Methodenartikel

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

DOI:

10.3791/68894

⸱

19 september 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gedrag van cellen en het lot van cellen worden beïnvloed door elektrische stromen of velden die endogeen zijn of van buitenaf worden toegepast. Statische elektrische signalen kunnen worden toegepast in op maat gemaakte microfluïdische apparaten om de elektrische omgeving na te bootsen in langzame fysiologische processen zoals ontwikkeling, wondgenezing en homeostase. Een belangrijke klasse van cellulaire elektrische studies is de controle van celmigratie door statische galvanische stromen in het vlak in eenvoudige microfluïdische kanalen die wondstromen nabootsen, met stroomdichtheden van ~0,1-1000 A/m2. Vanwege de incompatibele geometrie zijn deze apparaten echter niet geschikt om elektrische effecten te bestuderen in weefselhomeostase, waar cellen apico-basale polariteit en een transepitheliaal potentiaalverschil (TEPD) aannemen. Hier beschrijven we een uniek op microfluïdicum gebaseerd apparaat dat fysiologische ionenstromen loodrecht op het vlak van confluente epitheelcellagen toepast om de TEPD te verstoren en de elektrische regulatie van de stabiele toestanden van het weefsel te onderzoeken. De opstelling is gemaakt van een tweelaags UV-uithardend polymeer ingebed met zacht, polyacrylamidegelsubstraat bedekt met extracellulair matrixeiwit naar keuze. Dit microfluïdische apparaat biedt de juiste geometrie en permeabel substraat om een relatief uniforme ionenstroom over de cellagen op centimeterschaal te induceren. De opstelling is compatibel met confocale beeldvorming van levende cellen en tractiekrachtmicroscopie om mechanische spanningen af te leiden die worden veroorzaakt door de transepitheliale stromen. Opvallend is dat de proliferatie, extrusie en migratie van cellen collectief worden beïnvloed binnen het confluente epitheel, afhankelijk van de richting van de ionenstroom, waardoor een nieuwe weefseltoestand wordt geïnduceerd die wordt gekenmerkt door verschillende cel-celinteractiesterktes, celgebeurtenissen (dood en proliferatie) en weefselstructuren. Het elektrisch gestuurde celgedrag kan worden opgevat als een elektrisch geïnduceerde mechanische stress en celrespons. Dit nieuwe microfluïdische apparaat en protocol bieden het hulpmiddel en de documentatie die nodig zijn voor de mechanobiologie- en bio-engineeringgemeenschappen om elektrische effecten in weefselhomeostase te bestuderen en nieuwe toepassingen voor weefseltechnologie te ontwikkelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bio-elektrische signalen zijn belangrijke biofysische factoren die bijdragen aan het beheersen van celgedrag. Het bekendste voorbeeld is de actiepotentiaal in neuronen en hartcellen, die elektrische signalen over lange afstanden (tot een meter) en met hoge frequenties (tot honderden Hertz) uitzenden1. Elektrische pulsen die met elektroden worden toegepast, kunnen worden gebruikt om het afvuren van de actiepotentiaal te stimuleren en zijn nuttig in onderzoek en medische toepassingen2. Endogene bio-elektrische signalen in langzame fysiologische processen zoals ontwikkeling, wondgenezing en homeostase 3,4,5,6,7,8 zijn ook gemeten 9,10 over perioden van uren tot dagen. Een belangrijk voorbeeld zijn confluente epitheellagen die actief een transepitheliaal potentiaalverschil (TEPD) in stand houden, variërend van enkele tot tientallen millivolts 4,11. Een snee of wond in deze confluente lagen genereert een kortsluitstroom, aangedreven door de elektrische activiteit van het weefsel 12,13. Gewikkelde stromen tot tientallen μA/cm2 en elektrische velden tot honderden mV/mm zijn gerapporteerd met verschillende technieken. Studies suggereren dat deze elektrische signalen een directionele aanwijzing produceren voor cellen om naar wond- of infectieplaatsen te migreren die belangrijk is voor het genezingsproces 3,6,14. Over het algemeen zijn zowel statische (of langzaam variërende) als snel variërende elektrische signalen belangrijk en veroorzaken ze verschillende cel- of weefselreacties.

Op het gebied van langzaam variërende signalen is een belangrijk fenomeen het elektrisch aangedreven migratieproces dat "galvanotaxis" wordt genoemd. Gecontroleerde galvanische stromen in het vlak kunnen worden toegepast in microfluïdische apparaten met eenvoudige kanalen om de wondstromen na te bootsen, terwijl celmigratie wordt onderzocht als functie van de stroomdichtheid 15,16. Elektrische velden van 0,1-1000 V/m (overeenkomende stroomdichtheid van 0,1-1000 A/m2) blijken celmigratie in veel celtypen aan te drijven in deze in vitro setting17, terwijl signaalroutes die canoniek zijn voor chemotaxis (celmigratie geleid door chemische gradiënten), zoals PI3K, zijn betrokken bij galvanotaxis 7,18. "Kale" microfluïdische apparaten voor onderzoek naar galvanotaxis kunnen worden vervaardigd met standaard zachte lithografie en microfabricagetechnieken19. Deze apparaten bestaan meestal uit een eenkanaals polydimethyl-siloxaan (PDMS) substraat dat is gebonden aan een glasplaatje (kanaaldoorsnede: honderden micrometers, lengte: centimeters). Elektroden die worden gebruikt om de statische stroom te leveren, worden ver van het celgebied geïnstalleerd en met of zonder zoutbruggen aangesloten. De zoutbrugverbinding kan worden gemaakt door gaten door het PDMS-substraat, microfluïdische connectoren en slangen gevuld met agar. Het eenvoudige glasplaatje (meestal 170 μm dik) onder het kanaal ondersteunt ook beeldvorming van levende cellen met hoge resolutie tijdens de galvanotaxis-experimenten, wat een cruciaal kenmerk is voor het bestuderen van het proces.

De rol van endogene elektrische signalen bij het behoud van weefselhomeostase wordt veel minder begrepen dan die bij wondgenezing. Een belangrijke reden is het gebrek aan geschikte instrumenten om deze effecten in intacte weefsels te bestuderen. Het microfluïdische apparaat voor galvanotaxis is niet geschikt voor dit doel vanwege zijn geometrie, die alleen elektrische stromen in het vlak ondersteunt. In de context van epitheliale homeostase is een nieuw apparaat nodig om de TEPD of out-of-plane stromen over een confluente epitheellaag te controleren en te verstoren. Om het doel te bereiken om een relatief uniforme ionenstroomdichtheid over een monolaag toe te passen, hebben we een microfluïdisch apparaat ontworpen en gefabriceerd met innovaties in apparaatgeometrie, materiaalgebruik en in situ biomechanische meetmogelijkheden4. Dit laatste vermogen is belangrijk omdat elektrische effecten het celgedrag kunnen beïnvloeden door koppeling met biomechanica en mechanobiologische routes, die met deze functie kunnen worden bestudeerd.

Dit nieuwe apparaat vertoont meerdere innovatieve functies. Het is ontworpen met twee lagen in plaats van het enkele kanaal dat te vinden is in de galvanotaxis-apparaten (innovatie in geometrie), terwijl de verbinding met de elektrodekamers vergelijkbaar blijft met die in de laatste. De eerste microfluïdische laag heeft kanalen om ionenstromen naar (of weg van) het weefselgebied te leiden, terwijl de tweede laag een opening heeft die deze stroom loodrecht over het epitheel leidt dat bovenop deze tweede microfluïdische laag zit (Figuur 1A,B). Microfabricagetechnieken worden gebruikt voor het produceren van voldoende dunne lagen, zodat confocale beeldvorming met hoge resolutie mogelijk is, ondanks het stapelen van microfluïdische lagen die de monsterdikte vergroten. Voor de andere belangrijke innovaties is in het midden van het apparaat een polyacrylamide (PA) synthetische hydrogel verwerkt, die een cruciale rol speelt (Figuur 1A,B). De fysisch-chemische eigenschappen van deze gel, zoals de beschikbare chemie om extracellulaire matrixeiwitten te coaten, de permeabiliteit voor ionen en de bekende elasticiteit, zijn respectievelijk essentieel voor celhechting en groei, toepassing van stromen buiten het vlak en meting van mechanische spanning20 tijdens elektrische stimulatie. Barrièrestructuren zijn opgenomen in laag 1 van het weefselgebied voor opsluiting van de PA-gelprecursoroplossing, zoals gedaan in eerdere microfluïdische apparaten21 (Figuur 1A,B). Last but not least, aangezien PA-gelpolymerisatie zuurstofgeremd is op PDMS-oppervlakken die doorlaatbaar zijn voor zuurstofgas, wordt een ander materiaal22 gebruikt voor de fabricage van apparaten, wat polymerisatie en strakke hechting van PA-gel mogelijk kan maken. Alle innovatieve functies zijn cruciaal om het nieuwe apparaat te laten werken.

Over het algemeen wordt de diepgaande studie van statische of langzaam variërende bio-elektrische signalen in de homeostase van intacte weefsels mogelijk gemaakt met dit nieuwe apparaat, waarvan het protocol hieronder zal worden beschreven. Het protocol en de resultaten waarnaar hier wordt verwezen, zijn gericht op de Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II) epitheelcellijn, inclusief de celgebeurtenissen (proliferatie, dood en extrusie en migratie) en weefselstructurele veranderingen die worden veroorzaakt door de elektrische stroom. Deze studies zijn ook leerzaam voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het toepassen van deze techniek om de elektrische regulatie van epitheeltransport en inductie van celgebeurtenissen en veranderingen in het lot van cellen in cellagen en complexere systemen, zoals primaire cellen en 2D-organoïden, te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol biedt stappen om een opstelling te bouwen die statische elektrische stromen toepast en de TEPD van confluent epitheel verstoort en om de effecten ervan te bestuderen door middel van beeldvorming van levende cellen en mechanobiologische technieken (Figuur 1). De opstelling bestaat uit apparaten gemaakt van microfluïdische chips die zijn gebonden aan cartridges, inzetstukken en houders om meerdere apparaten voor gemultiplexte experimenten op een microscoop te huisvesten, een paar elektrodekamers die zijn aangesloten op een bronmeter en apparaten, en een deksel van de kamer met levende cellen voor het behoud van de juiste omstandigheden voor levende cellen (Figuur 1C). De ontwerpprincipes en CAD-bestandstekeningen van de cartridge en andere belangrijke componenten van de installatie zijn te vinden in aanvullend bestand 1. De stappen omvatten: 1) PDMS zachte lithografie; 2) Chipfabricage en apparaatassemblage; 3) Voltooiing van de installatie; en 4) Monolaaggroei en experimenten met levende cellen. Gedetailleerde informatie over de reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt, wordt gegeven in de Materiaaltabel.

1. PDMS zachte lithografie

OPMERKING: In dit gedeelte wordt ingegaan op het produceren van PDMS-elastomeren uit SU-8-wafers (Figuur 2A, B) om UV-uithardende lijmlagen van de microfluïdische chip te vormen.

  1. PDMS zachte lithografie
    1. Fabriceer een afzonderlijke op SU-8 gebaseerde wafer voor elke microfluïdische laag, laag 1 en 2, met behulp van fotolithografietechnieken (aanvullend bestand 2 en aanvullend bestand 3).
      OPMERKING: De fabricage van wafers kan een maand duren als een verzoek wordt verzonden naar een microfabricage-/cleanroomfaciliteit. Siliciumetstechniek voor de fabricage van wafers kan ook worden gebruikt.
    2. Silaniseer de siliciumwafer om PDMS uit de vorm te laten komen19.
      1. Reinig de wafer met een stikstofblaaspistool onder druk. Activeer het oppervlak van de wafer door een kort zuurstofplasmaproces toe te passen (30 s, 30 W in 20 sccm O2 gasstroom bij een reactordruk van 1-3 mbar)23.
      2. Pipetteer 200 μL Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichloorsilaan in een schone plastic dop (diameter 60 mm, hoogte 15 mm). Plaats de dop naast de wafer in de vacuümexsiccator (alleen voor silanisatie). Zet de vacuümpomp aan en wacht 1-2 uur, terwijl de verdampte silaan als monolaag op de siliciumwafer wordt afgezet.
        LET OP: Silaan is bijtend en giftig. Draag handschoenen en een veiligheidsbril en werk in een zuurkast om een veilige werking te garanderen.
        OPMERKING: Een nieuw gesilaniseerde wafer kan worden gebruikt om 10-20 stuks PDMS-mallen te fabriceren. De vacuümtijd is afhankelijk van de toestand van de vacuümpomp. Overmatige silanisatie veroorzaakt een ongelijkmatige dikte en resulteert in een troebel uiterlijk, wat moet worden vermeden. Bewaar de wafel in kamers met vochtigheidsregeling wanneer deze niet in gebruik is. De PDMS-structuren gemaakt van nieuwe wafers kunnen worden gecontroleerd met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM).
    3. Meng voldoende basis-PDMS-hars en vernettingsmiddel grondig (w:w = 10:1 en 70-80 g) gedurende enkele minuten in een petrischaaltje (diameter 150 mm, hoogte 25 mm). Zorg ervoor dat er zich gelijkmatig kleine belletjes in het mengsel vormen, wat een goed mengsel bevestigt. Breng het mengsel over in centrifugebuisjes van 50 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten op 550 x g om de luchtbellen grondig te verwijderen.
      OPMERKING: PDMS-vloeistof is plakkerig en moeilijk schoon te maken; Wees voorzichtig bij het schenken. Reinig met isopropanol als de oppervlakken van de bank verontreinigd zijn door gemorst PDMS-mengsel.
    4. Giet het PDMS-mengsel voorzichtig op de wafer in een plastic of glazen schaal (diameter 150 mm, hoogte 25 mm) met een platte bodem en duw vervolgens de wafer naar beneden om PDMS van de bodem van de wafer te verwijderen. Ontgas het mengsel met een vacuümpomp.
      OPMERKING: Het is belangrijk om vloeibare PDMS van de bodem van de wafer te verwijderen; een dikke PDMS-laag aan de onderkant maakt het moeilijk om de wafer uit de plastic schaal te verwijderen, waardoor de kans groter wordt dat de wafer versplintert. Als alternatief kan men de PDMS langs de rand van de wafel snijden en de wafel in de petrischaal bewaren. Zorg voor een PDMS-dikte van ongeveer 1,5 mm voor laag 1 om de flexibiliteit van de mal in latere fabricagestappen te garanderen. Zorg voor een PDMS-dikte van ongeveer 2,5 mm voor laag 2 om de kans op doorzakken in latere fabricagestappen te verkleinen. De PDMS-dikte wordt gemeten met een liniaal nadat de PDMS-mallen in de benodigde vormen zijn gesneden.
    5. Laat de PDMS 2 uur lang uitharden in een oven op 80 °C en zorg ervoor dat het gerecht tijdens het proces zo horizontaal mogelijk wordt geplaatst. Laat de PDMS-vorm en -wafel afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de PDMS-vorm voorzichtig in zijn geheel van de wafel met behulp van een scherp chirurgisch mes en een gewatteerd pincet.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u geen krassen op het oppervlak van de wafer maakt. Controleer of er PDMS-resten worden gevormd op het waferoppervlak wanneer PDMS wordt afgepeld. Dit geeft aan dat het waferoppervlak opnieuw moet worden gesilaniseerd.
    6. Snijd de PDMS-mal in blokken die de interessante kenmerken bevatten en bewaar deze blokken in schone petrischalen (diameter 150 mm, hoogte 25 mm) of een vacuümkamer wanneer ze niet in gebruik zijn. Manipuleer de PDMS-mal zonder de essentiële kenmerken aan te raken.

2. Chipfabricage en assemblage van apparaten

OPMERKING: Gebruik een UV-uithardend polymeer met een lage viscositeit (maximaal UV-absorptiebereik 350-380 nm) om de microfluïdische chip te fabriceren door middel van PDMS-gieten. UV-uithardende lijm maakt de integratie van polyacrylamide (PA) hydrogel mogelijk als een transparant, iondoorlatend en elastisch celsubstraat. De eigenschappen van PA-gel ondersteunen het als een weefselmechanische stresssensor die beeldvorming van levende cellen en stimulatie van statische stroom mogelijk maakt. De chip zal uiteindelijk worden bevestigd aan een cartridge die kweekmedium bevat en wordt aangesloten op elektrodekamers.

  1. Voorbereiding van de glazen dekglaasjes
    1. Snijd met een diamantslijper het benodigde aantal rechthoekige glazen dekglaasjes (170 μm) in tot een grootte van 37 × 24mm2, zodat deze op de patroonafmetingen passen (aanvullend bestand 4).
      OPMERKING: Het dekglaasje heeft een dikte van 170 μm die compatibel is met beeldvorming met hoge resolutie, maar is kwetsbaar en vereist een zorgvuldige behandeling. Draag handschoenen en oogbescherming. Gooi de rechthoekige glazen dekglaasjes onmiddellijk weg als er zichtbare scheuren verschijnen, aangezien schilfers van deze rechthoekige glazen dekglaasjes een risico op lekken kunnen vormen. U kunt ook dekglaasjes van het juiste formaat bestellen bij fabrikanten van dekglaasjes. Raak de oppervlakken van rechthoekige glazen dekglaasjes niet met blote handen aan en laat vlekken achter die de beeldkwaliteit kunnen verslechteren.
    2. Leg de rechthoekige dekglaasjes in een schoon petrischaaltje zonder elkaar te overlappen en breng ze over naar een plasmakamer. Creëer een vacuümtoestand, maar laat aan het einde een beetje lucht binnen. Activeer de oppervlakken van de rechthoekige glazen dekglaasjes met behulp van luchtplasma (30 s tot 5 min, 29,6 W, afhankelijk van de toestand van de apparatuur)
      OPMERKING: Alleen de zijden die volledig zijn blootgesteld aan plasma (d.w.z. bovenoppervlakken) mogen in de volgende stap (stap 2.1.3) worden gebruikt. Voltooi stap 2.1.3 binnen 30 minuten na blootstelling aan plasma. De kamer zou er in dit stadium als roze-paars uit moeten zien als er luchtplasma is gegenereerd. Als de laatste bindingsstappen succesvol zijn, verkort dan voor het gemak de plasmaduur.
    3. Bereid 10 ml oppervlaktebehandelingsoplossing gemaakt van 0,3% azijnzuur en 0,5% 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylaat opgelost in 100% ethanol. Behandel rechthoekige glazen dekglaasjes met deze oplossing in een petrischaaltje (diameter 150 mm, hoogte 25 mm) gedurende 5 minuten op een shaker, om een goede hechting met UV-uithardende microfluïdische lagen op lijmbasis mogelijk te maken. Zorg ervoor dat de rechthoekige glazen dekglaasjes volledig zijn ondergedompeld in de oplossing en dat beide zijden zijn behandeld.
      LET OP: De oppervlaktebehandelingsoplossing is bijtend. Behandel het in een zuurkast.
    4. Spoel rechthoekige glazen dekglaasjes drie keer af met 100% ethanol, zonder ze tijdens het proces te laten drogen. Droog rechthoekige glazen dekglaasjes één voor één af met stikstofgas en een blaaspistool. Zorg voor een voldoende blaassnelheid die vloeistofdruppels netjes van de basisoppervlakken van de dekglaasjes verwijdert, waardoor vloeistofvlekken worden voorkomen. Bewaar rechthoekige glazen dekglaasjes in een schone petrischaal (diameter 150 mm, hoogte 25 mm).
      NOTITIE: Gebruik een blaaspistool om de luchtstroom parallel aan de basis van de dekglaasjes te richten en vermijd het gebruik van een te hoge blaassnelheid om te voorkomen dat de bril verbrijzelt.
  2. Laag 1 fabricage (Figuur 2C)
    1. Plaats een schone Layer 1 PDMS-vorm met de bedrukte zijde naar boven op een schone plastic afdrop (diameter 60 mm, hoogte 15 mm) en druk deze plat. Pipetteer 500 μL vloeibare UV-uithardende lijm langzaam op de mal en maak alle uitstekende structuren voorzichtig nat met behulp van een spatel. Verwijder luchtbellen als gevolg van het bevochtigingsproces.
      OPMERKING: Schone PDMS-mallen kunnen worden voorbereid door tape te gebruiken om stof of UV-uithardende lijmresten te verwijderen, of door te reinigen met ethanol. Bewaar PDMS-mallen uit voorzorg in vacuümkamers wanneer ze niet in gebruik zijn.
    2. Druk het dekglaasje voorzichtig naar beneden op de PDMS-mal. Voorkom dat overtollige UV-uithardende lijm de bovenzijde van het dekglaasje nat maakt, aangezien UV-uithardende lijmresten een schoon en plat dekglaasje kunnen voorkomen. Verwijder overtollige UV-uithardende lijm met laboratoriumwissers.
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de eigenschappen van de PDMS-mal die op de UV-uithardende lijmlaag zijn overgebracht, zijn uitgelijnd met de cartridge waarop deze zal worden gehecht. Markeer hiervoor het dekglaasje met een oplosbare markeerstift op de plaats waar het midden van de patroonputjes (drie) zich bevindt. Gebruik deze markeringen om het dekglaasje uit te lijnen met de PDMS-malfuncties wanneer u het rechthoekige glazen dekglaasje naar beneden drukt.
    3. Hard de structuur gedeeltelijk uit onder een gelijkmatig verlicht UV-licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) gedurende 10 s. Veeg de vlekken later weg met 75% ethanol. Houd de structuur stevig op een vlakke ondergrond en pel de Layer 1 PDMS-vorm er langzaam van.
      OPMERKING: Gedeeltelijke uitharding maakt de vorming van een voldoende vaste UV-uithardende lijmlaag mogelijk, waardoor de PDMS-mal in dit stadium kan worden afgepeld. Dit vergemakkelijkt ook de verlijming met een gedeeltelijk uitgeharde laag 2 in volgende stappen voor de fabricage van een tweelaagse UV-uithardende lijmstructuur. De Layer 1 PDMS-mal, die is voorbereid met een dikte van 1,5 mm (stap 1.2.4), zorgt voor voldoende PDMS-flexibiliteit die de kans verkleint dat de dunne dekstrip tijdens het schilproces breekt. PDMS-mal kan tot tien tot twintig keer worden hergebruikt, waarna er een witachtige laag UV-uithardende lijmresten op het PDMS-oppervlak kan ontstaan, waardoor de structuurdikte wordt verminderd. Gebruik in dit geval nieuwe PDMS-mallen.
  3. Laag 2 fabricage (Figuur 2D)
    1. Plaats een schone Layer 2 PDMS-mal, met de bedrukte zijde naar beneden, op een platte PDMS-plaat (plaatdikte van > 2,5 mm om een hoge stijfheid te garanderen). Tik zachtjes met een pincet op de kenmerken van bovenaf. Let op de interface voor donkerder worden of optisch contrast onder de functies - dit geeft het juiste contact aan.
      OPMERKING: De steunpilaren rond de belangrijkste kenmerken (twee ronde openingen en een spleet) zijn cruciaal om te voorkomen dat het PDMS-maloppervlak doorzakt.
    2. Vul de ruimte tussen de PDMS-mal en de plaat op met vloeibare UV-uithardende lijm via capillaire werking. Hard de structuur gedeeltelijk uit onder UV-licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) gedurende 10 s.
    3. Trek de composiet UV-uithardende lijmlaag en PDMS-mal voorzichtig van de PDMS-plaat met een zacht gevoerd pincet. Knip indien nodig overtollige randen van de UV-uithardende lijmlaag af met een scherpe schaar.
  4. Laag 1 en 2 verlijming (Figuur 2E)
    1. Plaats laag 1 bevestigd aan een rechthoekig glazen dekglaasje op een vlakke ondergrond. Lijn laag 2 (nog steeds bevestigd aan de PDMS-mal) uit met laag 1 en druk beide lagen stevig aan, zodat er "schaduwen" onder de kenmerken verschijnen.
    2. Hard de structuur uit onder UV-licht (363-370 nm, 224 mW/cm²) gedurende 10 s om lagen 1 en 2 te hechten, die de tweelaagse structuur van de microfluïdische chip vormen. Trek de PDMS-vorm voorzichtig van de chip.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de PDMS-mal met succes van de chip wordt afgepeld, gebruikt u een pincet om elke PDMS-steunpilaar te scheiden van de UV-uithardende kleeflaag 2 in stap 2.4.1. Deze actie helpt de algehele hechting tussen de PDMS-mal en laag 2 te verminderen, wat belangrijk is voor het afpellen.
  5. Integratie van polyacrylamidegel (Figuur 2F)
    OPMERKING: Bereid vóór dit gedeelte zoveel chips voor als nodig is voor een gemultiplext experiment.
    1. Bereid de PA-gelprecursoroplossing door de ingrediënten in de onderstaande tabel voorzichtig te mengen, wat overeenkomt met de PA-gelstijfheid naar keuze24 (zie tabel 1). Zorg ervoor dat er tijdens het pipetteren geen luchtbellen ontstaan, omdat zuurstof de geling remt.
      LET OP: TEMED en APS zijn giftig. Werk in een zuurkast en draag handschoenen.
      OPMERKING: Zorgvuldig pipetteren en hanteren is vereist omdat het om kleine hoeveelheden vloeistoffen gaat (1 μL TEMED voor 1 ml PA-gelprecursoroplossing). Gelstijfheid kan het celgedrag beïnvloeden, zoals blijkt uit veel mechanobiologische studies. Kies de stijfheid die het meest geschikt is voor uw experimenten. Fluorescerende kralen dienen als fiduciale markers voor gelvervorming en mechanische spanningsinferentie. Vortex-pareloplossing voordat u de oplossing in de PA-gelprecursoroplossing pipetteert. Het wordt aanbevolen om het kleine volume TEMED niet als laatste te mengen, aangezien PA-gelprecursoroplossingen beginnen te geleren wanneer beide initiators worden toegevoegd en kleine volumes moeilijk grondig te mengen zijn gedurende deze korte tijd.
    2. Piket onmiddellijk 10 μL van de PA-gelprecursoroplossing in het midden van het weefselgebied en bovenop de spleet van laag 2 (Fig. 1B, 2F). Druk voorzichtig aan met een rond glazen dekglaasje (diameter 10 mm) om een platte gel te vormen. Observeer de PA-oplossing die door de spleet in laag 1 stroomt en stop bij de rij barrièrepilaren.
      OPMERKING: Het volume van 10 μl PA-gelprecursoroplossing produceert een gel van 100 μm dik boven laag 2. Verander dit volume afhankelijk van de gewenste geldikte. Pipetteer de oplossing zo snel mogelijk op de chip, aangezien de PA-oplossing begint te polymeriseren zodra initiatoren worden toegevoegd. Druk met de juiste kracht op de oplossing om te voorkomen dat de oplossing over de barrièrepilaren stroomt en het kanaal blokkeert. Gooi de chip weg als de kanalen geblokkeerd zijn. Voor zachte gels met een stijfheid van 5 kPa of lager, gebruik glazen waterafstotend om de ronde glazen dekglaasjes te behandelen om de dekglaasjes hydrofoob te maken. Dompel de dekglaasjes in het bijzonder 5 minuten onder in waterafstotend glas, spoel ze 3 keer af met 100% ethanol en droog ze af met stikstofgas. Dit vergemakkelijkt het later afpellen van het dekglaasje van de gepolymeriseerde gel zonder de gel te vernietigen.
    3. Hard de microfluïdische chip onmiddellijk uit onder UV-licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) gedurende 5 minuten. Wacht minimaal ~1 uur totdat de PA-gel volledig is gestold.
      OPMERKING: Hierdoor wordt de chip volledig uitgehard, terwijl de gepolymeriseerde PA-gel zich aan de structuur kan hechten. Stappen 2.5.1, 2.5.2 en 2.5.3 moeten snel achter elkaar worden voltooid.
    4. Incubeer de chip grondig in HEPES (0,1 M, pH 7,4) gedurende ten minste 1 uur of langer om de gel nat te maken en de hechting tussen het dekglaasje en de gel los te maken. Verwijder het dekglas voorzichtig met een scherp pincet.
      OPMERKING: Voor zachtere gels met een stijfheid van 5 kPa of lager, verlengt u de incubatietijd tot 10 uur op een shaker om ervoor te zorgen dat het dekglas netjes van de gel wordt verwijderd zonder de gelstructuur te verstoren. Soms kunnen zich structurele patronen van enkele tientallen en honderden micrometers vormen tussen de rechthoekige dekslipbasis en de UV-uithardende laag op lijmbasis Layer 1. Deze patronen kunnen de helderveldbeeldvorming verstoren, maar hebben minimale effecten op fluorescentiebeeldvorming. Dit kan worden verbeterd door plasmaactivering van rechthoekige dekglaasjes, zoals in stap 2.1.2.
  6. Chip- en cartridgeverlijming (Figuur 2F)
    1. Plaats een gereinigde patroon van polycarbonaat van medische kwaliteit (aanvullend bestand 4) op een vlakke ondergrond, met de onderkant naar boven. Droog de gel op de chip met laboratoriumdoekjes vanaf de zijkant. Lijn de chip met de bedrukte zijde naar beneden uit met de cartridge.
      OPMERKING: Bij het testen van nieuwe cartridge-ontwerpen kan men bewerkings- of 3D-printmethoden gebruiken. Wanneer het ontwerp is vastgesteld, kan men spuitgieten gebruiken om grote hoeveelheden van de cartridge te produceren.
    2. Pipetteer UV-uithardende lijm in de spleten tussen de chip en de cartridge, die via capillaire werking worden gevuld. Uitharden met UV-licht (363-370 nm, 224 mW/cm2) gedurende 5 min.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat UV-uithardende lijm niet in de kanalen of naar de andere kant van de dekglaasjesbodem loopt.
  7. Verwijdering van niet-gepolymeriseerde PA-oplossing
    1. Gebruik een PDMS-stop en een spuit om ongeveer 5 ml HEPES (0,1 M, pH 7,4) door de afvalverwijderingskanalen te zuigen om de niet-gepolymeriseerde PA-gelprecursoroplossing die giftig is voor cellen weg te spoelen.
    2. Incubeer de gel in het apparaat met 2 ml HEPES (0,1 M, pH 7,4) per apparaat en plaats het 1-2 dagen op een shaker om ervoor te zorgen dat de niet-gepolymeriseerde PA-gelprecursoroplossing volledig wordt verwijderd.

3. Voltooiing van de installatie

OPMERKING: Nadat de apparaten zijn gemaakt, voltooit u de installatie (Figuur 1C) door PA-gel te coaten met ECM-eiwit voor het zaaien van cellen, de apparaten aan te sluiten op de elektrodekamer voor elektrische stimulatie en de apparaten in inzetstukken, houders en een deksel van een kamer met levende cellen te plaatsen voor gemultiplexte, levende celbeeldvormingsexperimenten.

  1. Bereiding van gesteriliseerde componenten
    1. Alle componenten van de opstelling, behalve het apparaat (materiaaltabel) moeten in de volgende volgorde worden gesonificeerd: eerst 30 minuten in een sopje, vervolgens 30 minuten in MQ-water en ten slotte 30 minuten in 75% ethanol. Droog ze daarna in een oven op 60 °C en behandel ze 30 minuten met UV-licht bij 200-280 nm in een bioveiligheidskast om sterilisatie te bereiken.
  2. PA-gelfunctionalisering met ECM-eiwit
    1. Steriliseer de apparaten met UV-licht (200-280 nm) in een bioveiligheidskast.
    2. Bereid de benodigde hoeveelheid 50 μg/ml Collageen I-werkoplossing in 1x DPBS op ijs.
      OPMERKING: Houd Collageen I-bouillon op ijs om gelering te voorkomen. Voor elk apparaat is 100-150 μL collageen I-werkoplossing nodig om de gel volledig onder te dompelen. Piket voorzichtig Collageen I-oplossingen om vezelvorming te voorkomen.
    3. Bereid de benodigde hoeveelheid Sulfo-SANPAH (SS) werkoplossing op ijs. Voor elke gelbehandeling is ongeveer 80 μL SS-werkoplossing nodig, waarbij 2 μL SS-stockoplossing (opgelost in watervrije DMSO) wordt verdund in 80 μL koude HEPES (vanaf 4 °C koelkast, 0,1 M, pH 7,4).
      OPMERKING: SS is vochtgevoelig; Voorkom condensatie van vocht op het product door de voorraadflesjes op kamertemperatuur te brengen voordat u ze opent. Gebruik No-weigh SS voor de beste prestaties en bereid voorraden voor in watervrije DMSO. Gebruik het zo snel mogelijk. Een koude HEPES-buffer wordt gebruikt om de hydrolysesnelheid van SS te verminderen ter voorbereiding op de SS-werkoplossing. Elke gel vereist twee behandelingen met de SS-werkoplossing om ervoor te zorgen dat het PA-geloppervlak goed wordt gefunctionaliseerd.
    4. Droog de gel in het apparaat door met laboratoriumdoekjes op de randen van de gel te deppen. Pipetteer 80 μL SS-werkoplossing op de gel en zorg ervoor dat het geloppervlak volledig wordt ondergedompeld in SS-oplossing. Behandel de gel gedurende 5 minuten met UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) om SS te activeren. Spoel 3 keer met koude HEPES (0,1 M, pH 7,4).
      OPMERKING: Pipeteer voorzichtig SS in het midden van de patroonput om te voorkomen dat SS wordt aangetrokken door de muur.
    5. Herhaal stap 3.2.4, maar spoel aan het einde drie keer af met koude 1x DPBS.
      OPMERKING: Stappen 3.2.3 tot 3.2.5 moeten snel achter elkaar worden uitgevoerd om SS-hydrolyse te voorkomen. De gespoelde gel zou in dit stadium een donkerdere tint rood moeten hebben als de activering van het oppervlak door SS is gelukt.
    6. Pipetteer 100 μL Collageen I-oplossing op PA-gel en zorg ervoor dat u de gel volledig onderdompelt. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel vervolgens drie keer los collageen af met 1x DPBS. Dompel de gel voor gebruik onder in 1x DPBS.
      OPMERKING: Collageen I-gecoat monster kan enkele dagen in de koelkast van 4 °C worden bewaard.
  3. Aansluiting van apparaten op elektrodekamers
    1. Bevestig apparaten aan de inzetstukken met behulp van schroeven (afbeelding 1C, type schroef: M3 X 10 mm). Bevestig vervolgens maximaal vier inzetstukken van het apparaat aan de houder die is ontworpen voor montage op een microscooptafel (type schroef: M3 X 5 mm).
      OPMERKING: Als het maximale aantal apparaatinsteekeenheden niet wordt gebruikt, wordt aanbevolen om alle andere houdersleuven te vullen met lege apparaten om de ruimte af te dichten, zodat goede live-celomstandigheden kunnen worden behouden voor de beeldvormingsexperimenten later. Lege apparaten kunnen eenvoudig worden gemaakt door cartridges te verlijmen op kale rechthoekige glazen dekglaasjes.
    2. Vul de apparaten met kweekmedium (DMEM++, 2 ml in elk van de hoofdputjes). Trek verder 2 ml medium door de afvalverwijderingskanalen om de 1x DPBS weg te spoelen en te vervangen.
    3. Bereid twee buizen van 50 ml voor met doppen die doorlopende gaten hebben om als elektrodekamers te functioneren. Maak gaten van de juiste grootte en hoeveelheid om de platina-elektroden en Tygon-slangen stevig te bevestigen en sluit de elektrodekamers aan op de apparaten. Vul elke elektrodekamer met 45 ml kweekmedium.
      NOTITIE: Gaten in de doppen kunnen eenvoudig worden gemaakt met behulp van scherpe chirurgische mesjes.
    4. Bereid de verbinding tussen elektrodekamers en apparaten voor: Bevestig twee slangconnectoren aan elk apparaat. Plaats een slangclip op elke Tygon-slang (Figuur 1C). Trek met een spuit kweekmedium door de slangen en klem ze stevig vast. Sluit het ene uiteinde van de met medium gevulde slang aan op de elektrodekamer en het andere op het apparaat.
      OPMERKING: Verminder de kans op het ontstaan van luchtbellen in de slang door voorverwarmd medium te gebruiken en/of het medium in een vacuümkamer te ontgassen. Voorkom dat er luchtbellen ontstaan op het raakvlak tussen Tygon-slangen en de slangconnector, knijp in de slanguiteinden om het mediumoppervlak uit te puilen voordat u het onderdompelt in het medium in de buis, of maak een fysieke bevestiging aan de slangconnectoren.
    5. Pas de relatieve hoogtes tussen de oppervlakken van het kweekmedium in de apparaten en de elektrodekamers aan met behulp van een laboratoriumaansluiting. Maak de slangclips los en laat alle middelgrote oppervlakken op dezelfde hoogte in evenwicht komen.
      NOTITIE: Vergeet niet om de slangclips vast te maken wanneer de hele opstelling wordt verplaatst om te voorkomen dat er vloeistof overloopt.
    6. Voer kwaliteitscontrole uit door de weerstand van elk apparaat afzonderlijk te meten met behulp van een elektrische bronmeter.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u alleen de slangclip losmaakt van het apparaat waarvoor de weerstand wordt gemeten, terwijl u de clips van de andere parallel aangesloten apparaten stevig vastmaakt.

4. Groei van monolagen en experimenten met levende cellen

OPMERKING: Om een goede confluente monolaag te vormen en een gelijkmatig verdeelde elektrische stroomdichtheid te bereiken die afhankelijk is van de samenvloeiing en elektrische weerstand van de monolaag. Zorg vervolgens voor de juiste omstandigheden voor levende cellen op een microscoop voor langdurige beeldvorming en elektrische stimulatie-experimenten.

  1. Monolayer groei
    1. Maak MDCK-cellen met trypsine los van de T25-kolven. Centrifugeer naar beneden en tel het gemiddelde volume dat nodig is om 0,1 miljoen cellen te verkrijgen. Suspendeer dit aantal cellen en meng ze goed in 2 ml medium in centrifugebuisjes.
    2. Pipetteer al het met cellen beladen medium in de put op het weefselgebied. Laat de cellen 15 minuten bezinken voordat u de hele opstelling langzaam overbrengt naar een weefselkweekincubator.
      OPMERKING: Voor elk apparaat komt een zaaidichtheid van 0.1 miljoen cellen overeen met 0.06 miljoen cellen per vierkante centimeter (6 × 104 cellen/cm2). Deze zaaidichtheid is schaars genoeg en de cellen groeien 2 dagen voordat ze een confluente toestand bereiken. Dit proces zorgt voor een goed gepolariseerde en homogene monolaag, zonder dat overtollige losse cellen hoeven te worden weggespoeld die het weefsel kunnen verstoren. Het is belangrijk dat de bezinkingsstap ongemoeid wordt gelaten, zodat er gelijkmatig wordt gezaaid
    3. Laat de cellen in de broedmachine (37 °C, 5% CO2, 90 % luchtvochtigheid) 72 uur groeien om een celdichtheid van >~50 cellen/100 μm2 te bereiken. Controleer dagelijks op een tafelmodel microscoop, met fasecontrast, om het groeiproces te volgen.
      OPMERKING: Met dit aantal gezaaide cellen hebben MDCK-cellen na 70 uur 80% 24% confluentie bereikt, volledige confluentie na 48 uur en verdere toename van de celdichtheid en weefselrijping tot 72 uur. Na 24 uur is de gemiddelde cellengte ongeveer 10-20 μm. Na 48 uur hebben de cel-celverbindingen en het cellichaam een duidelijk contrast onder fasecontrastbeeldvorming. Dit contrast neemt drastisch af na 72 uur.
  2. Beeldvorming van levende cellen
    1. Kies een epifluorescentie- of een confocale microscoop, afhankelijk van de experimentele behoeften. Wanneer cellen tot expressie komen of worden gekleurd met fluorescerende markers, kies dan confocaal voor driedimensionale observatie van celvorm en vervormingen van het gelsubstraat. Kies voor tweedimensionale waarneming fasecontrast en epifluorescentie, die minder fototoxiciteit produceren. Schakel het live-celsysteem 1 uur voordat u de opstelling naar de microscoop brengt in, zodat de microscoop-topincubator zich kan stabiliseren op 37 °C, 5% CO2 en 90% vochtigheid.
      OPMERKING: De live-cell systeemcontroller toont de omstandigheden in de stage-top incubator en geeft een waarschuwing wanneer de omstandigheden niet optimaal zijn. Aangezien het deksel van de stage-top incubator verschilt van het commerciële deksel vanwege de noodzaak om apparaatslangen te plaatsen die naar buiten uitsteken, moet het systeem opnieuw worden gekalibreerd om goede live-celomstandigheden te garanderen voor langdurige experimenten (een paar dagen tot een week). Kalibratie kan worden gedaan op basis van de gebruikershandleiding en de posities van de sensoren moeten bij experimenten hetzelfde worden gehouden als in de kalibratieomstandigheden. Controleer de verdampingssnelheid van het medium in de stage-top incubator en de pH-condities met fenolrood doordrenkt medium.
    2. Monteer de opstelling op de microscoop, met de elektrodekamers aan de zijkanten. Zorg ervoor dat de elektronische tafel van de microscoop voldoende bewegingsruimte heeft en niet tegen de elektrodekamers stoot. Zorg ervoor dat de gemiddelde oppervlaktehoogtes in evenwicht zijn en op dezelfde hoogte liggen tussen die in de apparaten en de elektrodekamers.
      OPMERKING: Het middelgrote oppervlak in de putjes van het apparaat, waar het weefselgebied zich bevindt (Figuur 1C), heeft een aanzienlijke invloed op helderveld- en fasecontrastbeeldvorming. Meniscus zorgt voor ongewenste lichtfocussering. Zorg ervoor dat het medium oppervlak vlak is aan de rand van de put, maar houd er rekening mee dat medium verdamping in de levend-celkamer na enige tijd zal leiden tot vervorming van dit platte oppervlak. Om dit probleem op te lossen, is een oplossing om een plat glazen dekglaasje in contact te brengen met het mediumoppervlak om dit oppervlak af te vlakken. Dit dekglaasje moet een kleiner oppervlak hebben dan de put, zodat het de gasuitwisseling niet belemmert, wat belangrijk is voor de celgroei. Een andere optie is om minerale olie van celkweekkwaliteit op het medium aan te brengen.
    3. Software instellen.
      1. Kies 10x of 20x objectieven voor beeldvorming van het hele weefsel met een epifluorescentiemicroscoop en 30x objectieven (WD 0,8 mm, NA 1,05) voor confocale beeldvorming met een hogere resolutie.
      2. Kies voor beeldvorming van het hele weefsel meerdere posities om het rechthoekige gebied in het weefselgebied te bedekken (Figuur 1A, bijv. 5 rijen bij 5 kolommen, de middelste rij bedekt de spleet, terwijl de andere buiten de spleet). Kies de fluorescerende en helderveldkanalen op basis van de cellijnen die in het resultaatgedeelte worden gebruikt (kanaal 488 voor groene fluorescentie en kanaal 561 voor rode fluorescentie). Kies een tijdsinterval van 1 uur om de fototoxiciteit in dit beeldvormingsexperiment op lange termijn gedurende maximaal enkele dagen te verminderen.
        OPMERKING: Andere objectieflenzen, zoals 4x, kunnen worden gekozen als een groter beeld van het hele weefsel nodig is.
  3. Elektrische stimulatie
    1. Controleer het aantal apparaten, de relatieve weerstand van het apparaat en de beoogde elektrische stroom van elk apparaat. Bepaal de totale elektrische stroom die gedurende een paar uur tot een week moet worden aangesloten in de algehele opstelling.
    2. Zoek een elektrisch signaal onder de stroomklemmodus. Voor 3 apparaten met dezelfde kanaalweerstand, met één besturingsgroep (geen elektrische stroom, slangclip bevestigd), één apicaal-naar-basaal (AtB) stroomtoestand en één basaal-naar-apicale (BtA) stroomtoestand (Figuur 1D), levert u een totale stroom van 20 μA met een bronmeter. Dit leidt ertoe dat 10 μA wordt geleverd voor elk apparaat met een geschatte stroomdichtheid ~10 μA/cm2 die fysiologisch relevant is (meer details in bespreking).
      NOTITIE: De totale voltage is ongeveer tientallen millivolt, afhankelijk van de lengte van de Tygon-slang. Zo'n elektrische stroom kan enkele dagen tot een week continu worden geleverd. De rode fenolindicator verandert van kleur in de elektrodekamers (zuurder in de kamer met de positieve elektrode), maar niet in de couveuse op het podium, die goed gekalibreerd is. De cellen blijven gezond zolang de omstandigheden van de levende cellen goed worden gehandhaafd. Onderzoekers kunnen het medium in de stage-top incubator eens in de twee dagen vervangen en het medium in de elektrodekamers eens in de paar dagen. Bevestig de slangklemmen bij het verwisselen van de elektrodekamers om overlopen van het medium te voorkomen. Zoals vermeld in stap 3.1.1, moet u eraan denken om een leeg apparaat te hebben om de houderruimte te bedekken. Dit zorgt ervoor dat de kamer van de levende cellen in de juiste staat verkeert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier gepresenteerde resultaten zijn een bewerking van de vorige publicatie4; Zie deze publicatie voor meer informatie.

Dit protocol maakt de toepassing mogelijk van een externe ionenstroom of elektrisch veld loodrecht op het vlak van cellen of weefsels. Deze elektrische stimulatie verstoort het endogene transepitheliale elektrische potentiaalverschil (TEPD) en stelt iemand in staat om de rol van TEPD bij het beheersen van weefselge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt gedetailleerde stappen en ontwerplogica om een nieuw microfluïdisch apparaat te fabriceren om transepitheliale elektrische potentiaalverstoringsexperimenten uit te voeren en om bio-elektrische effecten te bestuderen door middel van beeldvorming van levende cellen en mechanobiologische methoden. Het belang van deze methode is duidelijk in vergelijking met andere verwante methoden. Een verwante methode maakt bijvoorbeeld gebruik van een eenvoudige microfluïdische chip me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zorg ervoor dat alle auteurs alle belangenconflicten hebben bekendgemaakt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

XJ, PX, FF en TBS erkennen nuttige discussies met Dr. Xumei Gao, Xinru Yu en andere groepsleden van het Tissue Biophysics Laboratory. We danken de Customized Technology Service Facility (CTSF) van Westlake University voor hun hulp bij het tekenen van een schema. Dit werk werd ondersteund door de Westlake Education Foundation, het Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine en het Research Center for Industries of the Future (RCIF) aan de Westlake University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x DPBSGibco14190144
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate, TPMSigma2530850Bewaar onder stikstof na opening.
50 mL Falcon tubeCorning430829Boor 4 gaten in de dop van de 50 mL falcon tube, zodat de elektrode en de buis door de dop kunnen en in het medium kunnen worden ondergedompeld. Voor een set microfluïdische apparaten is minimaal 2 doppen nodig.
AzijnzuurSinopharm10000208
Acrylamide oplossing, 40%Sigma79061Toxisch
LuchtpompOKO labOKO-APOnderdeel van de microscoop-incubator op het stage-top
Ammonium Persulfaat, APSAladdinA112447
Cartridge--Cartridge is op maat gemaakt, en het ontwerp verwijst naar aanvullend materiaal. De grondstof is PC Makrolon 2858 Medical Grade, en hier vindt u meer details: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clips--Robert Clip, voor buisjes met een buitendiameter van 4,5 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Collagene ICorning354236
DI Milli-Q waterMilli-Q-
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium cultuurmedium,DMEM (hoge glucose)Gibco11965092DMEM++ is DMEM met extra 10%  FBS (Sigma-Aldrich), en 100 units/mL Penicilline-Streptomycine (Gibco).
Enclosure zwarte kooiOKO labH201Onderdeel van de microscoop-incubator op het stage-top
Epi-Fluorescente Inverted MicroscopeOlympusIX83
Absoluut ethanolSinopharm10009218
Fetaal runder serumSigmaF8318
Fluorescente kralen, 0,1 μL, rood (580/605)ThermoF8801
Gas kamerOKO labH201-PRIOR-SP200/400/600Onderdeel van de microscoop-incubator op het stage-top
Gas handmatige mixerOKO lab2GF-MIXEROnderdeel van de microscoop-incubator op het stage-top
GeneticineGibco10131027GFP–actin en H1–GFP MDCK werden gehandhaafd met behulp van media aangevuld met 0,5 mg/mL geneticine (Gibco) om hun genexpressie te behouden
HEPESSigma736459
IsopropanolSinopharm80109218
KimwipesKimberly-Clark ProfessionalLH-70155Laboratoriumdoekje
Langere schroef--Nichel-plated ronde kop kruis precisie machine schroef, M3 x 10 mm.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , 4th ed, Garland Science. New York. (2002).
  2. Cogan, S. F. Neural stimulation and recording electrodes. Annu Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  3. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through PI3K-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  4. Saw, T. B., et al. Transepithelial potential difference governs wound healing by electromechanics. Nat Phys. 18 (9), 1122-1128 (2022).
  5. Ferreira, F., Moreira, S., Zhao, M., Barriga, E. H. Stretch-induced collective cell migration in vivo. Nat Mater. 24, 452-470 (2025).
  6. Kennard, A. S., Theriot, J. A. Osmolarity-independent electrical response to injury in zebrafish epidermis. Elife. 9, 62386(2020).
  7. Allen, G. M., Mogilner, A., Theriot, J. A. Electrophoresis of keratocyte galvanotaxis. Curr Biol. 23 (7), 560-568 (2013).
  8. Levin, M., Thorlin, T., Robinson, K. R., Nogi, T., Mercola, M. Early step in left-right patterning. Cell. 111 (1), 77-89 (2002).
  9. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of surface electrical currents with a vibrating probe. Nat Protoc. 2 (3), 661-669 (2007).
  10. Metcalf, M. M., Shi, R., Borgens, R. B. Endogenous ionic currents in embryos. J Exp Zool. 268 (4), 307-322 (1994).
  11. Barratt, L., Rector, F., Kokko, J., Seldin, D. Factors governing the Journal of Clinical Investigation. J Clin Invest. 53 (2), 454-464 (1974).
  12. Zhao, M., et al. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  13. Barker, A., Jaffe, L., Vanable, J. Jr The glabrous epidermis in integrative and comparative physiology. Am J Physiol Integr Comp Physiol. 242 (3), R358-R366 (1982).
  14. Sun, Y., et al. Infection-generated electric field in gut epithelium guides migration of macrophages. PLoS Biol. 17 (4), e3000044(2019).
  15. Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A galvanotaxis assay in a microfluidic culture device. J Vis Exp. (68), e4193(2012).
  16. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  17. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions of cell signaling. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  18. Meng, X., et al. PI3K-mediated electrotaxis of embryonic and adult fibroblasts exposed to physiological electric fields. Exp Neurol. 227 (1), 210-217 (2011).
  19. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  20. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  21. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  22. Stoecklin, C., et al. A new approach to design artificial 3D microenvironmental and rheological cues. Adv Biosyst. 2 (7), 1700237(2018).
  23. Khoo, B. L., et al. Expansion of patient-derived circulating tumor cells in a microfluidic culture device. Nat Protoc. 13 (1), 34-58 (2018).
  24. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Methods Cell Biol. 47, 11-16 (2010).
  25. Choudhury, M. I., et al. Kidney epithelial cells are active mechanosensors that drive physiological fluid pumps. Nat Commun. 13 (1), 2317(2022).
  26. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Roy, B., et al. Fibroblast rejuvenation by mechanical reprogramming in the National Academy of Sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (19), 10131-10141 (2020).
  28. Tao, J., et al. Mechanical compression creates a quiescent muscle stem cell niche. Commun Biol. 6 (1), 43(2023).
  29. Iberite, F., Gruppioni, E., Ricotti, L. Skeletal muscle differentiation: Perspectives and challenges. NPJ Regen Med. 7 (1), 23(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Elektrische veldstimulatietransepitheliaal potentiaalcelproliferatiecelextrusiepolyacrylamidegelconfocale microscopietractiekrachtmicroscopie

Gerelateerde artikelen