Method Article

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryote cellen volgen een geconserveerde celcyclus die diverse processen reguleert, waaronder DNA-onderhoud en organelhomeostase. Het bestuderen van cellulaire processen op een celcyclusafhankelijke manier is vaak nodig om experimentele resultaten goed te interpreteren. Er zijn chemische en genetische methoden beschikbaar om celcyclussynchronisatie te produceren in gekweekte cellen in een breed scala aan organismen, waaronder modellen van gewervelde dieren, waardoor de studie van celcyclusafhankelijke processen mogelijk wordt. Onder modelorganismen blijft ontluikende gist echter een krachtpatser voor de analyse van de celcyclus vanwege de bijzonder robuuste synchronisatiemethoden, de korte generatietijd en de genetische traceerbaarheid. Gist deelt de kerncelcyclusmachine met andere eukaryoten, wat baanbrekende ontdekkingen in de regulatie van de celcyclus mogelijk heeft gemaakt. Dit protocol beschrijft methoden voor celcyclusanalyse in gist, met de nadruk op G1-arrestatie-release en mitotische arrest-release-experimenten, waaronder stamconstructie, kweekvoorbereiding en microscopie. PCR-taggingmethoden voor het produceren van geschikte stammen voor het stoppen van de celcyclus en fluorescentiemicroscopie worden gepresenteerd. Een G1-arrestatie wordt bereikt met behulp van de peptideferomoon α-factor, en korte wasbeurten resulteren in synchrone afgifte en progressie van de celcyclus. Monsters worden op verschillende tijdstippen na vrijgave in de celcyclus genomen en gefixeerd voor microscopie. Een tweede methode arresteert gistcellen in mitose door de celcyclusregulator Cdc20 uit te putten om een metafase-gearresteerde populatie te bereiken, evenals optionele afgifte in de anafase. Monsters worden gefixeerd en voorbereid voor beeldvorming voor en na de release, en worden afgebeeld en geanalyseerd. Beeldanalyse richt zich op het catalogiseren van dynamische lokalisatie en veranderingen in de populatiedichtheid van eiwitten in de celcyclus. Deze synchronisatiemethoden zijn geschikt voor diverse manipulaties van de celcyclus, en hoewel hun gebruik bij het afbeelden van vaste cellen hier wordt benadrukt, kunnen ze worden aangepast voor vele andere analyses, waaronder beeldvorming van levende cellen en biochemische en moleculaire testen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eukaryote celdeling wordt sterk gereguleerd via een programma dat de celcyclus wordt genoemd. De sterk geconserveerde en dynamische processen die in de celcyclus plaatsvinden, maken het op zichzelf interessant om te bestuderen, maar hebben ook wijdverbreide implicaties die onderzoek naar andere celbiologische processen informeren - veel organellen ondergaan bijvoorbeeld een dramatische hermodellering tijdens de celdeling, en de overvloed en lokalisatie van veel eiwitten is sterk gereguleerd gedurende 1,2,3. Hoewel er enkele extra lagen van complexiteit aanwezig zijn in metazoaire systemen in vergelijking met gist, waaronder meer verscheidenheid aan regulerende kinasen en eiwitten, evenals extra input van externe signalering in metazoa, is celdeling over het algemeen zeer sterk geconserveerd in alle eukaryoten 4,5. Veel fundamenteel werk om belangrijke inzichten in de progressie van de celcyclus en cruciale regulerende stappen vast te stellen, werd gedaan in gist, en het blijft om een groot aantal redenen een uiterst aantrekkelijk organisme voor het bestuderen van celcyclusgerelateerde vragen 6,7. De belangrijkste hiervan is het brede scala aan methoden dat beschikbaar is om de celcyclus te manipuleren, waardoor arrestatie in verschillende stadia en synchronisatie van cellen mogelijk is. Bijkomende voordelen zijn onder meer de korte celcyclus van gist (~90-150 min, afhankelijk van de temperatuur en mediaomstandigheden), het gemak van genetische manipulatie en de grote breedte van voorwaardelijke allelen die studie in een anders wild-type context mogelijk maken.

Progressie door de verschillende fasen van de celcyclus wordt aangedreven door de activiteit van verschillende belangrijke kinasen, waaronder de alomtegenwoordige cycline-afhankelijke kinase (Cdk), Polo-achtige kinase en Aurora-kinasen. Controlepunten van de celcyclus regelen de voortgang van de celcyclus en zorgen ervoor dat cellen niet naar de volgende fase van deling gaan, tenzij aan specifieke voorwaarden wordt voldaan 8,9. Deze controlepunten, en de overgangen die ze reguleren, kunnen door onderzoekers worden gekaapt om langdurige arrestatie te bereiken, of voorbijgaande arrestatie en vrijlating om een populatie cellen te synchroniseren (Figuur 1). Het controlepunt voor de celcyclusverplichting (Beperkingspunt of Begin in gist) zorgt er bijvoorbeeld voor dat de cel voldoende voedingsstoffen heeft om zich te verbinden tot deling voordat de DNA-replicatie begint10. Dit controlepunt kan in haploïde gist worden gemanipuleerd om een G1-arrestatie te bereiken, waarbij gebruik wordt gemaakt van het gistparingsprogramma dat interageert met de celcyclus. In bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) hebben haploïde cellen een van de twee paringstypen, MATa of MATα, die genetisch wordt bepaald door een paringstypelocus. Gisten van het ene paringstype zijn gevoelig voor het paringsferomoon van het andere paringstype en reageren door een MAP-kinase-signaleringscascade te activeren die uiteindelijk de Cdk-remmer Far1 fosforyleert en stabiliseert, die het binnendringen van de celcyclus voorkomt door zich te binden aan het Cln1/2-Cdk-complex en de activiteit ervan te blokkeren 11,12,13. Cellen die reageren op paringsferomonen kunnen visueel worden bepaald door de aanwezigheid van een paringsprojectie of shmoo (Figuur 1). Chemisch gesynthetiseerde α-factor kan dus worden toegevoegd aan culturen van MATA-cellen om een G1-arrestatie te bereiken. Een andere overgang van de celcyclus waarop onderzoekers zich kunnen richten om gistcellen te synchroniseren, is de overgang van metafase naar anafase. Tijdens mitose bewaakt het Spindle Assembly Checkpoint (SAC) de aanhechting van kinetochoren aan microtubuli en remt het de anafasebevorderende complex/cyclosoom (APC/C) door de activator, Cdc20, te sekwestreren wanneer niet-gehechte kinetochoren worden gedetecteerd. De APC/C is een E3-ligasecomplex dat essentieel is voor het binnendringen van de anafase. Wanneer aan de SAC is voldaan, bindt Cdc20 vervolgens de APC/C, en APC/C ubiquitineert verschillende eiwitten, voornamelijk securine en cycline B, die zich richten op afbraak en chromosoomsegregatie en mitotische exit bevorderen14,15. Hoewel Cdc20 zelf geen onderdeel is van de SAC, is de remming ervan het doel van SAC-activering; daarom kan induceerbare depletie van Cdc20 worden gebruikt om een gistcultuur in metafase te stoppen (Figuur 1)16.

Dit protocol omvat twee methoden voor het manipuleren van de gistcelcyclus, evenals een voorbeeldtoepassing van elke methode. In de eerste wordt de α-factor gebruikt om cellen in G1 te arresteren, gevolgd door een wasstap om cellen uit de arrestatie te bevrijden, wat resulteert in synchrone terugkeer van de celcyclus. De gesynchroniseerde cellen gaan door de hele celcyclus, waardoor onderzoekers cellen in elke celcyclusfase kunnen volgen en bestuderen. In deze methode wordt de dynamische lokalisatie van een GFP-gelabeld eiwit van belang, Stu2, overal gevolgd en wordt de associatie met de mitotische spoel gevolgd. Deze methode maakt ook gebruik van een getagde spindelpoollichaam (SPB)-component, Spc110-mCherry, die metingen van de mitotische spillengte mogelijk maakt en een uitstekende proxy is voor de progressie van de celcyclus17. Deze methode laat zien hoe het stoppen en loslaten van de celcyclus synchronisatie van celpopulaties mogelijk maakt, waardoor de studie van een eiwit of ander onderdeel van belang gedurende de hele celcyclus wordt vergemakkelijkt.

Bij de tweede methode wordt een mitotische arrestatie bereikt via depletie van Cdc20 met behulp van een auxine-induceerbaar degron (AID)-systeem18. In cellen die TIR1 (een F-box-eiwit van plantaardige oorsprong) tot expressie brengen, wordt elk eiwit met een AID-label geubiquitineerd en afgebroken na toevoeging van auxine. Hier gebruiken we een AID-gelabelde Cdc20 om induceerbare afbraak van Cdc20 mogelijk te maken, waardoor een arrestatie in de metafase wordt veroorzaakt. Deze celpopulatie wordt vervolgens gecontroleerd op de rekrutering van de gelabelde SAC-component Bub1-GFP naar kinetochoren, met behulp van het gelabelde kinetochooreiwit Mtw1-mCherry als fiduciale marker. Hoewel Bub1 SAC-onafhankelijke rollen speelt bij de kinetochoren en lokaliseert naar kinetochoren in vroege mitose, signaleert de aanhoudende kinetochoorlokalisatie in gearresteerde cellen onjuiste kinetochoor-microtubuli-aanhechtingen19. We hebben dit aangetoond door cellen te behandelen met het microtubuli-gif, nocodazol, dat de kinetochoor-microtubuli-aanhechtingen verstoort. Dit experiment laat zien hoe processen die specifiek zijn voor een afzonderlijke celcyclusfase kunnen worden bestudeerd met behulp van zeer afstembare arrestatiemethoden. We tonen verder aan dat auxine uit cdc20-AID-culturen kan worden gewassen, waardoor afgifte in anafase en toegang tot een nieuwe celcyclus mogelijk is, hoewel onze ervaring is dat deze culturen niet zo synchroon vrijkomen als een α-factor arrestatie-afgifte. Deze twee arrestatie-afgiftemethoden zijn zowel effectief als gemakkelijk te implementeren, maar er zijn veel andere methoden beschikbaar voor onderzoekers in gist om cellen in verschillende stadia van de celcyclus te arresteren 20,21,22,23. Verdere details van deze methoden zijn te vinden in de Discussie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Constructie van stammen voor analyse en beeldvorming van de celcyclus

  1. Ontwerp primers om het gen van interesse C-terminaal te labelen met behulp van Pringle Tagging Plasmids (pFA6a-plasmiden)24. Kortom, ontwerp F2- en R1-primers die, wanneer ze worden gebruikt met een pFA6a-serie plasmide, een PCR-product produceren dat direct in gist kan worden omgezet om een 'getagde' versie van het gen van interesse te genereren. Gebruik de primerparen en plasmiden in tabel 1 om de genen van belang in dit protocol te labelen. Plasmide- en primerontwerpstrategieën voor C-terminale tagging van gistgenen worden in detail beschreven door Longtine et al.24.
    OPMERKING: Deze methode kan worden gebruikt om fluorescerend gelabelde eiwitten te produceren voor beeldvorming, of Auxine Inducible Degron (AID) gelabelde eiwitten om het stoppen van de celcyclus te vergemakkelijken en andere experimenten die mogelijk worden gemaakt door afbraak van een doeleiwit18. Om bijvoorbeeld CDC20 te taggen met de AID (IAA7)-tag, bestaat de voorwaartse tagging-primer uit 25-40 basen van het CDC20-gen onmiddellijk voor het stopcodon, met uitzondering van het STOP-codon (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), en ook de Pringle Plasmid F2-adaptersequentie (5' cggatccccgggttaattaa 3') toegevoegd aan het 3'-uiteinde om de uiteindelijke primersequentie te produceren (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). De reverse CDC20 tagging primer bevat de reverse complement van de 25-40 basenparen direct na het STOP-codon (5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTTTTTTTTTTTA 3') en de Pringle Plasmid R1-adaptersequentie (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') om de uiteindelijke primersequentie te produceren (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). Het is ook belangrijk op te merken dat het gebruik van PCR-primers korter dan 40 basenparen de efficiëntie van integratie in het gistgenoom zal verminderen.
  2. Verdun de primers in water van moleculair-biologische kwaliteit tot 10 μM.
  3. Voer PCR uit met het F2- en R1-plasmidepaar en het juiste labelplasmide met behulp van standaardmethoden, volgens het thermische cyclerprogramma in tabel 2, en bevestig vervolgens de grootte van het PCR-product door middel van agarosegelelektroforese.
  4. Inoculeer de giststam om te zetten in 25 ml gistextract Peptone Adenine Dextrose (YPAD) cultuur en kweek 's nachts bij 23 °C. Voor het construeren van cdc20-AID-gist (die Cdc20 zal afbreken na behandeling met auxine), kan de getransformeerde stam ofwel al OsTIR1 bevatten die tot expressie komt vanuit een ectopische locus, of OsTIR1 kan in latere18 worden gekruist.
  5. Controleer de volgende ochtend de OD600 van de nachtcultuur. Als cultuur OD <2.0 gaat, gaat u verder met stap 1.6. Als OD > 2,0, verdun dan tot ~0,2-0,4 en houd rekening met 2-3 groeicycli.
  6. Oogst cellen bij OD600 = ~0.4-2.0 om ervoor te zorgen dat ze zich in de logaritmische groeifase bevinden. Oogst 5 OD's cellen per transformatie (bijv. 5 ml OD600 = 1,0). Als er meer dan één transformatie van dezelfde stam wordt uitgevoerd, kunnen cellen in dit stadium worden gecombineerd. Oogst de cellen door ze 5 minuten te centrifugeren bij 3.000 x g bij 23 °C.
  7. Gooi het bovenstaande weg en was de celpellet met 25 ml water, gevolgd door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij 23 °C.
  8. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in 1 ml 0,1 M lithiumacetaat (LiAc) en breng over in een (de) buis(ten) van 1,6 ml. Als u meer dan één transformatie uitvoert, splitst u de resuspensie van 1 ml in meerdere buisjes (bijv. voor 2 transformaties splitst u 2x 500 μL; splitst u voor 3 transformaties 3x 333 μL, enz.).
  9. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 23 °C en gooi het supernatant weg.
  10. Voeg het volgende toe aan de celpellet (in deze volgorde): i) 240 μL PEG (50%), ii) 36 μL 1,0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg Salmon Sperm DNA voorgekookt gedurende 5 min, iv) 54 μL water.
  11. Voeg 10 μL PCR-product (verkregen in stap 1.3) toe aan de cellen en vortex gedurende 1 minuut, zorg ervoor dat alles goed gemengd is.
  12. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 30 °C in een roltrommel in een warme ruimte of in een thermoshaker bij 1000 tpm.
  13. Hitteschokcellen bij 42 °C gedurende 15 minuten in een waterbad.
    OPMERKING: De optimale hitteschoktijd kan verschillen, afhankelijk van de achtergrond van de giststam. Dit protocol is geoptimaliseerd voor de achtergrond van de W303-stam.
  14. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 23 °C. Verwijder het bovenstaande middel en resuspendeer voorzichtig in 100 μl water.
  15. Voor transformaties met behulp van KanMX of een andere medicijnselectie, plaatcellen op YPAD en incuberen de platen bij 23 °C, en replica vervolgens de plaat naar de medicijnplaat de volgende dag.
    OPMERKING: Het toestaan van een dag groei op YPAD is van cruciaal belang om expressie van geneesmiddelresistentiegenen in getransformeerde cellen mogelijk te maken.
  16. Voor transformaties met behulp van auxotrofe markers (URA, HIS, enz.), platen cellen direct op selectief medium.
  17. Incubeer de platen gedurende 3 dagen bij 23 °C om de gisttransformatorkolonies te laten groeien.
  18. Controleer de juiste labeling van het gen door genomische PCR of door western blotting. Deze methoden worden in detail beschreven door Burnette25 en Chu et al26.
    OPMERKING: Voor het produceren van stammen met meerdere gelabelde allelen wordt herhaalde transformatie niet aanbevolen zonder terugkruising, omdat transformatie een mutageen proces kan zijn. Om bijvoorbeeld de stam te produceren die Stu2-GFP en Spc110-mCherry bevat, raden we aan om stammen afzonderlijk te transformeren om Stu2-GFP en Spc110-mCherry te produceren, en deze allelen vervolgens te combineren tot één haploïde stam door gistkruising, sporulatie, tetrad-dissectie en genotypische analyse. Meer informatie over gistkruisingen is verkrijgbaar bij Stansfield en Stark27 en Morin et al.28. Om een α-factor arrest-release uit te voeren, moet de gebruikte haploïde stam MATa zijn.

2. Gistcultuur en celcyclussynchronisatie: α-factor arrestatie-afgifte

  1. Inoculeer de gist 's nachts bij 23 °C in 25 ml YPAD-cultuur, om de volgende ochtend bij OD600 = 0,5-2,0 te zijn.
    1. Als cellen 's ochtends boven OD600 = 2,0 zijn, verdun ze dan terug tot OD600 = 0,2-0,4 en laat ze groeien gedurende ten minste 1 celcyclus (2-3 uur bij 23 °C).
  2. Verdun de cellen terug tot OD600 = 0,5 en voeg α-factor toe tot een uiteindelijke concentratie van 1 μg/ml (voorraad 10 mg/ml in DMSO). Cellen zouden idealiter een bar1-mutatie hebben (bijv. bar1-1), waardoor ze gevoeliger zijn voor α-factor. BAR1 wildtype cellen zijn minder gevoelig voor α-factor en vereisen een concentratie van α-factor die minstens een orde van grootte hoger is om goed te stoppen, wat minder economisch is.
  3. Controleer 2,5-3,5 uur na de arrestatie de mate van arrestatie door het percentage niet-ontluikende shmooed-cellen te tellen. Wanneer 90-95% van de cellen is geshmooed (gestopt in G1), ga dan verder met vrijgeven. De timing is afhankelijk van de giststam, het groeimedium en de temperatuur.
  4. Maak cellen vrij van α-factor-stilstand door in een centrifuge bij 3.000 x g gedurende 3-5 minuten bij 23 °C naar beneden te draaien en vervolgens supernatant af te gieten.
  5. Was de cellen door de pellet te resuspenderen in 25 ml YPAD + 1% DMSO.
  6. Herhaal stap 2.4-2.5 twee keer voor een totaal van drie wasbeurten, waarbij u de gebruikte tube na de eerste wasbeurt één keer vervangt.
  7. Voeg YPAD toe aan de cellen om het uiteindelijke volume op 25 ml te brengen en breng de cellen over in een nieuwe kolf.
    OPMERKING: Het gebruik van een nieuwe kolf is van cruciaal belang om sporen van α-factor die het vrijkomen zouden kunnen verhinderen, te verwijderen.
  8. Neem een monster op het tijdstip (0 min) en fixeer (zie de fixatie-instructies in stap 4.1 tot 4.4).
  9. Ga door met het nemen van tijdpuntmonsters om de 15 minuten als de groei plaatsvindt bij 23 °C. Deze timing zal bij andere temperaturen veranderen, afhankelijk van hoe snel de cellen groeien.
  10. Beoordeel op een tijdstip van 60 minuten de synchronie van de afgifte door onder een lichtmicroscoop te controleren of er uniforme kleine knoppen zijn (knopgrootte < 25% moedercelgrootte).
  11. Optioneel) Voeg 60 minuten na afgifte opnieuw α-factor toe tot een eindconcentratie van 1 μg/ml om progressie naar de volgende celcyclus te voorkomen. Bevestig synchrone celafgifte door de uniforme morfologie van de kleine knop te verifiëren voordat deze wordt toegevoegd.
  12. Ga door met het nemen van timepoint-samples tot 180 min, of zo lang als gewenst. Bij 23 °C vindt de metafase ~45-60 minuten na de release plaats, de anafase vindt ~60-90 minuten na de release plaats en de meeste cellen zullen 120 minuten na de release in de nieuwe G1 zijn.

3. Gistcultuur en celcyclussynchronisatie: Cdc20 depletie arrest-release

  1. Inoculeer een nachtelijke gistcultuur bij 23 °C om de volgende ochtend op een OD600 = 0,5-2,0 te zijn.
    1. Als de cellen de volgende ochtend boven OD600 = 2,0 zijn, verdun ze dan weer tot OD600 = 0,2-0,4 en laat ze groeien gedurende ten minste 1 celcyclus (2-3 uur bij 23 °C).
  2. Verdun terug tot OD600 = 0,5 en voeg auxine toe tot een eindconcentratie van 500 μM uit 1 M voorraad (500x) aan alle culturen. Voor culturen die andere geneesmiddelen krijgen (nocodazol), voeg deze gelijktijdig toe met auxine in de juiste concentratie (bijv. ~10 μg/ml nocodazol).
  3. Controleer 2 uur na de arrestatie de mate van arrestatie door het percentage cellen met grote knoppen te tellen (grote knoppen worden bepaald als de aanwezigheid van knoppen > 25% moedercelgrootte). Wanneer 90-95% van de cellen wordt gestopt in mitose, ga dan verder met het verzamelen van monsters of het vrijgeven van cellen van arrestatie, afhankelijk van de experimentele toepassing. Als 90% van de cellen niet wordt gearresteerd, laat de cultuur dan verder groeien en controleer deze elke 15-30 minuten. De timing is afhankelijk van de giststam, het groeimedium en de temperatuur.
    OPMERKING: Het is niet raadzaam om arrestaties te lang te laten duren (langer dan 4 uur) bij vrijlating, aangezien langdurige arrestaties de levensvatbaarheid van de cel kunnen verminderen.
  4. Om vrij te komen uit de uitputtingsstop van Cdc20, oogst de cultuur door centrifugatie bij 3000 x g gedurende 3-5 minuten bij 23 °C.
  5. Was de cellen door de pellet opnieuw te suspenderen in 25 ml YPAD + 1% DMSO en vervolgens te oogsten door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 3-5 minuten bij 23 °C.
  6. Herhaal stap 3.4-3.5 voor een totaal van 2 wasbeurten.
  7. Voeg YPAD toe aan de cellen om het uiteindelijke volume op 25 ml te brengen en breng de cellen over in een nieuwe kolf.
    OPMERKING: Het gebruik van een nieuwe kolf is van cruciaal belang om sporen van auxine te verwijderen die het vrijkomen zouden kunnen voorkomen.
  8. Neem tijdstip 0 en fixeer (zie fixatie-instructies in stap 4.1 tot 4.4).
  9. Ga door met het nemen van timepoints elke 10-15 minuten voor de gewenste lengte van het tijdsverloop. Bij 23 °C zouden de meeste cellen na 50-70 minuten uit de arrestatie zijn vrijgekomen.
    OPMERKING: Cellen komen niet zo synchroon los van deze Cdc20-uitputtingsstop als bij α-factor-arrestatie. Het kan echter nuttig zijn om anafase of mitotische exit-events te bestuderen. Bovendien is een technische beperking van deze arrestatie-vrijlating dat het op latere tijdstippen na de vrijlating moeilijker is om onderscheid te maken tussen metafasecellen die nog niet zijn vrijgegeven en de cellen die eerder zijn vrijgegeven en de metafase van hun volgende celcyclus hebben bereikt. Indien nodig kan dit worden ondervangen door ofwel live celbeeldvorming uit te voeren om individuele cellen te volgen wanneer ze vrijkomen uit de arrestatie of door α-factor aan de cultuur toe te voegen (ervan uitgaande dat de cellen MATa zijn) om cellen in G1 te stoppen na mitotische exit.

4. Fixatie van gist

  1. Centrifugeer 1 ml (of 0,5-1,5 ODs) cultuur gedurende 1 minuut op maximale snelheid (~20.000 x g) bij 23 °C.
  2. Zuig supernatans op en resusinfecteer cellen in 500 μL fixerende oplossing (3,7% formaldehyde in 0,1 M kaliumfosfaat (KPi) pH 6,4).
  3. Incubeer de cellen in de fixatieoplossing gedurende 2-15 minuten bij
    23 °C. Voor experimenten met het tijdsverloop is het over het algemeen raadzaam om cellen gedurende 15 minuten te fixeren om de timing van centrifugerende cellen bij het nemen van monsters af te stemmen.
    OPMERKING: De fixatietiming moet worden geoptimaliseerd voor specifieke fluoroforen en eiwitten die van belang zijn.
  4. Centrifugeer de cellen gedurende 1 minuut op maximale snelheid bij 23 °C, zuig supernatant op en suspendeer in 500 μl 0,1 M KPi (pH 6,4). Cellen in KPi kunnen bij 4 °C worden opgeslagen totdat ze klaar zijn om te worden afgebeeld.
    OPMERKING: Het fluorescentiesignaal met vaste cellen kan tot 2 weken meegaan, afhankelijk van de fluorofoor, maar verzamel voor het kwantificeren van fluorescerende signalen binnen 7 dagen afbeeldingen.

5. Dia's voorbereiden voor beeldvorming

  1. Wanneer de cellen zijn voorbereid op een beeld, centrifugeren ze gedurende 1 minuut op maximale snelheid bij 23 °C en gooien ze supernatant weg. Resuspendeer cellen in 10-100 μl Triton/DAPI/sorbitoloplossing (1,2 M sorbitol, 1% triton, 0,1 M KPi, pH 7,5, 2 μg/ml DAPI).
  2. Pipetteer ~0,8 μL cellen rechtstreeks op een schoon dekglaasje. Gebruik een pipetpunt om de celdruppel voorzichtig te verspreiden in een cirkel van ongeveer 1 cm2 in het midden van het dekglaasje.
  3. Plaats het dekglaasje op een microscopieglaasje. Gebruik een Kimwipe om voorzichtig rond het glaasje te drukken om het monster te verdelen.
  4. Sluit de randen van het dekglaasje af met nagellak.
  5. Bewaar eventueel maximaal 4-6 uur op een koele, donkere plaats voordat u de beeldvorming uitvoert om cellen te helpen tot rust te komen en overmatige beweging te voorkomen.

6. Beeldvorming

  1. Breng de dia naar een microscoop die is uitgerust met een 60x/1.42 olieobjectief en een rode, groene, blauwe, verre rode laser- en filterset. Objectieven met een hogere vergroting (tot 100x) kunnen ook worden gebruikt.
  2. Richt de microscoop op de gistcellen die aan het dekglaasje zijn bevestigd.
    OPMERKING: Als gistcellen te veel bewegen, kunnen de glaasjes 20-60 minuten op een koele, donkere plaats blijven staan om te bezinken.
  3. Zodra de gisten scherp zijn, stemt u de belichtingsinstellingen van elk kanaal af om een signaal-ruisverhouding van ten minste 3:1 te produceren, zodat er geen fluorescerende puncta overbelicht wordt.
    OPMERKING: Op een beeldvormingssysteem dat we bijvoorbeeld gebruiken met een wetenschappelijke CMOS-camera, produceert het gebruik van 60x 550 objectief- en immersieolie met een brekingsindex van n = 1.516, waarbij het maximale signaal van het rode kanaal wordt ingesteld op 1000-2000 au, het groene kanaal op 3000 au, het blauwe kanaal op 3000 au en het DIC-kanaal op 4000-5000 au beelden van hoge kwaliteit produceert.
  4. Pas de acquisitie-instellingen aan om 14-20 0.2 μm Z-stacks te nemen om in totaal 2-4 μm te overspannen.
  5. Voor microscopen die zijn uitgerust met nabewerkingsmodules, selecteert u Deconvolutie en Snelle projectie voor elke stapel.
  6. Verzamel Z-stapels cellen en maak genoeg foto's om ~100-200 cellen vast te leggen voor elke toestand of elk tijdstip.
  7. Raadpleeg het aanvullende bestand 1 voor software-instructies met schermafbeeldingen van de beeldverwerkingssoftware.

7. Analyse van het beeld

  1. Open geprojecteerde beelden in ImageJ en pas de helderheid en het contrast aan om verschillende kanalen te bekijken. Als de microscoop die voor beeldvorming wordt gebruikt geen nabewerkingsmodules heeft, voer dan in dit stadium de maximale projectie van de Z-stacks uit.
  2. Om de progressie van de celcyclus te bepalen, telt u 100 cellen per tijdstip en classificeert u ze als één of twee kernen. U kunt ook de spillengte of afstand tussen de spilpoollichamen berekenen om de toestand van de celcyclus te definiëren. De afstand tussen Spc110-foci < 1,5 μm komt overeen met metafasecellen en de afstand > 1,5 μm komt overeen met anafasecellen.
  3. Om de intensiteit van eiwitpuncta (bijv. Stu2-GFP) te berekenen, gebruikt u het selectiehulpmiddel uit de vrije hand om rond de grens van het interessesignaal te tekenen. Voeg dit signaal toe aan de ROI-manager (Region of Interest) door op T te drukken of het menu te gebruiken. Selecteer in ROI-manager de optie Meten om de intensiteit van elke geselecteerde puncta te berekenen. Om veranderingen in het puncta-signaal in de loop van de tijd te bekijken, zet u de gemiddelde intensiteit met een betrouwbaarheidsinterval van 95% uit op een lijngrafiek voor elk tijdstip.
  4. Om het percentage cellen met Bub1-GFP puncta te berekenen, moet u ervoor zorgen dat de minimale en maximale helderheidsinstellingen van het groene kanaal hetzelfde zijn voor verschillende afbeeldingen. Cellen met een Bub1-GFP puncta die overlap vertoont met een Mtw1-mCherry puncta worden geteld als Bub1 gelokaliseerd in de kinetochoor; Anders wordt de cel als negatief geteld. Tel ~100 cellen per voorwaarde. Aravamudhan et al.29 bevat meer informatie over Bub1-lokalisatie naar kinetochoren.
  5. Om het percentage mononucleaire cellen met grote knoppen te berekenen, telt u het aantal cellen met een grote knop en één kern (één DAPI-signaal) in de populatie en deelt u dit door het totale aantal cellen.
  6. Raadpleeg het aanvullende bestand 1 voor de software-instructies met schermafbeeldingen van de beeldverwerkingssoftware.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het analyseren van veranderingen in celcyclusafhankelijke eiwitlokalisatie door middel van fluorescentiemicroscopie kan gemakkelijk worden bereikt met behulp van de methoden die we hier beschrijven. Onze groep is al lang geïnteresseerd in de dynamische regulatie en functie van de mitotische spindel. In gist fungeren spilpoollichamen (gemarkeerd door component Spc110) als microtubuli-organiserende centra van waaruit microtubuli-filamenten voortkomen om de ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door gebruik te maken van celcyclussynchronisatie in ontluikende gist kunnen belangrijke mechanismen voor een verscheidenheid aan cellulaire processen worden bestudeerd. Het gebruik van G1 arrest-releases met α-factor behandeling maakt synchrone progressie van een populatie cellen door de stadia van de celcyclus mogelijk, en, zoals we hebben aangetoond, kan dynamische lokalisatiepatronen van cellulaire regulatoren zoals Stu236 onthullen. Stilstanden van de celcycl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de Cell Imaging Core van de University of Utah voor het onderhoud van de Delta Vision-microscoopfaciliteit. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies F31CA2717405 (aan M.G.S.) en T32GM141848 (aan M.G.S. en T.C.S.), 5 For the Fight (aan M.P.M.), Pew Biomedical Scholars (aan M.P.M.), en NIH grant R35GM142749 (aan M.P.M.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-factorUniversity of Utah Core Synthesis FacilitySequence: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL Eppendorf TubesAxygenMCT-175-C
10mM dNTP mixThermo ScientificR0193
50 mL conical tubesgreiner bio-one227 261
5x Phusion HF reaction bufferNew England BioLabsB0518S
Acetic Acid, GlacialFisher ChemicalBP2401C-212
adenine hemisulfate saltSigma-AldrichA9126-100G
Agar, GranulatedApex Chemicals and Reagents20-275
agaroseApex Bioresearch Products20-102GP
Autoclave Amsco Century Steam SterilizerSterisSV-1262
autoclaved DI water
AuxinSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidCargille Laboratories20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Molecular ProbesCat#D1306
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testesSigma-AldrichD1626
DextroseFisher ChemicalD16-10
Disodium Ethylenediamine TetraacetateFisher ChemicalS811-10
DMSOThermo Scientific20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Fixed Speed Vortex MixerVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluorescent microscope DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerial #: NV01063. No longer supported
FormaldehydeFisher ChemicalCat#F79-500
gel apparatusThermo ScientificOwl EasyCast B1
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
glass beadsFisher Scientific11312A
Glass SlidesVWR48300-026
Innova 2300 Platform ShakerNew BrunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Laboratory centrifuge for 1.5 mL tubesEppendorf2525
Laboratory centrifuge for 50 mL tubesEppendorf5804
Lithium acetate dihydrateSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipettes p2, p20, p200 and p1000 and corresponding tipsRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Microscope Cover GlassFisher Scientific12541014
NocodazoleCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Orange GSigma-AldrichO7252
PEGHampton ResearchHR2-591
Peptone granulatedFisher BioreagentsBP9725-5
Phusion HF DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nature. 561 (7723), 411-415 (2018).
  3. Litsios, A., et al. Proteome-scale movements and compartment connectivity during the eukaryotic cell cycle. Cell. 187 (6), 1490-1507.e21 (2024).
  4. Satyanarayana, A., Kaldis, P. Mammalian cell-cycle regulation: Several Cdks, numerous cyclins and diverse compensatory mechanisms. Oncogene. 28 (33), 2925-2939 (2009).
  5. Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling growth factor signaling and cell cycle progression in individual fibroblasts. J Biol Chem. 291 (28), 14628-14638 (2016).
  6. Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast, I. detection of mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 66 (2), 352-359 (1970).
  7. Forsburg, S. L., Nurse, P. Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 7 (1), 227-256 (1991).
  8. Morgan, D. O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol. 13 (1), 261-291 (1997).
  9. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: Controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  10. Hartwell, L. H., Culotti, J., Pringle, J. R., Reid, B. J. Genetic control of the cell division cycle in yeast: A model to account for the order of cell cycle events is deduced from the phenotypes of yeast mutants. Science. 183 (4120), 46-51 (1974).
  11. Chan, R. K., Otte, C. A. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by a factor and α factor pheromones. Mol Cell Biol. 2 (1), 11-20 (1982).
  12. Madhani, H. D. From a to alpha: Yeast as a model for cellular differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2007).
  13. Skotheim, J. M., Di Talia, S., Siggia, E. D., Cross, F. R. Positive feedback of G1 cyclins ensures coherent cell cycle entry. Nature. 454 (7202), 291-296 (2008).
  14. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  15. Stern, B. M., Murray, A. W. Lack of tension at kinetochores activates the spindle checkpoint in budding yeast. Curr Biol. 11 (18), 1462-1467 (2001).
  16. Lim, H. H., Goh, P. Y., Surana, U. Cdc20 is essential for the cyclosome-mediated proteolysis of both Pds1 and Clb2 during M phase in budding yeast. Curr Biol. 8 (4), 231-237 (1998).
  17. Chan, L. Y., Amon, A. Spindle position is coordinated with cell-cycle progression through establishment of mitotic exit-activating and -inhibitory zones. Mol Cell. 39 (3), 444-454 (2010).
  18. Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. Nat Methods. 6 (12), 917-922 (2009).
  19. Gillett, E. S., Espelin, C. W., Sorger, P. K. Spindle checkpoint proteins and chromosome-microtubule attachment in budding yeast. J Cell Biol. 164 (4), 535-546 (2004).
  20. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).
  21. Yeong, F. M., Lim, H. H., Padmashree, C. G., Surana, U. Exit from mitosis in budding yeast. Mol Cell. 5 (3), 501-511 (2000).
  22. Uhlmann, F., Wernic, D., Poupart, M. A., Koonin, E. V., Nasmyth, K. Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103 (3), 375-386 (2000).
  23. Wäsch, R., Cross, F. R. APC-dependent proteolysis of the mitotic cyclin Clb2 is essential for mitotic exit. Nature. 418 (6897), 556-562 (2002).
  24. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  25. Burnette, W. N. "Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).
  26. Chu, J. H., Yeast, A. M. Yeast colony PCR: it doesn't get any easier than this. , https://www.protocols.io/view/yeast-colony-pcr-it-doesn-t-get-any-easier-than-th-gzwbx7e (2017).
  27. Stansfield, I., Stark, M. J. Yeast genetics and strain construction. Methods Microbiol. 36, 23-43 (2007).
  28. Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci. J Vis Exp. (27), e1146(2009).
  29. Aravamudhan, P., Chen, R., Roy, B., Sim, J., Joglekar, A. P. Dual mechanisms regulate the recruitment of spindle assembly checkpoint proteins to the budding yeast kinetochore. Mol Biol Cell. 27 (22), 3405-3417 (2016).
  30. Kilmartin, J. V. Lessons from yeast: the spindle pole body and the centrosome. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1650), 20130456(2014).
  31. Brouhard, G. J., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  32. Zahm, J. A., Stewart, M. G., Carrier, J. S., Harrison, S. C., Miller, M. P. Structural basis of Stu2 recruitment to yeast kinetochores. Elife. 10, e65389(2021).
  33. Wang, P. J., Huffaker, T. C. Stu2p: A microtubule-binding protein that is an essential component of the yeast spindle pole body. J Cell Biol. 139 (5), 1271-1280 (1997).
  34. Severin, F., Habermann, B., Huffaker, T., Hyman, T. Stu2 promotes mitotic spindle elongation in anaphase. J Cell Biol. 153 (2), 435-442 (2001).
  35. van Breugel, M., Drechsel, D., Hyman, A. Stu2p, the budding yeast member of the conserved Dis1/XMAP215 family of microtubule-associated proteins is a plus end-binding microtubule destabilizer. J Cell Biol. 161 (2), 359-369 (2003).
  36. Stewart, M. G., Carrier, J. S., Zahm, J. A., Harrison, S. C., Miller, M. P. A coordinated kinase and phosphatase network regulates Stu2 recruitment to yeast kinetochores. J Cell Biol. 224 (8), e220410196(2025).
  37. London, N., Ceto, S., Ranish, J. A., Biggins, S. Phosphoregulation of Spc105 by Mps1 and PP1 regulates Bub1 localization to kinetochores. Curr Biol. 22 (10), 900-906 (2012).
  38. Lampson, M. A., Grishchuk, E. L. Mechanisms to avoid and correct erroneous kinetochore-microtubule attachments. Biology (Basel). 6 (1), 1-15 (2017).
  39. Samson, F., Donoso, J. A., Heller-Bettinger, I., Watson, D., Himes, R. H. Nocodazole action on tubulin assembly, axonal ultrastructure and fast axoplasmic transport. J Pharmacol Exp Ther. 208 (3), 411-417 (1979).
  40. Banerjee, A., Deshaies, R. J., Chau, V. Characterization of a dominant negative mutant of the cell cycle ubiquitin-conjugating enzyme Cdc34. J Biol Chem. 270 (44), 26209-26215 (1995).
  41. Jones, M. H., et al. Chemical genetics reveals a role for Mps1 kinase in kinetochore attachment during mitosis. Curr Biol. 15 (2), 160-165 (2005).
  42. Valenti, R., et al. A proteome-wide yeast degron collection for the dynamic study of protein function. J Cell Biol. 224 (2), e202409050(2025).
  43. Sepers, J. J., et al. The mIAA7 degron improves auxin-mediated degradation in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 12 (10), jkac222(2022).
  44. Yesbolatova, A., et al. The auxin-inducible degron 2 technology provides sharp degradation control in yeast, mammalian cells, and mice. Nat Commun. 11 (1), 5701(2020).
  45. Feng, W., et al. Genomic mapping of single-stranded DNA in hydroxyurea-challenged yeasts identifies origins of replication. Nat Cell Biol. 8 (2), 148-155 (2006).
  46. Osborn, A. J., Elledge, S. J., Zou, L. Checking on the fork: the DNA-replication stress-response pathway. Trends Cell Biol. 12 (11), 509-516 (2002).
  47. An, Z., et al. Autophagy is required for G1/G0 quiescence in response to nitrogen starvation in Saccharomyces cerevisiae. Autophagy. 10 (10), 1702-1711 (2014).
  48. Smets, B., et al. Life in the midst of scarcity: adaptations to nutrient availability in Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 56 (1), 1-32 (2010).
  49. Haase, S. B., Lew, D. J. Flow cytometric analysis of DNA content in budding yeast. Methods Enzymol. 283, 322-332 (1997).
  50. Touati, S. A., Kataria, M., Jones, A. W., Snijders, A. P., Uhlmann, F. Phosphoproteome dynamics during mitotic exit in budding yeast. EMBO J. 37 (10), e98745(2018).
  51. Baro, B., et al. SILAC-based phosphoproteomics reveals new PP2A-Cdc55-regulated processes in budding yeast. Gigascience. 7 (5), giy053(2018).
  52. Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution imaging and analysis of individual astral microtubule dynamics in budding yeast. J Vis Exp. (122), e55610(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle AnalysisBudding YeastCell Cycle SynchronizationG1 Arrest ReleaseMitotic Arrest ReleaseChromosome SegregationFluorescence MicroscopyProtein LocalizationImageJ AnalysisSpindle Pole

Related Articles