Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Summary

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Abstract

Eukaryote cellen volgen een geconserveerde celcyclus die diverse processen reguleert, waaronder DNA-onderhoud en organelhomeostase. Het bestuderen van cellulaire processen op een celcyclusafhankelijke manier is vaak nodig om experimentele resultaten goed te interpreteren. Er zijn chemische en genetische methoden beschikbaar om celcyclussynchronisatie te produceren in gekweekte cellen in een breed scala aan organismen, waaronder modellen van gewervelde dieren, waardoor de studie van celcyclusafhankelijke processen mogelijk wordt. Onder modelorganismen blijft ontluikende gist echter een krachtpatser voor de analyse van de celcyclus vanwege de bijzonder robuuste synchronisatiemethoden, de korte generatietijd en de genetische traceerbaarheid. Gist deelt de kerncelcyclusmachine met andere eukaryoten, wat baanbrekende ontdekkingen in de regulatie van de celcyclus mogelijk heeft gemaakt. Dit protocol beschrijft methoden voor celcyclusanalyse in gist, met de nadruk op G1-arrestatie-release en mitotische arrest-release-experimenten, waaronder stamconstructie, kweekvoorbereiding en microscopie. PCR-taggingmethoden voor het produceren van geschikte stammen voor het stoppen van de celcyclus en fluorescentiemicroscopie worden gepresenteerd. Een G1-arrestatie wordt bereikt met behulp van de peptideferomoon α-factor, en korte wasbeurten resulteren in synchrone afgifte en progressie van de celcyclus. Monsters worden op verschillende tijdstippen na vrijgave in de celcyclus genomen en gefixeerd voor microscopie. Een tweede methode arresteert gistcellen in mitose door de celcyclusregulator Cdc20 uit te putten om een metafase-gearresteerde populatie te bereiken, evenals optionele afgifte in de anafase. Monsters worden gefixeerd en voorbereid voor beeldvorming voor en na de release, en worden afgebeeld en geanalyseerd. Beeldanalyse richt zich op het catalogiseren van dynamische lokalisatie en veranderingen in de populatiedichtheid van eiwitten in de celcyclus. Deze synchronisatiemethoden zijn geschikt voor diverse manipulaties van de celcyclus, en hoewel hun gebruik bij het afbeelden van vaste cellen hier wordt benadrukt, kunnen ze worden aangepast voor vele andere analyses, waaronder beeldvorming van levende cellen en biochemische en moleculaire testen.

Introduction

Eukaryote celdeling wordt sterk gereguleerd via een programma dat de celcyclus wordt genoemd. De sterk geconserveerde en dynamische processen die in de celcyclus plaatsvinden, maken het op zichzelf interessant om te bestuderen, maar hebben ook wijdverbreide implicaties die onderzoek naar andere celbiologische processen informeren - veel organellen ondergaan bijvoorbeeld een dramatische hermodellering tijdens de celdeling, en de overvloed en lokalisatie van veel eiwitten is sterk gereguleerd gedurende ^1,2,3. Hoewel er enkele extra lagen van co....

Protocol

1. Constructie van stammen voor analyse en beeldvorming van de celcyclus

1. Ontwerp primers om het gen van interesse C-terminaal te labelen met behulp van Pringle Tagging Plasmids (pFA6a-plasmiden)²⁴. Kortom, ontwerp F2- en R1-primers die, wanneer ze worden gebruikt met een pFA6a-serie plasmide, een PCR-product produceren dat direct in gist kan worden omgezet om een 'getagde' versie van het gen van interesse te genereren. Gebruik de primerparen en plasmiden in tabel 1 om de genen van belang in dit protocol te labelen. Plasmide- en primerontwerpstrategieën voor C-terminale tagging van g....

Results

Het analyseren van veranderingen in celcyclusafhankelijke eiwitlokalisatie door middel van fluorescentiemicroscopie kan gemakkelijk worden bereikt met behulp van de methoden die we hier beschrijven. Onze groep is al lang geïnteresseerd in de dynamische regulatie en functie van de mitotische spindel. In gist fungeren spilpoollichamen (gemarkeerd door component Spc110) als microtubuli-organiserende centra van waaruit microtubuli-filamenten voortkomen om de .......

Discussion

Door gebruik te maken van celcyclussynchronisatie in ontluikende gist kunnen belangrijke mechanismen voor een verscheidenheid aan cellulaire processen worden bestudeerd. Het gebruik van G1 arrest-releases met α-factor behandeling maakt synchrone progressie van een populatie cellen door de stadia van de celcyclus mogelijk, en, zoals we hebben aangetoond, kan dynamische lokalisatiepatronen van cellulaire regulatoren zoals Stu2³⁶ onthullen. Stilstanden van de celcycl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-factor	University of Utah Core Synthesis Facility		Sequence: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL Eppendorf Tubes	Axygen	MCT-175-C
10mM dNTP mix	Thermo Scientific	R0193
50 mL conical tubes	greiner bio-one	227 261
5x Phusion HF reaction buffer	New England BioLabs	B0518S
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	BP2401C-212
adenine hemisulfate salt	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Agar, Granulated	Apex Chemicals and Reagents	20-275
agarose	Apex Bioresearch Products	20-102GP
Autoclave Amsco Century Steam Sterilizer	Steris	SV-1262
autoclaved DI water
Auxin	Sigma-Aldrich	Cat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser Liquid	Cargille Laboratories	20130
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
DAPI (40 ,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Molecular Probes	Cat#D1306
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma-Aldrich	D1626
Dextrose	Fisher Chemical	D16-10
Disodium Ethylenediamine Tetraacetate	Fisher Chemical	S811-10
DMSO	Thermo Scientific	20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
Fixed Speed Vortex Mixer	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Fluorescent microscope DV Ultra	Leica	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	Serial #: NV01063. No longer supported
Formaldehyde	Fisher Chemical	Cat#F79-500
gel apparatus	Thermo Scientific	Owl EasyCast B1
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
glass beads	Fisher Scientific	11312A
Glass Slides	VWR	48300-026
Innova 2300 Platform Shaker	New Brunswick	NB-2300
Kimwipes	Kimtech	06-666
Laboratory centrifuge for 1.5 mL tubes	Eppendorf	2525
Laboratory centrifuge for 50 mL tubes	Eppendorf	5804
Lithium acetate dihydrate	Sigma-Aldrich	L4158-250G
Master cycler nexus X2	eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micro-pipettes p2, p20, p200 and p1000 and corresponding tips	Rainin	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12541014
Nocodazole	Calbiochem	Cat#487928; CAS: 31430-18-9; Lot#B35705
Orange G	Sigma-Aldrich	O7252
PEG	Hampton Research	HR2-591
Peptone granulated	Fisher Bioreagents	BP9725-5
Phusion HF DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L
Pipet-X	Rainin	PX-100R
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Scientific	424195000
Potassium phosphate, monobasic	Thermo Scientific	424200025
power source	Bio-Rad	23786
Start Acquire Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	Obtain with DV Ultra
Tris Base	Fisher Bioreagents	BP152-10
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
tube rotator	VWR	10136-084
water bath	VWR	WBE10A11B
Water, Ultra Pure	Apex Bioresearch Products	18-194
Yeast extract Granulated	Fisher Bioreagents	BP9727-5