescente kanker en stromale cellen de micro-omgevingen van tumoren reguleren door de factoren die worden uitgescheiden door senescente cellen4. Deze factoren stimuleren celproliferatie, migratie, invasie, differentiatie en verhogen de resistentie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Scientific Project Unit van Gazi University (Grant code: TOA-2021-7321) en TUBITAK (Grant code: 122S564 en 223S969).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-Slide 8 Well hoogfigure-materials-1bidi80806
0,05 % Trypsin-EDTA (1X)Gibco25300-054
Amicon Ultra centrifugal filter units (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
CO2 incubator (37°C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorubicinTocris2252
E-plate INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
HeLa Cellsfigure-materials-2AP Institute, Ankara, TurkijeHÜKÜK No: 90061901 
Leica DMi8 invertede fluorescentiemicroscoop Leica
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco70011-044
Senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) kleuringskit Cell Signalling9860S
Stage-top incubatiesysteemPecon 
Temp-controller 2002-2 Pecon 
Trypan Blauw KleurmiddelSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP systeem ACEA Biosciences/Agilent

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kankercelproliferatiesenescente cellenparacriene signaleringjuxtacriene effectengeconditioneerd mediumco kweektechniekenreal time celanalyselive cell imagingHeLa cellen

Gerelateerde artikelen