Onthulling van fosforyleringsmodificatie met behulp van Phos-tag SDS-PAGE gelelektroforese en in-vitrokinasetest

Samenvatting

Dit protocol beschrijft procedures voor het detecteren van veranderingen in fosforyleringsmodificaties van doeleiwitten met behulp van Phos-tag gelelektroforese in klinische monsters en in vitro kinasetesten.

Samenvatting

Fosforylering is een klassieke posttranslationele modificatie die de eiwitfunctie reguleert. Eiwitten bevatten doorgaans meerdere potentiële fosforyleringsplaatsen, die kunnen worden gemodificeerd door verschillende kinasen op verschillende locaties. Voor het bestuderen van fosforyleringsveranderingen van doeleiwitten bij ziekte zijn vaak fosfospecifieke antilichamen nodig. Commerciële opties kunnen echter beperkt zijn tot een enkele site of helemaal niet beschikbaar zijn. Hier wordt een methode beschreven om veranderingen in fosforyleringsmodificaties van doeleiwitten in klinische monsters te detecteren met behulp van de Phos-tag gelelektroforese en om gedetailleerde fosforyleringsplaatsen te identificeren door middel van in vitro kinasetesten. Gefosforyleerde eiwitten gebonden aan Phos-tag vertonen langzamere migratiesnelheden in SDS-PAGE-gelelektroforese, waardoor semi-kwantitatieve analyse van fosforyleringsveranderingen in ziekteweefsels mogelijk is op basis van de gemiddelde pixelintensiteit van de langzaam migrerende banden. Door Phos-tag SDS-PAGE te combineren met immunoblotting met behulp van panspecifieke antilichamen tegen meerdere kandidaat-eiwitten, kunnen onderzoekers doeleiwitten met fosforyleringsveranderingen efficiënt identificeren. Na de screening van kandidaat-kinasen worden in vitro kinasetesten uitgevoerd met het doeleiwit en worden de resulterende gefosforyleerde producten onderworpen aan massaspectrometrie voor nauwkeurige identificatie van de plaats. Deze methode vereist geen specifieke gefosforyleerde eiwitantilichamen, waardoor grootschalige screening van weefselmonsters mogelijk is om veranderde fosforyleringstoestanden bij de ziekte te identificeren. Bovendien kunnen de geïdentificeerde fosforyleringsplaatsen worden gebruikt om specifieke antilichamen te ontwikkelen voor kwantitatieve en lokalisatieanalyse in ziekteweefsels, waardoor een dieper inzicht wordt verkregen in hun functionele rollen.

Inleiding

Fosforylering is een belangrijke posttranslationele modificatie voor het moduleren van de subcellulaire lokalisatie, kinase-activiteit en transcriptie-activiteit van eiwitten. In het menselijk genoom zijn meer dan 500 eiwitkinasegenen gevonden, die betrokken zijn bij signaaltransductie, genexpressie en eiwit-eiwitinteractie¹. Fosforylering en defosforylering staan onder controle van verschillende kinasen, die snel omkeerbaar zijn om celadhesie, celproliferatie en celdifferentiatie te reguleren². Abnormale modificaties van eiwitfosforylering zijn echter verantwoordelijk voor veel ziekten bij de mens, waaronder tumorigenese, auto-immuunziekten, neurodegeneratie en subfertiliteit ^3,4,5.

Fosfoproteomische profilering van klinische monsters levert meerdere kandidaat-differentieel gefosforyleerde eiwitten op⁶. Om de belangrijkste fosforyleringsmodificaties bij menselijke ziekten aan het licht te brengen, is een eenvoudige en efficiënte methode nodig om de fosforyleringsstatus van specifieke doeleiwitten te detecteren. Fosforylering op verschillende plaatsen kan leiden tot duidelijke functionele veranderingen in het eiwit. Daarom is het gebruik van fosforyleringsspecifieke antilichamen die gericht zijn op bepaalde aminozuurplaatsen ongetwijfeld de beste methode om veranderingen in eiwitfosforylering te detecteren. Goed gekarakteriseerde fosfo-specifieke antilichamen zijn echter voor veel eiwitten afwezig. Bovendien is een meer geschikte aanpak nodig om nieuwe potentiële fosforyleringsplaatsen te identificeren. Fosforylering bij specifieke aminozuurresiduen verandert vaak de migratiesnelheid van een eiwit in gelelektroforese, en langzamer migrerende banden kunnen veranderingen in fosforyleringsstatus⁷ weerspiegelen. Deze mobiliteitsverschuivingen zijn echter meestal subtiel, waardoor ze moeilijk te onderscheiden zijn. Phos-tag is een gesynthetiseerde chemische verbinding die is ontworpen op basis van een alkalisch fosfatasekatalytisch domein als een model, dat gefosforyleerde Ser/Thr/Tyr- en His/Asp/Lys-residuen kan opvangen. Daarom versterkt fos-tag-conjugatie effectief de verschillen in migratiesnelheid tussen gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitten, terwijl ook variaties in het aantal fosforyleringsplaatsen worden onderscheiden⁸.

Deze op Phos-tag gebaseerde methodologie voor het detecteren van veranderingen in de fosforylering van doeleiwitten in weefselmonsters biedt duidelijke voordelen ten opzichte van conventionele benaderingen. Cruciaal is dat het de vereiste voor fosfo-specifieke antilichamen elimineert, in plaats daarvan gebruik maakt van standaard WB-grade eiwitspecifieke antilichamen voor detectie. De gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde vormen van doeleiwitten worden opgelost als afzonderlijke banden tijdens Phos-tag SDS-PAGE, waardoor semi-kwantitatieve beoordeling van veranderingen in fosforyleringsniveau in ziektetoestanden mogelijk is door middel van vergelijkende bandintensiteitsanalyse. De workflow in dit protocol omvat: (1) Phos-tag SDS-PAGE-scheiding van eiwitmonsters, (2) immunoblot-screening op gefosforyleerde doelen, (3) in vitro kinasetesten met kandidaat-kinasen geverifieerd door fosfo-Ser/Thr antilichamen. Daaropvolgende massaspectrometrie-analyse (uitgevoerd door een extern serviceplatform) identificeert fosforyleringsplaatsen om plaatsspecifieke antilichaamontwikkeling mogelijk te maken; De gedetailleerde methodologie is niet opgenomen in het huidige protocol. Deze aanpak werd met name met succes toegepast om Nur77-fosforyleringsveranderingen in klinische monsters te detecteren, Mst1-kinase te identificeren als de stroomopwaartse regulator van Nur77-fosforylering en een plaatsspecifiek fosfo-antilichaam te ontwikkelen voor klinische detectie van fosforylering bij threonine 366 van Nur77⁹. Daarom blijkt deze aanpak bijzonder waardevol tijdens voorbereidende onderzoeksfasen bij het onderzoeken van meerdere kandidaat-eiwitten, omdat het grootschalige screening van veranderingen in de fosforyleringsstatus over tal van doelen mogelijk maakt met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.

Protocol

De Institutional Review Boards van het Nanjing Drum Tower Hospital keurden het onderzoek bij mensen goed (2013-408081-01). Het huidige protocol is opgesteld met endometriumweefsel als representatief model. Met de juiste optimalisatie kan deze methodologie worden uitgebreid naar andere klinische monsters, inclusief maar niet beperkt tot tumorweefsels voor eiwitextractie en daaropvolgende analyses. Endometriumbiopsie wordt uitgevoerd in de mid-secretoire fase van vruchtbare vrouwen (controlegroep) en vrouwen met recidiverend falen van embryo-implantatie diein-vitrofertilisatie-embryotransfer ondergaan (ziektegroep). Alle patiënten gaven voorafgaand aan de bemonsteringsprocedure geïnformeerde toestemming. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de monsters

1. Spoel de verkregen verse weefselmonsters twee keer met voorgekoelde PBS om bloedcellen te verwijderen en scheid ongeveer 100 mg weefsel in een centrifugebuis van 1,5 ml.
2. Plaats het weefsel in een maalbuis van 2 ml met ronde bodem die 1 ml weefseleiwitlysisbuffer bevat (150.0 mmol/L NaCl, 1.0% NP-40, 50.0 mmol/L Tris pH 8.0, 0.5% natriumdeoxycholaat, proteaseremmercocktail en fosfataseremmercocktail 2 en 3).
3. Stel de snelheid van de snelle weefselverspreider in op niveau 5 (van de 6 niveaus) en maal het weefsel gedurende 10 s, gevolgd door 30 s incubatie op ijs. Herhaal dit proces 5 keer om weefselhomogenaat te verkrijgen.
4. Lyseer het homogenaat door langzame rotatie op een shaker bij 4 °C gedurende 30 minuten, centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C en 13.000 × g en verzamel het supernatant.
5. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-methode.
6. Neem in totaal 300 μg eiwit, breng het op een gelijk volume en meng met 4× Laemmli-eiwitmonsterbuffer. Denatureer het mengsel door het gedurende 8 minuten op 95 °C te verhitten, af te koelen tot kamertemperatuur en vervolgens te laden voor verdere analyse.
   OPMERKING: Vóór stap 2 worden conventionele Western blotting-analyses aanbevolen om het eiwit van belang te detecteren met behulp van totale antilichamen om de expressieniveaus te evalueren.

2. Gelbereiding van Phos-tag SDS-PAGE-gel

1. Bereid 100 ml 30% w/v Acrylamide/N, N'-methyleen-bisacrylamide gemengde oplossing door 29,0 g acrylamide en 1,0 g N'-methyleen-bisacrylamide toe te voegen.
   LET OP: In het donker bij 4 °C bewaren.
2. Bereid 1,5 mol/L Tris-HCl-oplossing (pH 8,8), 0,5 mol/L Tris-HCl-oplossing (pH 6,8), 10% w/v SDS-oplossing en 10% w/v ammoniumpersulfaatoplossing zoals gebruikt in conventionele SDS-PAGE.
3. Bereid 5,0 mmol/L Phos-tag Oplossing en 10 mmol/L MnCl₂ Oplossing specifiek voor Phos-tag SDS-PAGE gel.
4. Bereid de oplossende geloplossing voor in geval van bereiding van de 10 ml oplossing met 6 m/v% polyacrylamidegel met 50 μM fos-tag oplossing en 100 μM MnCl₂, door menging van 2 ml 30% (m/v) acrylamide/bis-acrylamide gemengde oplossing, 2,5 ml 1,5 mol/l Tris/HCl-oplossing (pH 8,8), 0,1 ml 5,0 mmol/l fos-tag oplossing, 0,1 ml 10 mmol/l MnCl_2-oplossing , 0,1 ml 10% (m/v) SDS-oplossing, 10 μl TEMED en 5,14 ml gedestilleerd water.
5. Draai de voorbereide oplossende geloplossing voorzichtig om homogeniteit te garanderen, plaats vervolgens de geloplossingsbuis in een vacuümexsiccator en breng gedurende 2 minuten een vacuüm (0,1 MPa) aan totdat er geen zichtbare belletjes meer zijn.
6. Voeg 50 μL 10% ammoniumpersulfaat toe en meng voorzichtig maar grondig.
7. Piket de oplossing onmiddellijk in de geassembleerde gelcassette totdat deze ~1 cm onder de bovenrand van de korte plaat bereikt. Vermijd het introduceren van bubbels.
8. Breng voorzichtig 0,5 ml gedestilleerd water aan op de gel om lucht buiten te sluiten en een vlakke interface te garanderen. Laat polymerisatie 20-30 minuten bij kamertemperatuur toestaan.
9. Bereid tegelijkertijd een standaard Tris-HCl gebufferde stapeloplossing (4,5% g/v polyacrylamidegel) door 0,6 ml 30% (w/v) acrylamide/bis-acrylamide gemengde oplossing, 1 ml 0,5 mol/l Tris-HCl-oplossing (pH 6,8), 40 μl 10% (w/v) SDS-oplossing, 4 μl TEMED en 2,33 ml gedestilleerd water te mengen. Draai en ontgas.
10. Zorg ervoor dat de gel volledig is gestold (kantel de gelcassette om de kanteling van de bovenste vloeistoflaag te observeren en bevestig tegelijkertijd de immobiliteit van de tussenliggende interface). Giet de waterlaag voorzichtig af en laat vervolgens volledig leeglopen.
11. Voeg 20 μL 10% ammoniumpersulfaat toe aan de voorbereide stapelgeloplossing, meng voorzichtig en pipetteer het onmiddellijk op de oplossende gel.
12. Plaats voorzichtig een kam met 10 of 15 putjes in de stapelgeloplossing en vermijd luchtbellen. Laat de stapelgel 10 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Bereid de gel altijd vlak voor gebruik voor. Optimaliseer de fos-gelabelde en acrylamideconcentraties voor elk interessant eiwit.

3. Elektroforese van Phos-tag SDS-PAGE

1. Monteer de elektroforese-apparatuur en vul de elektrodekamers met conventionele Tris/Glycine/SDS Running Buffer.
2. Laad 30 μg eiwitmonster in elk putje met behulp van een micropipet.
3. Voer elektroforese uit onder constante stroomomstandigheden (30 mA/gel) totdat het broomfenolblauw de bodem van de oplossende gel bereikt.
4. Week de gels twee keer 10 minuten in methanolvrije SDS-PAGE Transfer Buffer met 5 mM EDTA om bivalente kationen te verwijderen.
5. Breng de eiwitten gedurende 90 minuten over op het PVDF-membraan bij 90 V met behulp van natte/tank-vloeisystemen.

4. Immunoblotting en analyse

1. Blokkeer het membraan met 5% oplossing van magere melk of runderserumalbuminepoeder (verdund in 1×Tris-Boraat-Natrium Tween-20-oplossing, TBST) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
2. Verdun het primaire antilichaam tegen het doeleiwit in een geschikte verhouding en incubeer met het membraan een nacht bij 4 °C.
3. Was het membraan 3 keer met TBST, 10 minuten per wasbeurt, op kamertemperatuur met zacht roeren.
4. Incubeer het membraan met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
5. Was het membraan 3 keer met TBST, 10 minuten per wasbeurt, op kamertemperatuur met zacht roeren.
6. Incubeer met het verbeterde chemiluminescentiesubstraat in het donker gedurende 1 minuut, gevolgd door belichting.
7. Leg de beelden vast met behulp van een geautomatiseerd geldocumentatiesysteem en kwantificeer de doelbanden (langzaam migrerend gefosforyleerd doeleiwit en snel migrerend niet-gefosforyleerd doeleiwit) voor grijswaardenintensiteit met behulp van ImageJ-software.
   OPMERKING: Westerse vlekken van Phos-Tag-gels kunnen niet worden gebruikt om molecuulgewichtstoewijzingen te maken.
8. Bereken de verhouding tussen langzaam migrerende gefosforyleerde banden en snel migrerende niet-gefosforyleerde banden voor elk monster en analyseer het statistische verschil in fosforyleringspercentage tussen groepen.

5. Immunoprecipitatie van het doeleiwit

1. Construeer expressieplasmiden die coderen voor FLAG-gelabelde (of alternatieve epitooptags, inclusief maar niet beperkt tot HA, GFP, GST of His) wildtype of plaatsspecifieke fosfomutanten van het doeleiwit.
2. Transfect HEK293-cellen met expressieplasmiden met behulp van Lipofectamine 3000 volgens het protocol van de fabrikant.
3. Lyseer cellen in 1 ml weefseleiwitlysisbuffer zoals beschreven in stap 1 om eiwit supernatant te extraheren.
4. Incubeer het bovenstaande een nacht bij 4 °C bij 4 °C met rotatie met 20 μl Anti-FLAG M2-affiniteitsgel.
5. Centrifugeer (1000 × g, 3 min), verzamel agarosekorrels en was met 10 kolomvolumes TBS om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen.
6. Los FLAG-peptide op in TBS tot een uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml.
7. Elueer het gebonden FLAG-fusie-eiwit uit de anti-FLAG M2-affiniteitsgel door competitieve elutie met vijf eenkoloms volumes FLAG-peptideoplossing (gebruik 100 μL-oplossing voor 20 μL agarosekorrels) gedurende 5-10 minuten onder voorzichtig mengen.
8. Centrifugeer (1000 × g, 3 min) en vang supernatant op.
   OPMERKING: Als de kinase bekend is, ga dan verder met stap 6; Identificeer anders eerst potentiële kinasen door middel van gist-twee-hybride screening of bio-informaticavoorspelling (bijv. met behulp van PhosphositePlus of Group-based Prediction System) voordat u doorgaat naar stap 6.

6. In vitro kinasetest om gefosforyleerde aminozuren te identificeren

1. Bereid kinasebuffer (30 μL per reactie): 40 mM HEPES pH7.6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM β-glycerofosfaat, 200 μM ATP, 100 ng actief kinase, immunogeprecipiteerd FLAG-fusie-eiwit.
2. Incubeer bij 30 °C gedurende 30 minuten in een thermomixer met zacht roeren.
3. Stop de reacties door 10 μL 4× Laemmli-buffer toe te voegen en denatureer gedurende 5 minuten bij 95 °C.
4. Voer conventionele SDS-PAGE-elektroforese uit met behulp van immunogeprecipiteerd FLAG-fusie-eiwit dat reageert met of zonder actief kinase.
5. Sonde met anti-fosfo-Thr antilichaam en anti-fosfo-Ser antilichaam om gefosforyleerde aminozuren te identificeren. Sonde met anti-vlag-antilichaam als controle (zie materiaaltabel).
6. Voltooi de immunoblotting en analyse zoals beschreven in stap 4.

Resultaten

De voorlopige fosfoproteomische profilering van menselijke monsters van de controlegroep en de ziektegroep identificeerde Nur77 als een kandidaat differentieel gefosforyleerd eiwit. Om de werkzaamheid van Phos-tag SDS-PAGE bij het detecteren van Nur77-eiwitfosforylering te evalueren, werd een Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE-experiment uitgevoerd. Na totale eiwitextractie uit weefselmonsters werd 30 μg eiwit geladen en gescheiden door Mn²⁺-Phos-tag gelelektroforese, gevolgd d...

Discussie

De op Phos-tag gebaseerde benadering voor het detecteren van fosforyleringsveranderingen van doeleiwitten in klinische weefsels biedt aanzienlijke voordelen voor onderzoek naar eiwitfosforylering. Gefosforyleerde eiwitten vertonen een verminderde elektroforetische mobiliteit als gevolg van Phos-tag-binding, waardoor high-throughput screening van de fosforyleringsstatus van kandidaat-eiwitten mogelijk is zonder dat fosfospecifieke antilichamen nodig zijn. Dit is met name waardevol voor in...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% SDS Solution	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD	1610732
4×  Laemmli protein sample buffer	BIO-RAD	1610747
Acrylamide	Sangon Biotech	A601032
Ammonium persulfate	Sangon Biotech	A100486
Anti-FLAG M2 affinity gel	Millipore	A2220
Enhanced chemiluminescence kit	ThermoFisher	32106
FLAG antibody	CST	14793
FLAG Peptide	Millipore	F3290
HRP-conjugated secondary antibody	Bioworld Technology	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cell	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell	BIO-RAD	1658005
Mst1 antibody	CST	3682
N, N'-methylene-bisacrylamide	Sangon Biotech	A600025
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine(TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 antibody	CST	3960
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5726	Voor de remming van tyrosine-eiwitfosfatasen, zure en alkalische fosfatasen
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma	P0044	Voor de remming van eiwitfosfatase 2A, alkalische fosfatasen, eiwitfosfatasen 1 en 2A
Phospho-serine antibody	Sigma	P5747
Phospho-threonine antibody	Sigma	P6623
Phos-tag Acrylamide	Wako	304-93526	Voor de bereiding van Phos-tag SDS PAGE gel
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo	23227
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	S8830	EDTA-Vrij, tablet, voor de remming van serine-, cysteïne-, aspartaat- en metalloproteasen
PVDF membrane	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
Tissue Disperser	IKA	T 10	Om weefselhomogenaat te verkrijgen
Tris-HCl Buffer (0.5M, pH 6.8)	Sangon Biotech	B546020
Tris-HCl Buffer (1.5M, pH 8.8)	Sangon Biotech	B546019
Vacuum desiccator	ThermoFisher	5311-0250	Om de geloplossing te ontgassen
β-Mercaptoethanol	Sigma	M3148